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cellule eccitabili. La polarizzazione della MP dovuta alla concentrazione di diverse specie ioniche ai
suoi capi. Il PdM lo stato di polarizzazione della MP a riposo. Il PdA dato da un segnale elettrico
responsabile della trasmissione delle informazioni lungo le reti di cellule eccitabili (neuroni, cellule
muscolari) con effetti biologici, ad es. contrazione muscolare, attivit cardiaca ecc.
La diversa concentrazione delle specie ioniche suggerisce che la MP si comporti come una barriera
permeabile in maniera selettiva. La permeabilit selettiva della MP responsabile del :
-
PdM a riposo
Na+, Ca2+, Cl- . Questi ioni si trovano anche all interno, per
in concentrazioni molto inferiori, ad es. il Na+ nelle cellule
cardiache e nei neuroni presentano una concentrazione
circa 10 volte maggiore all esterno rispetto all interno della
cellula.
All interno si trovano soprattutto K+,
La polarizzazione dovuta alla diversa distribuzione degli ioni ai due capi della MP.
Una modificazione del PdM a riposo, verso valori pi positivi definita depolarizzazione, verso
valori pi negativi, iperpolarizzazione.
I canali ionici sono alla base del PdM a riposo, ma anche della genesi del PdA e della conduzione
dello stimolo, quindi delle risposte rapide delle cellule eccitabili. Sono proteine integrali di membrana
di natura glicoproteica (presenza di carboidrati sul versante extrac.), che attraversano interamente il
doppio strato lipidico. La loro funzione quella di offrire agli ioni una via di passaggio attraverso la
MP verso l interno o verso l esterno della cellula. Questo si verifica attraverso la loro capacit di :
-
condurre ioni, creando un flusso rapidissimo pari a circa 100 milioni ioni/sec. Tale flusso
non comporta alcuna spesa energetica per la cellula, perch si realizza grazie alle forze
elettrostatiche e ai gradienti di concentrazione presenti sui due versanti della MP.
riconoscere e selezionare gli ioni. Infatti, per ogni specie ionica esiste un tipo specifico di
canale. Ogni tipo di canale si ritrova poi, con piccole variazioni, in tutte le cellule.
Sono proteine allosteriche, quindi, oltre a cambiare conformazione sotto diversi stimoli, hanno anche
una cinetica di apertura e chiusura.
Costituiscono il bersaglio per molti farmaci e tossine. Il loro malfunzionamento pu provocare certi
tipi di malattie, come neurologiche (ad es. sclerosi multipla, sindrome di Guillain Barr = radiolite
acuta in senso distale prossimale, prima vengono colpite le gambe, poi le braccia ecc ) e aritmie cardiache.
non gated o ad accesso variabile o voltaggio dipendenti, che possono passare dallo stato
chiuso allo stato aperto, in risposta a stimoli elettrici, chimici, meccanici.
Alcuni canali presentano un elevata selettivit per una determinata specie ionica, mentre altri si
lasciano attraversare da diverse specie ioniche, ad es. le gap junctions (aspecifici) o i canali
parzialmente selettivi (K+/Na+ ; K+/Na+/Ca++). Per i canali passivi o non gated la selettivit di tipo
meccanico e chimico.
Lo ione attrae delle molecole di acqua intorno a s. Maggiore il
diamentro dello ione, minore sar il campo elettrico creato intorno a
s, perch sar maggiore la distanza dal nucleo. Quindi verr
creata una piccola nuvola di idratazione. Un esempio lo ione K+ il
cui raggio circa 0,13 nm.
Invece, lo ione Na+ pi piccolo, con raggio = 0,09 nm. Allora, in
questo caso verr creata una grande nuvola di idratazione attorno
allo ione perch si crea un campo elettrico forte essendoci pi
vicino al nucleo.
Il campo elettrico una propriet inversamente proporzionale al
raggio dello ione, quindi
raggio maggiore campo elettrico e nuvola di idratazione minore
Le molecole di acqua sono dei dipoli. Ci significa che, sebbene la
molecola elettricamente neutra, al suo interno le cariche sono
tuttavia separate. L atomo di ossigeno attrae, quindi assume
elettroni, l atomo di idrogeno tende a respingerli, quindi a cedere
elettroni. Per questa cratteristica l ambiente che si crea attorno
allacqua polare. I cationi sono attratti dagli atomi di ossigeno, gli
anioni dagli atomi di idrogeno.
l energia che serve perch gli ioni si liberini della nuvola di idratazione molto elevata
improbabile che uno ione dotato di nuvola di idratazione riesca ad attraversare il doppio
strato fosfolipidico della MP
il raggio finale di uno ione dotato di acqua di idratazione diverso dal raggio dello ione visto
come particella singola, perci non detto ad es. che siccome il raggio dello ione Na+ minore
del raggio dello ione K+, riuscir il Na+ ad attracersare il canale per il K +. Quindi, non
possibile considerare che la selettivit si possa basare alle dimensioni di uno ione. In altre
parole, anche se il Na+ pi piccolo del K+, il Na+ non riuscirebbe ad attraversare il canale per
il K+, perch contano le dimensioni finali dello ione, insieme alla sua acqua di idratazione.
Na+???
No! A questa domanda d la soluzione il fenomeno della selettivit chimica con la presenza di un
filtro molecolare all interno dei canali. Al centro del poro (lume) del canale esiste un restringimento
costituito da residui aminoacidici polari (idrofili, quindi, carichi negativamente) capaci di legare lo
ione in modo labile. Lo ione si libera quindi di una parte rilevante delle
molecole di acqua di idratazione e si lega per un tempo brevissimo, meno
di 1sec, al sito specifico del filtro. Il sito specifico ovviamente diverso
per ogni specie ionica e questo determinato dal modo in cui sono
disposte le cariche degli aminoacidi. Ad esempio, uno ione K +, entrato
+
La macromolecola
glicoproteica
costituita
da diverse
che
accidentalmente
in un
canale per il Na
, non potr
legarsi subunit
con la stessa
facilit
agli aminoacidi
poroattraverso
per ragioni
steriche
e quindiglidiioni.
affinit.
circoscrivono
un poro del
idrofilo
il quale
transitano
Alla
Insuperficie
questo modo
il K+ verr
escluso
dal canale.
Alla fine,legati
lo ione
esterna
troviamo
residui
di carboidrati
allaliberato
parte
dalla
sua acqua
di idratazione,
il canale
spinto dal
proteica.
Le subunit
proteicheattraversa
possono essere
identiche
tra gradiente
loro, e in
*NB : i canali passivi, seppur
selettivicaso
per avremo
una specie
ionica
determinata,
restano diverse
semprefra
aperti,
elettrochimico*.
questo
un omo
oligo
mero, oppure
loro e
quindi transitabili dallo ione inquindi
questione.
In questi
canali
il flusso
ionico
determinato
appunto
dal
avremo
un etero
oligo
mero.
Infine,
possibile che
le proteine
gradiente elettrochimico.
Ci sono 3 superfamiglie di canali ionici, quindi 3 superfamiglie di geni codificanti per i canali ionici.
Ogni famiglia sembra essersi evoluta da un unico gene ancestrale per duplicazione e divergenza.
Analogamente, quindi, a quanto accade per le isoforme di un certo enzima, possono essere espresse
delle varianti strutturali di uno stesso canale. Le varianti possono trovarsi in tessuti diversi, ma
anche nello stesso tessuto. Ad es, nei neuroni esistono pi di 12 tipi di canali diversi e ogni tipo si
presenta in molte isoforme che differiscono fra loro :
-
Queste differenze sono dovute all espressione di geni omologhi, ma anche a riarrangiamenti dell m
RNA proveniente dallo stesso gene. Queste varianti sono importanti perch migliorano l adattamento
di ciascun canale alla propria funzione specifica.
chiuso, ma attivabile
Lo stato chiuso non consente il transito di ioni, ma si pu passare allo stato aperto in pochi sec. Il
passaggio si realizza in risposta a determinati stimoli. L attivazione del canale non determina un
flusso continuo di corrente, ma impulsi ripetuti di durata variabile e ampiezza determinata. Questi
segnali di corrente hanno caratteristiche di tipo tutto o nulla e si ripetono con frequenza variabile
(imm. b).
(a)
(b)
(c)
La velocit di transizione di un canale voltaggio dipendente dallo stato aperto allo stato chiuso
dipende dal PdM. La durata dello stato aperto o chiuso dell ordine di qualche millisecondo. Cio il
canale rimane aperto o chiuso per alcuni millisecondi. Il passaggio degli ioni attraverso i canali
avviene per in meno di 1 sec. La cinetica si transizione dallo stato aperto allo stato chiuso e
viceversa dell ordine di 10 sec o meno. Questo d inizio ad una brusca modificazione a gradino
di carattere tutto o nulla. Cio il canale passa da uno stato completamente aperto ad uno stato
completamente aperto.
proteiche
del
canale.
apertura
la Cl
chiusura
regolate (acido
dalla
del
GABA sono
dipendente
sulle
trasmissioni
attraverso la iperpolarizzazione neuronale della cellula post-sinaptica dei neuroni : apertura del
canale che permette il rilascio di ioni cloro nella fessura sinaptica e rende quindi meno eccitabile il
neurone postsinaptico. Questi ioni negativi infatti sovraccaricano il neurone, rendendolo meno
reattivo ad altri neurotrasmettitori che normalmente lecciterebbero).
che
determina
un
cambiamento
della
Lo stato refrattario, pur perdurando lo stimolo che determina l apertura del canale, provocato da
meccanismi diversi da quelli che fanno aprire o chiudere il canale. Quindi, lo stato refrattario pu
essere dovuto a :
-
desensitizzazione, cio il canale ha ricevuto un numero di stimoli troppo elevato a cui non
pi in grado di rispondere. In altre parole, questo pu succedere se i canali ligando
dipendenti vengono esposti a concentrazioni molto alte di ligando. In alcuni casi questo
processo una propriet intrinseca del canale, come ad es. nel caso dello ione Ca ++ che si lega
sul canale dal versante intrac. e ne determna la chiusura del poro. Mentre in altri casi dovuto
alla defosforilzione del canale da parte di una fosfatasi.
inattivazione, significa che un canale voltaggio dipendente in grado di attivarsi solo per un
periodo di tempo determinato, ad es. il canale del Na + si attiva solo per 1msec. Quindi anche se
giungono stimoli appropriati, il canale non si apre. Questo succede perch l ansa intrac. che
connette i domini III e IV rappresenta in realt un cancello. Quando la depolarizzazione si
protrae a lungo, questa ansa si ripiega in modo tale da occludere il versante interno del poro,
rendendo in questo modo il canale inattivo.
Si parla di probabilit di apertura, perch il flusso di ioni attraverso un canale attivato non un
flusso continuo di corrente. E pittosto una succesione di impulsi con ampiezza costante (pA) durata
variabile (alcuni msec) e frequenza irregolare.
Se il canale fosse attraversato da ioni durante tutto il tempo della sua attivazione, la probabalit di
apertura Po = 1. Ma in realt, vale che 0 < Po < 1, perch il canale oscilla sempre tra lo stato schiuso
e lo stato aperto.
Il tempo medio di apertura e di chiusura indica la durata media degli impulsi di corrente (che
corrispondono alle singole aperture del canale) e la durata media degli intervalli tra due aperture
successive (durante le quali il canale chiuso). Lo studio di questi parametri ci informa se per un
valore di Po avremo pi aperture di breve durata o meno aperture di lunga durata.
La conduttanza la capacit del canale di far passare ioni in presenza di una forza motrice
elettrochimica. La forza elettrochimica dipende dalla Vm e dalla Cioni sui due versanti della MP.
Negli anni 60 sono stati condotti studi su membrane
lipidiche artificiali, contenenti canali ionici formati di
gramicidina, un polipeptide ciclico di 15 aminoacidi, che
facendolo dimerizzare e unire le molecole per le due
estremit, si ottiene questo tipo elementare di canale. Con il
metodo del patch clamp (vedi oltre), sviluppato negli anni
70, stato possibile misurare le correnti.
E stato osservato, quindi, che la relazione fra il PdM e il flusso ionico lineare. In altre parole, se
applichiamo un Vm positivo o negativo, lo ione si sposta verso una determinata direzione (dipende
dalla carica dello ione). Se invece il Vm = 0, non c flusso ionico.
I = corrente ionica
Vm = potenziale di membrana
R = resistenza
g = conduttanza
Vm
I canali si chiamano
La conduttanza espressa proprio dalla pendenza della curva I/Vm. Questi
ohmici, perch la loro conduttanza rimane costante e quindi, seguono la 1 legge di Ohm :
I = Vm/R = Vm * g
(R = 1/g,
g = 1/R)
Pi la MP permeabile ad uno ione, cio minore la resistenza dei suoi canali a questo ione,
maggiore sar la sua conduttanza e quindi, la sua capacit di portare il Vm verso il suo potenziale di
equilibrio (vedi oltre).
permeabilit ad uno ione = conduttanza (g) = resistenza (R)
Esiste quindi, per questi canali ohmici, una relazione lineare tra la forza motrice elettrochimica ai
capi della MP e la corrente ionica che attraversa i canali stessi.
La conduttanza della gramicidina g = 12 pS (picoSiemens).
A riposo, lo ione con la maggiore conduttanza lo ione K+.
Bisogna sempre tener presente che :
-
Alcuni canali non si comportano secondo la 1 legge di Ohm, in quanto presentano una conduttanza
non uniforme per i diversi valori di voltaggio. Questo significa che presentano una migliore
conduttanza a certi valori di PdM rispetto ad altri. Consentono quindi alla corrente di fluire pi
facilmente in un verso piuttosto che in quello opposto, quando la direzione del gradiente
elettrochimico si inverte. Questi canali vengono chiamati rettificanti.
Quindi, abbiamo visto che i canali voltaggio dipendenti risultano chiusi quando la MP si trova allo
stato di polarizzazione a riposo (PdM) e si attivano in seguito a sue variazioni. Quasi tutti i canali
voltaggio dipendenti si aprono in seguito ad una depolarizzazione, ma esistono alcuni che si
attivano in seguito ad una iperpolarizzazione. Tutti si attivano solo se il Vm raggiunge un
determinato valore minimo specifico per ogni tipo di canale. Questo valore si chiama soglia di
attivazione. I canali voltaggio dipendenti sono importanti :
-
la liberazione dei NT dalle terminazioni nervose e degli ormoni dalle cellule endocrine
l attivit ritmica spontanea delle cellule segnapassi o pacemaker del cuore e di alcuni
neuroni
Vedremo ora la struttura del canale del Na+, ma in realt tutti i canali (del Na+, K+, Ca++) hanno molti
aspetti strutturali in comune, perch i geni che li codificano sono altamente omologhi fra loro.
1 subunit
1 o 2 subunit : 1 (o 3) e 2. (imm. a)
L attivazione dei canali del Na+ voltaggio dipendenti determina l ingresso nella cellula di ioni Na +.
Le propriet funzionali di questi canali sono :
-
terminale
intrac.
determina
Canali del Ca++ voltaggio dipendenti : sono oligomeri formati da diverse subunit, ad es. 1, , ,
2. Il poro formato anche in questo caso dalla subunit , simile a quella dei canali del Na +, 4
domini omologhi ripetuti, ciascuno formato da 6 segmenti transmembrana S1 S6 ad elica. Il
segmento S4 il sensore del voltaggio, ma l ansa fra S5 S6 non rappresenta invece il filtro di
selettivit.
La subunit si trova nel lato intrac. e contiene un
sito di fosforilazione per le protein kinasi.
Le subunit 2 e sono unite da un ponte S S,
interagiscono con proteine G.
I canali del Ca++ si classificano in base alle loro
propriet in canali a bassa soglia e in canali ad alta
soglia. Vedremo il ruolo di alcuni di questi canali nello
studio dell attivit contrattile del cuore.
Canali del Cl- voltaggio dipendenti : presentano una struttura a doppio cilindro, quindi hanno
due subunit identiche, ciascuna delle quali ha il proprio poro funzionale attraversato dagli ioni.
Ciascuna subunit costituita pi o meno da 17 eliche, di cui non tutte attraversano
integralmente la MP. L attivit dei canali regolata dal pH e dagli anioni extracellulari. Sono
importanti per :
-
Abbiamo gi visto che la polarizzazione della MP allo stato di riposo determinata dalla distribuzione
degli ioni sui suoi due versanti. A PdM 65 mV (neurone) i canali del Na + e del K+ voltaggio
dipendenti restano chiusi. Quindi, i flussi ionici hanno luogo attraverso canali passivi.
A questo punto sorge un altra domanda : fino a che punto pu continuare l uscita degli ioni K+?
La fuoriuscita del K+ determinato dalla forza chimica (concentrazione) crea una polarizzazione della
MP che diventa pi elettro (-) all interno e pi elettro (+) all esterno. Insorge, quindi, una forza
elettrica (determinata dalla polarizzazione della MP) che si oppone a quella chimica.
Inoltre, man mano che lo ione K+ esce, la concentrazione e quindi, la forza chimica, diminuisce.
Invece, la forza elettrica aumenta. Ad un certo punto, queste due forze diventeranno uguali e
opposte. La forza chimica tender a spingere lo ione K + fuori dalla cellula, e la forza elettrica tender
a riportarlo dentro. Questa situazione chiamata equilibrio elettrochimico ed caratterizzata da
un flusso netto dello ione pari a 0.
Il valore di Vm per il quale abbiamo equilibrio elettrochimico diverso per ogni specie ionica e viene
calcolato dall EQUAZIONE DI NERST.
EQUAZIONE DI NERST
Macroglia
-
Astrociti (tamponano leccesso di K+ liberato dai neuroni nei periodi di elevata attivit
assumendoli nelle zone ad alta concentrazione e estrudendoli nelle zone a bassa
concentrazione).
-
Vediamo, comunque, che considerando lo ione K+ otteniamo il valore Vm = 75 mV che diverso dal
valore registrato Vm = 65 mV. Questo succede perch in realt, nei neuroni non solo lo ione K + a
determinare il PdM a riposo, ma anche gli ioni Na + e Cl- per i quali la MP possiede canali passivi.
Abbiamo visto l equazione di Nerst per il calcolo dell equilibrio elettrochimico dello singolo ione. Il
Vm di riposo invece considera la totalit delle specie ioniche e viene calcolato dall EQUAZIONE DI
GOLDMAN KATZ HODGKIN (calcolo di PdM costante).
ENa = + 55 mV, valore molto lontano dal Vm di riposo. Questo valore evidenzia il ruolo del Na + che
quello di depolarizzare la MP, perch indica che raggiunge l equilibrio elettrochimico a + 55 mV. Si
pu pensare che il Na+ dovrebbe entrare massivamente nella cellula visto che :
-
la sua concentrazione extrac. circa 10 volte maggiore rispetto a quella intrac. (forza chimica)
verr attratto dalle cariche (-) che predominano sul lato intrac. (forza elettrica)
Quindi, sia la forza chimica che quella elettrica spingono gli ioni Na + ad entrare (non sono opposte
come per il K+). Ma in realt ci non succede in maniera molto significativa, perch in condizioni di
riposo, la MP altamente permeabile al K+ ma molto meno al Na+, perch possiede un numero esiguo
di canali passivi per il Na +, quindi in condizioni di riposo poco permabile al Na + (circa 25 volte
rispetto al K+).
Anche se la MP non molto permeabile al Na+, questo ione entra nella cellula e man mano rende il
versante intrac. meno elettronegativo. Questa depolarizzazione abbassa la forza elettrica che si
oppone all uscita di K+ e aumenta la forza chimica che spinge il K+ a uscire. Se questo fenomeno
perdura nel tempo, verrebbero alterate le C ioniche e di conseguenza anche la polarizzazione della
MP a riposo.
Questo viene evitato, perch interviene la pompa Na+/K+ - ATPasi. Grazie all
energia fornita dall idrolisi dell ATP, la pompa determina un flusso di ioni
Na+ e K+ contro gradiente elettrochimico. Cio la pompa fa uscire 3 ioni di
Na+ e nello stesso tempo fa entrare 2 ioni K+. In questo modo allontana la
maggioranza delle cariche (+), ripristinando la polarizzazione
della MP al valore di riposo. Praticamente la pompa ha un attivit modesta. In condizioni di riposo il
flusso ionico che determina equivale alla diffusione passiva degli ioni, in modo tale da mantenere la
distribuzione degli ioni ai due versanti che garantiscono il PdM a riposo.
ECl = 60 mV Vm. La concentrazione del Cl- alta a livello extrac. e molto pi bassa a livello intrac.
Nella maggior parte dei neuroni si distribuisce passivamente ai due lati della MP. Praticamente la
sua distribuzione si adegua al Vm, senza contribuire alla genesi del PdM. alcuni neuroni sono dotati
comunque di un trasportatore attivo che genera un flusso di Cl- contro gradiente.
Secondo l EQUAZIONE DI GOLDMAN KATZ HODGKIN (per la maggior parte delle cellule il
contributo del Cl- pu essere trascurato, se PIONE >>> PALTRI IONI GOLDMAN = NERST):
P=
permeabilit
Riassumendo, i fattori che determinano il PdM a riposo e il flusso ionico responsabile della
polarizzazione della MP sono :
1) la differenza di concentrazione degli ioni sui due versanti della MP
2) la permeabilit della MP alle specie ioniche :
a)
b)
c)
PdM a riposo
Se si apre lo stesso numero di canali sia per il Na + che per il K+, la driving force del K+ sar minore
di quella del Na+. Questo succede perch i gradienti chimici dei due ioni sono diversi, quindi, per
spingere il K+ serve una forza inferiore, visto che il suo gradiente chimico a favore della suo
spostamento verso l esterno.
Ix = gx * (Vm Ex)
flusso degli ioni
driving force
La driving force di uno ione dipende anche dal gradiente elettrico, quindi, dalla differenza fra il Vm
e il potenziale di equilibrio di quella specie ionica. Aprendosi ad es., i canali per il Na +, il Vm tende a
raggiungere il ENa. Nello stesso tempo gli ioni K+ tendono ad uscire e spostare nuovamente il Vm
verso il loro EK. Dunque, quando la somma di tutte le correnti ioniche pari a 0, il PdM a riposo.
Circuito equivalente
un modello che deriva dalle propriet dei circuiti elettrici e aiuta a capire comportamento dei
canali ionici :
o
I canali ionici possono essere paragonati a un conduttore. Vengono rappresentati con delle
resistenze elettriche. La resistenza si oppone al passaggio dello ione ed inversamente
proporzionale alla conduttanza. g = 1/R
La forza elettromotrice di ogni specie ionica creata dal suo gradiente elettrochimico ed
rappresentata da una batteria. Se si riferisce ad es, al K + sar pari a EK =
75 mV. La
Possiamo rappresentare tutti i canali passivi della MP in un unico conduttore (resistenza), ad es. per
il K+, gK il cui valore calcolato dall equazione gK = NK *
NK = numero di canali
=conduttanza del singolo canale.
Il PdM viene calcolato disegnando il circuito con tutte le conduttanze, comprese le batterie, unite fra
loro in parallelo.
La tecnica del patch clamp (blocco di area) stata introdotta negli anni 70 e perfezionata nei primi
anni 80 da Erwin Neher e Bert Sakmann (Nobel per la Fisilogia nel 1991).
Con quest tecnica possibile registrare i flussi ionici attraverso un singolo canale. Questo possibile
facendo aderire alla MP la punta (diamentro circa 1 m) di un microelettrodo riempito di soluzione
salina. La punta deve essere perfettamente sigillata alla MP. Tale sigillo si ottiene applicando alla
punta una leggera pressione negativa, praticamente una suzione, fino al punto in cui la resistenza
del sigillo raggiunge valori dell ordine dei gigaohm (109 ). Si parla quindi di gigaseal e di
configurazione cell attached. Sul pezzetto di MP sottostante alla punta del microelettrodo ci sono
pochi canali, quindi, se vogliamo studiarne solo uno, necessario bloccare gli altri. Questo
possibile tramite blocco farmacologico o tramite applicazione di un potenziale che determini
inattivazione dei canali che vogliamo escludere.
A questo punto applichiamo al canale lo stimolo specifico che lo attiva. Tramite un amplificatore
specifico viene mantenuta la V desiderata (voltage clamp) e si registra la corrente unitaria che
fluisce attraverso il canale studiato. L uso dell amplificatore indispensabile, perch senza di esso
il flusso di corrente tenderebbe a modificare la V.
Tramite queste registrazione possibile studiare le propriet funzionali dei canali (conduttanza,
probabilit di apertura, tempo di apertura/chiusura).
Applicando un ulteriore suzione alla MP possibile aportare il lempo della MP sottostante al
microelettrodo, senza danneggiare il sigillo tra pipetta e MP. Questa la configurazione whole cell.
In questa maniera possibile registrare le correnti di tutti i canali che stiamo studiando, presenti
sulla MP, ed escludere (bloccando o inattivando) ovviamente gli altri tipi di canali. Con questo metodo
possiamo studiare l ampiezza delle correnti totali, la cinetica di attivazione e inattivazione e la
voltaggio dipendenza dei canali.
possibile utilizzare l amplificatore per mantenere costanti i flussi di corrente su valori definiti.
Questa la current clamp e permette di studiare le variazioni del PdM spontanee o in risposta a
stimoli specifici.
Il PdA il fenomeno della variazione del PdM, prodotto a livello delle cellule eccitabili in risposta ad
uno stimolo. caratterizzato dalla breve durata e dalla forma stereotipata. un fenomeno
autorigenerativo in grado di propagarsi lungo le fibre nervose senza attenuarsi in modo evidente.
La teoria del PdA stata formulata da Huxley e Hodgkin negli anni 40 (premio Nobel 1963) e rimane
fino ad oggi valida.
Il PdA non si sviluppa in tutti i tipi cellulari, ma solo nelle cellule eccitabili. Le cellule eccitabili sono
i neuroni, le cellule muscolari (scheletriche, miocardiche, lisce) e le cellule endocrine. L eccitabilit
la propriet di queste cellule di produrre impulsi elettrici. Galvani, nel 700, ha realizzato i primi
esperimenti sull elettricit animale, ripetuti a livello della giunzione NM della rana da E. du Bois
Reymond e H. von Helmholtz nell 800. Questi impulsi elettrici, cio i PdA :
sono stereoptipati
Nelle cellule eccitabili uno stimolo adeguato produce una Vm che, se supera un valore critico
(soglia), innesca la generazione del PdA. Perch si sviluppi il PdA la cellula deve avere :
o
Ad es. un fibroblasto esprime canali voltaggio dipendenti sulla MP, ma in quantit molto inferiore,
perci non eccitabile.
Bisogna ora distinguere fra due tipi di segnali elettrici che si possono generare a partire da uno
stimolo : i potenziali elettrotonici (o graduati) e i potenziali d azione.
I potenziali elettrotonici si generano quando lo stimolo non sufficientemente intenso a generare un
PdA. Quindi, la variazione piccola e rimane un evento localizzato, che non si propaga con ampiezza
Caratteristiche del PdA
costante, ma si attenua fortemente. La risposta, quindi, graduata e dipende dall ampiezza e dalla
durata dello stimolo.
1) Si osserva solo nelle cellule eccitabili.
3) Le ampie variazioni del PdM sono provocate da variazioni specifiche e sequnziali della
conduttanza della MP al Na+ e al K+. Le variazioni di concentrazione degli ioni del LIC e
LEC sono minime (<1%) e anche la spesa energetica.
6) Si propaga nello spazio con una velocit compresa tra 1 e 100 m/sec, in modo non
decrementale.
8) un evento stereotipato, si ripete nel tempo e nello spazio sempre con la stessa forma.
Stimolando una cellula eccitabile con stimoli di intensit crescente, per basse intensit non si genera
un PdA, ma solo risposte elettrotoniche, mentre ad un certo punto si genera un impulso. Questo
punto critico corrisponde al valore soglia di potenziale per lo sviluppo di un PdA.
Un evento sotto soglia non efficace, cos il potenziale ritorna lentamente al PdR.
Un evento sopra soglia d origine in modo irreversibile ad un PdA.
Supponiamo di avere uno stimolo sopra soglia. Prima di raggiungere la soglia la depolarizzazione
mediata dai canali passivi del Na+. Dopo che il valore soglia del potenziale sia raggiunto,
intervengono i canali del Na+ voltaggio dipendenti. Si inizia con una leggera depolarizzazione che fa
aprire pochi canali del Na+ voltaggio dipendenti. L ingresso del Na + depolarizza ulteriormente la MP,
evento che provoca ulteriore apertura di altri canali del Na + voltaggio dipendenti. Questo processo
rapidissimo e continua fino al raggiungimento di un valore di potenziale che si avvicina a E Na
=+55mV, ma non diventa mai uguale. Questo succede perch mentre si attivano i canali del Na+ :
a) si aprono canali per il K + voltaggio dipendenti, pi lentamente rispetto a quelli del Na + che
determinano la depolarizzazione, ma comunque permettono al K + di uscire, cos il versante
intrac. diventa pi elettronegativo.
b) I canali del Na+ voltaggio dipendenti iniziano a chiudersi e a inattivarsi prima ancora che
finisca la fase di depolarizzazione. La chiusura sopravviene altrettanto rapidamente come l
apertura.
chiusura, perch se i canali del Na+ non si aprissero e non si chiudessero cos rapidamente, i canali
del K+ non potrebbero prevalere sui primi e determinare la ripolarizzazione della MP e il ritortno ai
valori di riposo.
A riposo PK > PNa motivo per cui il PdR tende verso il EK.
Durante la depolarizzazione iniziano ad aprirsi i canali del Na+ voltaggio dipendenti e diventa
PK << PNa. Ora il PdM tende verso il ENa.
Durante la ripolarizzazione si chiudono i canali voltaggio dipendenti del Na+ e si aprono quelli
del K+, quindi diventa di nuovo PK > PNa e il PdM tende verso il EK e si ritorna a riposo.
In molti neuroni si pu andare incontro ad una iperpolarizzazione tardiva, dopo il PdA, e questo
succede a causa dei canali di K+ che rimangono aperti per un breve tempo dopo che il valore di
riposo sia raggiunto.
A seguito del PdA la MP diventa meno eccitabile e non pu generare nuovi PdA. Questa fase di
minore responsivit a nuovi stimoli si chiama periodo refrattario e in particolare, distinta in
Durante la depolarizzazione ci sono canali del Na + voltaggio
periodo refrattario assoluto (PRA) e periodo refrattario relativo (PRR).
dipendenti sia aperti che inattivati. Verso la fine si
inattivano anche gli ultimi. L inattivazione dura ancora per
un po, mentre si gi sopravvenuta la ripolarizzazione. Per
tutto il periodo di tempo in cui i canali del Na + voltaggio
dipendenti restano inattivi, non possibile in alcun modo
scatenare un nuovo PdA. Questo il PRA. Dura poco pi di
1 1,5 msec.
Terminato il PRA, la MP non ancora completamente
ripolarizzata, ma i canali inattivati del Na+ iniziano a tornare
stimolo molto pi intenso di quello che servirebbe in condizioni di riposo per depolarizzare la MP,
perch restano ancora aperti molti canali del K + che hanno una cinetica di apertura e chiusura pi
lenta rispetto ai canali del Na+. Questo il PRR.
Il periodo refrattario molto utile perch :
1) impedisce il riverbero dei segnali che devono essere propagati verso una sola direzione.
2) limita la fraquenza di scarica di un neurone (o di un nervo) per mantenere costante la forma
e la temporizzazione dei PdA.
La tecnica del voltage clamp, inventata da Cole e Marmot negli anni 40, ci permette di comprendere
meglio il meccanismo delle varie correnti ioniche durante il PdA. Con questa tecnica possibile
portare e mantenere costante il PdM a un valore desiderato, diverso da quello di riposo, e registrare
le diverse correnti per quel valore di PdM.
Tramite questa tecnica si registrano diverse correnti, ma non possibile sapere quale curva
corrisponde ad ogni specie ionica. Per riuscire a definire gli ioni, quindi anche i canali coinvolti
bisogna eseguire esperimenti pi complessi, come gli esperimenti di sostituzione ionica. Si riduce ad
es. la concentrazione di Na+ all esterno, cos si registra soltanto una corrente entrante di Na+, che
riflette l andamento temporale della conduttanza che d origine alla depolarizzazione. L analisi delle
variazioni della conduttanza confermano che :
-
Tetrodotossina (TTX)
Tetraetilammonio (TEA)
TTX
(ma
cocaina,
anche
batraco-
Il PdA si genera nel monticolo assonico e si propaga lungo l assone. La propagazione di stimoli sotto
soglia ha naturalmente un decorso decrescente. La propagazione degli stimoli sopra soglia invece
sembra continuare attivamente, senza un decremento evidente.
Alcuni assoni non sono mielinizzati (vedi oltre) e hanno una distribuzione uniforme di canali Na+ e K+
voltaggio dipendenti. Di conseguenza lo stimolo si propaga punto a punto con la successiva
apertura di canali uno dopo l altro. La direzione di propagazione unica perch i canali appena
aperti si trovano nel PRA, sono quindi inattivi.
Gli assoni mielinizzati si trovano generalmente nei nervi periferici (neuroni motori e sensitivi), mentre
neuroni non-mielinizzati si trovano nel cervello e nel midollo spinale.
Ogni neurone riceve circa 10.000 sinapsi. L attivit sinaptica viene sommata in due maniere :
-
gradienti elettrochimici di certi ioni (forza elettromotrice per la creazione di correnti ioniche)
I neuroni possiedono tre propriet passive importanti per la genesi dei messaggi elettrici :
-
la resistenza dell assoplasma, cio resistenza intrac. dell assone e dei dendriti (RA)
Per tale motivo, una cellula pi piccola si depolarizza pi intensamente e velocemente, mentre una
cellula grande si depolarizza di meno e lentamente. La resistenza inversamente proporzionale alla
superficie cellulare = 4r2 :
Relazioni corrente-voltaggio. Facendo passare nelle cellule impulsi graduati di corrente sotto soglia,
entranti o uscenti, possibile determinare la relazione fra la corrente iniettata nella cellula e le
conseguenti variazioni del potenziale di membrana Vm.
A. L'aumento graduale degli impulsi di corrente entranti o uscenti (A 1) determina variazioni
proporzionali e simmetriche del potenziale di membrana V m (A2). Si noti che le variazioni del
voltaggio hanno un andamento temporale pi lento degli impulsi di corrente.
B. Mettendo in grafico il voltaggio stabile finale osservato contro l'intensit degli impulsi di corrente
iniettati, si ottiene una curva I/V. La pendenza della curva I/V rappresenta la resistenza
d'ingresso del neurone. Nell'esempio riportato, la curva I/V lineare; V m varia di 10 mV per 1 nA
di variazione della corrente, il che corrisponde a una resistenza di 10 mV/1 Na, ovvero di
10 x 106 (10 M).
V = Q/Cin
V = I * t/Cin
I = Q/t
Nel circuito equivalente qu sotto riportato, abbiamo una reistenza e un condensatore messi in
parallelo.
IM = IR + IC
I = Cin * V/t
IR = corrente ionica (ioni che attraversano i canali),
IC = corrente capacitiva (ioni che modificano la carica netta custodita ai capi della MP).
Le due correnti sono complementari.
(A)
(B)
(A) Per studiare gli effetti della capacit della membrana (Cm) sulla velocit di variazione del potenziale
di membrana in risposta al flusso delle correnti, viene impiegato un modello semplificato di circuito
elettrico equivalente. Tutti i canali passivi vengono riuniti in un unico elemento di resistenza (R m). Le
batterie che rappresentano la forza elettromotrice prodotta dalla diffusione degli ioni non vengono
incluse nel modello in quanto modificano soltanto il valore assoluto del potenziale di membrana e non
la sua velocit di variazione.
(B) Il tracciato in alto rappresenta la risposta del potenziale di membrana (Vm) all'applicazione di un
impulso rettangolare di corrente. L' andamento temporale della risposta (linea grigia c) presenta
combinate sia le caratteristiche di un elemento puramente resistivo (linea tratteggiata a), che quelle di
un elemento puramente capacitivo (linea tratteggiata b). Il grafico in basso mostra la corrente totale
della membrana (Im) e le sue componenti ionica (I i) e capacitiva (IC) (Im = Ii + IC) in rapporto con l'impulso
di corrente. Il tempo impiegato a raggiungere il 63% del voltaggio finale rappresenta la costante di
tempo della membrana. In generale, la costante di tempo nei diversi neuroni varia fra 1 e 20 msec.
resistenza : l impulso di corrente uscente, quindi del PdM ai capi della MP cambia
istantaneamente
capacit : il cambiamento del PdM sar lento perch la capacit riduce la velocit di
depolarizzazione
La capacit di ingresso richiede che la MP si carichi, prima che il voltaggio ai capi della MP si possa
modificare. proprio questa carica del condensatore a rallentere la risposta, perch coincide
praticamente con l accumulo o la deplezione di ioni ai capi della MP. La capacit della MP
costante, mentre la resistenza varia da cellula a cellula in base al numero di canali aperti a riposo.
1 e-1 = 0,63
Oltre alla costante di tempo, esiste un altro parametro importante, la costante di spazio . Misura
lo spazio percorso dalla depolarizzazione lungo il neurite affinch si raggiunga circa il 63% del PdA.
Quindi se lambda grande, la distanza percorsa sar maggiore nell'unit di tempo e quindi la
velocit di propagazione sar maggiore. E viceversa.
La corrente diffonde
verso vie a resistenza
minore
Pi grande la costante di spazio, migliori saranno le propriet del cavo conduttore. Ad es.
assone = 1mm
dendrite = 150 200 m
La costante di spazio d informazioni sulla capacit della cellula di preservare lo stimolo mentre esso
si propaga dal dendrite all assone. Questa capacit dipende da :
-
la struttura isolante
il diamtro del dendrite e dell assone : se grande oppone una bassa resistenza, quindi lo
stimolo si disperde meno e raggiunge a destinazione quasi inalterato
il numero dei canali per unit di superficie della MP : pi canali ci sono e pi lo stimolo si
disperde
L ideale sarebbe un neurone grande dotato di pochi canali perch preserva meglio lo stimolo,
riducendone molto la dispersione.
Sono molto importanti la resistenza assiale al flusso di corrente (Ra) ma anche la resistenza del
materiale che circonda il cavo, quindi della MP dell assone (RM).
Se la MP ha...
che
li
rende
capaci
propagare
il
segnale
di
verso
Le cellule di Purkinjie del cervelletto hanno invece una struttura dendritica molto complessa e con
diametro piccolo. Questo determina una elevata dispersione, ma l enorme numero di sinapsi per
cellula garantisce che gli stimoli giungano al corpo cellulare. Il ruolo delle cellule di Purkinjie del
cervelletto inibitorio (regolazione e coordinazione motoria), quindi non c il bisogno di condurre
stimoli a grande distanza, ma solo fino ai nuclei cerebellari profondi.
segnali
che
giungono
al
corpo
Sommazione spaziale : prendiamo come esempio una cellula con arborizzazione dendritica ricca che
riceve due segnali nello stesso momento, ma su dendriti distanti fra loro.
Se corta, ad es. 0,3 mm, i segnali si disperdono prima di raggiungere il corpo cellulare, quindi
non si possono sommare oppure si sommano ma il segnale si disperde comunque senza superare la
soglia e prima di arrivare al corpo cellulare.
Se lunga, ad es. 1 mm, i segnali percorono pi spazio prima di disperdersi, quindi hanno
maggiore probabilit di sommarsi e di superare la soglia e di conseguenza arrivare al corpo cellulare
prima di disperdersi.
La sommazione temporale e spaziale sono meccanismi molto diffusi nel SNC e stanno alla base dell
elaborazione delle informazioni. Un altro meccanismo utile per il SN, soprattutto il SNP, per
migliorare la propagazione dei segnali la mielinizzazione assonale.
Abbiamo visto che pi elevata la capacit della MP, pi cariche ioniche vengono intrappolate dalla
MP a un particolare voltaggio. Questo furto di cariche rallenta la propagazione degli stimoli.
1 perch riducono la capacit della membrana. Le spire fanno sommare le capacit in serie,
che si sommano cos : 1/CTOT = 1/C1 + 1/C2 +....+ 1/CN e