Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Resumen
El objetivo de este trabajo es obtener inulinasas a partir de inulina mediante la
fermentacin con Klyveromyces marxianus bajo las condiciones (medio aerobio y pH 5.5),
se incub durante 12 hrs en un agitador orbital a 200 rpm y a una temperatura de 30C.
Se llev a cabo la identificacin del microorganismo K. marxianus por la tcnica de tincin
de Gram esto para corroborar que est presente dicho microorganismo en la
fermentacin, por otro lado se llev a cabo una serie de mtodos para esta fermentacin
uno de ellos fue la determinacin de azucares reductores esto con la ayuda del mtodo de
colorimetra DNS; as como la determinacin de protenas utilizando el mtodo de Lowry,
tambin se emplearon metales Mg 2+ y Cu2+ como cofactores pudiendo actuar como
activadores o inhibidores para la produccin de inulinasas. Por ltimo se realizo la
determinacin de DNA mediante PCR punto final.
Palabras claves: Klyveromyces marxianus, Inulinasas, inulina y fermentacin.
Abstract
The objective of this study was to obtain inulin from inulinases by fermentation with
Klyveromyces marxianus under conditions (aerobic medium and pH 5.5), incubated for 12
hrs in an orbital shaker at 200 rpm and a temperature of 30 C. Was conducted organism
identification K. marxianus by Gram staining technique to corroborate this said
microorganism fermentation, on the other hand held a number of methods for this
fermentation one of them was the determination is present reducing sugars with the help
of this method DNS colorimetry; and protein determination using the Lowry method, metals
Cu2 + and Mg2 + as co-factors were also employed may act as activators or inhibitors for
the production of inulinases. Finally determining endpoint DNA by PCR was done.
Keywords: Klyveromyces marxianus, Inulinases, inulin and fermentation.
Introduccin
Objetivos Especficos
de
Materiales y Mtodos
Preparacin del medio de fermentacin
La fermentacin se llev a cabo en un medio
aerobio en un matraz Erlenmeyer de 150 mL
El contenido del medio de cultivo fue:
Inulina
11 g
Mg.SO4. 7 H2O
0.33 g
NH4cl2
3.85 g
kH2PO4
1.1 g
Extracto de levadura 1.65 g
pH
5.5
Se incub durante 12 hrs en un agitador orbital a
una temperatura de 30C con una agitacin de
200 rpm. Se inculo 7 mL del medio al matraz
Erlenmeyer en el que se llev a cabo la
fermentacin. (Cortes, 2013)
Se guard en un tubo eppendorf 1mL de inculo
para la extraccin del DNA.
Azucares reductores
muestra
abs
0
2
4
6
8
10
12
0.213
0.411
0.528
0.612
0.696
0.963
0.681
concentracin
g/ml
actividad
enzimtica
U
56.0639316
108.169195
138.958668
161.063932
183.169195
253.432353
179.221826
0
7.5
9.63
11.17
12.7
17.58
12.43
del
cido
3,5
actividad
especfica
mol/min
x
mg
0
470.51
522.6
390.96
556.77
577.52
553.18
Determinacin de protenas
2.
Centrifugar a 12,000 rpm por 2 minutos y
eliminar el sobrenadante.
3.
Resuspender las clulas en 293 l de
EDTA 50 Mm.
4.
Agregar 7.5 l de liticasa y mezclar
suavemente con pipeteo.
5.
Incubar la mezcla a 37 C durante 60 min
(mezclando cada 20 min).
6.
7.
Centrifugar a 12,000 rpm y desechar el
sobrenadante.
8.
Adicionar 300 l de solucin de lisis
nuclear.
9.
Agregar 100 l de solucin de
precipitacin de protenas y agitar en vrtex por
20 seg.
10.
11.
12.
Transferir el sobrenadante a un tubo de
1.5 ml que contenga 300 l de isopropanol.
13.
Mezclar por inversin hasta ver las
hebras de DNA.
14.
15.
Agregar 300 l de etanol e invertir el
pellet varias veces.
16.
Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min y
decantar el sobrenadante. Dejar el tubo drenado
sobre papel absorbente por 15 min.
17.
DNA.
18.
Agregar 1 l de Rnasa e incubar a 37C
por 15 min.
19.
Crecimiento
Actividad enzimtica
Curva de crecimiento
muestra
Abs
0
0.779
2
0.886
4
1.379
6
1.728
8
1.96
10
2.098
12
1.258
Metales
Contro
l
12.43
inhibidor
activador
1
mM 5 mM 1 mM 5
Cu
Cu
Mg
mM
Mg
6.85
8.62
13.76
13.6
5
Discusin
Comparacin
Conclusin
de
inulinasa por
Kluyveromyces
8. Nuez
de
Castro,
Pirmide, Madrid, 2001.
Enzimologa,
Referencias
Maggi, produccin
levaduras
de
marxianus.2010.
Presencia de Organismos
Genticamente Modificados en
Muestras de Alimentos, obtenido el 08
de diciembre de 2014 de http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/m
anuals/Manual%20ES/Sesi
%C3%B3n6.pdf
Manuel; Colinas-Len,
Ma. Teresa; cobalto como retardante de la