Separacion De Fosfolipidos y Determinacion

De Colesterol
Instituto Politcnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas
Departamento de Bioqumica
Prctica 8 Separacin de fosfolpidos por cromatografa en capa fina y
determinacin de colesterol en yema de huevo

INTRODUCCIN
Los lpidos son compuestos de origen biolgico que se disuelven en
compuestos no polares como el cloroformo o el dietil ter y se clasifican en
compuestos y simples. Los lpidos compuestos contienen cidos grasos por
lo que son saponificables.
Los lpidos simples esteroides son derivados del isopreno y no son
saponificables. Entre ellos se encuentran el colesterol, hormonas sexuales,
cidos biliares y algunas vitaminas. Son molculas cclicas.
El colesterol es uno de los esteroides ms abundantes y se asla de la
extraccin de casi todos los tejidos animales. Se encuentra distribuido
ampliamente en el cuerpo humano, pero an no se conocen todas sus
funciones biolgicas y es esencial para la vida; sin embargo, no es necesario
ingerirlo en los alimentos porque el cuerpo sintetiza la cantidad adecuada.
OBJETIVOS
* Separar fosfolpidos de la yema de huevo por cromatografa en capa fina.
* Comparar las ventajas de dicha tcnica con la cromatografa en papel.
* Determinar la concentracin de colesterol en la yema de huevo por el
mtodo de Lieberman-Burchard.
Imagen2. Placa con revelador de NINHIDRINA. (Grupos amino)
Imagen 1. Placa expuesta con cristales de YODO. (Dobles enlaces)
RESULTADOS
Tabla 1. Valores de los Rf de fosfolpidos.
Frente de la mancha: 5.4 cm |
MOLIBDATO |
| Recorrido | RF |
Mancha 1 | 0.9 | 0.16 |
Mancha 2 | 1.3 | 0.24 |
Mancha 3 | 2 | 0.37 |
Mancha 4 | 3 | 0.55 |
Mancha 5 | 3.9 | 0.72 |
YODO |
Mancha 1 | 2.4 | 0.44 |
Mancha 2 | 3.7 | 0.68 |
Mancha 3 | 4.7 | 0.87 |

NINHIDRINA |
Mancha 1 | 1.5 | 0.27
Mancha 2 | 3.5 | 0.64
BISMUTO |
Mancha 1 | 0.7 | 0.13
Mancha 2 | 2 | 0.37 |
Mancha 3 | 2.9 | 0.53

|
|
|
|

ESQUEMA DE PLACAS OBTENIDAS

Imagen 4. Placa con revelador de BISMUTO. (presencia de colina)
Imagen 3. Placa con revelador MOLIBDATO. (Fosfolpidos en general)
Clculos
ABS
Concentracin de colesterol
Interpolacin: Gallina---67g ABS (0.300) Pata---47g ABS(0.212)
20g---0.25ml 40g---0.50ml 60g---0.75ml 80g---1.0 ml 100g---1.25 ml
0.082 0.178 0.268 0.369 0.605

Pata
Gallina
47g---5l 235000g---25000l = 235 mg /yema
67g---5l 335000g---25000l = 335 mg /yema
DISCUSIONES
Realizamos 4 cromatografas de la misma muestra de huevo porque solo de
esta forma identificamos mayor variedad de fosfolpidos presentes en la
yema dndose a conocer mediante la aplicacin de diferentes tipos de
reveladores. La prueba de molibdato presenta el mayor nmero
deinterpretaciones debido a que es una prueba general para fosfolpidos y
se visualiza con manchas de color azul; podramos decir que solo para este
experimento nos bastara aplicar solamente el revelador molibdato porque
cubre todas las expectativas; sin embargo, la fosfatidil serina y la fosfatidil
colina no se llegan a separar por completo, por lo que se tendran que
realizar otras pruebas para evitar confusiones. Otro punto importante a
aclarar es que la mancha que representa a lpidos neutros como el
colesterol no presenta el color azul caracterstico de la prueba sino se
expresa una tonalidad plida y amarillenta.
La prueba de ninhidrina es especfica para fosfolpidos que presenten
grupos amino y es positivo con manchas de color violeta solo para fosfatidilserina y fosfatidil-etanol-amina. En cuanto a la prueba de Yodo, ste nos
permiti visualizar de color caf lpidos con dobles enlaces dando positivo

para lpidos neutros ( en este caso el colesterol), fosfatidiletanolamina y

lecitina. La esfingomielina posee solamente un doble enlace en la primera
cadena hidrocarbonada pero dio negativo, probablemente sera por la
cantidad de muestra que no es suficiente para ponerlo de manifiesto,
adems de que sus cadenas con ms largas con respecto a los dems.
Finalmente, se trabaj con el revelador Bismuto, que nos permitie observar
fosfolpidos que presenten colina en su estructura con machas anaranjadas,
y encontramos a la isolecitina, esfingomielina y lecitina como lo
esperbamos.
Analicemos ahora la concentracin de colesterol en yema de huevo. Segn
el Instituto del huevo, se maneja una concentracin promedio de 200mg/
unidad de colesterol para loshuevos en general. En otras fuentes se
encontr que la concentracin es mayor en el huevo de pata que en el de
gallina (680mg/unidad y 246mg/unidad respectivamente). Las
concentraciones de colesterol que obtuvimos en nuestra grfica nos dicen lo
contrario, ya que obtuvimos mayor concentracin en la yema de huevo de
gallina, y la diferencia entre las dos muestras es solo de 100 mg/yema. Para
justificar un mayor valor en la yema de gallina sugiero que tal vez existi
alguna falla a la hora de preparar los tubos para la curva tipo de
concentracin de colesterol porque se trabaj con cloroformo que se
volatiliza muy rpido, y con anhdrido actico que en cualquier momento se
pudo hidratar. Otro posible error sera en la preparacin de estndar de
colesterol. Cabe destacar que a pesar de ste factor, los valores estn
alrededor del promedio estndar de colesterol (335 mg/yema en huevo de
gallina y 235 mg/yema en huevo de pata).
CONCLUSIONES
* Se separaron fosfolpidos de la yema de huevo de gallina y de pata por el
mtodo de cromatografa en placa fina.
* Se compar la estructura de algunos fosfolpidos presentes en la yema de
huevo y se diferenciaron entre s por medio de diferentes reveladores.
* Se determin la concentracin de colesterol presente en la yema de huevo
y pata por el mtodo de Lieberman-Burchard.
* La concentracin de colesterol presente en la yema de huevo de gallina es
de 335 mg/yema y en la de pata de 235 mg/yema (segn nuestros
resultados).
BIBLIOGRAFA
* www.institutohuevo.com/
* http://equilibriodinamico.es/?page_id=81
* Graham Solomons, T.W. Qumica Orgnica. Limusa Wiley, pp 1260 a 1271.
(2007
Prctica 8
Separacin de fosfolpidos por cromatografa en capa fina y
determinacin de colesterol en yema de huevo.

Acosta Caudillo Aracely, Galvn Lpez Rafael.

Seccin 4. Grupo: 3IV1.
Introduccin:
Los fosfolpidos son anfipticos, esto es que son simultneamente
hidroflicos e hidrofbicos. La "cabeza" de un fosfolpido es un
grupo fosfato cargado negativamente y las dos "colas" son cadenas
hidrocarbonadas fuertemente hidrofbicas.
En las membranas celulares juegan un papel muy importante, ya
que controlan la transferencia de sustancias hacia el interior o
exterior de la clula. Una de las caractersticas de los fosfolpidos
es que una parte de su estructura es soluble en agua (hidroflica),
mientras que la otra, es soluble en lpidos (hidrofbica). La parte
hidroflica es en la que se encuentra el aminoalcohol o base
nitrogenada. Esta caracterstica estructural hace posible que los
fosfolpidos participen en el intercambio de sustancias entre un
sistema acuoso y un sistema lipdico, separando y aislando a los
dos sistemas, a la vez que los mantiene juntos.
En medio acuoso las colas de los fosfolpidos tienden a disponerse
en manera tal de formar un ambiente local hidrofbico. Esto deja a
los grupos fosfatos "de cara" al ambiente hidroflico. Existen tres
estructuras que los fosfolpidos pueden formar en razn de
naturaleza anfiptica.
Objetivos:
Separar los fosfolpidos de la yema de huevo por medio de
cromatografa en capa fina.
Comparar las ventajas de esta tcnica de separacin con la
cromatografa en papel.
Determinar la concentracin de colesterol en la yema de huevo por
el mtodo de Lieberman-Burchard.
Resultados:
Prueba de Molibdato

Prueba de Yodo

Prueba de Ninhidrina
Prueba de Bismuto

Prueba
|

| cm frente de disolvente

Molibdato | 4.5 | 5.4 | 0.833

| 3.8 | | 0.703

| 3.2 | | 0.592

| 1.8 | | 0.333

Yodo | 3.4 | 5.4 | 0.629

| 2.8 | | 0.518

| 2.0 | | 0.370

|1

| | 0.185

| 0.5 | | 0.092

| 1.4 | | 0.259

Bismuto

| 3.1 | 5.4 | 0.574

| 2.9 | | 0.537

| 1.7 | | 0.277

| 0.4 | | 0.074

| Rf

Ninhidrina | 3.75| 5.4 | 0.694

| 2.6 | | 0.481

| cm frente de soluto

La tabla muestra la relacin de frentes obtenidas en cada una de

las cromatoplacas de las diferentes puebas que se le realizaron al
extracto de fosfolpidos de la yema de huevo.
Fosfolpido | Rf
|

| Molidato | Bismutocolina | Ninhidrina(-NH2)

Lifosfatidil colina

| 0.17| +

|+

|-

Esfingomielina

| 0.26| +

|+

|-

Fosfatidilcolina

| 0.33| +

|+

|-

|-

|+

Fosfatidil etanolamina | 0.71| +

|-

|+

Lpidos neutros | 1.0 | -

|-

Fosfatidil serina | 0.33| +

|-

Esta tabla
muestra lo valores de Rf conocidos de algunos fosfolpidos.
a 640nm
a 640nm
Masa g
Masa g

Interpolando en la curva tipo obtuvimos que de masa es igual a 98

microgramos as que con esto hacemos una relacin para saber
cuanto obtuvimos de nuestro filtrado.
98g----5x10-3ml
x----7ml
X= 137200g de colesterol
Pasando este valor a mg tenemos un valor de 137.2mg, este valor
representa la cantidad de colesterol que hay en media yema, as
que tenemos que en una yema completa hay 274.4 mg de
colesterol.
De datos tericos se tiene que en una yema de huevo de gallina se
encuentran de 210-270 mg de colesterol.
Discusin de resultados:
De acuerdo a los valores de Rf ya conocidos, las coincidencias
encontradas con el experimento realizado en la prctica nos indican
que la yema de huevo tiene fosfatidilcolina y fosfatdiletanolamida,
esto nos lo revelo la prueba de molibdato y el bismuto nos revel la
presencia de esfingomielina y la ninhidrina revel la presencia de
esfingomielina, tambin se tuvo la presencia de lpidos neutros que
corrieron con el disolvente.
Conclusiones:
La cantidad de colesterol contenida en un huevo aproximadamente
es de 274.4 mg que es un valor muy acercado al de bibliografa, as
mismo pudimos comprobar que la yema de huevo contiene
fosfatidilcolina, fosfatdiletanolamida, esfingomielina y
esfingomielina.
Separacin de fosfolipidos por cromatografa en capa fina.Los lpidos son
biomolculas orgnicas insolubles en el agua que pueden extraerse de las
clulas y de los tejidos mediante disolventes no polares, por ejemplo, el

cloroformo, el ter o el benceno. Existen diferentes familias o clases de

lpidos, pero las propiedades distintivas de ellos derivan de la naturaleza de
la cadena hidrocarbonada de la porcin principal de su estructura. Los
lpidos desempean diversas funciones biolgicas importantes:
* Como componentes estructurales de la membrana
* Como formas de transporte y almacenamiento del combustibles
catablicos
* Como cubierta protectora sobre la superficie de muchos organismos
Los lpidos se han clasificado en simples y complejos.
Los lpidos simples no contienen cidos grasos por lo que nos son
saponificables y se dividen en terpenos, prostaglandinas y esteroides.
El colesterol es el esterol ms comn y es un compuesto clave en la sntesis
de cidos biliares, hormonas sexuales, hormonas corticosuprarrenales y
vitamina D. se encuentra en los tejidos corporales y en el plasma sanguneo
de los vertebrados. Se presenta en altas concentraciones en el hgado,
mdula espinal, pncreas y cerebro.
Anlisis de la tcnica
En la obtencin de fosfolpidos de la yema de huevo:
El cloroformo-metanol separa las protenaspresentes en la yema del huevo
de los lpidos y carbohidratos que contiene este, el hielo se utiliza debido a
que el solvente utilizado es muy voltil y el hielo ayuda a que no se
volatilice.
El KCl utilizado es un lavado que se realiza para eliminar aminocidos y
pptidos.
Se deja reposar para separar en dos fases la fase acuosa queda arriba y en
esta fase se van algunos pptidos y aminocidos que persistieran en la
mezcla, la fase organica contiene los fosfolpidos de la yema de huevo.
Objetivo:
* Separar los fosfolpidos de la yema de huevo por medio de cromatografa
en capa fina.
Resultados
RF a la relacin existente entre la distancia recorrida por el compuesto y la
recorrida por el disolvente en el mismo tiempo, es decir:
RF= (distancia recorrida por el compuesto)/(distancia recorrida por el
disolvente)
Tabla de rf de yema de huevo de gallina |
| Molibdato | Yodo | Ninhidrina | Bismuto |
Lpidos neutros | Rf =0.65.1 =0.11 | Rf =0.85.4 =0.14 | ----- | ----- |
Fosfatidil-etanol-aminaFEA | Rf =1.25.1 =0.23 | Rf =1.95.4 =0.35 | Rf =25.5
=0.36 | ----- |
Fosfatidil Serina | Rf =1.95.1 =0.37 | Rf =2.15.4 =0.38 | Rf =3.95.5 =0.70 |
----- |
Fosfatidil Colina | Rf =2.85.1 =0.54 | Rf =2.75.4 =0.5 | ------ | Rf =0.75.4
=0.12 |

Esfingomielina | Rf =3.85.1 =0.74 | Rf =3.75.4 =0.68 | ----- | Rf =1.55.4

=0.27|
Lisofosfatidil Colina | Rf =4.35.1 =0.84 | Rf =55.4 =0.92 | ----- | Rf =2.35.4
=0.42 |
Tabla de rf de yema de huevo de pata |
| Molibdato | Yodo | Ninhidrina | Bismuto |
Lpidos neutros | Rf =0.55.2 =0.09 | Rf =0.65.4 =0.14 | ----- | ----- |
Fosfatidil-etanol-aminaFEA | Rf =1.95.2 =0.36 | Rf =15.4 =0.35 | Rf =2.15.5
=0.38 | ----- |
Fosfatidil Serina | Rf =2.15.2 =0.40 | Rf =1.75.4 =0.38 | Rf =3.65.5 =0.65 |
----- |
Fosfatidil Colina | Rf =2.75.2 =0.51 | Rf =2.75.4 =0.5 | ------ | Rf =0.75.6
=0.125 |
Esfingomielina | Rf =3.25.2 =0.59 | Rf =3.75.4 =0.68 | ----- | Rf =1.75.6
=0.30 |
Lisofosfatidil Colina | Rf =45.2 =0.76 | Rf =4.85.4 =0.92 | ----- | Rf =2.95.6
=0.51 |
Resultados
Referencia
* LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUMICA /Michael M. Cox, David L. Nelson/
EdicionesOmega /1264 pginas
Discusin de resultados:
Por la cromatografa de la yema realizamos diferentes pruebas para
determinar algunas caractersticas de los fosfolpidos separados como:
Prueba de molibdato: El reactivo reacciona con el grupo fosfato por lo que
esta prueba identifica a los fosfolpidos en general por lo que todas las
manchas en la placa dieron positivas solo la de los lpidos neutros no.
Prueba de bismuto: esta prueba identifica fosfolpidos que contienen en su
estructura colina y los tie de color amarillo-naranja