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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS


DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
CURSO BACTERIOLOGIA 001343
GUIA 2. IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS
OBJETIVO GENERAL
Reconocer las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de los Cocos Gram-positivos de
inters en microbiologa.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.
Estudiar las caractersticas ms importantes de los gneros Staphylococcus,
Streptococcus, Micrococcus, Deinococcus.
2.
Realizar las diferentes pruebas utilizadas para la identificacin de gnero y especie
en Staphylococcus y Streptococcus, Micrococcus, Deinococcus.
3.
Distinguir las especies de Staphylococcus y Streptococcus patgenas de las no
patgenas.
INTRODUCCIN
Los cocos grampositivos fueron descritos por primera vez en 1878 por el cientfico alemn
Robert Koch, quien reconoci que un grupo variado de enfermedades eran producidas por
microorganismos con patrones de crecimiento en parejas, cadenas o racimos. Los cocos
grampositivos son bacterias esfricas con un tamao entre 0.5 a 1.8 micras de dimetro.
Son inmviles y poseen metabolismo respiratorio o fermentativo, produciendo cido a
partir de la glucosa, sin produccin de gas. Este grupo de microorganismos forma parte de
la flora normal del cuerpo humano y usualmente son inofensivos, aunque otros son
potencialmente patgenos u oportunistas.
Dentro de los cocos grampositivos se incluyen tres gneros: Micrococcus, Staphylococcus y
Streptococcus. El gnero Staphylococcus, perteneciente a la familia Micrococcaceae, se
encuentra incluido en el Volumen III de la segunda edicin del Manual Bergey de
Bacteriologa Sistemtica, en la seccin de Bacterias Gram-positivas con bajo porcentaje
de contenido en G + C. Las especies del gnero Staphylococcus se observan
microscpicamente como cocos en racimos de uvas, pero pueden disponerse
individualmente, en pares, ttradas o cadenas cortas. Son inmviles, fermentadores de
glucosa, anaerobios facultativos, no forman esporas y son catalasa positivos; normalmente
no estn encapsulados o tienen una formacin limitada de cpsula. El gnero
Staphylococcus est conformado por 48 especies, siendo las ms importantes desde el
punto de vista clnico: S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus.
El gnero Streptococcus, perteneciente a la familia Streptococcaceae, est formado por
cocos grampositivos que se organizan en cadenas cuando crecen en medios lquidos. Son
inmviles, catalasa negativos, no forman esporas y algunas especies poseen cpsula. Son
microaerofilicos con tendencia a la respiracin anaerbica. Su metabolismo es fermentativo
debido a que metabolizan la glucosa con formacin de cidos pero sin produccin de gas.

Se clasifican de acuerdo a su capacidad de producir hemlisis en agar sangre de cordero, a


sus propiedades inmunolgicas (clasificacin serolgica de Lancefield), y la resistencia a
agentes qumicos y fsicos. El crecimiento ocurre usualmente a temperatura de 25 C a 45
C, con un crecimiento ptimo a 37C. Los estreptococos colonizan los animales
vertebrados principalmente en la boca y el tracto respiratorio superior. De las 65 especies
del gnero Streptococcus solo cuatro tienen una importancia clnica significativa:
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptocococcus bovis y Streptococcus
pneumoniae. Hay otras especies de estreptococos menos significativos que se agrupan con
la denominacin de Streptococcus del grupo viridans.
Los especies del gnero Micrococcus, que en el pasado se confundan con estafilococos, no
contienen cidos teicoicos, ni glicina en el puente interpeptdico del peptidoglicano. En el
laboratorio clnico los estafilococos se pueden distinguir fcilmente de los micrococos con
base en su resistencia a la bacitracina (0.004 U), la sensibilidad a la furazolidona y a los
efectos de la lisostafina. Estos microorganismos no fermentadores de glucosa no tienen
mucho inters desde el punto de vista clnico y forman parte de la flora normal cutnea.
PROCEDIMIENTO A SEGUIR EN EL LABORATORIO (DIA 1)
Parte A.
1. Cada grupo de dos estudiantes recibir un cultivo en medio slido (agar sangre) con
una especie del gnero Sthaphylococcus o Streptococcus. Es importante en este paso
observar el tipo de hemolisis de las colonias: alfa, beta o gamma.
2. Realizar coloracin de Gram a partir de una colonia aislada del medio de cultivo y
observar la morfologa al microscopio.
3. Sembrar el microorganismo en la prueba Glucosa OF (caldo con glucosa al 1%),
llevar a incubacin a 37 C y leer a las 48 horas (segundo da de la practica).
4. Realizar la prueba de catalasa, con este fin siga el siguiente procedimiento: a. sobre
una lmina limpia coloque 2 gotas del reactivo de perxido de hidrgeno al 3%, b.
Tome con un palillo de madera o plstico una o dos colonias aisladas de la bacteria
problema y mezcle con el perxido de hidrgeno. La formacin de burbujas (de
aire) es considerada como reaccin positiva.
En esta prueba debe tener cuidado de no arrastrar agar sangre ya que podra
ocasionar falsos positivos.
SI LA PRUEBA DE CATALASA ES POSITIVA SIGA CON EL PASO 5.
SI LA PRUEBA DE CATALASA ES NEGATIVA SIGA CON EL PASO 7.
5. Los cocos Gram-positivos con prueba de catalasa positiva, fermentadores de
glucosa (esperar al da 2 de la prctica para leer esta prueba), sern considerados del
gnero Staphylococcus. Como se dijo en el paso 1 es importante registrar el tipo de
hemlisis que presentan las colonias en el agar sangre.
6. Sembrar el estafilococo en estudio en Agar Baird-Parker, en Agar Salado manitol y
en Agar Sangre para hacer la prueba de la Novobiocina (ver instrucciones mas
adelante). Despus de la siembra llevar los medios de cultivo a incubacin a 37 C
durante 24-48 horas. Tambin debe montar la prueba de DNasa; con este fin el agar
DNA debe ser sembrado con colonias jvenes de estafilococo, en forma uniforme y

en cuadrado sobre un rea de 1 cm2 . El agar DNA utilizado en el laboratorio tiene


incorporado el indicador azul de toluidina O al 0.005%. Despus de incubar el agar
DNA a 37 C durante 18-24 horas, si la bacateria produce DNasa el medio vira de
color azul a rosado (hidrlisis del DNA). Con el fin de ver ms claramente la zona
de hidrlisis del DNA (precipitacin) se agrega sobre el crecimiento bacteriano 1 ml
de una solucin de HCL 1N. La formacin de una zona clara alrededor del
microorganismo indica una hidrlisis positiva del DNA. Debido a la no
disponibilidad de plasma no se montar la prueba de la coagulasa.
7. Los cocos Gram-positivos con prueba de catalasa negativa, fermentadores de
glucosa (esperar al da 2 de la prctica para leer esta prueba), sern considerados del
gnero Streptococcus. Como se dijo en el paso 1 es importante registrar el tipo de
hemlisis que presentan las colonias en el agar sangre.
8. Si el microorganismo problema es beta hemoltico se deben realizar las siguientes
pruebas: susceptibilidad a la Bacitracina, prueba de CAMP, prueba Bilis-Esculina y
prueba de crecimiento en NaCl 6.5%. Incubar las pruebas a 37 C durante 18-24
horas.
9. Si el microorganismo problema es alfa hemoltico debe montar la prueba de
optoquina, sembrar en Bilis-Esculina y en NaCl 6.5%. Incubar las pruebas a 37 C
durante 18-24 horas.
10. Si el microorganismo problema es gamma hemoltico debe montar la prueba de
Bilis-Esculina y NaCL 6.5%. Incubar las pruebas a 37 C durante 18-24 horas.
Parte B.
En forma paralela al trabajo realizado para la identificacin del microorganismo problema,
en el primer da del laboratorio, cada grupo de estudiantes debe realizar un antibiograma
para demostrar la sensibilidad o resistencia del microorganismo problema a determinados
antimicrobianos. Con este fin el estudiante debe preparar una suspensin del
microorganismo en NaCl 0.85 % y ajustar a la escala 0.5 de MacFarland. La suspensin
bacteriana preparada se debe sembrar en forma masiva (cubrir totalmente el medio) con
escobilln sobre el agar Mueller Hinton o agar Mueller Hinton suplementado con sangre,
segn sea el caso de la bacteria en estudio. Despus de la siembra del microorganismo se
colocan los sensidiscos sobre la superficie del medio de acuerdo al criterio del profesor o
profesores y dependiendo de la disponibilidad de los sensidiscos y de las bacterias a
estudiar. Llevar a incubacin, a 37 C durante 18-24 horas, los antibiogramas realizados.
PROCEDIMIENTO A SEGUIR EN EL LABORATORIO (DIA 2). RESULTADOS
Parte A.
El da 2 de la prctica de laboratorio, el estudiante debe leer las pruebas realizadas con el
fin de identificar el microorganismo objeto de estudio. El informe de laboratorio se hace de
acuerdo a las instrucciones dadas en el documento INFORME DE LABORATORIO que
esta colgado en nuestro correo de g-mail. El estudiante esta en la obligacin de discutir los
resultados con los profesores del curso. Antes de finalizar la prctica los profesores deben
hacer una puesta en comn con el fin de mostrar todos los perfiles microbiolgicos y

bioqumicos encontrados en los microorganismos estudiados en todo el grupo.


Parte B.
El da 2 de la prctica de laboratorio, el estudiante debe observar el antibiograma realizado
y determinar con una regla en mm los halos de inhibicin que presentaron las bacterias en
estudio. Se debe incluir en el informe de laboratorio las lecturas de los halos de inhibicin e
informar, de acuerdo a los criterios de interpretacin, si la bacteria en estudio es sensible o
resistente a los antimicrobianos evaluados.
INSTRUCCIONES PRECISAS PARA REALIZAR LAS PRUEBAS
1.

Prueba de Glucosa OF( Oxidacin-Fermentacin). Se utilizan tubos con caldo,


con indicador azul de bromotimol y glucosa al 1%. Con este fin se toman dos tubos
de Glucosa OF y se siembran en profundidad; inmediatamente uno de los dos tubos
se cubre con parafina o aceite mineral estril (1-2ml), y el otro se deja tal como est
(sin cubrir). Despus de llevar a incubacin de 18-24 horas a 37C, se leen las dos
pruebas. El microorganismo es oxidador si el tubo no cubierto cambia a color
amarillo y el tubo cubierto no cambia de color. El micrrorganismo es fermentador si
ambos tubos cambian a color amarillo.

2.

Resistencia a la Novobiocina. Se utilizan discos de 5 microgramos, concentracin


que resulta ser til para identificar S. saprophyticus, ya que es el nico que presenta
resistencia. Para sembrar la bacteria es necesario preparar una suspensin de la
misma a una turbidez 0.5 de la escala Mac-Farland ( OJO esta suspensin tambin
sirve para el antibiograma). Despus de preparada, la suspensin se siembra con un
hisopo de algodn sobre una caja de agar sangre y se coloca un disco de
novobiocina sobre la superficie de la caja ya sembrada. Despus de llevar a
incubacin de 18 24 horas a 37C, se lee la zona de inhibicin. Si la zona de
inhibicin es menor o igual a 16 mm, se considera que la bacteria es resistente a la
Novobiocina.

3.

Prueba de coagulasa en tubo. Hacer una suspensin, de varias colonias obtenidas


de un cultivo de 18 24 horas de incubacin a 37 C, en 0.5 ml de plasma humano
o de conejo citratado fresco. Despus de incubar a 37 C durante 4 horas, observar
la formacin de cogulos. Si no hay cogulos, incubar de nuevo a 37C entre 8 16
horas, observando el plasma cada dos horas. Si el tiempo de incubacin se prolonga
por mas de 18 horas, debe tenerse en cuenta que la formacin de estafiloquinasa por
algunas cepas de S. aureus, puede lisar el coagulo y generar falsos negativos.

4.

Prueba de susceptibilidad a la bacitracina. Debe utilizarse un inculo


concentrado puro de microorganismo ya sea en medio slido o lquido. Despus de
sembrar en un agar sangre, masivamente las colonias en un rea de
aproximadamente de 4 cm X 4 cm, se coloca en toda el rea central el disco de
bacitracina (disco diferencial de 0.04 U). Despus de incubar aerbicamente a 37C
durante 18 24 horas se mide el dimetro de inhibicin del crecimiento alrededor
del disco de bacitracina. Cualquier rea de inhibicin indica la sensibilidad del
microorganismo. Los Streptococcus beta hemolticos del grupo A o Streptococcus
pyogenes son sensibles a la bacitracina, los enterococos beta hemolticos y los
estreptococos betahemolticos del grupo B son resistentes a la bacitracina.

5.

Prueba de resistencia al trimetoprim-sulfametoxazol (SXT): Se utilizan discos


con 1.25 microgramos de trimetropin y 23.75 microgramos de sulfametoxasole. Los
estreptococos del grupo A y B son resistentes al SXT.

6.

Prueba de CAMP: Es una prueba utilizada en la identificacin presuntiva de


Streptococcus beta hemolticos del grupo B. Los estreptococos del grupo B
producen una sustancia llamada factor CAMP que intensifica la hemlisis producida
por los Staphylococcus aureus productores de beta lisina en agar sangre de cordero
o buey desfibrinada. Para realizarla, se siembra perpendicularmente en agar sangre
(sin tocarse) la bacteria problema de Streptococcus beta hemoltico con respecto a la
cepa de Staphylococcus aureus subesp. aureus (ATCC 6538 o CMDM 080).
Despus de inocular las dos bacterias se incuba a 37C durante 18-24 horas. La

prueba es positiva si se forma una zona en forma de flecha en la zona de unin de


las hemlisis de los dos microorganismos.

7.

Prueba de Bilis-Esculina: Es una prueba presuntiva para la identificacin de los


Streptococcus del grupo D. Es una prueba muy especfica que se utiliza en tubo o en
placa y se complementa con la prueba de tolerancia al NaCl 6.5%. El medio BilisEsculina se inocula con una colonia de cultivo puro del estreptococo problema y se
lleva a incubacin a 37C en atmsfera del 5% de CO 2 durante 18-24 horas. Si hay
un viraje del medio de claro a oscuro casi negro la prueba es positiva. Es positiva
para estreptococos del grupo D.

8.

Prueba de tolerancia a NaCL 6.5%. Esta prueba es til para diferenciar


Streptococcus grupo D Enterococcus de los Streptococcus grupo D no
Enterococcus. El medio a inocular contiene caldo BHI con NaCl en una proporcin
de 6.5 %. Para realizar la prueba, se inoculan dos o tres colonias del
microorganismo a estudiar, se incuba a 37C durante 24 - 48 horas en atmsfera
aerbica o con 5% de CO2. Si los estreptococos crecen enturbiando el medio la
prueba se considera positiva, y confirma que el estreptococo es del grupo D
enterococo. Si no crece (no enturbiamiento del medio), la prueba es negativa. Los
cultivos negativos deben incubarse hasta 72 horas, y si no hay crecimiento despus
de 48 72 horas la prueba es negativa.

9.

Prueba de la optoquina: Es utilizada para la identificacin de Streptococcus


pneumoniae. El microorganismo a identificar, en estado puro, se siembra
masivamente sobre agar sangre, repartiendo uniformemente el inculo sobre el
medio y colocando encima y en el centro el disco de optoquina. Posteriormente se
lleva a incubacin a 37 C en atmsfera del 5 % de CO 2 durante 18-24 horas.
Cuando se utilizan discos de optoquina de 5 microgramos un halo de inhibicin
mayor o igual a 14 mm indica que la bacteria es sensible (positivo). Si el
microorganismo es sensible a la optoquina, presuntivamente se cree que es
Streptococcus pneumoniae. Esta prueba slo se le realiza a Streptococcus alfa
hemolticos.

PRELABORATORIO DE PRACTICA DE IDENTIFICACION DE COCOS GRAM


POSITIVOS
1.

Investigar el fundamento de cada uno de los medios de cultivo descritos en la


prctica.

Investigar el fundamento de cada una de las pruebas de identificacin descritas en


la gua.

3.

Elaborar un esquema de identificacin para las especies clnicamente ms


importantes de los gneros Staphylococcus y Streptococcus. En el esquema se debe
incluir coloracin de Gram, prueba de catalasa, tipo de hemolisis y todas las pruebas
utilizadas en el laboratorio.

4.

Investigar cuales estreptococos y estafilococos son considerados flora normal y en


que lugares del cuerpo se encuentran.

5.

Investigar las patologas ms importantes producidas por estreptococos y


estafilococos. Indica las especies involucradas en cada caso.

La versin final de este documento se debe al trabajo de los Drs. Alba Alicia Trespalacios y
Fredy Omar Gamboa.