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a u l a

A histria da fermentao:
do incio aos dias de hoje

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Bioqumica II | A histria da fermentao: do incio aos dias de hoje

Desde a Antigidade, o processo de fermentao era conhecido

e muito utilizado na fabricao de vinhos, queijos e pes. Aristteles
descreveu quatro etapas na formao do vinho: a infncia, quando a uva
estava na parreira; a adolescncia, com o suco de uva; a maturidade com
o vinho; e finalmente a velhice e morte, quando o vinho se transformava
em vinagre.
Uma das primeiras definies do processo fermentativo foi
elaborada em 1684, por Willis:
A fermentao um movimento intestino de partculas ou
princpios de cada corpo, tendendo para a perfeio ou para a
transformao em outro. As partculas elementares postas em
movimento, devido sua prpria natureza ou ocasionalmente
vibrando maravilhosamente, so aprisionadas e transformam-se
em outras: as sutis e mais ativas esforam-se na tentativa de escapar
suavemente, mas estando entrelaadas com outras mais espessas
so impedidas de faz-lo. Tambm as mais espessas so mantidas
unidas pelo intento e expanso das mais sutis e so enfraquecidas at
que cada uma alcance sua prpria grandeza e exaltao. Elas fixam
em si a devida perfeio ou completam as alteraes e mutaes
designadas pela natureza.

At o incio do sculo XIX, a conservao dos alimentos era

feita utilizando-se basicamente a tcnica da salmoura. Nessa poca, o
Imprio Napolenico estava em expanso. Entretanto, um dos maiores
empecilhos para a conquista de novos territrios era a alimentao de
seus soldados. Napoleo, ofereceu, ento, um prmio de 12000 francos
para quem inventasse uma maneira eficiente de conservar os alimentos
por um longo perodo de tempo.
Nesse contexto, destacou-se o francs Mr. Nicolas Appert, dono
de uma loja de secos e molhados, que exportava alimentos para diversas
localidades e pessoas, inclusive para o Czar da Rssia. Sua tcnica de
Figura 9.1: Capa do livro
de Mr. Appert, A arte de
preservar alimentos de
origem animal e vegetal, 1810.

conservao de alimentos, herdada de seu pai, consistia em adicionar

grandes quantidades de acar s frutas e ferver os alimentos, que
deveriam imediatamente ser tampados e selados com parafina.

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MDULO 3

Suas receitas foram publicadas em um livro (Figura 9.1), considerado

AULA

por muitos como o primeiro livro de Bioqumica.

Hoje o processo fermentativo amplamente
conhecido e mundialmente utilizado em escala
industrial. A cerveja um exemplo de produto obtido
a partir deste processo, onde o organismo fermentador
uma levedura.

A IMPORTNCIA DA HISTRIA DA FERMENTAO NA

HISTRIA DA BIOQUMICA
Com base no livro de Mr. Appert, um fsico-qumico da poca

!
Acesse http://perso.magic
. f r / o r m e r r y /
newindex.html para
saber mais sobre Nicolas
Appert e suas importantes
contribuies para a
indstria de alimentos.
e http://members.nbci
.com/_XMCM/cervas/
fabricacao.htm) se voc
quer saber mais sobre
como se fabrica cerveja.

chamado Gay-Lussac fez a seguinte experincia (Figura 9.2):

Aqueceu duas vasilhas com caldo de carne e cobriu apenas uma
delas com uma camada de mercrio.
Em qual das vasilhas voc esperaria que ocorresse fermentao?

Pense
sobre isso!

Por qu?
Na metade do sculo XIX a qualidade dos vinhos na Frana era
muito baixa. J se tinha conhecimento, na poca, de que a qualidade

do vinho dependia do tipo de uva utilizada, bem como do repique (uma

poro de um vinho de boa qualidade j fermentado). A adio do
repique acelerava o processo de fermentao e uniformizava o paladar
do vinho.
Na tentativa de solucionar o problema da qualidade do vinho
de paladar ruim, uma vincola francesa contratou Louis Pasteur, um
qumico simples e muito religioso.

Figura 9.2: O experimento

de Gay-Lussac. Em A a
vasilha com caldo de carne;
em B a vasilha com caldo
de carne coberta por uma
camada de mercrio.

Ao analisar o vinho ao microscpio, Pasteur observou a

existncia de grande quantidade de glbulos castanhos, alguns
inclusive se dividindo (Figura 9.3).

Figura 9.3: Glbulos castanhos observados

por Pasteur ao analisar o vinho ao microscpio.

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Bioqumica II | A histria da fermentao: do incio aos dias de hoje

Pasteur lanou mo de suas experincias anteriores como cientista

para tentar desvendar os segredos da fermentao. Antes de ser contratado
pela fbrica de vinhos, Pasteur havia se dedicado ao estudo da polarizao
da luz por cidos orgnicos e observou, usando um polarmetro, que cidos
orgnicos extrados de tecidos de seres vivos eram capazes de desviar o

MISTURA
RACMICA

plano da luz polarizada. Ao contrrio, os cidos orgnicos sintticos no

Mistura racmica
uma mistura de
substncias capazes
de desviar o plano
de luz polarizado
para a esquerda
(levrgiras) com
substncias capazes
de desviar o plano de
luz polarizado para a
direita (dextrgiras).

eram capazes de desviar o plano da luz polarizada.

Pasteur concluiu que os cidos orgnicos eram constitudos de uma
MISTURA RACMICA
A e que somente os seres vivos eram capazes de transform-los

em um grupo homogneo de substncias capazes de desviar o plano da luz.

Pense sobre isso!
Isolando cidos orgnicos de um repique e colocando-os em um
polarmetro, Pasteur observou que esses compostos eram capazes de
desviar a luz.

Pense
sobre isso!

O que voc concluiria no lugar de Pasteur?

Assim, Pasteur prope que os glbulos castanhos so organismos
vivos e que somente na presena destes pode haver fermentao. Pasteur
associou no s a fermentao, mas tambm outros processos presena
de organismos vivos e formulou, assim, a Teoria Vitalista.
Surgem imediatamente crticas ferozes sua teoria. A mais
contundente e irnica foi escrita por um renomado qumico da poca
chamado Liebig:

SOLUO DO SEGREDO DA
FERMENTAO ALCOLICA
O levedo de cerveja, quando disperso em gua, quebra-se em um nmero
infinito de pequenas esferas. Se estas esferas so transferidas para uma
soluo aquosa de acar, elas desenvolvem-se em pequenos animais.
Estes animais so dotados de uma espcie de trompa de suco com a
qual eles devoram o acar da soluo. A digesto reconhecvel clara
e imediatamente por causa da descarga de excrementos. Estes animais
evacuam lcool etlico dos seus intestinos e dixido de carbono dos seus
rgos urinrios. Deste modo pode-se observar que um fluido especificamente mais claro
exudado de seu nus e ascende verticalmente, ao passo que um jato de dixido de carbono
ejetado em intervalos muito curtos dos seus genitais enormemente grandes.
(WOEHLER E LIEBIG,1893).

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metabolismo dos glbulos observados por Pasteur. Ao contrrio,

Liebig e boa parte da comunidade cientfica da poca acreditavam
que a fermentao era, na verdade, um processo meramente qumico,
decorrente da reao entre substncias albuminides (nitrogenadas),
presentes na superfcie dos glbulos, com o acar do meio, na
presena de ar.
Para responder s crticas, Pasteur mostrou que os glbulos
presentes no meio contendo acar eram capazes de promover a

MDULO 3

s/O2

AULA

de que a fermentao era um processo biolgico que dependia do

c/O2 produzido

Essa passagem mostra que havia uma forte resistncia idia

c/O2
Tempo (min)

Figura 9.4: Resultado do

experimento de Pasteur. Foi
medido CO2 em funo do
tempo de fermentao na
presena (c/O2) ou na ausncia (s/O2) de oxignio.

fermentao, mesmo na ausncia de ar (Figura 9.4).

Com os resultados obtidos a partir das experincias realizadas na
ausncia de oxignio, Pasteur afirma que a fermentao pode ocorrer
mesmo em condies de anaerobiose, descrevendo pela primeira vez
La vie sans lair (A vida sem ar).
Foram necessrios mais de cinqenta anos para que fossem
acrescentados novos conhecimentos rea da fermentao.
Dois irmos, Hans e Edward Bchner, aps terem sido expulsos de
laboratrios de pesquisa por serem muito desastrados, resolveram abrir
em sociedade uma pequena fbrica para produzir um xarope contra a
tuberculose. Hans era microbiologista e Edward, botnico e qumico; este
ltimo tendo inclusive trabalhado com o renomado qumico Adolf von
Bayer. Ambos decidiram investir em um negcio que lhes fosse rentvel.
No incio do sculo XIX, as principais doenas eram a sfilis e a
tuberculose. Por no haver tratamento efetivo para ambas as doenas,
possu-las significava sentena de morte para o paciente. Era costume, na
poca, internar os portadores de tuberculose em sanatrios localizados
nas montanhas, onde respiravam ar puro, repousavam e eram obrigados
a beber uma cerveja escura e amarga. Na opinio de muitos especialistas,
o levedo depositado no fundo da cerveja produzia antitoxinas capazes de
combater os microorganismos causadores da tuberculose. Entretanto, para
o total efeito teraputico eram necessrios vrios litros dessa cerveja.
Valendo-se disto, os irmos Bchner resolveram preparar um
xarope dessa levedura e poupar o sofrimento dos doentes, que poderiam
adquirir um xarope com extrato concentrado de antitoxinas, dispensando
assim a ingesto dos litros de cerveja amarga.

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Bioqumica II | A histria da fermentao: do incio aos dias de hoje

Para preparar o xarope, eles montaram uma estratgia que

consistia em:
1 fazer crescer grandes quantidades de levedura em frascos contendo
caldo de acar (leveduras em cultura);
2 isolar as leveduras do meio de cultura atravs de centrifugao
(leveduras ntegras isoladas);
3 romper as leveduras (a ruptura das clulas era realizada atravs de
um processo trabalhoso que utilizava uma espcie de prensa, chamada
prensa francesa, com a capacidade de gerar at 300 atmosferas) (extrato
de levedura);
4 e, por fim, filtrar o extrato de leveduras para obter um concentrado
livre de clulas (extrato livre de clulas).
Para conservar o xarope, recorreram ao clssico livro de Mr. Appert
sobre conservar os alimentos e adicionaram grandes quantidades de acar
Pense
sobre isso!

(xarope de levedura).
Seria esse procedimento eficiente para conservar o xarope?
Para surpresa dos irmos Bchner, o xarope continuou a fermentar.
Baseando-se nas experincias de Pasteur, eles pensaram prontamente
que se tratava de uma contaminao com clulas intactas. Para resolver
o problema, passaram o xarope pela prensa francesa diversas vezes e
certificaram-se, utilizando um microscpio, de que no havia mais clulas

Pense
sobre isso!

ntegras. No entanto, o xarope continuava a fermentar.

Por qu ?
Hans, o microbiologista, cansado de trabalhar sem obter
resultado, desfez a sociedade com o irmo. Edward, consciente de que
a fermentao obtida com o xarope no era por erro experimental,
continuou seu trabalho. Aps repetir inmeras vezes o processo de quebra
das leveduras, Edward teve certeza de que a presena de clula ntegra de
levedura no era necessria para que a fermentao ocorresse. E, assim,
submeteu sua descoberta comunidade cientfica.

Figura 9.5: Edward

Buchner. 1 Prmio
Nobel de Qumica. Der
Einfluss des Sauerstoffs auf Grungen (A
influncia do oxignio
na fermentao), publicado em 1885.
Pense
sobre isso!

Edward Bchner (Figura 9.5) recebeu, em 1907, o 1 Prmio

Nobel de Qumica por seu trabalho Der Einfluss des Sauerstoffs auf
Grungen (A influncia do oxignio na fermentao), publicado em
1885, e o seguinte comentrio de Bayer, seu antigo chefe:
Esse rapaz, apesar de no ter nenhum talento para qumica, vai
ficar famoso.
Que conseqncias os resultados acima proporcionaram teoria
Vitalista de Pasteur e pesquisa bioqumica?

100 CEDERJ

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MDULO 3

A FERMENTAO E A VIA GLICOLTICA

AULA

Paralelamente descoberta dos irmos Bchner, de

que a fermentao ocorria mesmo na ausncia de vida,
Arthur Harden e William John Young, dois pesquisadores
ingleses, foram contratados por uma fbrica de cerveja para
estudar a fermentao.
Em 1903, eles estabeleceram a relao de 1:1 entre gs
carbnico e etanol produzidos pela fermentao do acar.
Utilizando o extrato de levedura na presena de glicose e

Figura 9.6: Uma placa de estrada

na Inglaterra anunciando Young e
Harden. Para onde esses dois levaram
a Bioqumica?

medindo a produo de CO2, eles observaram que a fermentao ocorria

durante algum tempo, sendo porm interrompida aps certo perodo.
Eles observaram tambm que a fermentao alcolica da glicose,
por suco de levedura (o extrato de levedura dos irmos Bchner), era
muito aumentada pela adio de mais suco de levedura, o qual tinha sido
previamente fervido e filtrado. Este lquido fervido, por si s, era incapaz
de fermentar quando em presena de glicose. Observe o Grfico 9.1. Ele

Dixido de carbono

representa o andamento da fermentao ao longo do tempo.

1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0

A
DILISE
0 10 20 30

40

50

60

70

80

90 100

Tempo em horas
Grfico 9.1: Medida de dixido de carbono em funo do tempo de fermentao.
Curva A: na presena de 25 mL de suco de levedura + 25 mL de gua + 5g de glicose;
Curva B: na presena de 25 mL do mesmo suco de levedura que na curva A + 25 mL
de suco de levedura fervido + 5g de glicose.

O que sugere esse resultado?

Pense
sobre isso!

Harden e Young submeteram o suco de levedura fervido DILISE

e assim separaram duas fraes distintas (tabela 8.1). Uma frao era
composta de molculas pequenas que passaram pela membrana de dilise.
Outra frao era composta de molculas grandes, que no passaram na
membrana de dilise e, portanto, foram chamadas resduo.

Dilise um
procedimento atravs
do qual se separam
molculas grandes de
molculas pequenas.
A dilise baseia-se na
capacidade de estas
molculas atravessarem
os poros de uma
membrana.
O limitante, ento, ser
o tamanho, ou seja,
molculas pequenas
passam e molculas
grandes no passam
pelos poros. Para que
esta seletividade seja
eficiente, voc pode
imaginar o tamanho que
estes poros devem ter?

CEDERJ 101

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Bioqumica II | A histria da fermentao: do incio aos dias de hoje

Tabela 9.1: Dilise do suco de levedura fervido:
25 mL de suco de levedura+ 5 gramas glicose

Pense
sobre isso!

No

gua
(mL)

Suco
fervido
(mL)

Resduo
(mL)

Dialisado
(mL)

Tempo
(horas)

Dixido
de carbono
(grama)

25
0
0

0
25
0

0
0
25

0
0
0

48
48
48

0,253
0,561
0,264

25
0

0
0

0
0

0
25

48
48

0,154
0,251

Levando-se em considerao os resultados, que caracterstica

teria, ento, o ativador da fermentao?
Como resultado de um grande nmero de tentativas de isolar o
constituinte do suco de levedura responsvel pelo aumento da
fermentao, observou-se que quando cido fosfrico na forma
de um fosfato solvel estava presente era produzido um aumento
na taxa de fermentao. O efeito da adio de fosfatos solveis ao
suco de levedura foi ento examinado e encontrou-se uma evoluo
inicial rpida bem marcada de dixido de carbono produzido.
Alm disso, os sucos de levedura usados invariavelmente contm
fosfatos, precipitveis por mistura magnsia; nesse ponto no
pode haver nenhuma dvida de que o fenmeno inicial devido
presena destes. (HARDEN e YOUNG, 1906).

Com estas descobertas, Harden e Young afirmaram que o processo

fermentativo necessitava tanto da frao residual da dilise do suco no
fervido, que chamaram zimazes (protenas), quanto da frao dialisvel
do suco de levedura, que eles chamaram cozimazes. A observao
de fosfatos durante o processo fermentativo levouos a supor que as
cozimazes fossem compostas por fosfato.
Adicionando sucessivamente Pi (fosfato inorgnico) a um extrato
de leveduras, observaram que a retomada da fermentao ocorria at
certo ponto, e a partir da tanto a adio de Pi como a adio de glicose
no mais ativavam o processo. Por outro lado, a adio de mais suco de
levedura fervido ainda era capaz de ativar a fermentao (Grfico 9.2).

102 CEDERJ

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Dixido de carbono

110
100
90
80
70

60
50
40

30

20
10
0

10

20

30 40

50 60

70

80

90 100 110 120 130 140 150

Tempo em minutos
Pense
sobre isso!

Qual seria ento o destino do fosfato inorgnico?

Utilizando um sal de prata, Harden e Young foram capazes de
isolar, por precipitao, um composto fosforilado com seis carbonos
(6C) e dois fosfatos, e identificaram como sendo frutose-1,6-bisfosfato,
denominado ster de Harden e Young, o primeiro intermedirio da via
glicoltica identificado. Na poca, os autores ficaram em dvida se o
composto era uma hexose difosfatada ou duas trioses monofosfatadas.
Como voc faria para provar que este composto realmente

Pense
sobre isso!

participa do processo fermentativo?

A seguir, Otto Meyerhoff, um pesquisador alemo, trabalhando
com msculo de r, peito de pombo e de coelho, mostrou que o msculo
se contraa na ausncia de oxignio e isso resultava na produo de
cido ltico.
Esse processo pode ser ativado por duas fraes do extrato de
msculo, uma termossensvel (frao sensvel ao calor, tambm chamada
zimazes) e outra termorresistente (frao insensvel ao calor, chamada
cozimazes). Mas este no foi o nico paralelo entre a fermentao da
levedura e os msculos do pombo: Meyerhoff testou Pi nos msculos
e obteve os mesmos resultados de Harden e Young. Assim, sabendo
que a glicose consumida pelo extrato de levedura na fermentao,
resultando em etanol e dixido de carbono, e que a adio de glicose em
macerados de msculo de coelho resultava no aparecimento de lactato,
Otto Meyerhoff levantou a possibilidade de as protenas envolvidas nos
dois processos serem tambm semelhantes.
Que experincia voc faria para testar esta hiptese?

Pense
sobre isso!

CEDERJ 103

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MDULO 3

120

Grfico 9.2: Efeito da adio de fosfato na

fermentao.
Mistura da reao: 25 mL de suco de levedura
+ 20 mL de gua + 5 g de glicose.
Curva A: representa a fermentao na ausncia
de fosfato adicionado;
Curva B e C: representam o efeito da adio
sucessiva de duas quantidades de 5 mL de
fosfato de sdio (0,3 M).

AULA

130

Bioqumica II | A histria da fermentao: do incio aos dias de hoje

uma frao termossensvel, porque o aquecimento a 50 C por
somente um minuto resulta num considervel grau de inativao.
(...) O ativador tem as propriedades de uma enzima. Eu proponho,
portanto, design-la hexoquinase, pois ela atua especificamente
Clulas lisadas
so clulas cujas
membranas foram
rompidas. Isso pode
ocorrer por uma
grande variedade
de tcnicas, como
congelamento/
descongelamento,
presso, choque
osmtico etc.

em hexoses fermentveis. (...) Com certas variaes, a velocidade

inicial de formao de cido ltico proporcional quantidade de
hexoquinase. Levedura o nico material do qual foi possvel isolar
o ativador. (...) A procura da hexoquinase em leveduras lisadas
foi baseada na idia de que extratos de levedura apresentam uma
esterificao rpida das hexoses fermentveis, com subseqente
fermentao. Extrato de msculos, ao contrrio, no apresenta
qualquer acumulao de steres. Esta diferena deve ser devida
ao fato de o fator essencial para a esterificao da glicose ser mais
concentrado em leveduras. A validade dessa hiptese ilustrada por
observaes simultneas da formao de cido ltico e esterificao
de hexoses em extratos de msculo ativados.
(MEYERHOFF, 1930).

J nessa poca, se conhecia o efeito letal de alguns compostos,

seja em bactrias e leveduras, como tambm em mamferos. Entretanto,
o mecanismo de ao de tais compostos ainda no era conhecido.
Nesse contexto, alguns pesquisadores decidiram testar o efeito
desses venenos durante o processo fermentativo e, aps anlise dos
produtos, obtiveram o seguinte resultado:

Tabela 8.2. Efeito de diferentes inibidores em reaes da via glicoltica.

Pense
sobre isso!

DROGA

EFEITO

1. Fluoreto de sdio

Acmulo de 2-fosfoglicerato e a
seguir 3-fosfoglicerato.

2. Cloro-acetal-fosfato (CAP)

Acmulo de dihidroxicetona fosfato e

frutose 1,6-bisfosfato.

3. Iodoacetato

Um sbito acmulo de gliceraldedo

1,3-bisfosfato seguido do seu rpido
desaparecimento e de um grande
acmulo de frutose 1,6- bisfosfato.

A partir destes dados, deduza as possveis etapas envolvidas na

degradao da glicose.
Pista 1: Uma via metablica pode ser descrita como
A

104 CEDERJ

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MDULO 3

Onde A o substrato ou matria-prima da via, B e C so os

AULA

intermedirios e D o produto final.

Se um determinado inibidor interrompe a reao B

D, qual

dos intermedirios ser acumulado? O que no ser mais produzido?

Utilize esta lgica para cada uma das linhas da tabela e encontre
as reaes isoladamente.
Pista 2: A gliclise uma via de degradao ou quebra da glicose
e, portanto, os produtos so molculas menores. Observe as reaes
isoladamente. Consulte as frmulas das molculas, veja quais delas so
maiores e quais so menores. Observe tambm o grau de semelhana
entre elas.
Se voc chegou at aqui, entendeu como uma via metablica
pode ser desvendada. Na prxima aula mostraremos a gliclise na sua
totalidade. Agora, a maior parte da via voc j conhece. Ento vai ser
fcil compreender o que falta. Vamos l?

Para saber mais, visite estes endereos:

Harden e Young: http://ir2lcb.cnrs-mrs.fr/~athel/harden.htm
Edward Bchner: http://ir2lcb.cnrs-mrs.fr/~athel/buchner.htm#buch;
http://ir2lcb.cnrs-mrs.fr/~athel/buchner.htm
Louis Pasteur: http://www.woodrow.org/teachers/chemistry/institutes/1992/Pasteur.html
http://www.pasteur.net/louis/index.htm
Baseado no material organizado pelo departamento de Bioqumica Mdica, CCS, UFRJ.

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