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Reymark Christoper Comilang

Matricola 777838

CORSO DI BIOTECNOLOGIE VEGETALI


ESERCITAZIONI IN LABORATORIO 2014-2015

ESERCITAZIONE 1

Data:10/11/2014

Espressione transiente in Nicotiana benthamiana del costrutto 35S::GUS in presenza e assenza di


un gene soppressore del silencing p19.
Usati 2 ceppi di Agrobacterium tumefaciens uno portante il plasmide binario 35S::GUS e uno
portante 35S::P19.
Si vuole vedere leffetto leffetto della soppressione del silencing.
Cosa che ci si aspetta (ipotesi):
- esprime 35S::GUS -> poca colorazione dovuta al silencing;
- esprime 35S::P19 -> amplificazione dellespressione di GUS.
Materiali:
Infiltration medium 10 mM MgCl2
100 mM Acetosyringone

Protocollo:
Batteri posti in centrifugazione per 10-15 minuti. I Batteri vengono recuperati rimuovendo il
supernatante e risospesi in un Buffer(il medium di infiltrazione 10 mM MgCl2) di 5-6mL.
Dopo unultima centrifugazione si recupera il pellet e si procede ad unulteriore sospensione in
4mL di medium di infiltrazione.
Il campione poi diluito 1:10 e 1:100 per ottenere un valore di assorbanza=0.2 .
Le assorbanze ottenute dalle diluizioni sono le seguenti:
Diluizione 1:10 - A=0.2
Diluizione 1:100 - A=0.19

Si preparano ora i 5mL di soluzione per linfiltrazione:


4.5mL soluzione MgCl2 + 0.5 mL di soluzione di Agrobatterio che porta costrutto 35S::GUS
Si prepara un seconda soluzione per infiltrazione,questa volta contenente il ceppo di Agrobatterio
con il costrutto 35S::P19.
Aggiunta di Acetosiringone 100 microM (da soluzione di Acetosiringone 100 mM) alla soluzione di
infiltrazione (volume=5mL)e lasciare a riposo per 30 minuti:
si aggiungono ,quindi, 5 microL di Acetosiringone alla soluzione .
Dopo i 30 minuti, si procede allinfiltrazione in foglie di Nicotiana benthamiana .
CONCLUSIONI:
A) Foglie infettate con costrutto 35S::GUS:
Le foglie infettate presentano un basso effetto del silenziamento del gene GUS, mostrando zone
visibilmente di colorazione bluastra, andando contro lipotesi di un silenziamento del gene GUS.
Si sa che in realt il silenziamento avviene, questo risultato pu essere causato da diversi motivi
quali infiltrazione non ottimale o silenziamento non del tutto avvenuto al momento della
estrazione delle foglie infette.
B) Foglie infettate con costrutto 35S::P19:
Le foglie presentano colorazione blu, ma non differiscono di molto in aspetto dalle foglie infettate
con il primo costrutto. Le foglie non mostrano loverespressione del gene GUS che ci si aspettava.
Anche in questo caso la causa potrebbe essere uninfiltrazione non ottimale oppure il gene P19
potrebbe non essersi espresso al momento dellestrazione delle foglie infette. Quindi, la causa
potrebbe essere laver dato poco tempo al gene di esprimere.

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ESERCITAZIONE 2

Data:11/11/2014

ESPERIMENTO 1:

Staining con GUS in piante di tabacco transgeniche dove il gene GUS sotto il controllo di diversi
promotori
3 linee indipendenti infiltrate in condizioni di stress abiotico, in questo specifico caso in condizioni
di siccit, e in condizioni normali.
Materiali:
Linea 1 : gene GUS sotto il promotore 1kbAtMYB60pro:GUS
Linea 2: gene GUS sotto il promotore 256bpAtMYB60pro:GUS
Linea 3: gene GUS sotto il promotore ABRE/DREAtMYB60pro:GUS

Staining solution
50 mM sodium phosphate buffer, pH 7,
0.1% (v/v) Triton-X100,
0.5 mg ml-1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide X-glucoronic acid
0.5 mM K3 Fe(CN)6.
Destaining solution
70% (v/v) Ethano

Cosa ci si aspetta (ipotesi):


- Dalla Linea 1 ci si aspetta un attenuazione dellespressione del gene GUS o un silenziamento
completo in condizioni di siccit e in condizioni normali;
- Dalla Linea 2 sotto il promotore minimo ci si aspetta un espressione molto debole in condizioni
di siccit;
- Dalla Linea 3 sotto controllo del promotore chimerico ABRE/DREA ci si aspetta una
overespressione in condizioni di siccit e una situazione simile al promotore minimo in condizioni
normali.
Protocollo:
Si fanno 2 saggi:
1)Condizioni Normali
2)Condizioni di Siccit

Due le piante usate la Linea 2(promotore minimo) e Linea 3(promotore chimerico ABRE/DREA).
Viene staccata una foglia da ciascuna pianta e lasciata sul bancone per un periodo di 1 ora e 30
minuti per simulare le condizioni di siccit.
Viene tagliato un disco fogliare dalle foglie messe ad essiccare e poste in 1 mL di Staining solution
in tubo Eppendorf.
Si hanno quindi :
a) Un disco fogliare posto ad essiccazione da pianta con promotore minimo;
b) Un disco fogliare da pianta con promotore chimerico ABRE/DREA.
A queste Eppendorf si accoppiano dischi fogliari staccati a fresco dalle rispettive piante:
a) Un disco fogliare ottenuto a fresco dalla pianta con promotore minimo;
b) Un disco Fogliare ottenuto a fresco dalla pianta con promotore chimerico ABRE/DREA.

I tubi Eppendorf sono poi incubati a 37C per una notte.


RISULTATI:

Fresco(controllo)

Essiccato(1h30min)

Promotore minimo 256

Presenza di pochi
spot blu

Aumento degli spot blu minimo

Promotore chimerico
ABRE/DREA

Presenza di pochi
spot blu

Assenza di upregolazione del


gene GUS

CONCLUSIONI:
A) Dischi fogliari prelevati da pianta con Promotore minimo 256:

Il risultato ottenuto quello che ci si aspettava nel caso di un promotore debole come il
promotore minimo 256. Lespressione del gene GUS infatti praticamente simile nei due
saggi effettuati.

B) Dischi fogliari prelevati da pianta con Promotore Chimerico ABRE/DREA:


Il risultato mostra una contraddizione con le ipotesi di un upregolazione in condizioni di siccit e
una downregolazione in condizioni normali. Infatti, i dischi fogliari non presentano sostanziali
differenze.
Una possibile spiegazione di questyo fenomeno che la pianta fosse gi in condizioni di stress, e
quindi avesse gi iniziato ad esprimere il gene GUS nelle condizioni di normalit, mostrando quindi
nessuna differenza tra condizioni di siccit e di normalit.

ESPERIMENTO 2:
Selezione di piante Transgeniche Arabidopsis tramite luso di erbicida BASTA.
Le piante transgeniche sono state trasformate con un transgene che conferisce resistenza
allerbicida.
4 lineedi di Arabidopsis da selezionare e da indicarne il genotipo a selezione effettuata.
Si stima il numero di piantine allinterno di una vaschetta targata linea #4 contenente le piantine
da selezionare:
Tra le 2800-3000 piantine.
Materiali:
Piante transgeniche Arabidopsis
Erbicida BASTA
Protocollo:
Le piantine vengono spruzzate con lerbicida BASTA.
RISULTATI:
Dalle 3000 piantine di partenza si arriva a 64 piantine selezionate (il 2.1 % delle piantine
sopravvive).

CONCLUSIONI:
Solo il 2.1 % delle piantine sopravvissuto alla selezione con erbicida BASTA. Non tutte le piantine
nella vaschetta hanno ottenuto il transgene. Questo fa pensare che il genotipo di queste piantine
sia il genotipo di una generazione T1, ossia le piantine trasformate che poi saranno utilizzate per
creare altre generazioni di piante transgeniche.

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ESERCITAZIONE 3

Data:17/11/2014

Esperimento di Trasformazione:

Floral dip of Arabidopsis plants

Trasformazione di piante Arabidopsis tramite il metodo di floral dip.


Le piante utilizzate sono mutanti abi1-1 ,mutanti signaling ABA.
Questa mutazione interrompe il segnale ABA, abi1-1 sempre legato alle chinasi impedendo
lattivazione degli effettori che poi porteranno alle risposte al segnale.
Mutanti aba1-1 sono piante con fioritura precoce nei giorni corti e lABA un regolatore negtivo
della fioritura durante i giorni corti.
Obiettivo della trasformazione:
Trovare ed Identificare un gene soppressore dei mutanti abi1-1.
Il costrutto utilizzato inserisce nel genoma di Arabidopsis resistenza a BASTA e una sequenza
costituita da 4 Promotori 35S. Questa sequenza aumenta lespressione dei geni al quale
adiacente, pu lavorare sia a monte che a valle del gene.
Dopo trasformazione si cercano piante con fenotipo diversi dal mutante abi1-1 nei giorni corti.

Materiali:
Infiltration medium: 5.0% (w/v) sucrose 0.05% (v/v) Silwet L-77
Plant Material : Arabidopsis abi1-1 mutants (Landsberg erecta background)

Protocollo:
Coltura di Agrobatteri divise in due Falcon tubes e messe a centrifugazione per 20 minuti.
Le cellule sono risospese in medium di infiltrazione di Saccarosio 5% (50 mL) in un contenitore al
quale aggiunto Silwet ad una concentrazione finzale di 0.05% (v/v)=0.05 mL.
Le piante vengono impregnatecon il medium di infiltrazione per 3-5 secondi, vengono poi poste al
buio per tutta la notte allinterno di sacchi di plastica per mantenere lumidit.