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TROUBLESHOOTING
DOI: 10.4322/sc.2011.020
ISSN 1984-4433
Resumo
Com os desenvolvimentos recentes em HPLC e a complexidade dos atuais desafios enfrentados pela
tcnica, tem sido mais comum o uso de anlises no modo de eluio em gradiente de fase mvel. O
uso desses gradientes permite, por exemplo, anlises mais rpidas e capazes de separar compostos
com faixas mais amplas de hidrofobicidade do que nas metodologias com eluio isocrtica. Por outro
lado, a utilizao de gradiente mais exigente com a configurao da instrumentao analtica. Essas
configuraes podem ser particularmente crticas em casos de anlise com corridas curtas em UHPLC ou
com o uso de colunas microbore em LC-ESI-MS. Dependendo do tipo de detector e fase mvel utilizada,
volumes muito pequenos de mistura podem provocar excessivo rudo e instabilidades na linha de base do
cromatograma. Pelo contrrio, um volume muito grande do misturador pode acarretar atrasos no efetivo
incio do gradiente e demora no recondicionamento da coluna ao fim da corrida cromatogrfica. Nesse
artigo ser feita uma reviso de algumas particularidades do uso de gradiente, bem como dos respectivos
cuidados e ajustes para se minimizar as possibilidades de falha nesse tipo de anlise.
Palavras-chave
HPLC; UHPLC; colunas microbore; misturador de solvents; volume de atraso do gradiente; instrumentao.
Santos Neto AJ
1 Aspectos gerais
Apesar da maior simplicidade das anlises
com eluio isocrtica em HPLC (aquelas em que
no h variao da composio/fora de eluio da
fase mvel ao longo da separao), diversas aplicaes requerem o uso de eluio em gradiente de
fase mvel. Um exemplo seria a anlise de amostras complexas para as quais se necessita reduzir o
tempo de eluio de compostos que apresentam
alta interao com a fase estacionria da coluna
(sem prejudicar a separao dos analitos menos
retidos presentes na mesma amostra). Anlises
em gradiente exigem instrumentao mais sofisticada e solventes mais puros, causam maiores
problemas na linha de base do detector e so mais
problemticas na transferncia do mtodo entre
diferentes equipamentos. Embora existam essas
complicaes, certas situaes exigem as anlises em gradiente, como amostras com compostos de interesse apresentando fatores de reteno
(k) muito amplos em anlise isocrtica; amostras
contendo interferentes muito retidos e que podem
eluir tardiamente em anlises subsequentes ou
sobrecarregar a coluna; amostras muito diludas e
em solventes fracos, as quais necessitam pr-concentrao na coluna cromatogrfica.
Para a formao de gradientes em HPLC
h duas tcnicas mais comumente empregadas: o gradiente de baixa presso (Low-Pressure
Gradient LPG) usando vlvula proporcional
de mistura precedendo a bomba ou o gradiente
de alta presso (High-Pressure Gradient HPG)
usando dois ou mais dispositivos de bombeamento. Em ambos ocorre a programao da
variao da composio final da fase mvel em
funo do tempo, de maneira a garantir um gradiente de solventes na fase mvel. Obviamente,
se necessrio, tais sistemas podem operar no
modo isocrtico, permitindo uma fcil alterao
na composio desejada para a fase mvel isocrtica. As bombas mais comumente encontra328
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Figura 1 Ilustrao dos sistemas de bombeamento utilizados para a) LPG; e b) HPG. Adaptao feita com
permisso de Dionex (Part of Thermo Fisher Scientific)[2].
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Dimetro
interno (i.d.)
Vazo tpica
LC convencional
3,2-4,6 mm
0,5-2,0 mL/min
LC microbore
1,5-3,2 mm
100-500 L/min
micro-LC (-LC)
0,5-1,5 mm
10-00 L/min
LC capilar (cLC)
150-500 m
1-10 L/min
nano-LC
10-150 m
10-1000 nL/min
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Figura 3 Cromatograma ilustrando as oscilaes inadequadas causadas na linha de base por problemas na
mistura do gradiente (a), em relao a um cromatograma adequado (b). Adaptao feita com permisso de
Dionex (Part of Thermo Fisher Scientific)[2].
Santos Neto AJ
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3 Implicaes da existncia de
volume excessivo
Se um volume inadequadamente pequeno
de mistura pode ser um problema, por outro
lado, um volume muito grande tambm no
Figura 5 Separao isocrtica com metanol:gua (70:30, v/v). Picos 1 a 6: uracila, fenol, acetofenona,
nitrobenzeno, metilbenzoato e tolueno, respectivamente. a) Fase mvel pr-misturada usando apenas uma
bomba; b) Metanol e gua impulsionados por duas bombas e combinados em um misturador em T. c) Metanol
e gua impulsionados por duas bombas e combinados em um misturador completo. Com permisso, a partir
da referncia 4.
Santos Neto AJ
Santos Neto AJ
Figura 7 Comparao entre cromatogramas obtidos por LC-ESI-UV-MS com coluna microbore (1502,1mm,
2,6m). Injees sequenciais de mistura contendo 5 antibiticos. Anlise em gradiente linear de 8 a 30% do solvente B,
retornando a 8% em intervalo de 1 minuto e mantendo-se equilibrado por mais 5minutos, em vazo de 0,15mL/min.
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4 Consideraes finais
A existncia de um misturador efetivo para
a homogeneizao da fase mvel obtida em sistemas cromatogrficos com mltiplos canais de
solventes de extrema importncia em diversas
aplicaes, quer seja usando anlise isocrtica ou
em gradiente, com bomba binria de alta presso ou quaternria de baixa presso. A influncia de uma adequada mistura recai sobre o rudo
da linha de base, permitindo limites de deteco
significativamente melhores para alguns detectores e diversas composies de fase mvel.
Um perfeito ajuste do volume utilizado
para a mistura importante para UHPLC e
LC-ESI-MS, no apenas no sentido de garantir-se uma mistura minimamente aceitvel para a
fase mvel como tambm para evitar grandes
atrasos no gradiente, os quais podem inviabilizar
o desenvolvimento de anlises rpidas, eficientes
e reprodutveis.
Santos Neto AJ
Referncias
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Recebido: 15/11/2011
Aceito: 17/11/2011