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Introduo
A necessidade de se obter informao no decorrer dos
bioprocessos, tem contribudo para o aparecimento e utilizao de uma grande diversidade de tcnicas e ferramentas
concebidas para o efeito. Os dados obtidos no s tm permitido aprofundar o conhecimento dos processos, como
tambm o desenvolvimento de novas estratgias.
Um citmetro de fluxo um sistema constitudo por 5
elementos: fonte(s) de radiao, (lmpada de mercrio
ou laser), uma cmara de fluxo, unidades de filtros pticos
para seleco de um intervalo de comprimento de onda
especfico a partir duma gama espectral mais vasta, fotododos ou fotomultiplicadores para a deteco sensvel e
processamento dos sinais com interesse e uma unidade que
processa os dados recolhidos (Figura 1). A suspenso celular injectada e atravessa a cmara onde se d a passagem
clula a clula atravs do feixe de radiao, perpendicular
ao fluxo. A passagem individual das clulas obtida atravs
da focagem hidrodinmica do fluxo de amostra, sendo esta
injectada no seio de uma soluo salina (sheath fluid) que
tambm atravessa a cmara (Figura 2).
A diferena de velocidades entre os dois fluidos faz com
que o fluxo se processe em regime laminar. A velocidade
de escoamento da soluo de revestimento (sheath fluid)
superior da amostra, e ajustvel, o que permite reduzir e
controlar a espessura da soluo da amostra de forma a que
possa passar uma clula de cada vez. Desta forma, podem
detectar-se at 10000 clulas (eventos) por segundo.
O feixe de radiao de excitao ao interceptar a partcula
(clula) na cmara, sofre disperso quer na direco frontal
(forward scattering), quer lateral (side scattering). A radiao assim dispersa detectada directamente por fotododos
(disperso frontal) ou pode ser desviada a 90 por lentes,
espelhos dicricos e filtros pticos e focada em fotomultiplicadores. A combinao destes tipos de radiao dispersa
revela informaes importantes tais como a dimenso
celular, a granularidade/complexidade e a morfologia.
Compostos intracelulares com fluorescncia intrnseca (ex:
clorofilas, ficobiliprotenas, NAD(P)H, etc.) ou passveis de
se ligarem a corantes fluorescentes (fluorocromos), permitem a diferenciao selectiva de subpopulaes com base
na combinao de vrios fluorocromos. A fluorescncia
destes compostos tambm detectada por fotomultiplica-
Boletim de Biotecnologia
FL3
FL2
FL4
FL1
Fotomultiplicador
Radiao dispersa a 90
Laser
Lentes de Convergncia
Fotododo
Detector de disperso frontal
Cmara de Fluxo
H vrios mtodos de contagem de clulas. O mais utilizado o mtodo de contagem raciomtrico baseado
na adio de uma determinada concentrao de partculas
de referncia (esferas que emitem fluorescncia) amostra.
O volume da amostra analisado pode ser determinado a
partir do nmero de esferas contadas enquanto a amostra
est a passar no citmetro; a contagem das clulas ento
determinada dividindo o nmero de clulas contadas por
este volume. A utilizao do mtodo raciomtrico permite
corrigir tempos mortos e variaes de fluxo que eventualmente possam ocorrer num equipamento que funcione
com diferenas de presso no processamento da amostra.
A maioria dos fabricantes de citmetros de fluxo produz
esferas de contagem de concentrao conhecida para o
Amostra
Sheat Fluid
Cmara de Fluxo
Boletim de Biotecnologia 33
Propriedade Observada
Clulas Saudveis
Clulas Vitais
Clulas Intactas
Clulas Mortas
se torna necessrio detectar e descrever as vrias subpopulaes de forma diferenciada. A citometria de fluxo permite
a avaliao da heterogeneidade de culturas microbianas,
escala da clula individual, no ignorando outras ferramentas importantes tais como a microscopia de varrimento
confocal e a anlise de imagem (Porter et al., 1996). Desta
forma, dados discretos representando subpopulaes
diferentes podem fornecer uma imagem mais detalhada
e real da complexidade e heterogeneidade que ocorre num
determinado bioprocesso (Porter et al., 1996; Rieseberg et
al., 2001). Por estes motivos, esta tcnica tem tido cada vez
mais impacto na comunidade cientfica.
A combinao de vrios fluorocromos em citometria de
fluxo permite a diferenciao de diferentes subpopulaes
numa determinada populao, correspondentes a diferentes nveis de funcionalidade das clulas. Esta diferenciao
levou introduo do termo vivel, mas no culturvel,
aplicado a clulas que no estando metabolicamente
activas, tambm no esto mortas e, evidentemente, no
so reveladas atravs dos ensaios de viabilidade celular. A
utilizao de critrios do funcionamento celular tais como
o potencial da membrana citoplasmtica e a integridade da
mesma, os quais sero descritos adiante em detalhe, permitem caracterizar estes estados metablicos (Nebe-von
Caron et al. 2000).
As clulas de bactrias saudveis so delimitadas por uma
membrana citoplasmtica que lhes permite comunicar
selectivamente com o ambiente que as rodeia. Os sistemas
de transporte activo geram um gradiente electroqumico
que fundamental para o perfeito funcionamento de uma
clula saudvel. O corante fluorescente brometo de etdio
(BE) consegue atravessar uma membrana polarizada, mas
s se liga s cadeias do ADN quando a clula no possui
um sistema de transporte activo no especfico proto/
antiporte. Este sistema quando se encontra activo, expulsa
este fluorocromo da clula (Midgley, 1987). O iodeto de
propdio (IP) tambm se liga s cadeias do ADN, mas
no consegue atravessar uma membrana citoplasmtica
saudvel. Bis-oxonol um corante lipoflico e aninico que
acumula intracelularmente desde que a clula se encontre
despolarizada, como se ver adiante. A utilizao da mistura destes corantes permite a diferenciao dos seguintes
estados metablicos funcionais: clulas saudveis (com
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Espao Extracelular
Hiperpolarizao
Membrana
Despolarizao
Espao Intracelular
b)
Espao Extracelular
Hiperpolarizao
Membrana
Despolarizao
Espao Intracelular
Boletim de Biotecnologia 35
Grupo
Corante
Referncias
Aninicos
Bis-oxonol
DiBAC4(3)
DiSBAC2(3)
DiBAC4(5)
Catinicos
Rodamina
Rh 123
Carbocianinas
DiOC2(3)
DiOC5(3)
DiOC6(3)
DiIC1(5)
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Nmero de Eventos
DiOC6(3)
Figura 4 - (Retirada de Hewitt e Nebe-Von-Caron, 2001) (a) Fluorescncia emitida por clulas de E.coli 3110 em fase exponencial, submetidas
a um tratamento trmico (60C durante 30 s), coradas com a mistura
brometo de etdio + bis-oxonol + iodeto de propdio (BEP) e (b) uorescncia emitida por clulas de Rhodococcus sp. coradas com a mesma
mistura. Quatro subpopulaes foram difrenciadas, correspondentes a
(A) clulas saudveis, no coradas; (B) clulas vitais, sem o sistema de
transporte activo que exclui o BE e, so, portanto, coradas por este corante; (C), clulas intactas, sem o sistema de transporte activo que exlcui o
BE, mas com potencial de membrana, coradas por EB/BOX; e (D) clulas mortas com as membranas citoplasmticas permeabilizadas, coradas
por EB/BOX/PI. As medies no citmetro de uxo foram realizadas
num Coulter Epics Elite com excitao a 488 nm, proveniente de um
laser de argon (15 mW). As uorescncias do IP, BE e BOX foram medidas a 635, 575 e 525 nm, respectivamente. Devido elevada sobreposio
dos espectros de emisso do BE e do IP, o sistema foi compensado de
forma a eliminar a uorescncia emitida pelo IP no detector de emisso
de uorescncia do BE.
A Figura 6 a) mostra o grfico de densidades correspondente a clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 quando submetidas a um tratamento trmico a 100C, durante
10 minutos, e posteriormente coradas com uma mistura de
DiOC6(3) +PI. possvel diferenciar duas subpopulaes
(B) e (D), que correspondem respectivamentes a clulas
com membranas polarizadas (B), que no so coradas por
nenhum dos corantes e, uma outra sub-populao (D),
composta por clulas coradas por ambos os flurocromos.
A interpretao desta ltima sub-populao, baseada na
colorao destas clulas por ambos os corantes, levaria
a concluir que estas clulas possuem membranas polarizadas (coradas pelo DiOC6(3) ), mas permeabilizadas
(coradas pelo IP), o que contraditrio. Mason et al., 1995,
observaram que clulas de E.coli, quando submetidas ao
mesmo tratamento trmico e coradas com DiOC6(3), apresentavam uma fluorescncia superior s clulas saudveis
(possuidoras de membranas citoplasmticas polarizadas).
Teoricamente, clulas que so coradas por este composto
possuem membranas polarizadas, pelo que a fluorescncia
do DiOC6(3) emitida por clulas submetidas ao tratamento
trmico (que induz a despolarizao e permeabilizao da
membrana) deveria ser baixa ou ausente. Os autores explicaram esta discrepncia baseando-se no carcter lipoflico
do DiOC6(3). A estrutura das cadeias dos fosfolpidos das
membranas citoplasmticas das clulas, quando expostas a
elevadas temperaturas colapsa, ficando as regies hidrofbicas da membrana expostas e acessveis ao DiOC6(3)
que ir ligar-se a esses centros, devido sua elevada
afinidade por aquelas regies. Nesta situao, a emisso
da florescncia do DiOC6(3) detectada em clulas mortas
no dependente do potencial de membrana, mas sim da
afinidade daquele composto pelas regies hidrofbicas da
membrana expostas.
Clulas recolhidas de uma cultura contnua em estado estacionrio taxa de diluio de 0.27 h-1 (max>1h -1), quando
coradas com a mistura de DiOC6(3) e PI apresentam o
grfico de densidades mostrado na figura 6 b), onde posBoletim de Biotecnologia 37
II
Figura 6 - (Retirada de Reis et al., 2004) (a) Clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 submtidas a um tratamento trmico (banho de gua a
100, durante 10 minutos), coradas com a mistura de DiOC6(3)+IP. Duas
subpopulaes foram diferenciadas, correspondentes a (B) clulas com
a membrana citoplasmtica despolarizada, no coradas por nenhum dos
corantes; e (D) clulas com a membrana citoplasmtica permeabilizada,
coradas por ambos os corantes DiOC6(3)+IP. (b)
(b) Clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 em estado estacionrio
(D=0.27 h-1), coradas com a mistura DiOC6(3)+IP. Quatro subpopulaes foram diferenciadas, correspndentes a (A) clulas saudveis, coradas
pelo DiOC6(3); (B) clulas com a membrana citoplasmtica despolarizada, no coradas; (C) clulas com a membrana despolarizada e permeabilizada, coradas pelo IP; e (D) clulas com a membrana citoplasmtica
despolarizada, permeabilizada e danicada. As medies no citmetro
de uxo foram realizadas num Coulter Epics Elite com excitao a 488
nm, proveniente de um laser de argon (15 mW). As uorescncias do IP
e do DiOC6(3) foram medidas a 635 e 525 nm, respectivamente.
Boletim de Biotecnologia
Figura 7 - (Retirada de Reis et al., 2004) Fotograa de transmisso electrnica (x 25000) de clulas do Bacillus licheniformis CCMI 1034 em
carncia de nutrientes por um perodo de 3 horas. possvel visualisar
clulas fantasma que apresentam um reduzido contedo material citoplasmtico no interior do envelope da clula. Estas estruturas (I), contrastam com as estruturas do tipo II, relativas a clulas normais, cujo
contedo citoplasmtico denso.
No decurso de qualquer bioprocesso, essencial a monitorizao da proliferao celular, bem como da viabilidade.
As informaes da concentrao de biomassa so cruciais
na tomada de decises, durante o controlo do processo.
Estas informaes podem permitir a recolha do produto na
concentrao adequada, de forma a obterem-se produtividades mximas, ou ainda a activao de sistemas indutveis
no tempo correcto, de modo a optimizar-se a eficincia
global do processo. A existncia de uma fraco significativa de clulas mortas ou dormentes durante qualquer parte
da evoluo do bioprocesso reflectir-se- negativamente no
rendimento global do processo, uma vez que estas clulas
no contribuem para a formao do produto. Portanto,
importante a obteno de informao rigorosa e precisa
sobre os estados fisiolgicos das clulas presentes numa
determinada populao. Tal como foi referido atrs, a marcao com misturas de corantes permite obter esta informao com um elevado grau de preciso num intervalo de
tempo reduzido e com tempo de resposta quase em tempo
real, mostrando numerosas vantagens relativamente aos
mtodos tradicionalmente utilizados na determinao da
viabilidade celular.
Boletim de Biotecnologia 39
Agradecimentos
O trabalho realizado pelos autores na Universidade de
Birmingham (Reino Unido) foi financiado pelo projecto
Europeu do Quinto Programa quadro (QLK3-1999-0004)
Enhanced, Intelligent Processing of Food and Related
Wastes using Thermophilic Populations. Teresa Lopes da
Silva e Alberto Reis agradecem Fundao para a Cincia
e a Tecnologia o apoio financeiro atravs das bolsas de
Doutoramento BD/5453/2001 e Ps-Doutoramento BPD/
8039/2002, respectivamente.
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