INTRODUCCIN AL HPLC

1. Introduccin

Esta pgina web es para la introduccin

de
informacin
bsica
sobre
cromatografa lquida y los productos
Shodex. La explicacin que se utiliza
aqu es simple y fcil de entender, por lo
tanto las palabras utilizadas no pueden ser
apropiadas para referencias cientficas.

2. Qu es la cromatografa de lquidos?

La historia de la cromatografa lquida (CL) se inici a principios del siglo XX. En 1906, un botnico
ruso Mikhail Tswett invento CL para separar varios pigmentos de plantas. El inyecto el extracto de una
planta y ter de petrleo a travs de una columna de vidrio lleno de carbonato de calcio. Dado que esto
fue hecho en una columna de vidrio, fue capaz de observar los cambios dentro de la columna. Al
principio, slo vio una capa de pigmento en la parte superior de la columna (Figura 1.a). Pero a medida
que pasa el tiempo, el pigmento se divide en cuatro capas de colores diferentes (Figura 1.b). La
investigacin descubri ms tarde que las cuatro capas eran (i) de color verde azulado, clorofila a, (ii) de
color verde amarillento, clorofila b, (iii) de color amarillo, xantina, y (iv) de color naranja; caroteno.
Todo el proceso de separacin dur varias horas y por lo tanto no era un mtodo muy prctico. Este
tiempo largo de anlisis fue una de las razones que la CL no se convirti en una herramienta analtica
popular hasta 1970, medio siglo despus de la invencin de Mikhail Tswett.
A continuacin se presenta algunos de los trminos utilizados en el anlisis de cromatografa.
La cromatografa es una tcnica de separacin y la palabra cromatografa se origin de la palabra chroma
que significa "color" y graphein que significa "escribir". Cromatgrafo es el equipo de separacin y
cromatograma es el grfico obtenido en el anlisis
Tcnica
(No Imagen!)

Cromatografa

Analtica

Cromatografo

Cromatograma

Figura 2. Imgenes de cromatografa, chromatografo, and cromatograma.

3. Qu es el HPLC?

HPLC significa cromatografa lquida de alto rendimiento. Antes que el HPLC est disponible, el anlisis
de LC era llevado a cabo por el flujo gravitacional del eluyente (el disolvente utilizado para el anlisis de
CL), lo que requiere varias horas para que el anlisis sea completado. Incluso las mejoras aadidas ms
tarde fueron capaces solo de acortar el tiempo de anlisis un poco. Los sistemas CL iniciales se llaman
"cromatografa de baja presin" o "cromatografa en columna".
En 1970 en los EE.UU., Jim Waters fund Waters Corporacin y comenz a vender instrumentos de
HPLC. Esto promovi el uso de HPLC en las reas de anlisis prcticos. Los sistemas de CL que Waters
Corporation desarroll utilizan bomba de alta presin que genera un rpido flujo de eluyente, y por lo
tanto result en una mejora dramtica en el tiempo de anlisis. Comparados con la "cromatografa de
baja presin" los nuevos tipos se llamaron "cromatografa lquida de alta presin". Por lo tanto, se sola
pensar que HPLC significa cromatografa lquida de alta presin, sin embargo hoy en da es entendido
que las siglas HPLC se refieren a Cromatografa Lquida de Alto Rendimiento. Otro gran cambio a partir
de la fecha de Tswett fue los mtodos de adquisicin de datos. En lugar de observar los cambios de las
capas con los ojos, se acopl el sistema detector y la informacin de datos fueron grabados en hojas de
papel. Si tuviramos que demostrar el resultado del anlisis de Tswett sera un grfico (cromatograma),
como la figura 3.
1.
Naranja
2.
Amarillo
3. Amarillento
4. Verde Azulado

Figura 3. Representacin del anlisis LC de Tswett

Inicialmente, el Sistema HPLC se le refera como Waters Corporations System. Aun Ahora, Waters
Corporation es el pionero de HPLC, pero hay varias otras empresas que fabrican y venden sistemas de
HPLC.
Tcnicamente Hablando, la Palabra CL representa toda la cromatografa de Lquidos, incluyendo CL de
baja presin, sin embargo, la mayora de los sistemas de CL utilizada en estos das son HPLC lo que a
menudo la palabra LC es utilizada para referirse al HPLC.
4. Los Componentes de HPLC

Tpicamente
el
sistema
HPLC
Los detalles de cada uno se explican abajo.

consta

de

lo

siguiente

(Figura

4).

Figura 4
4.1 Bomba

En la primera etapa del desarrollo del HPLC, la bomba fue la parte ms importante del sistema. El
desarrollo del HPLC se puede decir que fue dado por el desarrollo del sistema de bombeo. La bomba se
colocaba en lo ms alto del sistema CL y generaba un flujo del reservorio del disolvente al sistema. En
esta etapa el requisito ms importante del sistema era poder generar una alta presin. Sin embargo, hoy
en da, la generacin de alta presin es normal y lo que ms preocupa ms hoy en da es proporcionar
una presin constante en cualquier condicin, para proporcionar un caudal controlable y reproducible
dado que el cambio en la proporcin del flujo puede influir el anlisis en gran medida.
La mayora de las bombas utilizadas en los sistemas LC actuales generan el flujo con un movimiento de
vaivn de un pistn de motor (bombas de pistn). Debido a este movimiento del pistn, se produce
"pulsos". Ha habido grandes mejoras del sistema para reducir esta pulsacin y las bombas recientes crean
un pulso muy inferior a las antiguas bombas. Sin embargo, los anlisis actuales requieren una
sensibilidad muy alta para cuantificar una pequea cantidad de analitos, e incluso un pequeo cambio en
la velocidad del flujo puede influir en el anlisis. Por lo tanto, las bombas necesarias para el anlisis de
alta sensibilidad tienen que ser muy precisas.
4.2 Inyector

Un inyector se coloca al lado de la bomba. El mtodo ms simple es utilizar una jeringa, y la muestra se
introduce en el flujo de eluyente. Ya que la precisin de la medicin por CL tiene mucho que ver con la
reproducibilidad de la inyeccin de la muestra, el diseo de los inyectores es un factor importante. El
mtodo de inyeccin ms utilizado se basa en lazos de muestreo. El uso de muestreador automtico
(auto-inyector) del sistema tambin es ampliamente utilizado ya que permite una serie de inyecciones
repetitivas en un tiempo programado.
4.3 Columna

La separacin se lleva a cabo dentro de la columna, por lo tanto, se puede decir que la columna es el
corazn de un sistema de CL. La teora de la cromatografa en columna no ha cambiado desde la poca
de Tswett, sin embargo ha habido una continua mejora en el desarrollo de la columna. Las columnas

recientes suelen estar preparados en una carcasa de acero inoxidable, en lugar de columnas de vidrio
utilizadas en el experimento de Tswett. En general, el material de relleno que se utiliza es de gel de slice
o de polmeros en comparacin con el carbonato de calcio utilizado por Tswett.
El eluyente utilizado para la CL vara de cido a solventes bsicos. La mayora de la cubierta de la
columna es de acero inoxidable y es tolerante a una gran variedad de disolventes. Sin embargo, para el
anlisis de algunos analitos como las biomolculas y los compuestos inicos, el contacto con el metal no
es deseable, por lo tanto columnas con cubierta de politer ter cetona (PEEK) se utiliza en su lugar.
4.4 Detector

La separacin de los analitos se realiza dentro de la columna, mientras que un detector se utiliza para
observar la separacin obtenida. La composicin del eluyente es consistente cuando no hay analito est
presente, en cambio la presencia del analito cambia la composicin del eluyente. Lo que el detector hace
es medir estas diferencias. Esta diferencia se observa como una forma de seal electrnica. Hay
diferentes tipos de detectores disponibles. Diferentes tipos detector y se explican en la leccin 6.
4.5 Registracin de Datos

El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de seal electrnica, y as no es visibles a
nuestros ojos. En otros tiempos, la pluma- papel-registrador grfico se utilizaba muy popularmente. Hoy
en da, una computadora con un posesor de base de datos (integrador) es ms comn. Hay varios tipos de
procesadores de datos, e incluye un sistema simple que consiste en construir la impresora y el procesador
de textos, y un tipo de computadora personal que consta de monitor, teclado e impresora. Tambin hay
programas que estn diseados especficamente para el sistema LC. Ofrece no slo la adquisicin de
datos, pero tambin caterticas como mximo de ajuste, la correccin de lnea base, el clculo
automtico de la concentracin, la determinacin del peso molecular, etc.
Los componentes introducidos hasta el momento son los fundamentos del sistema LC. A continuacin se
presentan algunos equipos opcionales se utiliza con el sistema bsico de LC.
4.6 Desgasificador

El eluyente utilizado para anlisis con LC puede contener gases como oxgeno que son no visibles a
nuestros ojos. Cuando el gas est presente en eluyente, este se detecta como un ruido y causas una lnea
base inestable. Generalmente los mtodos que se utilizan incluye el burbujeo (burbujeo de gas inerte),
uso de bomba de vacio, sistema destilacin, y / o calentamiento y agitacin. Sin embargo, estos mtodos
no son convenientes cuando el disolvente se deja por un perodo de tiempo determinado (por ejemplo,
durante un anlisis largo). El desgasificador usa unos tubos de membrana de polmero especial para
eliminar los gases. Los numerosos pequeos poros en la superficie del tubo de polmero permite que el
aire pase a travs mientras que previene cualquier otro lquido pasar a travs del poro. Mediante la
colocacin de esta tubera bajo el contenedor de baja presin, crea las diferencias de presin dentro y
fuera de la tubera (mayor en el interior del tubo). Esta diferencia hace que el gas disuelto se mueva a
travs de los poros y eliminar el gas. En comparacin con el tipo clsico de desgasificacin por lotes, el
desgasificador se puede utilizar on-line, es ms conveniente y eficiente. Muchos de los nuevos sistemas
HPLC contienen un desgasificador.
4.7 Horno de columna

La separacin con LC es a menudo muy influenciada por la temperatura de la columna. Con el fin de
obtener resultados repetibles, es importante mantener una temperatura constante. Tambin para algunos

anlisis, como el azcar y los cidos orgnicos, se puede obtener mejor resolucin a temperatura elevada
(50 ~ 80 C). Tambin es importante mantener una temperatura estable para obtener resultados
repetibles, incluso cuando se analiza a una temperatura de ambiente. Hay posibilidades de que los
diferentes cambios de temperatura haga que los resultados de la separacin sean diferentes.
Generalmente las columnas se mantienen dentro del horno de columna (calentador columna).
5. Otro tipos de Cromatografa

Otro miembro de la cromatografa, que se utiliza a menudo como el LC, es la cromatografa a gas (GC).
Mientras LC utiliza eluyente (flujo generado por un sistema de bombeo), GC utiliza el gas (gas
portador), siempre desde un tanque de gas, por lo que no requiere sistema de bombeo. Por lo tanto, el
sistema de GC es ms simple que el sistema LC y por esa razn, era ampliamente disponible antes de
que el sistema LC llegara a ser popular. En ese momento, palabra cromatografa se refiere al GC. La
sencillez del sistema GC es una ventaja pero tambin una desventaja. Las muestras que se analizaron
tienen que estar en forma gaseosa antes de ser introducido en el flujo del gas portador. Por lo tanto, si la
muestra original esta en forma gaseosa, el GC es una herramienta conveniente. Sin embargo, la mayora
de las muestras son en forma lquida o slida y requiere calentamiento a alta temperatura para convertirlo
en gas. Algunos analitos se alternan por el calor, por lo que el mtodo de GC no es ideal para ese caso.
Problema relacionado es que GC tiene un lmite superior para el anlisis de compuestos de gran peso
molecular.
En comparacin, las muestras lquidas pueden ser analizadas directamente por LC. Adems, si la muestra
slida puede ser disuelta en un solvente, esta puede ser analizada por LC. Algunas muestras son
insolubles en agua, pero la mayora de ellos son solubles en disolventes orgnicos, hay una alta
probabilidad de que podemos encontrar un solvente que disuelve la muestra. Por lo tanto, LC se puede
utilizar a temperatura de ambiente (es decir, sin causar alteracin de la sustancia analizada) para una
amplia
gama
de
anlisis.
Esto hizo que el mtodo de LC pueda ser ms popular que el mtodo de GC. Hay otros tipos de
cromatografa como la cromatografa en capa fina, super-crtica cromatografa de fluidos, papel, etc, pero
sus usos son an menos populares que el GC.