Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
TESIS
para optar al ttulo profesional de Bilogo con Mencin en Microbiologa y
Parasitologa
AUTORA
Melina Yuriana Huamn Romero
ASESOR
Elena Quillama Polo
Lima Per
2010
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
A mis hermanos y dems miembros de mi familia por estar ah, por mostrarme
ese nimo especial y por mantenernos unidos hasta en los momentos ms
difciles.
CONTENIDO
Pags.
RESUMEN
ABSTRACT
I. INTRODUCCION......1
II. ANTECEDENTES.... 5
3.2 MTODOS.........12
3.2.1. Toma de muestras..12
3.2.2. Procesamiento de las muestras: Aislamiento primario......13
3.2.3. Caracterizacin fenotpica de las levaduras...13
a. Morfologa de las clulas vegetativas.....13
b. Crecimiento en medio lquido....14
c. Crecimiento en medio slido..14
d. Determinacin de la capacidad de filamentizacin....14
e. Determinacin de la capacidad de esporulacin.....14
f. Fermentacin de carbohidratos....15
g. Asimilacin de carbohidratos.....15
h. Asimilacin de sustancias nitrogenadas.....16
i. Hidrlisis de la urea.....16
3.3.4. Seleccin de levaduras...16
a. Tolerancia a altas concentraciones de etanol..........16
b. Tolerancia a altas concentraciones de glucosa....17
c. Deteccin del factor killer.......17
d. Resistencia a anhdrido sulfuroso...17
IV. RESULTADOS...18
4.1 Aislamiento e identificacin de levaduras.18
4.2 Caracterizacin fenotpica de levaduras19
4.3 Preseleccin de levaduras aisladas20
4.4 Pruebas de Seleccin de levaduras20
4.4.1. Tolerancia al etanol20
4.4.2
Tolerancia a glucosa...21
4.4.3
4.4.4
TABLAS .23
FIGURAS 36
V. DISCUSIN ..42
VI. CONCLUSIONES .....47
VII. RECOMENDACIONES...48
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.51
ANEXO A: PROTOCOLOS ....57
ANEXO B: MEDIOS DE CULTIVO ..62
RESUMEN
La Cachina o vino joven es una bebida obtenida por fermentacin espontnea
de la uva, involucra el desarrollo secuencial de varias especies de levaduras, como
responsables de la fermentacin alcohlica asociadas a las uvas y a los equipos de la
bodega que se utilizan durante la produccin artesanal de la bebida (Fleet, et al. 1984).
ABSTRACT
The Cachina or the young wine is a beverage obtained by spontaneous fermentation
of the grape, involves the sequential development of various species of yeasts. as
representatives of the alcoholic fermentation associated with grapes and winery
equipment are used during the production of handicrafts drinking. (Fleet et. al. 1984).
The aim of this study is to identify and characterize yeast strains associated with
native Cachina of Lunahuan wineries through simple and feasible methods to be used
finally as starter cultures in winemaking in the region, favoring a further stabilization
and ensuring the microbiological quality of the drink.
From 88 yeast isolated and identified to species level. The species found and their
frequencies of occurrence were Saccharomyces cerevisiae 64% (56). Kloeckera
apiculata 23% (20), Saccharomyces sp. 11% (10), Candida sp. 2% (2). 17 strains of
Saccharomyces cerevisiae preselected due to their fermentative abilities were tested
using simple methodologies for selection. The strain S. cerevisiae 2CA.1 distinguish
form all the yeast for having a great fermentative ability, significantly tolerate
concentrations of 10% ethanol, grow optimally in 20% glucose and resist high
concentrations of sulfur dioxide (up to 300 mg /I), as well as toxin-producing killer ,
iridicating its great capacity to being a possible starter in the grape rnost and to produce
wines of quality and standardized.
I. INTRODUCCIN
La vid (Vitis vinifera I.) es una planta que se cultiva tradicionalmente en la costa
sur del Per, principalmente en Lima, Ica, Arequipa, Moquegua y Tacna, y ha sido
introducido por los espaoles a fines del siglo XVI (Ramos, 2002). La poca de
vendimia o cosecha de uvas en stas regiones ocurre entre Enero y Marzo, y es
destinado para consumo directo y elaboracin de vinos.
apiculata,
Candida
vini,
C.
stellata,
C.
pulcherrima,
Pichia
e incluso dentro de los depsitos de una misma bodega. Las causas de esta variabilidad
son factores climticos, microbiolgicos y tecnolgicos, por tanto la necesidad de
asegurar la fermentacin alcohlica as como la tipicidad y reproducibilidad de los vinos
requieren cada vez ms el uso de cultivos iniciadores autctonos. A pesar de que existen
levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es ms efectivo el uso de
cultivos puros de levaduras que procedan de la zona vitivincola donde se van a utilizar,
lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se conoce que las
levaduras que se encuentran en una microzona son especficas del rea, totalmente
adaptadas a las condiciones climticas de la zona, completamente adaptadas a la materia
prima, es decir, al mosto a fermentar y responsables, al menos parcialmente de las
caractersticas sensoriales nicas de los vinos obtenidos (Torija, 2002).
Debido a que la calidad del vino est estrictamente relacionada con la flora
microbiana tpica que se desarrolla durante la fermentacin, existe una demanda
creciente por conocer la sucesin ecolgica de la microflora durante el proceso de
fermentacin natural como primer paso para lograr la seleccin de cepas con
potencialidad enolgica.(Capello, 2004) La capacidad para determinar la presencia de
estas especies en las uvas, vinos y bodegas, etc. es fundamental para entender el proceso
de formacin del vino, mejorar su calidad y prevenir alteraciones de origen microbiano
(Regodn, 1997).
II. ANTECEDENTES
La industria vitivincola en el Per juega un papel en los aspectos econmico y
social desde la poca de la colonia. Segn los registros de las crnicas en relacin a los
cultivos de vid en la costa, Reginaldo Lizrraga, fraile de la orden de San Agustn,
seal al valle de Lunahuan en Caete como uno de los centros ms importantes en la
produccin de uvas y vinos (Huertas L., 2004), cuya industria enolgica contina
actualmente en pleno desarrrollo.
la
Bilbao y col (1997) examinaron los efectos de la temperatura (10 y 25C) sobre
el crecimiento de cultivos solos y mixtos de Kloeckera apiculata y Saccharomyces
cerevisiae empleando un medio basado en jugo de manzana para los ensayos de
fermentacin, resultando que a 10C , S. cerevisiae obtuvo la mayor poblacin en
cultivos puros y mixtos, mientras que el crecimiento de K. apiculata aumento a 10C
tanto en cultivos puros y mixtos en comparacin con los resultados obtenidos a 25C
Ubenda y col (1998) lograron aislar 74 levaduras del genero Saccharomyces de
las bodegas en la regin de Valdepeas (Espaa) para estudiar sus propiedades
8
produccin de las toxinas killer era afectada por diversos factores: elevada
concentracin de azcar, altas temperaturas y ciertos valores de pH.
Soarez y col. (2000) logr caracterizar la toxina killer producida por la levadura
S. cerevisiae Y500-4L aislada a partir de mosto en Brasil, denotando que la actividad
ptima de la toxina se logra entre valores de pH 3.8-4.5 y a temperaturas de 22 y 25C.
10
3.1.2 MUESTRAS
Las muestras de Cachina, elaboradas con diversas variedades de uvas de Lunahuan
fueron obtenidas a partir de diferentes tiempos de fermentacin espontnea. Asimismo
se recolectaron 3 variedades de uvas para extraer los mostos respectivos con el fin de
realizar un seguimiento de la microflora nativa responsable de la fermentacin
alcohlica a nivel de laboratorio, tal como se indica en el siguiente listado.
Cachina Acholada (15 das de fermentacin)
Cachina de uva Borgoa (9 das de fermentacin)
Cachina de uva Borgoa Blanca (15 das de fermentacin)
Cachina de uva Borgoa Blanca (30 das de fermentacin)
Cachina de uva Moscatel (6 das de fermentacin)
Cachina de uva Quebranta (1 da de fermentacin)
Cachina de uva Uvina (6 das de fermentacin)
Cachina de uva Uvina (9 das de fermentacin)
Cachina de uva Uvina (15 das de fermentacin)
Cachina de uva Uvina (20 das de fermentacin)
Uva Quebranta (Seguimiento del proceso de fermentacin cada 7 das
hasta el da 40).
Uva Uvina (Seguimiento del proceso de fermentacin cada 7 das hasta el
da 20).
Uva Italia (Seguimiento del proceso de fermentacin cada 7 das hasta el
da 60).
11
3.2.- METODOS
3.2.1.- TOMA DE MUESTRA
La toma de las muestras de Cachina se realiz en frascos estriles de 200
ml y fueron etiquetados conteniendo los siguientes datos:
-
Nombre de la muestra
Variedad de la uva
Tiempo de fermentacin
Fecha de recoleccin
Localidad
12
3.2.2.-
PROCESAMIENTO
DE
LAS
MUESTRAS:
AISLAMIENTO
PRIMARIO
Para el aislamiento de levaduras nativas, se tomaron alcuotas (0.1 ml) a
partir de muestras diluidas de cachinas y mostos, y se sembraron sobre placas de
petri con medio agar YPG pH 5,5. La incubacin se realiz a 30C por 72 horas.
Transcurrido este tiempo se procedi a la lectura de las caractersticas morfolgicas
de las colonias y se seleccionaron independientemente 2 a 3 colonias
morfolgicamente similares de cada tipo aparecidas en cada placa, asignndoles un
cdigo respectivo.
Una vez obtenido los cultivos crecidos y activos, se analiz la pureza de
los cultivos mediante examen microscpico para su adecuada conservacin, la cual
se realiz sembrando las cepas en frascos viales conteniendo agar YPG 1,5%. El
mantenimiento en cepario se realiz a 4C.
globosas,
13
14
g. Asimilacin de carbohidratos
La capacidad de asimilar carbohidratos por las levaduras fue evaluada
segn el medio base Peptona de Carne 0.5% y NaCl 0.25% descrito por Kreger-van
Rij (1984). Los cultivos puros centrifugados fueron resuspendidos en solucin salina
y 0.1 ml de la suspensin fue inoculada en el medio base conteniendo diferentes
azcares galactosa, glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa, rafinosa, en condiciones
aerbicas. Las lecturas confirmativas se realizaron a las 24 horas.
15
i. Hidrlisis de la rea
Para determinar la presencia de la enzima ureasa en las cepas de
levaduras, se sembr cultivos activos en tubos conteniendo agar inclinado con urea
de Christensen. Se incubaron a 30C y la observacin de la reaccin se realiz a las
24 horas, hasta las 96 horas. (Kurtzman, 1998).
16
17
IV. RESULTADOS
cerevisiae
63,6%
(56),
Kloeckera
apiculata
Saccharomyces sp. 11,4% (10), Candida sp. 2,3% (2) (Figura 1).
18
22,7%
(20),
Todas las
20
cerevisiae 5CA mostr una D.O. de 0.381 a las 48h. (D.O. inicial 0h= 0.093) y la cepa
S. cerevisiae 1Qc.3 fue capaz de lograr D. O. de 0.756 a las 48h mostrando una
tolerancia significativa a concentraciones altas de etanol (Figuras 7 y 8).
21
22
TABLAS
23
Tiempo de
fermentacin
Cachina de
Uva quebranta
Clulas por ml
2 x107
Especies aisladas
(N de cepas identificadas)
Kloeckera apiculata (2)
5 x 106
1 da
Cachina de
uva Uvina
6 das
1.4 x 108
Saccharomyces cerevisiae(2)
Cachina de
uva Moscatel
6 das
1.4 x 109
Cachina de
uva Uvina
9 das
2.8 x 108
Cachina de
uva Borgoa
9 das
3.6 x 108
15 das
N.D.
15 das
2,4 x 107
Cachina
acholada
15 das
7.9 x 107
Cachina de
uva Uvina
20 das
2.1 x 106
30 das
7.6 x 104
Cachina de
uva Borgoa
Blanca
Cachina de
uva Uvina
Cachina de
Uva Borgoa
Blanca
Total
27
N.D: No determinado
24
Tiempo de
fermentacin
Clulas por ml
6 das
1.5 x 109
Cepa (N de cepas)
Kloeckera apiculata (3)
Saccharomyces cerevisiae (2)
Cachina de
Uva Italia
15 das
1.7 x 105
25 das
N.D
60 das
N.D.
Total
14
N.D: No determinado
Tiempo de
fermentacin
Clulas por ml
Cepa (N de cepas)
1.8 x 107
1.3 x 107
1 da
3 x 106
9 x 107
14 das
3.1 x 107
21 das
1.0 x 107
28 das
1.9 x 107
40 das
5.5 x 106
7 das
Cachina de
Uva Quebranta
Total
28
25
Muestra
Tiempo de
fermentacin
Clulas por ml
1 da
4.8 x 108
1.9x 108
Saccharomyces sp (4)
2.0 x 106
1.0 x 106
3.0 x 107
7 das
Cachina de
Uva Uvina
14 das
2.0 x 106
20 das
6.1 x 106
Total
Cepa (N de cepas)
Saccharomyces sp (2)
19
26
Saccharomyces
cerevsiae
Kloeckera
Apiculata
Saccharomyces
sp.
Candida
sp.
63,6%(56)
22,7%(20)
11,4%(10)
2.3%(2)
Ovoidal, redonda,
yema polar y lateral
Redonda, borde liso,
blanca, mamelonada
aterciopelada.
Elpticas, ahusadas,
yema bipolar
Redonda, borde
liso, cremosa,
brillosa
Ovoidal, yema
polar
Redonda, borde
liso, blanca,
ligeramente
brillosa
Ovoidal, yema
polar
Redonda, blanca
mantequillosa,
borde liso,
brillosa.
Sedimento blanco,
sin turbidez.
Sedimento blanco
regular, sin
turbidez, velo en la
superficie
Sedimento blanco,
sin turbidez.
Sedimento
blanco, sin
turbidez.
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
D
+
D
-
AG
AG
AG
AG
AG
AG
-
AG
AG
AG
Gd
AG
AG
Gd
+
-
Caractersticas
Morfologa celular
Morfologa de la
Colonia
Comportamiento
en caldo
Asimilacin de
carbohidratos:
Galactosa
Glucosa
Lactosa
Maltosa
Sacarosa
Rafinosa
Fermentacin de
carbohidratos:
Galactosa
Glucosa
Lactosa
Maltosa
Sacarosa
Rafinosa
Ureasa
KNO3
Pseudomicelio
Esporulacin
+: Reaccin Positiva
-: Reaccin negativa
d: Reaccin dbil
AG : Acidez y Gas
27
Cdigo de la
cepa
Especie identificada
Cachina Uvina
15 das
2CA.1
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Acholada
15 das
3CA.1
Saccharomyces cerevisiae
15 das
4CA
Saccharomyces cerevisiae.
Cachina Uvina
6 das
5CA
Saccharomyces cerevisiae
30 das
7CA
Saccharomyces cerevisiae
30 das
7CB
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Borgoa
9 das
8CA
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Uvina
9 das
10CA
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Uvina
20 das
12CA
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Italia
6 das
LI.4
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Quebranta
1 da
1Qc.3
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Quebranta
21 das
QLe
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Quebranta
40 das
QLh
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Quebranta
40 das
QLi
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Uvina
7 das
ULb
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Uvina
20 das
UL2
Saccharomyces cerevisiae
Cachina Uvina
20 das
UL3
Saccharomyces cerevisiae
Fuente/ Muestra
28
2CA.1
0
4
8
10
12
0
0,104
0,1
0,1
0,09
0,09
24
1,45
1,41
1,089
0,34
0,107
48
1,408
1,395
1,273
1,059
0,115
3CA.1
0
4
8
10
12
0,101
0,102
0,101
0,098
0,096
0,182
0,142
0,13
0,121
0,098
0,711
0,582
0,226
0,154
0,101
1,065
0,943
0,415
0,167
0,107
1,344
1,289
1,16
0,337
0,107
1,251
1,24
1,228
1,076
0,102
4CA
0
4
8
10
12
0,105
0,108
0,106
0,105
0,098
0,172
0,145
0,109
0,107
0,101
0,549
0,488
0,196
0,113
0,105
1,013
0,909
0,327
0,154
0,107
1,389
1,346
0,92
0,239
0,101
1,394
1,329
1,232
0,852
0,092
5CA
0
4
8
10
12
0,101
0,092
0,089
0,085
0,083
0,368
0,238
0,16
0,149
0,101
0,825
0,7
0,423
0,16
0,112
1,102
1,028
0,737
0,181
0,12
1,4
1,318
1,271
0,66
0,132
1,357
1,331
1,31
1,23
0,381
7CA
0
4
8
10
12
0,109
0,105
0,118
0,108
0,105
0,283
0,21
0,149
0,126
0,119
0,72
0,525
0,291
0,21
0,132
1,119
0,945
0,51
0,244
0,14
1,393
1,315
1,157
0,703
0,115
1,42
1,33
1,285
1,133
0,113
7CB
0
4
8
10
12
0,104
0,101
0,098
0,099
0,096
0,148
0,109
0,101
0,103
0,098
0,28
0,228
0,109
0,106
0,102
0,659
0,545
0,144
0,114
0,106
1,345
1,199
0,246
0,115
0,108
1,31
1,2
0,471
0,121
0,098
8CA
0
4
8
10
12
0,105
0,106
0,103
0,103
0,104
0,257
0,191
0,133
0,127
0,12
0,84
0,623
0,36
0,17
0,151
1,223
1,108
0,533
0,291
0,148
1,335
1,281
1,222
0,676
0,154
1,324
1,285
1,224
1,062
0,166
10CA
0
4
8
10
12
0,11
0,103
0,108
0,105
0,102
0,237
0,188
0,153
0,148
0,11
0,88
0,69
0,273
0,204
0,133
1,245
1,12
0,544
0,271
0,126
1,392
1,353
1,171
0,703
0,117
1,379
1,36
1,336
1,262
0,11
12CA
0
4
8
10
12
0,1
0,099
0,096
0,093
0,09
0,258
0,194
0,114
0,099
0,065
0,655
0,406
0,198
0,118
0,102
1,066
0,886
0,416
0,197
0,112
1,527
1,468
1,222
0,509
0,117
1,534
1,48
1,451
1,005
0,113
Cepa
%Etanol
29
Continuacin...
Tabla 7. Crecimiento de cepas de Saccharomyces cerevisiae en medio YPG con
diferentes concentraciones de etanol.
1Qc.3
0
4
8
10
12
0
0,119
0,103
0,108
0,107
0,101
24
1,48
1,455
1,38
0,895
0,244
48
1,465
1,427
1,385
1,337
0,756
LI.4
0
4
8
10
12
0,1
0,098
0,103
0,099
0,097
0,324
0,263
0,205
0,174
0,115
0,872
0,724
0,308
0,225
0,118
1,226
1,114
0,558
0,247
0,101
1,367
1,324
1,226
0,762
0,109
1,376
1,32
1,21
1,145
0,13
QLe
0
4
8
10
12
0,11
0,1
0,103
0,106
0,09
0,281
0,205
0,14
0,157
0,119
0,945
0,755
0,34
0,186
0,113
1,297
1,118
0,526
0,251
0,119
1,451
1,45
1,301
0,701
0,119
1,43
1,447
1,328
1,214
0,105
QLh
0
4
8
10
12
0,115
0,112
0,13
0,117
0,1
0,267
0,198
0,166
0,16
0,152
0,994
0,63
0,302
0,191
0,126
1,369
0,96
0,46
0,232
0,109
1,49
1,51
1,2
0,69
0,112
1,46
1,474
1,289
1,153
0,105
QLi
0
4
8
10
12
0,118
0,113
0,112
0,112
0,114
0,32
0,242
0,183
0,124
0,119
0,889
0,668
0,472
0,159
0,13
1,171
1,026
0,8
0,22
0,136
1,46
1,405
1,33
0,609
0,139
1,461
1,432
1,372
1,215
0,25
ULb
0
4
8
10
12
0,117
0,113
0,108
0,105
0,101
0,252
0,194
0,163
0,143
0,13
0,999
0,661
0,303
0,165
0,128
1,363
1,138
0,485
0,23
0,127
1,415
1,401
1,225
0,71
0,126
1,419
1,396
1,299
1,18
0,117
UL3
0
4
8
10
12
0,105
0,105
0,108
0,102
0,101
0,253
0,211
0,136
0,122
0,109
0,572
0,525
0,299
0,321
0,112
1,203
0,967
0,651
0,349
0,114
1,314
1,135
1,127
0,808
0,115
1,342
1,143
1,135
1,112
0,113
UL2
0
4
8
10
12
0,104
0,102
0,103
0,103
0,102
0,237
0,221
0,133
0,117
0,128
0,684
0,523
0,366
0,247
0,152
1,153
1,008
0,533
0,391
0,128
1,255
1,191
0,876
0,776
0,134
1,337
1,28
1,094
1,002
0,156
Cepa
%Etanol
30
Cepa
2CA.1
3CA.1
4CA
5CA
7CA
7CB
8CA
10CA
12CA
%Glucosa
10
15
20
25
0
0,109
0,101
0,102
0,109
10
15
20
25
0,11
0,099
0,09
0,113
0,2
0,192
0,175
0,16
0,81
0,733
0,672
0,413
1,147
1,086
1,052
0,827
1,586
1,526
1,509
1,418
1,741
1,707
1,654
1,58
10
15
20
25
0,112
0,112
0,099
0,11
0,156
0,154
0,128
0,116
0,547
0,64
0,47
0,457
1,11
0,959
0,917
0,83
1,94
1,7
1,525
1,453
1,941
1,83
1,646
1,692
10
15
20
25
0,11
0,104
0,108
0,11
0,49
0,445
0,424
0,417
0,99
1,01
0,926
0,804
1,317
1,163
1,087
1,08
2,158
1,758
1,588
1,513
2,185
1,967
1,69
1,753
10
15
20
25
0,093
0,096
0,106
0,099
0,128
0,126
0,131
0,116
0,58
0,485
0,424
0,28
0,98
0,936
0,85
0,669
1,584
1,553
1,496
1,415
1,832
1,742
1,78
1,59
10
15
20
25
0,105
0,102
0,11
0,094
0,124
0,127
0,133
0,113
0,312
0,306
0,338
0,258
0,709
0,708
0,666
0,575
1,397
1,339
1,38
1,11
1,834
1,566
1,6
1,33
10
15
20
25
0,102
0,113
0,1
0,11
0,213
0,184
0,168
0,152
0,94
0,83
0,65
0,475
1,37
1,19
1,118
0,93
1,727
1,597
1,815
1,479
1,777
1,74
2,034
1,698
10
15
20
25
0,105
0,1
0,1
0,113
0,249
0,219
0,127
0,152
0,828
0,764
0,561
0,394
1,201
1,152
0,95
0,732
1,748
1,672
1,577
1,491
1,814
1,78
1,71
1,66
10
15
20
25
0,107
0,108
0,108
0,105
0,225
0,192
0,128
0,125
0,657
0,583
0,508
0,397
1,058
1,033
0,983
0,84
1,725
1,649
1,711
1,52
1,826
1,775
1,76
1,8
31
48
1,921
2,038
2,142
1,789
Continuacin
Tabla 8.- Crecimiento de cepas de Saccharomyces cerevisiae en medio YPG con
diferentes concentraciones de azcar.
Cepa
1Qc.3
LI.4
QLe
QLh
QLi
ULb
UL3
UL2
%Glucosa
10
15
20
25
0
0,112
0,1
0,096
0,099
10
15
20
25
0,11
0,108
0,102
0,113
0,208
0,164
0,177
0,172
0,779
0,653
0,678
0,674
1,191
1,067
1,03
0,952
1,845
1,96
1,499
1,458
1,88
2,001
1,668
1,661
10
15
20
25
0,106
0,107
0,102
0,105
0,205
0,159
0,172
0,132
0,858
0,775
0,79
0,636
1,396
1,07
1,326
0,93
1,776
1,85
1,62
1,55
1,82
2,026
1,834
1,72
10
15
20
25
0,1
0,105
0,105
0,11
0,135
0,162
0,136
0,15
0,799
0,749
0,669
0,626
1,3
1,253
1,097
0,981
1,848
1,701
1,909
1,62
1,869
1,9
2,204
2,063
10
15
20
25
0,105
0,1
0,102
0,096
0,278
0,211
0,182
0,125
0,865
0,795
0,728
0,555
1,269
1,228
1,14
0,918
1,726
1,674
1,654
1,513
1,916
1,853
2,237
1,772
10
15
20
25
0,106
0,1
0,108
0,098
0,144
0,145
0,149
0,153
0,802
0,773
0,735
0,73
1,283
1,156
1,233
1,115
1,823
1,77
1,584
1,534
1,899
1,969
1,792
1,759
10
15
20
25
0,103
0,106
0,106
0,103
0,118
0,126
0,121
0,111
0,448
0,475
0,424
0,284
0,898
0,916
0,655
0,469
1,514
1,653
1,506
1,315
1,632
1,742
1,718
1,509
10
15
20
25
0,102
0,102
0,101
0,099
0,164
0,145
0,129
0,12
0,702
0,673
0,635
0,573
1,201
1,112
1,103
0,675
1,693
1,377
1,584
1,134
1,859
1,658
1,592
1,268
32
48
1,815
1,9
2,24
1,545
Tabla 9.- Espectro inhibitorio del factor killer de Saccharomyces cerevisiae frente a cepas
taxonmicamente afines, aisladas de Cachina.*
Cepas
product.
1Qc.3
2CA.1
3CA.1
7CA
7CB
8CA
10CA
12CA
QLh
Ulb
1Qc.3
14
11
15
-
2CA.1
-
3CA.1
-
Cepas sensibles
Dimetro de inhibicin ( mm)
7CA
7CB
8CA 10CA
18
16
10
16
16
7
16
18
9
-
12CA
-
QLh
13
13
15
-
ULb
11
11
13
-
Tabla 10.- Espectro inhibitorio del factor killer de Saccharomyces cerevisiae frente a cepas
taxonmicamente afines, aisladas de Cachina.*
Cepas
product.
4CA
5CA
LI.4
Qle
Qli
UL2
UL3.1
YAT 674
K1
1Uc.1
-
4CA
-
5CA
-
Cepas sensibles
Dimetro de inhibicin ( mm)
LI.4
Qle
QLi
UL2
11
11
11
13
11
12
13
11
12
11
11
11
UL3.1
12
13
13
12
33
P453
12
12
13
10
100mg/L
200mg/L
300mg/L
2CA.1
+++
+++
++
3CA.1
+++
++
4CA
+++
+++
5CA
+++
+++
++
7CA
+++
++
++
7CB
+++
++
8CA
+++
++
++
10CA
+++
++
12CA
+++
++
1QC.3
+++
+++
++
LI.4
+++
+++
++
QLe
+++
++
++
QLh
+++
+++
++
QLi
+++
+++
ULb
+++
++
UL3.1
+++
++
UL2
+++
++
Saccharomyces cerevisiae
34
Especie identificada
Tolerancia
al etanol
2CA.1
Saccharomyces cerevisiae
10%
20%
300mg/L
K+
3CA.1
Saccharomyces cerevisiae
10%
10%
200mg/L
K+
4CA
Saccharomyces cerevisiae
8%
10%
200mg/L
K+
5CA
Saccharomyces cerevisiae
10%
10%
300mg/L
K+
7CA
Saccharomyces cerevisiae
10%
10%
300mg/L
Sensible
7CB
Saccharomyces cerevisiae
10%
10%
200mg/L
Sensible
8CA
Saccharomyces cerevisiae
10%
20%
300mg/L
Neutro
10CA
Saccharomyces cerevisiae
10%
10%
200mg/L
Sensible
12CA
Saccharomyces cerevisiae
10%
10%
200mg/L
K+
LI.4
Saccharomyces cerevisiae
10%
15%
300mg/L
K+
1Qc.3
Saccharomyces cerevisiae
10%
20%
300mg/L
Sensible
QLe
Saccharomyces cerevisiae
10%
15%
300mg/L
Sensible
QLh
Saccharomyces cerevisiae
10%
20%
300mg/L
Sensible
QLi
Saccharomyces cerevisiae
10%
20%
200mg/L
Sensible
ULb
Saccharomyces cerevisiae
10%
15%
200mg/L
Sensible
UL2
Saccharomyces cerevisiae
10%
10%
200mg/L
Sensible
UL3.1
Saccharomyces cerevisiae
10%
15%
200mg/L
Sensible
35
tolerancia
al azcar
Tolerancia
a SO2
Fenotipo
killer
FIGURAS
36
2.3%
11.4%
22.7%
63.6%
Candida sp.
Saccharomyces sp.
Kloeckera apiculata
Saccharomyces cerevisiae
Fig. 1.- Distribucin porcentual de cepas nativas de levaduras aisladas de Cachina, del
distrito de Lunahuan-Lima.
37
38
Fig. 6.- Pseudomicelio de Candida sp. 1CB en Agar Arroz Almidn pH 6.5
39
1.6
1.4
Densidad Optica
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0% Et
4% Et
8%1 Et
10% Et
12% Et
1.6
1.4
Densidad Optica
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0% Et
4% Et
1
8% Et
10% Et
12% Et
40
2.5
1.5
0.5
0
0
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
Tiempo (h)
2%
10%
15%
20%
25%
2.5
1.5
0.5
0
0
12
16
20
24
28
32
36
40
44
Tiempo (h)
1QC.3
8CA
ULb
LI.4
7CA
41
48
% total de levaduras
evaluadas
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
K(+)S(+)
0
K(+)S(-)
6 cepas
Sensibles
10 cepas
Neutras
1 cepa
3CA.1
12CA
2CA.1
Fig. 12.- Inhibicin del crecimiento causada por toxina killer de tres cepas de
Saccharomyces cerevisiae 2CA.1, 3CA.1 Y 12CA en agar YEPD-MB previamente
sembrada con la cepa sensible de S. cerevisae 7CA.
42
V. DISCUSION
De un total de 88 cepas de levaduras aisladas de mostos de uvas en proceso de
fermentacin, el mayor porcentaje correspondi a la especie Saccharomyces cerevisiae
y en menor porcentaje a kloeckera apiculata y Candida sp. Estos resultados coinciden
con lo descrito por Ethiraj S. et al, (1980); Fleet et al. , (1984); Querol et al., (1990);
Poblet, M. et al.,( 1992); Fleet y Heard, (1993); Schtz y Gafner, (1993); Capello et al.,
(2004); Satora et al, (2005); sin embargo al inicio de la fermentacin de los mostos
tambin suelen estar presentes Metschnikowia, Pichia, Kluyveromuyces y Rhodotorula,
las cuales no se encontraron en las muestras en estudio.
43
Adems se comprob que a partir del sexto da, la levadura que comienza a
predominar fue Saccharomyces. La capacidad de cepas de Saccharomyces para crecer
en los mostos y transformarlos en vino se sostiene en que su poder alcoholgeno es
elevado y es resistente al SO2 y sugiere que esta levadura realiza una gran contribucin
a la ecologa de la fermentacin y finalmente le otorga caractersticas particulares a la
bebida. Este resultado coincide con los estudios de Torija (2004).
44
Por otro lado, todas las cepas de levaduras alcohol tolerantes, fueron adems
capaces de crecer en un medio conteniendo concentraciones altas de azcar glucosa
(10%, 15%, 20% y 25%). Este resultado esta de acuerdo con las observaciones de Gray
(1945) quien sostuvo que las levaduras etanol tolerantes tienden a ser tambin azcar
tolerantes. Ekunsanmi y Odunfa (1990) acertaron que la combinacin de tolerancia al
azcar y etanol es una ventaja de la levadura nativa para ser utilizada en la industria
vitivincola.
46
VI. CONCLUSIONES
Durante la fermentacin espontnea de los mostos de diferentes uvas de la
regin de Lunahuan, ocurre una sucesin natural de microorganismos y la
fermentacin es iniciada principalmente por especies de Kloeckera apiculata,
seguida de Saccharomyces cerevisiae hasta el final de la fermentacin.
47
VII. RECOMENDACIONES
48
VIII. BIBLIOGRAFA
Achi, O.K. (2005) The potential for upgrading traditional fermented foods through
biotechnology. African Journal of Biotechnology 4(5) 375-380
Bentez T., Del Castillo L., Aguilera A., Conde J y Cerd-Olmedo E. (1983) Selection
of wine yeast for growth and fermentation in the presence of ethanol and sucrose.
Applied and Environmental Microbiology 45(5) 1429-1436
Bilbao, A., Irastorza, A., Dueas, M. and Fernndez, K. (1997) The effect of
temperature on the growth of strains Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae
in apple juice fermentation. Letter in applied and Environmental Microbiology 48(5)
1034-1038
Cansado j., Longo E., Sieiro, C., Velsquez, J.B. and Villa T.G.(1991) Role of killer
character in spontaneus fermentations from NW Spain: ecology, distribution and
significance. Appl. Microbiology and Biotechnology. 34, 643-647
Ceccato S.R.; Moreira L.C and Regenfuss C. (1999) Killer character of yeast isolated
from ethanolic fermentations. Scientia Agricola. 56 (3)
Ciani, M., Fatichenti, F. (1999) Selective sugar consumption by apiculate yeasts. Letters
in Applied Microbiology 28, 203-206
49
Codn A. C., Gasent-Ramirez J. M. and Bentez T. (1995) Factors Vich affect the
frecuency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae Bakers
Yeast. Applied and Environmental Microbiology 61(2), 630-638
Ethiraj S., Onkarayya H. y Suresh R. (1980) A note on the nature and sequence of
yeasts during fermentation of apples growth in India. Journal of Applied Bacteriology
48, 97-100
Fleet, G.H. y Heard, G.M. (1993) Yeast growth during fermentation. Wine
Microbiology and Biotechnology. (Ed. G.H. Fleet) pp. 27-54. Harwood Academic
Publishers, Switzerland.
50
Gil, J.V., Mateo J.J., Jimenez M., Pastor A. Y Huertas T. (1996) Aroma Compounds in
Wine as Influenced by Apiculate Yeast. Journal of Food Science. 61(6), 1247-1250.
Ibarra A., Mendiola J., Cabanillas J., Huallanca D., Chavez G., Garca L y Espino F.
(2005) Niveles de grado alcohlico, acidez total y calidad sensorial de la cachina
producida en el valle de Ica (Per) Revista de Enologa 53.
Izg F.; Altinbay D. and Ycelis A. (1997) Identification and killer activity of a yeast
contaminating starter cultures of saccharomyces cerevisiae strains used in the turkish
baking industry. Food Microbiology. 14, 125-131.
Kreger-Van Rij, N.J.W. (1984). The yeast: A taxonomic study 4 ed. Amsterdan.
Elsevier Science Publishers.
Khle, A. Van der Aa y jeperson, L. (1998) Detection and identification of wild yeast in
lager breweries. International Journal of Food Microbiology. 43:205-213.
Longo, E., Cansado, J., Agrelo, D. y Villa, T.G. (1991). Effect of climatic conditions on
yeast diversity in grape musts from northwest Spain. American Journal of Enology. 42,
141-144
51
Morata, A., Caldern F., Gonzlez, M.C., Varela, F., Colomo., Uthurry C y Sarez J.
(1999) Primeros Criterios de Seleccin de Levaduras para la Vinificacin en tinto.
Jornadas Cientficas 99, realizado del 17-19 de mayo de 1999
Mas A., Torija M. J., Beltrn G., Novo M., Hierro N., Poblet M., Rozs N y Guillamn
J.M. (2002) Seleccin de levaduras. Tecnologa del vino 39-44
Mesas, J.M.; Alegre, M.T. (1999) El papel de los microorganismos en la elaboracin del
vino. Ciencia y Tecnologa de los Alimentos 2, 174-183
Osho, A. (2005) Ethanol and sugar tolerance of wine yeast isolated from fermenting
cashew apple juice. African Journal of Biotechnology 4(7), 660-662
Poblet, M.; Rozs N.; Ruiz, A.; Reguant, C., Beltrn G., Torija, M.A., Guillamn J.M.,
Bordons, A., Mas, A. (1999) Seguimiento e identificacin de los microorganismos
presentes durante la elaboracin de vinos. Enologa.
Querol A., Barrio E., Huerta T. y Ramn D. (1992) Dry yeast strain for use in
fermentation of Alicante wine: Selection and DNA patterns. Journal of Food Science.
57, 183-185
52
Ramos, P. Proyecto de ley 3685. Ley que declara de inters nacional el cultivo de la vid
y de la produccin de uvas y derivados, promoviendo su tecnificacin para mejor
aprovechamiento (2002) Congreso de la Repblica. Per.
Regondn, J.A., Prez, F., Valds, M.E., De Migue, C. And Ramrez, M. (1997) A
simple and effective procedure for selection of wine yeast strains. Food Microbiology
14, 247-354
Redzepovic S., Orlic S., Sikora S., Majdak A. and Petrorius I.S. (2002) Identification
and characterization of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus strains
isolated from Croatian vineyards. Letter in Applied Microbiology 35, 305-310
Ribreau-Gayon, P., Dubourdieu, D., Donche B., and Lonvaud A. (2006) Cytology,
Taxonomy and Ecology of Grape and Wine Yeasts. Handbook of Enology: The
Microbiology of Wine and Vinifications 1, 1-52.
Rodrguez L.A., Abad, D., Gomez, J, Casanova, J.B. y Lema, C. (1998) Fenotipo Killer:
Distribucin en las comarcas de la Ribeira Sacra en las poblaciones de Saccharomyces
cerevisiae. Food Technology 2(1), 33-37
Sangorrn M.P., Zajonskovsky I.E., Lopes C.A., Rodrguez M.. Giraudo de van Broock
(2001) Killer behaviour in wild wine yeast associated with Merlot and Malbec type
must spontaneously fermented from Northwestern Patagonia (Argentina). Journal Basic
Microbiology 2, 105-113
53
Satora P. and Tuszunski T. (2005) Biodiversity of yeasts during plum Wegierka Zwykla
spontaneous fermentation. Food Technol. Biotechnology 43, 277-282
Shane Gold R., Meagher M M., Hutkins R. and Conway T. (1992) Ethanol tolerance
and carbohydrate metabolism in lactobacilli. Journal of Industrial Microbiolgy 10, 4554.
Schutz M., Gafner J. (1993) Analysis of yeast diversity during spontaneous and induced
alcoholic fermentations. Journal of Applied Bacteriology 75, 551-558
Ubeda J.F., Briones A.I. and Izquierdo P.M. (1998) Study of the oenoilogical
characteristics and enzymatic activities of wine yeasts. Food microbiology 15, 399-406
Valente P., Ramos J.P. and Leoncini O. (1999) Sequencing as a tool in yeast molecular
taxonomy. Canadian Journal of Microbiolgy. 45, 949-958
Vazquez F., Figueroa L. y Toro M.E. (2000) Food Microbiology Protocols. Chapter:
Selection of wine yeast by means of oenological characteristics. Edited by Spencer and
Raogut de Spenser Humana Press - Totowa, New Jersey
54
Zagorc T., Marz A., Cadez N., Povhe Jemec K., Pter G., Resnik M., Nemanic J. and
Raspor P. (2001) Indigenous wine killer yeast and their application as a starter culture in
wine fermentation. Food Microbiology. 18, 441-451
55
ANEXO A
PROTOCOLOS
56
CACHINA
MUESTRA
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
9 ml de
solucin salina
estril (0.85%)
57
3 ml
10 ml de
caldo A
+ 0 ml etanol
0% etanol
3 ml
9,6 ml de
caldo A
+0,4 ml etanol
4% etanol
3 ml
9,2 ml de
caldo A
+ 0,8 ml etanol
8%etanol
3 ml
9 ml de
caldo A
+1 ml etanol
10%etanol
3 ml
8,8 ml de
caldo A
+1,2 ml etanol
12% etanol
58
5ml
YPG
2%Glu
YPG
10%Glu
YPG
15%Glu
YPG
20%Glu
YPG
25%Glu
59
A
Incubar a 30 C por
24 horas.
A partir de un cepario
slido inocular el
cultivo a un caldo
lquido YPG pH 5.5
Realizar pasaje de 24
horas de crecimiento.
Obtener cultivos
activos de 24
horas. Posibles
productoras (A)
B
Agregar cultivo a un
nuevo caldo YPG
pH 5.5 y medir la
D.O. = 0.2 (560 nm)
560 nm
0.2 A
60
61
ANEXO B
MEDIOS DE CULTIVOS
62
A. MEDIOS DE CULTIVOS:
1. AGAR YPG (Yeast Extracte Pectone Dextrose)
Extracto de Levadura .......5.0 gr/L
Peptona de carne.10.0 gr/L
Glucosa...20.0 gr/L
Agar .......18.0 gr/L
Ajustar el pH a 5.5
Esterilizar por 15 minutos a 121C
Para el aislamiento de Levaduras.
2. YEPD lquido
La misma composicin que el medio anterior, pero sin agar.
63
Ajustar el pH a 7.0
Esterilizar por 15 minutos a 121C
7. AGAR ACETATO
Acetato de Potasio 1%
Extracto de Levadura 0.25%
Glucosa. ..0.1%
Agar 1.8%
pH 7.5- 8.0
Licuar el medio
Autoclavar a 121C por 15 minutos.
Colocar los tubos es plano inclinado
64
B. REACTIVOS:
1. INDICADOR PRPURA DE BROMOCRESOL
Prpura de Bromocresol .0.04 gr
Agua destilada .......................................................1000 ml
NaOH 1N....... 1 gota
pH = 7.0
*Dejar 24 a 48 horas antes de su uso
2. AZUL DE METILENO
Azul de metileno..........0.3 gr.
Etanol al 95 %...............30.0 ml
Agua destilada................100.0 ml
65
II Agente decolorante
H2SO4 acuoso al 1 %
III Solucin de Azul Metileno
-
66