Efeitos de Galactanas Sulfatadas Das Algas Marinhas Botryocladia Occidental

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR
DANIEL MAGALHES GOMES
EFEITOS DE GALACTANAS SULFATADAS DAS ALGAS

MARINHAS Botryocladia occidentalis, Champia feldmannii E
Solieria filiformes NO PROCESSO INFLAMATRIO AGUDO
E NA NOCICEPO
FORTALEZA - CEAR
2006
EFEITOS DE GALACTANAS SULFATADAS DAS ALGAS

MARINHAS Botryocladia occidentalis, Champia feldmannii E
Solieria filiformes NO PROCESSO INFLAMATRIO AGUDO
E NA NOCICEPO
Dissertao apresentada ao Curso

de Mestrado Acadmico em Cincias
Fisiolgicas do Centro de Cincias da
Sade da Universidade Estadual do
Cear como requisito parcial para
obteno do grau de Mestre em
Cincias Fisiolgicas.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Maria
Sampaio Assereuy
Co-Orientador: Prof. Dr. David Neil
Criddle
FORTALEZA - CEAR
2006
G633e
Gomes, Daniel Magalhes

Efeitos de galactanas sulfatadas das algas marinhas
Botryocladia occidentalis, Champia feldmannnii e Solieria
filiformis no processo inflamatrio agudo e na nocicepo /
Daniel Magalhes Gomes. Fortaleza, 2006.
Oritentadora: Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assereuy.
Dissertao (Mestrado Acadmico em Cincias
Fisiolgicas)-Universidade Estadual do Cear, Centro de
Cincias da Sade.
1.Polissacardeo sulfatado. 2.Inflamao aguda. 3.
Nocicepo. I.Universidade Estadual do Cear, Centro de
Cincias da Sade.
CDD: 615.1

EFEITOS DE GALACTANAS SULFATADAS DAS ALGAS MARINHAS
Botryocladia occidentalis, Champia feldmannii E Solieria filiformes NO PROCESSO
INFLAMATRIO AGUDO E NA NOCICEPO
Aprovada em: 14/07/2006

Dissertao apresentada ao Curso de
Mestrado Acadmico em Cincias
Fisiolgicas do Centro de Cincias da
Sade da Universidade Estadual do
Cear como requisito parcial para
obteno do grau de Mestre em
Cincias Fisiolgicas.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________
Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assereuy UECE
Orientadora
______________________________________
Profa. Dra. Nylane Maria Nunes Alencar - UFC
______________________________________
Prof. Dr. Wladimir Ronald Lobo Farias - UFC
meus pais, todos os meus

amigos
lafacienses,
minha
orientadora Ana Maria Sampaio

Assreuy e a minha namorada
Delany Roque.
Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus, que ao longo de todo o trabalho, deu-me condies para que prosseguisse apesar
de todas as adversidades.
Aos meus pais, Dalton Moreira Gomes e Maria Oscarina Magalhes Gomes, pelo apoio
incondicional no s nesse trabalho, mas em todos os projetos realizados ao longo de toda a
minha vida.
minha namorada Delany Roque de Queiroz que acompanhou praticamente toda minha
histria acadmica e, anseio eu, que me acompanhe pelo resto da vida. Obrigado pelo
estmulo nas horas de descrena, dos conselhos nas horas de desespero e pelo amor
imensurvel que temos um pelo outro.
Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy, por ter me recebido em seu laboratrio, pela
orientao, pacincia e principalmente, pelo exemplo de carreira docente e esprito
cientfico.
Ao Prof. Wladimir Ronald Lobo Farias pelas palestras sobre os polissacardeos sulfatados e
o fornecimento dos mesmos para a realizao deste trabalho.
A Profa. Dra. Nylane Maria Nunes Alencar pela ateno dispensada nas vrias vezes que
cedeu seu laboratrio para execuo de alguns experimentos e por ter aceitado o convite de
compor esta banca.
A todos os professores do Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgicas que pela

contribuio em minha formao cientfica.
Aos meus amigos Ana Vaneska Passos Meireles, Alana de Freitas Pires, Mrio Rogrio
Lima Mota, Rafaela Gomes Cardoso, Sabrina Rodrigues Fontenele pela amizade,
companheirismo, auxlio nos experimentos, pelo bom humor mesmo nas situaes mais
difceis sendo estas cientficas ou pessoais. Vocs sempre foram as melhores companhias
nos momentos mais importantes.
Michelle Soares Josino da Silva, pela companhia nas interminveis, por vezes famintas e
exaustivas, mas tambm hilrias horas de experimento para a concretizao desse trabalho.
todos os meus demais colegas lafacienses Ricardo, Cladia, Samile Albertina,

Emmanuel e Pedro pela convvio sempre agradvel e troca de experincias de vida.
Aos colegas do Curso de Mestrado em Cincias Fisiolgicas: Nilson, Hermgenes, Kalina,

Higina, Magnely, Mrcia Andra, Delany, Rosngela, Michele, Paulo, Thasi, Ana Paula,
Juliana Zani, Danielle, Paula Matias, Paula Virgnia e Walber pelas horas de estudo mas
tambm de descontrao vividos pelos corredores, e salas de aula da UECE.
Fundao Cearense de Amparo a pesquisa (FUNCAP) pela concesso de bolsa de estudo

como apoio financeiro ao desenvolvimento cientfico.
A todos a minha mais sincera gratido.
RESUMO
Os polissacardeos sulfatados (PLS) constituem uma classe de carboidratos ricos em polinions, e
que apresentam uma diversidade de atividades biolgicas relevantes. As atividades mais estudadas so a
antitrombtica e a anticoagulante, tendo sido tambm demonstrada as atividades antiinflamatria tanto in
vitro quanto in vivo. Entretanto, a maioria das atividades destas molculas demonstradas na literatura se
refere aos PLS obtidos de algas pardas, sendo estas atividades pouco exploradas nos PLS obtidos de outros
grupos de algas. Alm disso, os estudos exploram pouco a atividade destas molculas in vivo e suas
propriedades pr-inflamatrias. Sendo assim o presente estudo investigou in vivo as atividades
antiinflamatria e pr-inflamatria dos PLS extrado das algas vermelhas Botryocladia occidentalis,
Solieria filiformes e Champia feldmannii, estudando com maiores detalhes a atividade pr-inflamatria
desta ltima, alm de suas propriedades antinociceptivas. Foram utilizados ratos Wistar machos e fmeas
(150-250g) nos estudos de inflamao e camundongos Swiss albinos (20-35g) nos estudos de nocicepo.
Na investigao da atividade antiinflamatria destas molculas, os animais foram injetados com os PLS por
via endovenosa na dose de 0,9 mg/Kg antes de receberem os estmulos inflamatrios carragenina, dextrana
ou zimosan. Os polissacardeos de B. occidentalis e S. filiformes, testados no edema da carragenina e
dextrana, no foram capazes de inibir a formao do edema destes, enquanto que os de C. feldmannii alm
de no inibir estes edemas no inibiu tambm aquele elicitado por zimosan. Na investigao da atividade
pr-inflamatria, os PLS foram injetados por via subcutnea intraplantar. Todos os PLS testados induziram
edema de pata, sendo o edema de C. feldmannii o mais pronunciado de todos. Durante as investigaes das
propriedades pr-inflamatrias dos polissacardeos sulfatados de C. feldmannii no houve uma
correspondncia nos estudos de dose-resposta sendo o edema destas molculas persistente por 24 horas aps
sua aplicao. Ainda nos estudos que atestam suas propriedades pr-inflamatrios, estes PLS tambm
induziram a migrao de neutrfilos para a cavidade peritoneal de ratos elevando tambm a permeabilidade
vascular nos tecidos das patas desses animais. Nas tentativas de modulao farmacolgica desta atividade os
animais receberam os PLS (0,9 mg/Kg, s.c.) ou 1 hora aps a injeo dexametasona - glicocorticide
(1mg/Kg, s.c.), indometacina - inibidor de prostaglandinas (5mg/Kg, s.c), L-NAME - inibidor da sntese de
xido ntrico (25mg/Kg; e.v), meclizina - anti-histamnico (40 mg/Kg, s.c) e pentoxifilina - inibidor de TNF
e IL1 (90mg/Kg, s.c.). Todos os mediadores inibiram o edema causado pelos PLS de C. feldmanni, exceto o
L-NAME, excluindo a participao de xido ntrico nos eventos inflamatrios desse edema. A atividade
antinociceptiva dos PLS de C. feldmannii foram investigadas atravs do teste de contores abdominais
conduzidas por cido actico. Essa substncia foi administrada nas doses (0,2; 1; 5 e 25 mg/Kg, s.c.) 30
minutos antes da injeo de cido actico 0,6%. A dose de 1 mg/kg foi a que apresentou a melhor inibio.
Em suma, os PLS testados demonstram no possuir atividade antiinflamatria, enquanto que os PLS de C.
feldmannii apresentaram significativa atividade pr-inflamatria somada a sua potente atividade
antinociceptiva.
Palavras-chaves: polisacardeos sulfatados; inflamao aguda; nocicepo.
ABSTRACT
The sulfated polysaccharides (SPL) constitutes a class of carbohydrates rich in polyanions and that
presents a diversity of important biological activities. The antithrombotic and the anticoagulant activities are
the most studied. It was demonstrated by the sulfated polysaccharides (SPL) the anti-inflammatory activity
both in vitro and in vivo. However, the majority of the activities of these molecules demonstrated in
literature are related to SPL obtained from brown seaweed (Phaeophytas) being these activities little
exploited from the SPL obtained from other groups of seaweed.
Moreover, the studies little explore the activity of these molecules in vivo and its pro-inflammatory
properties. So, the present study has investigated the anti-inflammatory and pro-inflammatory activities of
the SPL extracted from the red algae Botryocladia occidentalis, Solieria filiformes and Champia feldmannii,
studing in more detail the pro-inflammatory activity of the latter besides its antinociceptives properties.
Wistar rats (150-250 g) were used on the pro and anti-inflammatory studies and male Swiss mice (20-35 g)
in the nociception studies.
In the investigation of anti-inflammatory activity of these molecules, the animals of each group
were injected by endovenous via (0.09 mg/kg) of their respectives SPL before they receive the
inflammatory stimuli carrageenan, dextran or zimosan. The polysaccharides of B. occidentalis and S.
filiformes, tested in the carrageenan oedema and dextran were not able to inhibit the formation of these
oedema, while the SPL of C. feldmannii than not inhibit these oedema also not inhibited that elicitated by
zimosan. In pro-inflammatory activit research the SPL were injected by subcutaneously intraplantar via. All
SPL tested induced paw oedema, being the oedema of C. feldmannii the sharpest of all.
During the investigation of pro-inflammatory properties of sulfated polysaccharides of C.
feldmannii there was no correlation in studies of dose-response being the oedema of these molecules
persistent for 24 hours after its application. Even the studies that prove their pro-inflammatory properties,
these SPL also led neutrophils migration of abdominal cavity of rats also raising the vascular permeability
in paw tissue of these animals.
In attempts of modulation of this activity the animals received the SPL (0.9 mg/kg, sc) or 1 hour
after the dexamethasone injection (1.0 mg/Kg, s.c.), indomethacin (5 mg/Kg, s.c.), L-NAME (25 mg/Kg;
e.v), meclyzine (40 mg/kg, s.c.), pentoxifylline (90 mg/Kg, s.c.). The results demonstrated that only LNAME failed to inhibit the paw oedema elicitated by C. feldmannii, indicating, however, the possibility to
have greater participation of cytokines and prostaglandins in the process. The nonciceptive activity of C.
felmanni SPL as antinociceptiva was confirmed when its administration was done of (0.2, 1, 5 and 25
mg/kg, s.c.) 30 minutes before the injection of acetic acid 0.6%. The dose of 1 mg/kg presented the best
inhibition. In short, the SPL testes demonstrated no posses anti-inflammatory activity, while the SPL of C.
feldmannii showed a significant pro-inflammatory activity in addition to its potent nonciceptive activity.
Keywords: sulfated polysaccharides; acute inflammation; nociception.
LISTA DE ABREVIATURAS
ADP =
Adenina difosfato
ANOVA =
Anlise de varincia
ASC =
rea sob a curva
ATP =
Adenosina trifosfato
C3a=
Fragmento menor do sistema do complemento ativado
C3b=
Fragmento maior do sistema do complemento ativado
C5a =
Quinto componente (fragmento menor) do sistema complemento

ativado
Cg =
Carragenina
COX-1 =
Isoforma 1 da enzima cicloxigenase
COX-2 =
COX-3 =
DL50 =
Dose que produz letalidade em 50% dos animais
EDTA =
cido etilenodiamonotetractico
E.P.M =
Erro padro da mdia
e.v. =
Endovenosa
eNOS =
Isoforma endotelial da enzima xido ntrico sintase
iNOS =
Isoforma induzida da enzima xido ntrico sintase
nNOS =
Isoforma neuronal da enzima xido ntrico sintase
fMLP =
Peptdeo N-formil-metil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina
HDL =
Lipoprotena de alta densidade
HE =
Hematoxilina-Eosina
i.p. =
Intraperitoneal
ICAM-1 e ICAM-2 = Molcula de adeso intercelular-1 e 2

(do ingls: intercelular adhesion molecule)
IgG =
Imunoglobulinas G
IgM =
Imunoglobulinas M
IL-1 =
Interleucina-1
IL-4=
Interleucina-4
IL-8 =
Interleucina-8
LDL =
Lipoportena de baixa densidade
LTB4 =
Leucotrieno B4
MBL =
Lectina ligante de manose
NADP =
Nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato associada ao

grupamento fosfato
NADPH =
Nicotinamida adenina dinucleotdeo associado com um grupamento

hidrognio
nNOS =
Isoforma neuronal da enzima xido ntrico sintase
NO =
xido ntrico
NOS =
Enzima xido ntrico sintase
PAF =
Fator de ativao de plaquetas (do ingls: platelet activator factor)
PCAM-1 =
Molcula de adeso de clula endotelial e plaqueta
PLS =
Polissacardeo sulfatado
s.c. =
Subcutnea
TNF- =
Fator de necrose tumoral alfa (do ingls: Tumoral Necrosis Factor-)
VLDL =
Lipoprotena de muito baixa densidade (do ingls: very-low density

lipoproteins)
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
Foto da alga marinha Botryocladia occidentalis
34
FIGURA 2
Foto da alga marinha Champia feldmannii
34
FIGURA 3
Foto da alga marinha Solieria filiformis
34
FIGURA 4
Esquema geral de extrao dos polissacardeos sulfatados totais
43
FIGURA 5
Os polissacardeos sulfatados das algas Botryocladia occidentalis,

Champia feldmannii e Solieria filiformis no inibem o edema de pata
induzido por dextrana
FIGURA 6
O polissacardeo sulfatado de Champia. feldmannii administrado em

diferentes doses no apresenta efeito antiinflamatrio
FIGURA 7
43
45
Os polissacardeos sulfatados das algas Botryocladia occidentalis, Champia

feldmannii e Solieria filiformis no inibem o edema de pata induzido por
carragenina
FIGURA 8
O Polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii pr-tratado em

diferentes tempos no inibe o edema de pata induzido por carragenina
FIGURA 9
49
O polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii no inibe o edema

de pata induzido por zimosan
FIGURA 10
47
51
Os polissacardeos sulfatados das algas Botryocladia occidentalis, Champia

feldmannii e Solieria filiformis induzem a formao de edema de pata
53
FIGURA 11
Os polissacardeos sulfatados da alga Champia feldmannii provocam edema

de pata em ratos em diferentes doses
FIGURA 12
Os PLS de C. feldmannii induzem um aumento de permeabilidade vascular

em pata de ratos
FIGURA 13
61
- Meclizina, dexametasona, indometacina e pentoxifilina inibem o edema de

pata induzido por Champia feldmannii
FIGURA 16
59
O polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii provoca aumento da

migrao de neutrfilos para a cavidade peritoneal de ratos
FIGURA 15
57
O polissacardeo sulfatado de Champia. feldmannii provoca edema de pata

nas primeiras 12 h aps sua administrao em ratos
FIGURA 14
55
63
O polissacardeo sulfatado da alga vermelha Champia feldmannii apresenta

efeito antinociceptivo no teste de contores abdominais (teste writhing) em
camundongos
65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Meclizina, dexametasona, indometacina e pentoxifilina inibem o edema de

pata induzido por Champia feldmannii
Tabela 2
63
O polissacardeo sulfatado da alga vermelha Champia feldmannii apresenta

efeito antinociceptivo no teste de contores abdominais (teste writhing) em
camundongos
65
SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUO
16
1.1 ALGAS MARINHAS

1.2 ALGAS MARINHAS VERMELHAS
1.3 CARBOIDRATOS
1.4 POLISSACARDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARINHAS
1.5 ATIVIDADES BIOLGICAS DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARINHAS
1.6 RESPOSTA INFLAMATRIA
1.6.1 Alteraes vasculares
1.6.2 Eventos celulares
1.7 NOCICEPO
17
17
18
19
20
23
24
26
28
2 JUSTIFICATIVA
31
3 OBJETIVOS
32
3.1 GERAL
3.2 ESPECFICOS
32
32
4 MATERIAIS E MTODOS
33
4.1 ANIMAIS
33
4.2 COLETA DE ALGAS
33
4.3 ISOLAMENTO DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS
35
4.4 DROGAS E REAGENTES
37
4.5 CARACTERIZAO DAS ATIVIDADES BIOLGICAS DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS
EM EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE INFLAMAO
38
4.5.1 Atividade pr-inflamatria no modelo do edema de pata
38
4.5.1.1 Envolvimento dos mediadores
38
4.5.1.2 Alteraes da permeabilidade
39
4.5.2 Atividade pr-inflamatria no modelo de peritonite induzida por C. feldmanni 39
4.5.3 Avaliao da atividade antiinflamatria
40
4.6 AVALIAO DOS EFEITOS DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS NA NOCICEPO
40
4.7 ENSAIO DE TOXICIDADE AGUDA

4.8 ANLISE ESTATSTICA
41
41
5 RESULTADOS
42
5.1 EFEITO DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS DE BOTRYOCLADIA OCCIDENTALIS,

DDDCHAMPIA FELDMANNII E SOLIERIA FILIFORMIS SOBRE O EDEMA DE PATA INDUZIDO POR
42
DDDDEXTRANA
5.2 EFEITO DA ADMINISTRAO DE DIFERENTES DOSES DOS POLISSACARDEOS

DDDDSULFATADOS
DE CHAMPIA FELDMANNII NO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR
DDDDDEXTRANA
44
5.3 EFEITO DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS DE BOTRYOCLADIA OCCIDENTALIS,

DDDCHAMPIA FELDMANNII E SOLIERIA FILIFORMIS SOBRE O EDEMA DE PATA INDUZIDO POR
46
5.4 EFEITO DO POLISSACARDEO SULFATADO DE CHAMPIA FELDMANNII ADMINISTRADO EM
DDDDIFERENTES TEMPOS DE PR-TRATAMENTO SOBRE O DESENVOLVIMENTO DO EDEMA DE
DDDPATA INDUZIDO POR CARRAGENINA
48
5.5 EFEITO DO POLISSACARDEO SULFATADO DE CHAMPIA FELDMANNII NO EDEMA DE PATA
DDDEM RATO INDUZIDO POR ZIMOSAN
50
5.6 EFEITO EDEMATOGNICO DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS DE BOTRYOCLADIA
DDDOCCIDENTALIS, CHAMPIA FELDMANNII E SOLIERIA FILIFORMIS EM RATOS
52
5.7 EFEITO DOS PLS DE CHAMPIA FELDMANNI ADMINISTRADOS EM DIFERENTES DOSES
DDDSOBRE O EDEMA DE PATA
54
5.8 EFEITOS DOS PLS DE CHAMPIA FELDMANNII SOBRE O AUMENTO DA PERMEABILIDADE
DDDVASCULAR
56
5.9 ESTUDO DO DESENVOLVIMENTO DO EDEMA DE PATA INDUZIDO PELOS
DDDPOLISSACARDEOS SULFATADOS DA ALGA MARINHA VERMELHA CHAMPIA FELDMANNII
DDDNA FASE TARDIA DO EDEMA
58
5.10 EFEITO DOS PLS DE CHAMPIA FELDMANNII SOBRE A MIGRAO DE NEUTRFILOS PARA
DDDDA CAVIDADE PERITONEAL DE RATOS
60
5.11 MODULAO DA ATIVIDADE PR-INFLAMATRIA DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS
DDDDDE CHAMPIA FELDMANNII ATRAVS DE BLOQUEIO FARMACOLGICO
62
5.12 EFEITO DOS PLS DE CHAMPIA FELDMANNII NO MODELO DE CONTORES ABDOMINAIS
DDDDINDUZIDAS POR CIDO ACTICO (TESTE WRITHING)
64
DDDDCARRAGENINA
6 DISCUSSO
66
7 CONCLUSO
72
8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
73
1 INTRODUO
1.1 Algas marinhas

As algas (do latim, algae, singular: alga) so eucariotos fotossintetizantes com uma
enorme variedade de formas e dois tipos de reproduo, sexuada e assexuada. A parede
celular de muitos destes organismos, assim como a de plantas, composta de celulose. As
algas so abundantes em gua doce ou salgada, no solo e em associao com plantas ou
fungos. Como fotossintetizadoras elas necessitam de luz e ar para a produo de alimentos
e para seu crescimento, mas geralmente no necessitam de compostos orgnicos do
ambiente. Como resultado da fotossntese, estas produzem oxignio e carboidratos, que so
utilizados por outros organismos, inclusive os animais. Dessa forma, possuem um papel
importante no equilbrio da natureza (TORTORA; FUNKE; CASE, 2002) representando a
base da cadeia alimentar nos oceanos e sustentando mais de dois teros da biomassa
mundial sendo ainda responsveis por aproximadamente metade da atividade fotossinttica
global (DAY; BENGSON; FLECK, 1999).
As algas apresentam importncia econmica muito diversificada. Como por
exemplo, fazem parte da dieta alimentar em muitos pases orientais, apesar de no
possurem alto valor nutritivo, devido ao fato de o homem no dispor de enzimas capazes
de digerir a maioria das substncias da parede celular. Estas, no entanto, fornecem sais
necessrios, bem como um certo nmero de vitaminas importantes e elementos raros,
tendo, portanto, valor como alimento suplementar. Elas podem ser utilizadas diretamente
como fertilizantes alm de fornecerem substncias intensamente exploradas na indstria de
cosmticos e alimentcia e tambm apresentarem relevantes propriedades farmacolgicas
(VAN; MANN; JANHS; 1989).
As algas so divididas em trs grandes grupos: algas verdes (Clorophyta), algas
pardas ou marrons (Phaeophyta) e algas vermelhas (Rhodophyta). As algas verdes so as
mais comuns, ocorrendo vastamente em gua doce e do mar, mas tambm em ambientes
terrestres midos. Podem ser unicelulares ou pluricelulares, coloniais ou de vida livre.
17
Possuem clorofilas a e b, carotenos e xantofilas. So verdes justamente pelo fato de a

clorofila predominar em relao aos demais pigmentos. Apresentam o amido como reserva
e sua parede celular de celulose. As algas pardas so pluricelulares e predominantemente
marinhas. Tem essa colorao devido a um pigmento carotenide, a fucoxantina. Possuem
tambm clorofilas a e c e sua parede, alm de celulose, possui polissacardeos, como a
algema e como reserva apresentam um polissacardeo caracterstico, a laminarina.
1.2 Algas marinhas vermelhas
As algas vermelhas so pluricelulares particularmente abundantes em guas

tropicais quentes. Observa-se um nmero inferior a cem espcies em gua doce, porm, o
nmero de espcies marinhas excede a soma de espcies pertencentes s divises
Phaeophyta e Clorophyta. Rhodophytas tm como pigmento predominante a ficoeritrina,
que confere a cor caracterstica do grupo, mas tambm apresentam ficocianina e clorofilas a
e d. Estas geralmente crescem presas s rochas ou sob outras algas, havendo poucas
espcies flutuantes. A maioria dessas algas apresenta uma estrutura filamentosa que cresce
a partir de uma nica clula apical e se divide seqencialmente em segmentos originando
um eixo, que por sua vez, forma verticilos de ramos laterais (RAVEN; EVERT;
EICHORN, 1996). As algas vermelhas diferem em sua composio polissacardica em
relao aos vegetais por apresentarem usualmente galactanas sulfatadas como principais
constituintes da parede celular na matriz extracelular (PAINTER, 1983). Nas algas
marinhas, os polissacardeos constituintes da matriz extracelular desempenham funes
correlacionadas com a regulao mecnica, osmtica e inica, adaptando-as ao ambiente
marinho (KLOAREG & QUATRANO, 1998).
18
1.3 Carboidratos
Os carboidratos so um grupo diverso de compostos contendo primariamente
tomos de carbono ligados a hidrognios e grupos hidroxila. Estas so as biomolculas
mais abundantes encontradas em fontes naturais, principalmente nos vegetais, que as
sintetizam num processo denominado fotossntese.
A palavra carboidrato designava, durante o sculo XIX, uma famlia de compostos
denominados hidratos de carbono representados pela frmula geral Cn(H2O)n. Com a
descoberta de novos compostos que no apresentavam as mesmas propriedades qumicas, o
significado do termo carboidrato foi modificado e ampliado. Atualmente inclui
poliidroxialdedos, lcoois cetnicos e cidos e seus derivados simples, assim como
polmeros contendo ligaes do tipo acetal (SZNAIDMAN, 1999).
Alguns carboidratos so relativamente pequenos com pesos moleculares menores
que 100 kDa. J outros so grandes macromolculas com pesos moleculares na ordem de
centenas de milhares de kDa. Perante tal diversidade, existem segundo o seu tamanho, trs
classes principais de carboidratos: monossacardeos, oligossacardeos e polissacardeos. Em
sua grande maioria, monossacardeos e oligossacardeos apresentam pequeno peso
molecular, so compostos cristalinos, solveis em gua e tm geralmente sabor doce, j os
polissacardeos, embora em geral tambm sejam solveis em gua, no apresentam sabor e
possuem alto peso molecular.
Monossacardeos so acares simples e consistem de uma unidade de
poliidroxialdedo ou cetona, que no pode ser hidrolisada a unidades menores em condies
razoavelmente suaves. O monossacardeo mais abundante na natureza a D-glucose, um
acar com seis tomos de carbono em sua molcula (LENINGHER et al., 2002).
Dissacardeos so formados pela ligao de unidades de monossacardeos (2 a 6)
unidas entre si por ligaes glicosdicas caractersticas. Ocorrem freqentemente na forma
de dissacardeos, com cadeias formadas por duas unidades de monossacardeos. Trs
importantes exemplos de oligossacardeos so os dissacardeos lactose (D-glucose + Dgalactose), maltose (D-glucose + D-glucose) e a sacarose, ou acar da cana, o qual
consiste de dois monossacardeos, D-glucose e D-frutose, (LENINGHER et al., 2002).
19
Polissacardeos consistem de longas cadeias contendo centenas de milhares de

unidades de monossacardeos. Alguns, como a celulose, ocorrem em cadeias lineares,
enquanto outros, como o glicognio, tm cadeias ramificadas. Os polissacardeos mais
abundantes, amido e celulose, sintetizados pelos vegetais, consistem de unidades repetitivas
de D-glucose, mas diferem entre si no tipo de ligao glicosdica (-D-glicose na celulose e
-D-glicose no amido). Um polmero constitudo somente por um tipo de monossacardeo
um homopolissacardeo; um polmero que contm mais de um tipo de monossacardeo
um heteropolissacardeo (CAMPBELL, 2000).
1.4 Polissacardeos sulfatados de algas marinhas

Os polissacardeos sulfatados (PLS) so macromolculas complexas que apresentam
ampla distribuio na natureza. Estes polmeros so aninicos devido a presena de alta
densidade de cargas negativas como steres sulfato e em certos casos, de resduos de cido
hexurnico. Os PLS podem ser encontrados em microrganismos, animais vertebrados e
invertebrados (DIETRICH et al., 1985) e tambm em algas, sendo, entretanto, ausentes nas
plantas superiores. Microrganismos apresentam polissacardios na composio da parede
celular, constituindo assim esse envoltrio importante para a manuteno da estrutura
destes. Muitos microrganismos secretam exopolissacardios compostos por unidades
monossacardicas largamente encontradas em organismos macroscpicos (SUTHERLAND,
1989). Em invertebrados marinhos ocorre como polissacardios de estrutura linear simples,
formados por monmeros oligossacardicos repetitivos ou como molculas de estrutura
semelhante aos glicosaminoglicanos de tecidos de mamferos, apresentando ramificao e
padro de sulfatao diferentes (ALVES et al., 1997). Polissacardios sulfatados ainda no
foram encontrados em plantas vasculares superiores (YON et al., 2002), entretanto, atravs
de sulfatao qumica, diversos polissacardios de vegetais adquirem algumas atividades
semelhantes aquelas dos PLS encontrados em vertebrados (MAGDEL et al., 1998).
As algas marinhas, so os organismos que apresentam uma maior quantidade de
PLS com propriedades biolgicas estudadas. Polissacardios sulfatados encontrados nestes
apresentam estrutura complexa, altamente heterognea e muitas vezes ramificada
20
(MULLOY et al., 1994). Os PLS encontrados na parede celular de algas marinhas pardas
(Phaeophyta)
possuem
como
carboidrato
mais
representativo
-L
fucose
(PANTANKAR et al., 1993), sendo portanto, classificados como fucanas. J nas algas
marinhas verdes (Chlorophyta) os PLS em maior quantidade so aqueles compostos por
unidades de D-manose e galactose, sendo assim classificados como arabino-galactanas
(PERCIVAL & MACDOWELL, 1967). As algas marinhas vermelhas (Rhodophyta), por
terem a galactose como seu monmero majoritrio, possuem polissacardios sulfatados
definidos como galactanas. Estas quando extradas de agarfitas e carragenfitas, so
classificadas como agaranas e carragenanas, respectivamente (ESTEVES et al., 2000).
Atravs de estudos estruturais detalhados foi definido um terceiro grupo de galactanas
denominado, hbridos-D/L (STORTZ & CEREZO, 2000) ou carrgar (CHOPIN et al.,
1999).
1.5 Atividades biolgicas de polissacardeos sulfatados de algas

marinhas
O interesse pelos polissacardeos sulfatados tem aumentado com o progresso do
conhecimento das mltiplas atividades biolgicas desempenhadas por estas molculas.
Estes compostos tm apresentado diversas propriedades tais como: atividade
antitumoral (SOEDA et al. 1994), antiproliferativa (McCAFREY et al., 1992), antiadesiva
(LEY; CERRITO; ARFORS, 1991), antiangiognica (LINHARDT & TOIDA, 1997),
antiaterosclertica (ENGELBERG, 1991) e antimetasttica (ZACHARSKI & ORNSTEIN,
1998) alm da utilizao em estudos do metabolismo da L-galactose, um de seus principais
componentes (MOURO & ASSREUY, 1995). No entanto, entre as propriedades mais
exploradas esto as aes anticoagulante e antitrombtica, sendo estudadas com o objetivo
de se encontrar um substituto a heparina (MOURO & PEREIRA, 2000).
Farias e colaboradores (2000) descreveram que duas fraes (F2 e F3) da Dgalactana sulfatada extrada da alga Botryocladia occidentalis so polissacardeos
anticoagulantes, pois aumentam a inibio da trombina e do fator Xa da coagulao na
presena de antitrombina e/ou cofator II da heparina. Foi tambm determinado, neste
21
mesmo trabalho, que o contedo de sulfato destas molculas importante para a ao

anticoagulante, uma vez que galactanas dessulfatadas perdem esta atividade. Contudo, esta
no a nica exigncia para desempenho desta funo, visto que polissacardeos altamente
sulfatados, como as dextranas sulfatadas, tm atividade anticoagulante menor que F2 e F3
de B. occidentalis. Alm disso, as fraes F2 e F3 diferem no contedo de sulfato, mas tm
aproximadamente a mesma potncia anticoagulante. Pode-se considerar, de fato, que o
principal requisito para a elevada atividade desempenhada por estas molculas parece ser a
posio especfica ocupada pelos resduos sulfato, pois a lambda carragenana, que difere
das fraes obtidas de B. occidentalis apenas neste aspecto, no apresenta atividade e
anticoagulante to alta quanto as referidas fraes. A heparina, um polissacardeo altamente
sulfatado, apresenta alguns efeitos colaterais no seu uso clnico, tais como a ineficcia para
alguns pacientes com deficincia de antitrombina, complicaes hemorrgicas e
trombocitopenia (WEITZ, 1994), somado ao fato de uma das fontes de obteno desse
anticoagulante ser o tecido bovino, apresentando assim a possibilidade da transmisso
iatrognica da encefalite bovina (doena da vaca louca), torna-se de suma importncia o
estudo de polissacardeos que possam substituir a heparina (TRENTO et al., 2001).
Polissacardeos sulfatados tambm tm demonstrado importantes efeitos na inibio
da replicao de vrus, incluindo alguns que so importantes patgenos humanos como o
vrus da imunodeficincia adquirida (HIV), herpes simples, cytomegalovrus e o vrus da
dengue (WITROUW et al., 1994; DAMONTE et al., 1996). O vrus humano herpes
simples tipo 1 (HSV1) largamente difundido no mundo, podendo causar vrias doenas e
ameaar a vida de indivduos imunossuprimidos como pacientes transplantados ou com
HIV (LEVIN, 1993; STEWART et al., 1995). Nestes casos, um anlogo da guanosina, o
acyclovir, pode ser utilizado no combate as infeces causadas pelo vrus da herpes.
Existem, porm, mutantes resistentes ao acyclovir (ACVR-HSV). Perante o insucesso deste
frmaco sobre estes indivduos resistentes foi realizado um estudo das atividades antivirais
de extratos aquosos das algas verdes (Ulva fasciata e Codium decorticatum), pardas
(Padina gymnospora, Laminaria abyssalis e Sargassum vulgare) e vermelhas (Pterocladia
capilaceae, Hypnea musciformis e Vidalia obtusiloba), provenientes da costa do Rio de
Janeiro-Brasil sobre o ACVR-HSV. Tais extratos mostraram-se efetivos e com baixa
toxicidade sendo o efeito mais significativo exercido pela alga Laminaria abyssalis, que
22
inibiu o vrus cerca de 100% em baixas concentraes de extrato (1,2% p/v) (SANTOS et
al., 1999).
Polissacardeos
sulfatados
tambm
apresentam
efeito
antinociceptivo
em
camundongos. Tal atividade foi demonstrada por Vieira e colaboradores (2004) para
polissacardeos totais extrados da alga Bryothamnion seaforthii, uma alga vermelha
comum no litoral do Cear. Estes polissacardeos administrados aos animais por via
intraperitoneal (i.p.) nas doses de 1 e 5 mg/Kg promoveram um significativo decrscimo no
nmero de contores abdominais induzidas por cido actico. No entanto, no modelo de
nocicepo causado por formalina, estes polissacardeos s foram eficazes em maior dose
(10 mg/Kg). J no modelo de placa quente, que avalia a atividade nociceptora central, a
dose de 5 mg/Kg; i.p., aumentou o tempo de reao ao estmulo trmico nos tempos 30, 60
e 90 min. de pr-tratamento. Administrados por via oral na dose de 10mg/Kg, este
carboidrato elevou o tempo de reao somente aos 60 e 90 min do pr-tratamento. Viana e
colaboradores (2004) tambm atestaram a eficcia dos polissacardeos sulfatados de uma
alga vermelha do mesmo gnero, Bryothamionion triquetrum. Estes, quando administrados
nas doses 1 e 5 mg/Kg por via intraperitoneal, tambm inibiram as contores abdominais
induzidas por cido actico em 71 e 79%, respectivamente.
Outra
propriedade
demonstrada
para
estas
molculas
sua
atividade
antiinflamatria. Polmeros de PLS extrado de algas pardas apresentaram potente inibio

do sistema do complemento humano in vitro (BLONDIN et al., 1994), sendo capazes de
inibir de maneira dose dependente, as vias clssica e alternativa desse sistema. Tissot e
colaboradores (2003) descreveram que fraes de uma fucana, de estrutura bem definida
extrada da alga parda Ascophyllum nodosum, apresentam efeito inibitrio in vitro sobre o
consumo das protenas C2, C4 e em menor grau de C3 com pouca ou nenhuma atividade
anticoagulante. Ou seja, este polissacardeo sulfatado tem a vantagem de inibir a ativao
da via clssica do sistema do complemento logo nos primeiros passos, evitando assim sua
amplificao, atravs da produo de peptdeos pr-inflamatrios. Estes dois trabalhos
sugerem que, tais polmeros (fucanas) tm, portanto, grande potencial farmacolgico
podendo ser utilizados como drogas anticomplemento e antiinflamatria atuando na
preveno de danos teciduais ou apresentando algum provvel papel no transplante de
rgos ou biomateriais.
23
Os PLS tambm apresentaram propriedades antinflamatrias in vivo. Mary e

colaboradores (2003) demonstram que polissacardeos derivados de microalgas vermelhas
Pophyridium sp., aplicados topicamente na pele de pacientes com sensibilidade ao irritante
cutneo balsamo do Peru, inibiram a formao de eritema em 55%. O mesmo trabalho
prope que a eficcia desses polissacaradeos ocorre devido a inibio do recrutamento e
adeso de neutrfilos polimorfonucleares.
1.6 Resposta inflamatria

A inflamao um importante mecanismo de defesa do organismo e se constitui de
uma resposta complexa de um tecido vascularizado contra estmulos agressores de origem
qumica, fsica ou biolgica tendo como objetivo destruir, imobilizar ou diluir o agente
lesivo. Essa reao envolve vrios fenmenos tais como, vasodilatao, aumento do fluxo
sangneo seguido de aumento da permeabilidade vascular, exudao de lquidos e
protenas plasmticas para o espao extravascular e migrao de leuccitos para o foco
inflamatrio (ROCHA & SILVA, 1979; SEDGWICK & WILLOUGHBY, 1985).
A reao inflamatria ocorre em duas fases distintas. A fase inicial, chamada de fase
aguda, geralmente tem durao relativamente curta e as primeiras manifestaes clnicas
observadas incluem: eritema, edema local, febre e dor, j descritas por Cornelius Celsus, no
incio da era crist (sinais cardinais da inflamao). Virchow, no sculo XIX, apontou a
perda de funo do tecido ou rgo lesado, como o quinto sinal cardeal (ROCHA &
SILVA, 1979). Alm disso, esta fase apresenta infiltrado predominantemente neutroflico.
A segunda denomina-se fase crnica e apresenta uma durao mais longa, estando,
associada histopatologicamente a presena de linfcitos e macrfagos, proliferao
vascular, fibrose e necrose tecidual (SEDGWICK & WILLOUGHBY, 1985).
Todas as respostas envolvidas nos eventos inflamatrios, em qualquer fase do
processo, so mediadas por fatores qumicos provenientes do plasma sanguneo ou de
clulas que se encontram no local, sejam elas residentes ou no. Estes fatores qumicos so
chamadas de mediadores inflamatrios e participam da resposta inflamatria amplificando
e influenciando a evoluo desta resposta (BAUHMAN & GAUDIE, 1994). Portanto, caso
estes mediadores sejam inibidos pode haver a modulao negativa da inflamao ou vice-
24
versa. Em determinadas condies fisiolgicas ou patolgicas, o processo inflamatrio

pode tornar-se prejudicial a clulas normais do indivduo, sendo necessrio ento que os
mediadores inflamatrios envolvidos sejam modulados negativamente (BAUHMAN &
GAULDIE, 1994, BROID, 1991).
1.6.1 Alteraes vasculares
Logo aps a leso tecidual, os vasos sangneos locais sofrem uma

vasoconstrio transitria seguida de vasodilatao por ao de uma variedade de
mediadores inflamatrios produzidos no plasma e/ou pela interao do microrganismo com
clulas teciduais (VANE, 1994). Devido a vasodilatao ocorre um aumento do fluxo
sangneo, o que provoca calor e eritema. Posteriormente, como resultado do aumento de
permeabilidade da microvasculatura e conseqente extravasamento de lquidos e protenas
para o interstcio ocorre a estase sangunea. Esses eventos so causados pela ligao dos
mediadores a receptores especficos localizados nas clulas alvo, e conseqente induo de
uma resposta. Entre estes mediadores destacam-se a bradicinina, a serotonina, a histamina,
as prostaglandinas da srie E e da srie I, sendo estes dois ltimos metablitos do cido
araquidnico formados em conseqncia da ativao da via enzimtica das ciclooxigenases.
Estas enzimas existem sob duas isoformas, a constitutiva ciclooxigenase-1 (COX-1), que
tem clara funo fisiolgica e sua ativao leva produo de quantidades pequenas de
ciclooxigenase-2 (COX-2). A forma induzida (COX-2) produz prostaglandina em grandes
quantidades responsveis pelos eventos inflamatrios. A COX-3 uma variante da COX-1
(pois derivada do mesmo gene dessa isorforma), encontra-se distribuda principalmente
no crtex cerebral, medula espinhal e corao e apresenta atividade antiinflamatria
(CHANDRASEKHARAN & DAI, 2002). A bradicinina causa dilatao induzindo a
liberao de fatores de relaxamento vascular derivados do endotlio (EDRFs). Em 1987, foi
demonstrado que um dos EDRFs liberados por clulas endoteliais o xido ntrico (NO)
(PALMER; FERRIGE; MONCADA, 1987; MONCADA; PALMER; HIGGS, 1991), que
tem participao no controle do fluxo sanguneo (FORTES; HYSLOP; DENNUCI, 1994) e
da permeabilidade vascular induzida pelo fator ativador de plaqueta (PAF) e pela prpria
bradicinina (MAYHAN, 1992). O xido ntrico sintetizado a partir de L-arginina,
25
oxignio molecular, nicotinamida adenina dinucleotdeo associado ao grupo fosfato e on

hidrognio (NAPH) e outros cofatores pela enzima xido ntrico sintase (NOS). Trs
isoformas de NOS so descritas, sendo duas constitutivas, a endotelial (eNOS) e a neuronal
(nNOS), e uma NOS induzida (iNOS), sendo que esta ltima no regulada por clcio
(NATHAN, 1997; THIEMERMAN, 1997).
O aumento da permeabilidade vascular pode ser originado de mecanismos
diretos, em que o prprio agente agressor atua sobre a parede vascular, ou indiretos, em que
h ao de mediadores qumicos que podem ativar receptores nas clulas endoteliais. Neste
processo, esto envolvidos citocinas como a interleucina-1 (IL-1) e o fator de necrose
tumoral (TNF-) que causam reorganizao citoesqueltica endotelial; histamina e
leucotrienos que causam contrao endotelial; leuccitos e agentes agressores, que
provocam leso do vaso e conseqente extravasamento de fluidos; fator de crescimento
endotelial, que promove transcitose e neovascularizao que tambm aumenta o
extravasamento de fluidos. Portanto, so vrias as substncias qumicas produzidas durante
a inflamao que modulam os processos vasculares e a ativao leucocitria, como por
exemplo: sistema de coagulao (trombina, fator Xa), o sistema fibrinoltico e o sistema das
cininas (ROBBINS; COTRAN; KUMAR, 1994) e proteases do plasma provenientes do
sistema do complemento (C3a, C5a),
O sistema do complemento um mecanismo efetor da imunidade humoral,
tanto inata como adquirida, que tem papel importante na defesa do organismo contra as
infeces. O sistema constitudo por um conjunto de cerca de 30 protenas solveis no
plasma. A ativao do complemento se d por trs vias: a clssica, a da lectina ligante de
manose (MBL) e a via alternativa (TISSOT et al., 2003). A ativao da via clssica
dependente da interao de Imunoglobulinas M (IgM) e Imunoglobulinas G (IgG) com o
antgeno. As vias alternativa e da MBL podem ser ativadas diretamente pela superfcie de
patgenos, participando, assim, da imunidade inata. As trs vias de ativao convergem
para a gerao da enzima chave, denominada convertase de C3 ou C3-convertase, principal
ponto de amplificao da cascata do complemento (LESAVRE et al., 1979). As C3
convertases apesar de estruturalmente distintas, apresentam uma atividade proteoltica
comum, que clivar C3 dando origem ao fragmento menor do sistema do complemento
ativado (C3a) e ao fragmento maior do sistema do complemento ativado (C3b). O
26
fragmento C3b gerado vai se combinar com a C3-convertase dando origem C5convertase. A clivagem de C5 pela C5-convertase inicia a via citoltica comum que culmina
com a polimerizao de C9 na membrana da clula-alvo, formando o complexo de ataque
membrana (MAC) que interfere na propriedade de permeabilidade seletiva da membrana,
permitindo a entrada de gua, ons e pequenas molculas para o citosol da clula-alvo,
distendendo a membrana alm de sua capacidade elstica e levando sua ruptura (RAWAL
& PANGBURN, 2001). Durante a ativao do complemento so gerados peptdeos com
atividade biolgica: o C3a e o C5a que tm atividade quimiottica e de anafilatoxina; o
C3b, que alm de funcionar como opsonina, facilitando a fagocitose de partculas por
fagcitos, tambm participa na composio da C3-convertase da via alternativa (C3bBb).
1.6.2 Eventos celulares

As modificaes vasculares, que incluem alteraes no leito vascular e no fluxo
sanguneo, acontecem na tentativa do organismo hospedeiro defender-se contra agentes
agressores. Ocorre assim a migrao de clulas imunolgicas ao foco da infeco que iro
fagocitar, degradar e destruir antgenos ou o tecido necrtico. Apesar da importncia destes
eventos, o mesmo pode ser potencialmente lesivo aos tecidos do prprio indivduo devido
ao prolongamento do processo inflamatrio que pode tambm lesionar clulas normais.
Alm disso, mediadores vasoativos e quimiotticos liberados pelo prprio infiltrado celular
contribuem para a amplificao dos eventos vasculares e celulares da resposta inflamatria
(BEVILACQUA et al., 1994).
As alteraes ocorridas variam de acordo com o tipo de estmulo e estgio em
que a leso se encontra. Tais alteraes, nas primeiras 24 horas, se caracterizam por um
infiltrado de origem neutroflica, que com o decorrer do processo vai sendo substitudo por
clulas mononucleares. Os leuccitos alcanam o foco da infeco devido a uma srie de
alteraes locais que resultam na adeso destas clulas ao endotlio vascular e componentes
da matriz extracelular e conseqente passagem das mesmas para o espao extravascular.
Os fenmenos celulares da inflamao envolvem o acionamento das
capacidades celulares de movimentao, de adeso e de englobamento de partculas. O
principal fenmeno a sada de leuccitos da luz vascular e sua migrao para o local
agredido. Esse fenmeno segue a seguinte seqncia: 1. marginao 2. rolamento
27
(adeso fraca) 3. adeso firme 4. diapedese 5. quimiotaxia.

Na marginao, os leuccitos posicionam-se adjacentes as clulas do endotlio
devido a quebra do fluxo laminar, como resultado das alteraes vasculares (estase
sangnea). Posteriormente, os leuccitos interagem com molculas de adeso de trs
famlias, as selectinas, as integrinas e as imunoglobulinas, que so de extrema importncia,
pois tornam possvel a adeso do leuccito ao endotlio (McEVER, 1991).
A participao destas molculas de adeso inicia-se j na adeso fraca, passo
este mediado pelas selectinas, que seguida de rolamento. Aps o rolamento, portanto,
segue-se a adeso firme dos leuccitos, fenmeno mediado por imunoglobulinas e -2
integrinas. Estas ltimas presentes na superfcie dos leuccitos podem ter sua expresso
aumentada aps a ativao do leuccito por mediadores inflamatrios como o PAF ou
citocinas. Portanto, posteriormente a adeso firme segue-se a ligao estvel de
imunoglobulinas, principalmente molcula de adeso intercelular-1 (ICAM-1), molculas
de adeso intercelular-2 (ICAM-2) e molcula de adeso de clula endotelial e plaquetas
(PCAM-1) que esto presentes no endotlio, denominadas de -2integrinas (ROBBINS,
1994).
Aps estes processos adesivos, os leuccitos migram pelas fendas entre as
clulas do endotlio, graas a movimentos amebides que realizam, fenmeno este
denominado diapedese.
Os leuccitos podem sair do interior do vaso para o foco infeccioso atrados por
agentes quimiotticos tanto de origem endgena (produtos liberados pelas prprias clulas
atravs da cascata do sistema do complemento, da lipoxigenase, citocinas, etc.) quanto de
origem exgena (agentes liberados pelo microrganismo invasor). Alm disso os agentes
quimiotticos podem se diferenciar como de ao direta, que atraem diretamente a clula
imune [leucotrieno B4 (LTB4), C5a, peptdeo N-formil-metil-L-metionil-L-leucil-Lfenilalanina (fMLP), interleucina-8 (IL-8) e subunidade I da espermadesina suna
(ASSEREUY et al., 2002)] ou de ao indireta, que agem estimulando as clulas residentes
(macrfagos, mastcitos, fibroblastos, etc.) a liberar agentes quimiotticos como o
lipopolissacardeo bacteriano (LPS), IL-8, IL-1 e TNF- (RIBEIRO et al.; 1991, 1996).
Seguida a quimiotaxia, ainda se faz necessrio que os leuccitos reconheam a
partcula ou clula causadora da infeco com subseqente fagocitose, degradao e
28
destruio deste agente. Participam do processo de reconhecimento e fixao opsoninas

[imunoglobulina G (IgG); fragmentos de C3 como o terceiro componente do sistema do
complemento ativado (C3b), algumas lectinas endgenas, colectinas, partculas que se
ligam a receptores especficos dos leuccitos, os FcR que reconhecem e se ligam a IgG,
receptores do sistema complemento, etc. Aps a ligao da partcula opsonizada ao FcR
ocorre o engolfamento e formao de fagossomo que seguido pela destruio da partcula
ingerida atravs da gerao de metablitos do oxignio, passo este dependente de
nicotinamida adenina dinucleotdeo oxidase (NADPH-oxidase, que produz perxido de
hidrognio), mieloperoxidases (MPO, que na presena de halides, como o Cl-, converte
H2O2 em HOCl), halogenao (ligao covalente do halgeno a constituintes celulares),
oxidao de protenas e lipdios ou ainda de protenas bactericidas por aumento de
permeabilidade, lisozima, lactoferrina, etc. presentes nos grnulos leucocitrios
(ROBBINS, 1994).
1.7 Nocicepo
A dor causada por leses ou doenas uma constante ao longo da histria da
humanidade e o incmodo gerado por esta levou o homem a buscar tratamentos para este
estado desde as primeiras civilizaes (CARVALHO, 1999).
A dor pode ser definida segundo Adams (1997) como um sinal precoce e fisiolgico
de morbidade, sendo a principal experincia sensorial, entre todas as outras, atravs da qual
o indivduo detecta a presena de doena em si prprio.
A nocicepo um mecanismo pelo qual o estmulo doloroso transmitido ao
sistema nervoso central. Essa transmisso envolve uma interao complexa com estruturas
perifricas ativadas pela estimulao trmica, mecnica ou qumica, e centrais da superfcie
da pele ao crtex cerebral central (FURST, 1999). As clulas responsveis pela captao
destes estmulos so chamadas de nociceptores e esto localizadas na pele, msculos,
vasos, fscia, juntas e vsceras (GRUBB, 1998, BENSSON, 1999). Esses nociceptores
apresentam terminaes de neurnios mielinizados (fibras A), mas principalmente
desmielinizadas (fibras C), que se caracterizam por no apresentar acomodao, e sim
29
facilitao do aumento de sensibilidade por estmulos contnuos. O corpo celular destes

nociceptores primrios fazem sinapse no corno dorsal com os neurnios de segunda-ordem
predominantemente na substncia gelatinosa da medula espinhal. O neurnio de segunda
ordem atravessa a medula espinhal para ascender no trato espinotalmico com suas fibras
terminais predominantemente localizadas no tlamo. No tlamo, neurnios de terceiraordem mandam axnios subseqentes diretamente a cpsula interna do crtex
somatosensorial onde ocorre a localizao destacada do estmulo nocivo, ou manda axnios
ao giro cngulo anterior onde eles esto envolvidos com componentes emocionais. Sendo
assim, o sinal doloroso proveniente da periferia, em decorrncia da ativao de um dos
tipos de nociceptores, integrado a nvel medular e a seguir projetado para o encfalo pelo
sistema ntero-lateral (GREGOR & WINDHORST, 1996). vlido salientar, que alm do
trajeto descrito (via-clssica), existem outras rotas possveis envolvendo diferentes
estruturas nervosas (BENSSON, 1999).
Existem vrios tipos de dor, chamadas de nociceptiva, neurognica, neuroptica e
psicognica, as quais esto associadas com um estmulo de nociceptores, danos do tecido
neuronal, disfuno de um nervo ou fatores psicolgicos, respectivamente (FURST, 1999;
MILLAN, 1999).
Com relao ao tempo de durao do episdio de dor, este pode ser classificado de
trs formas: a dor transitria, na qual os transdutores nociceptivos so induzidos na
ausncia de qualquer dano tecidual; a dor aguda, com a formao de dano tecidual limitado
ao local da leso e ativao dos nociceptores ou a dor crnica, comumente provocada por
uma leso ou doena, podendo ser perpetuada por outros estmulos no nociceptivos
(LOESER & MELZACK, 1999).
Drogas que apresentam propriedades analgsicas produzem efeitos devido a
modulao da liberao de mediadores analgsicos endgenos ou a inibio da
neurotransmisso algognica (GRUB, 1998; FURST, 1999; MILLAN, 1999). Vrias
substncias algognicas so liberadas dos tecidos lesados, e quando acumuladas em
quantidades suficientes, ativam os nociceptores, que como j visto apresentam ampla
distribuio. Muitos destes nociceptores esto acoplados a protena G e associados
formao de segundos mensageiros. A ao direta ou indireta desses mediadores qumicos,
como as substncias opiceas endgenas ou endorfinas; os metablitos derivados da cascata
30
do cido araquidnico, como as prostaglandinas e os leucotrienos; peptdeos, tais como

cininas, taquicininas, calcitonina, galanina, colecistocinina, peptdeo intestinal vasoativo;
serotonina; acetilcolina; glutamato; NO, adenosina trifosfato (ATP); adenosina difosfato
(ADP); cininas, etc, so os grandes responsveis pela multiplicidade de eventos que ocorre
durante a transmisso da dor, tanto no sistema nervoso central quanto no sistema nervoso
perifrico. Dentre os principais eventos, incluem-se os efeitos vasoconstrictores,
vasodilatadores, contracturantes musculares, edematognicos, ativadores de canais inicos
e de alterao de permeabilidade inica membranar, ppula, rubor, entre outros (FURST,
1999; MILLAN, 1999; CALIXTO et al., 2000). Alm desses, demonstrou-se a importncia
de certas citocinas como TNF- , IL-8 e interleucina-4 (IL-4) na mediao da nocicepo
resultante da estimulao de clulas residentes (THOMAZZI et al., 1997; CUNHA et al.,
1999).
31
2 JUSTIFICATIVA
A inflamao e a dor so de fundamental para uma resposta protetora do organismo
aos diversos tipos de agresses. Porm, a inflamao pode ser potencialmente lesiva aos
tecidos, alm de ser a maior causa de morbidade e mortalidade em diversas patologias
humanas. Portanto, os estudos delineados com o intuito de avaliar as molculas
participantes do processo inflamatrio e da dor e a caracterizao de novas substncias que
interfiram nestes so de extrema relevncia.
Sendo assim, os dados da literatura que demonstram atividade anticomplemento (in
vitro) e antinociceptiva (in vivo) de fucanas sulfatadas, nos levaram a investigao in vivo
das propriedades antiinflamatria, prinflamatria e antinociceptiva de galactanas isoladas
das algas marinhas vermelhas Botyocladia occidentalis, Champia feldmannii e Solieria
filiformis. Esta investigao pode sugerir estas molculas como ferramentas importantes
para a compreenso do papel de polissacardeos sulfatados no processo inflamatrio e gerar
um possvel perfil teraputico dos PLS e uso destes na melhora do prognstico de vrias
doenas de cunho inflamatrio tais como asma, choque sptico e artrite reumatide. E por
fim, valorizar a flora marinha de nosso vasto litoral.
32
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Investigar o papel dos polissacardeos das algas vermelhas Brotyocladia
occidentalis, Champia feldmannii e Solieria filiformis na inflamao e na nocicepo e seus
respectivos mecanismos de ao.
3.2 Especficos
a) Anti-inflamatrios
Estudar o efeito dos PLS de Brotyocladia occidentalis, Champia feldmannii e
Solieria filiformis sobre o desenvolvimento de edema de pata induzido por estmulos
inflamatrios osmtico e no-osmtico.
b)Pr-inflamatrios
1. Estudar o efeito edematognico dos PLS de B. occidentalis, C. feldmannii e S filiformis;
2. Avaliar a habilidade dos PLS de C. feldmannii em induzir migrao de neutrfilos para a
cavidade peritoneal;
3. Investigar os mediadores inflamatrios envolvidos no efeito edematognico dos PLS de
C. feldmannii.
c)Nocicepo
Estudar o efeito antinociceptivo dos PLS de C. feldmannii.
d) Toxicidade
Avaliar a toxicidade aguda dos PLS de C. feldmannii.
33
4 MATRIAIS E MTODOS
4.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar (Rattus novergicus) machos e fmeas (150-250g) e
camundongos Swiss albinos, machos (25-35g), que foram fornecidos pelo Biotrio Central
do Campus do Pici da Universidade Federal do Cear. Estes animais receberam rao e
gua ad libitum, sob condies adequadas de luz e temperatura e foram manipulados de
acordo com os princpios estabelecidos pelo Comit de tica em Pesquisa-UECE para uso
destes animais de experimentao.
4.2 Coleta das algas

As algas marinhas vermelhas Botryocladia occidentalis (FIGURA 1),
Champia feldmannii (FIGURA 2) e Solieria filiformis (FIGURA 3) foram coletadas na
praia do Pacheco, municpio de Caucaia, Fortaleza-Cear, Brasil. As espcies foram
coletadas em rochas de meso-litoral durante as mars de sizgia. Em seguida, a mesma foi
transportada em saco plstico at o laboratrio, sendo cuidadosamente separada das epfitas
e lavada com gua destilada para a retirada de impurezas. Aps a limpeza, a alga foi
desidratada luz solar e cortada em pequenos pedaos para, posteriormente, ser submetida
ao processo de extrao.
34
Figura 1- Foto da alga marinha Botryocladia occidentalis.
Figura 2- Foto da alga marinha Champia feldmannii.
Figura 3- Foto da alga marinha Solieria filiformes.
35
4.3 Isolamento dos polissacardeos sulfatados

Os PLS utilizados foram isolados e purificados no Laboratrio de Bioqumica
Marinha-BIOMARLAB do Departamento de Engenharia de Pesca (UFC) segundo a
metodologia descrita por Farias e colaboradores (2000). Aps a coleta, as algas de nosso
interesse, foram separadas das epfitas e outras algas menores e desidratadas sob luz solar.
O tecido seco (5g) foi cortado em pequenos pedaos e hidratado em 250 mL de tampo
acetato de sdio 0,1M; pH 5,0; 5mM de cido etilenodiamonotetractico (EDTA) e cistena
(5mM). A mistura foi incubada com papana bruta (30mg/mL) a 60C em banho maria
por 24 horas e filtrada em placa porosa. O resduo obtido foi lavado em 138 mL de gua
destilada, submetido a outra filtragem e o filtrado obtido reunido ao da primeira filtragem.
Os polissacardeos sulfatados presentes na amostra foram precipitados atravs da adio de
16 mL de uma soluo a 10% de cloreto de cetilpiridnio, para que ocorresse a precipitao
dos carboidratos sulfatados, e mantidos por 24 horas, temperatura ambiente. A soluo foi
ento centrifugada (10.000 x g, 20 min, 5C) e o sobrenadante descartado. O precipitado foi
lavado com 610 mL de uma soluo a 0,05% de cloreto de cetilpiridnio e depois dissolvido
em 172 mL de NaCl 2M e etanol absoluto (100:15, v/v). Os polissacardeos sulfatados
foram novamente precipitados com 305 mL de etanol absoluto por 24 horas a 4 C. O
precipitado, obtido por centrifugao (10.000 x g, 20 min, 5C), foi lavado duas vezes com
305 mL de etanol a 80% e uma vez com o mesmo volume de etanol absoluto. O material
foi seco em estufa a 60C por 24 horas, sendo obtido ento o extrato bruto (FIGURA 4).
Aps obteno de cerca de 200mg do PLS na etapa anterior, estes foram dissolvidos
em 40 mL de tampo acetato de sdio 50 mM, pH 6,0 e a soluo obtida, foi adicionada a
250 mL de uma resina de DEAE-celulose previamente equilibrada com o mesmo tampo.
O concentrado de polissacardeos totais (1 mL de uma soluo contendo 1 mg/mL de
extrato de polissacardeos) foi submetido a uma cromatografia de troca inica em coluna de
DEAE-celulose. A coluna foi equilibrada em tampo acetato de sdio 0,1M, pH 5,0 +
EDTA 5mM + cistena 5mM a um fluxo de 60mL/h. A eluio da coluna realizou-se, passo
a passo, com o tampo de equilbrio com diferentes concentraes.
36
ALGA DESIDRATADA
Hidratao (tampo acetato de sdio 0,1 M pH 5.0 + EDTA
5mM + cistena 5mM + papana 30mg/mL / 60 por 24 h
Material digerido
Filtrao em placa porosa
Filtrado
Resduo (re-filtado)
16 mL de soluo 10% de
cloreto de cetilpiridnio 25C 24 h
Precipitado
Centrifugao 10.000 x g, 20 min, 5C
Sobrenadante
(descartado)
Resduo
Lavagem (0,05% cloreto de cetilpiridnio) e
dissoluo 172 mL NaCl 2 M e etanol absoluto
Homogenato
Etanol absoluto 24 h, 4 C
Precipitado
Centrifugao 10.000 x g, 20 min, 5 C
Resduo
Lavagem etanol 80% (2x) e etanol absoluto (1x)
POLISSACARDEOS SULFATADOS TOTAIS

Figura 4. Esquema geral de extrao dos polissacardeos totais.
37
4.4 Drogas e reagentes
cido actico glacial - Isofar

Albumina (ampolas de 2mg/mL) - Pierce
Azul de Evans - Sigma Chemical
Carragenina - Sigma Chemical
Cloreto de Sdio (ampolas de 250 mL) Frenesius e Kabi Brasil LTDA
Corante histolgico (Hematoxilina/eosina) - Isofar
Dexametasona (Decadronal) Prodome Qumica e Farmacutica
Dextrana - Sigma Chemical
Heparina (ampolas de 5.000 UImL)- Cristlia
Indometacina (cpsulas, 25mg; Indocid) - Prodome
L-NAME - Sigma Chemical
Meclizina (Meclin) Laboratrio Apsen
Pentoxifilina - Sigma Chemical
Soluo de Turk Isofar
Violeta Genciana Laboratrio Tatuna LTDA.
Zimosan - Sigma Chemical
38
4.5 Caracterizao das atividades dos polissacardeos sulfatados

em modelos experimentais de inflamao
4.5.1 Atividade pr-inflamatria no modelo do edema de pata
O modelo do edema de pata foi utilizado no estudo das propriedades prinflamatrias dos polissacardeos sulfatados. No estudo destas propriedades a substncia
estudada, ou seja, os PLS so administrados nas patas de cada animal, sendo a evoluo do
edema acompanhado por pletismografia.
O edema obtido nesse estudo foi calculado como a diferena entre o volume das
patas em um determinado tempo aps o estmulo e antes do estmulo (tempo zero). As reas
sob as curvas (ASC) tambm foram calculadas usando o mtodo do trapzio (LANDUCCI
et al., 1995). Os resultados foram expressos em unidades arbitrrias e comparados queles
obtidos das patas dos animais injetados somente com os estmulos inflamatrios.
Nos experimentos realizados os polissacardeos sulfatados das diferentes algas
foram injetados por via subcutnea (s.c.) nas doses de 0,1; 0,3 ou 0,9 mg/Kg. Na maioria
dos experimentos o desenvolvimento do edema foi acompanhado aps a administrao dos
PLS nos tempos , 1, 2, 3, 4 h.
4.5.1.1 Envolvimento dos mediadores
Na investigao da participao de mediadores inflamatrios no edema de pata

induzido pelos PLS de C. feldmannii fora utilizados os antagonistas, listados abaixo, tendo
sido os mesmos administrados 30 ou 60 min. antes da administrao dos PLS (0,9 mg/Kg)
injetados em 0,01 mL/Kg de peso corporal com salina estril, por via s.c. ou e.v.
1. Dexametasona - glicocorticide (1mg/Kg; s.c.; pr-tratamento de 1h) (LEMOS et al.,

2002);
2. Indometacina - inibidor de prostaglandinas (5mg/Kg, s.c ; 1 h) (LEMOS et al., 1);
3. L-NAME- inibidor da sntese de xido ntrico (25mg/Kg; e.v; 1 h) (CUZZOCREA et al.,
1997);
39
4. Meclizina - anti-histamnico (30 mg/Kg; s.c; 30 min.) (FEITOSA et al., 2002);

5. Pentoxifilina, inibidor de TNF e IL1 (90mg/Kg, s.c.; 1 h) (FEITOSA et al., 2002).
4.5.1.2 Alteraes da permeabilidade
A metodologia empregada para a quantificao da permeabilidade vascular foi

baseada naquela utilizada por Leme & Wilhelm (1974).
Os animais foram administrados com Azul de Evans (25 mg/Kg) por via
intrapeniana. Aps 30 min cada animal recebeu o estmulo inflamatrio C. feldmannii (0,9
mg/Kg) ou salina estril (0,01 mL/100g de peso corporal) por via s.c. intraplantar. Passados
30 min da administrao destes foi realizado o sacrifcio dos animais por deslocamento
cervical, sendo ento as patas seccionadas logo abaixo do malolo, pesadas e incubadas em
1mL de formamida concentrada, temperatura de 360C por 72h.
Em seguida, para se quantificar o Azul de Evans extrado dos tecidos foi realizada a
leitura das densidades pticas (por espectrofotometria, A 600nm) do sobrenadante da
soluo previamente incubada. Os dados obtidos em absorbncia foram convertidos em g
do azul de Evans, atravs da regresso linear baseado em uma curva padro. Os resultados
foram calculados em g de azul de Evans/g pata.
4.5.2 Atividade pr-inflamatria no modelo de peritonite induzida por C.

feldmannii
Os PLS de C. feldmannii na dose de 0,9 mg/Kg contidos em 1,0 mL de uma

soluo de salina estril (NaCl 0,15 M) foram injetados por via intraperitoneal (i.p.) nos
animais, caracterizando assim o controle positivo de migrao de neutrfilos. O controle
negativo, foi administrado com salina (1 mL/cavidade). Os animais forma sacrificados no
melhor tempo da atividade edematognica, ou seja, 1h aps receberem as respectivas
substncias os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. As clulas presentes
na cavidade peritoneal foram coletadas atravs da lavagem de cada cavidade, injetando-se
10 mL de salina contendo 5 UI/mL de heparina. As contagens total e diferencial dos
40
leuccitos foram realizadas conforme metodologia descrita por Souza & Ferreira, (1985).
Neste procedimento, 20 L do fluido coletado de cada animal foi diludo em 380 L de
reagente de Turk e posteriormente usados para a contagem total de leuccitos em cmara de
Neubauer por microscopia ptica. A contagem diferencial (foi realizada atravs de
esfregaos corados pelo mtodo da hematoxilina/eosina (HE).
Foram contadas 100 clulas por cada lmina e calculada a percentagem de cada uma
delas. O nmero de neutrfilos, moncitos, linfcitos e eosinfilos foram estimados por L
do fluido peritoneal, calculando-se a percentagem obtida na contagem diferencial do
nmero total de leuccitos.
4.5.3 Avaliao da atividade antiinflamatria
O modelo do edema de pata tambm foi utilizado no estudo das propriedades

antiinflamatrias dos polissacardeos sulfatados. Neste caso os PLS de B. occidentalis, C.
feldmannii e S. filiformis foram administrados por via e.v. nas doses de 0,1; 0,3 ou 0,9
mg/Kg em diferentes tempos (0, 10 ou 30 min. antes) com relao a aplicao dos
estmulos inflamatrios carragenina (Cg) (2 mg/pata), dextrana (300g/pata) ou zimosan (1
mg/pata). O controle positivo de edema foi o grupo administrado somente com salina e.v. e
Cg, dextrana ou zimosan s.c. O controle negativo foi o grupo de animais administrados com
salina e.v. e s.c.
4.6 Avaliao dos efeitos dos polissacardeos sulfatados na

nocicepo
O teste de atividade dos PLS sobre a nocicepo teve como finalidade avaliar o
efeito dos PLS administrados por via endovenosa sobre a induo da dor, atravs de um
modelo de nocicepo qumica, o teste das contores abdominais induzidas por cido
actico (Teste de Writhing).
41
Este teste tem como objetivo a determinao da atividade analgsica perifrica. A

metodologia utilizada seguiu o modelo proposto por Koster e colaboradores (1959). Cada
grupo experimental foi constitudo de 8 a 10 camundongos. As contores abdominais
foram induzidas atravs da injeo de cido actico 0,6% (v/v) administrados i.p. (0,1
mL/10g de peso corporal). Aps 10 min da administrao do cido actico foi feita a
contagem do nmero de contores abdominais durante 20 min consecutivos. Nos animais
do grupo experimental, 30 min antes de receber a injeo de cido actico, foram injetados
os PLS de C. feldmannii (0,2; 1; 5 e 25 mg/Kg, i.p.) dissolvidos em 0,1 mL/10g de peso
corporal com salina estril. O controle negativo recebeu apenas o veculo (0,1 mL/10g, i.p.)
tambm 30 min antes de receber o cido actico. A porcentagem da inibio foi calculada
atravs da comparao das mdias das contores obtidas dos grupos controle positivo
(injetados apenas com cido actico) com o grupo experimental (pr-tratados com PLS
antes de serem injetados com cido actico).
4.7 Ensaio de toxicidade aguda

A toxicidade foi realizada em grupos de dez camundongos distribudos ao acaso e
tratados, em dose nica, com salina (0,1 mL/10g, e.v.) ou com os PLS de Champia
feldmannii (1; 5 ou 25 mg/Kg; e.v. contidos em 0,1 mL para cada 10g de peso corporal)
tendo sido avaliadas durante 48 horas, alm das mortes, alteraes fsicas, fisiolgicas e
comportamentais tais como: convulses, prurido, piloereo e freqncia cardaca e
respiratria dentre outros e letalidade.
4.8 Anlise estatstica

De todos os experimentos foram calculadas as Mdias das respostas Erro Padro
da Mdia (EPM). As diferenas estatsticas entre os grupos foram obtidas atravs da anlise
de varincia (ANOVA) e teste de Ducan ou teste t de Student para dados pareados ou nopareados p < 0,05 foi fixado para indicar significncia estatstica.
42
5 RESULTADOS
5.1 Efeito dos polissacardeos sulfatados de Botryocladia
occidentalis, Champia feldmannii e Solieria filiformis sobre o
edema de pata induzido por dextrana
A injeo subcutnea intraplantar de 300g/pata do estmulo inflamatrio dextrana,

uma substncia conhecida por induzir um edema osmtico acelular (LO et al., 1982),
promoveu intenso edema, quando comparado com o grupo salina, que atingiu um pico
mximo nos primeiros 30 min de seu desenvolvimento (0,68 0,04 mL), mantendo-se o
mesmo elevado at 4 hora aps sua administrao. Os PLS de B. occidentalis, C.
feldmannii e S. filiformis injetados por via endovenosa (e.v) na dose de 0,9 mg/Kg, 30 min.
antes da administrao de dextrana, no promoveram reduo do edema elicitado pela
dextrana em nenhum dos tempos analisados. Houve sim uma potencializao do edema de
pata induzido por dextrana no grupo pr-tratado com C. feldmannii nos tempos de 120 e
240 min da administrao do estmulo em 25% e 53%, respectivamente, e no grupo tratado
com B. occidentalis aps 240 min., com um aumento de 53% (FIGURA 5).
Devido a escassez de trabalhos que utilizem polissacardeos sulfatados in vivo,
optou-se por investigar a possibilidade da dose utilizada estar acima da faixa adequada para
produo do efeito testado.
43
salina (0,01 mL/kg)

dextrana (300 g/pata)
Botryocladia occidentalis (0,9 mg/kg)
1,0
Champia feldmannii (0,9 mg/kg)

Solieria filiformis (0,9 mg/kg)
A
Edema (mL)
0,8
0,6
#
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
150
*#
ASC (unidades arbitrrias)
100
50
salina
B. occidentalis C. feldmannii S. filiformis
Dextrana 300 g/pata
Figura 5- Os polissacardeos sulfatados das algas Botryocladia occidentalis, Champia feldmannii e

Solieria filiformis no inibem o edema de pata induzido por dextrana. Os PLS foram administrados (0,9
mg/Kg, e.v.) 30 min. antes da dextrana. O grupo controle positivo recebeu dextrana (300g/pata, s.c.). O
grupo controle negativo recebeu salina (0,1 mL/100g de peso corporal) e.v. e s.c. O edema foi medido antes
(tempo zero) e nos tempos 30, 60, 120, 180 e 240 min aps a injeo de dextrana e expresso como a variao
dos volumes das patas (mL) entre os vrios tempos e o tempo zero. (Painel A). As reas sob as curvas (ASC)
foram determinadas, utilizando-se o mtodo do trapzio (Painel B). Cada ponto representa a mdia E.P.M.
da variao de volume de pata de 6 ratos. *p<0,05 em relao ao grupo salina. # p<0,05 C. feldmannii em
relao a dextrana.
44
5.2
Efeito
da
administrao
de
diferentes
doses
dos
polissacardeos sulfatados de Champia feldmannii sobre o

edema de pata induzido por dextrana
A injeo subcutnea intraplantar de dextrana 300 g/pata causou intenso edema
com um pico mximo j nos primeiros 30 min (0,83 0,04 mL) de seu desenvolvimento.
Os PLS de Champia feldmannii injetados e.v. (0,1; 0,3; 0,9 mg/Kg), 30 min antes da
administrao de dextrana, no promoveram reduo do edema, em nenhuma das doses
utilizadas confirmando assim a ineficcia dos PLS testados neste edema. Ocorreu tambm
neste caso uma potencializao do edema de dextrana, devido a injeo de C. feldmannii
em todas as doses utilizadas, ou seja, 0,1 mg/Kg em 60 e 180 min; 0,3 mg/Kg em 240 min e
0,9 mg/Kg em 120 min. (FIGURA 6).
Estes dados confirmam o anterior no que diz respeito a capacidade dos PLS de C.
feldmannii de potencializar o edema da dextrana, em certos tempos, e exclui tambm a
questo da dosagem utilizada ter sido elevada. Isto nos leva a propor uma investigao das
atividades destes polissacardeos sobre outro estmulo inflamatrio, a carragenina que induz
um edema de pata que envolve a liberao temporal de vrios mediadores inflamatrios,
com grande infiltrao leucocitria (LO et al., 1982).
Apesar de identificarmos a potencializao em determinados tempos, no foi detectada
uma potencializao no clculo da integral das reas sobre as curvas (ASC).
45
salina (0,01 mL/kg)

dextrana (300 g/pata)
1,2
1,0
Edema (mL)
#
0,8
0,6
"
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
250
B
200
150
100
50
salina
0,1
0,3
0,9
Champia feldmannii mg/Kg
Dextrana (300 g/pata)
Figura 6- O polissacardeo sulfatado de Champia feldmannii administrado em diferentes doses no

apresenta efeito antiinflamatrio. Os animais receberam o PLS de C. feldmannii via subcutnea intraplantar
(0,1; 0,3 ou 0,9 mg/kg de peso corporal) antes da injeo de dextrana. O grupo controle positivo recebeu
dextrana (300g/pata, s.c.). O controle negativo recebeu salina (0,01mL/kg de peso corporal; s.c.). O edema
foi medido antes (tempo zero) e nos tempos de 30, 60, 120, 180 e 240 min aps a injeo dos PLS ou salina e
expresso como a variao dos volumes deslocados pelas patas (mL) entre os vrios tempos e o tempo zero
(Painel A). As reas sob as curvas (ASC) foram determinadas, utilizando-se o mtodo do trapzio (Painel B).
Cada ponto representa a mdia E.P.M. da variao de volume da pata de 6 ratos. *p<0,05 C. feldmannii 0,1
mg/Kg em relao a dextrana. *p<0,05 C. feldmannii 0,3 mg/Kg em relao a dextrana. #p<0,05 C.
feldmannii 0,9 mg/Kg em relao a dextrana.
46
5.3
Efeito dos polissacardeos sulfatados de Botryocladia

occidentalis, Champia feldmannii e Solieria filiformis sobre o
edema de pata induzido por carragenina
A injeo subcutnea intraplantar de Cg (2 mg/pata) promoveu intenso edema de
pata que atingiu um pico mximo na 3 hora (1,22 0,08 mL) de seu desenvolvimento,
decaindo depois desse. A administrao e.v. (0,9 mg/Kg) dos PLS de B. occidentalis, C.
feldmannii e S. filiformis 30 min. antes da administrao de Cg, no promoveram reduo
do edema em nenhum dos tempos analisados. Observou-se mais uma vez que o grupo prtratado com C. feldmannii apresentou potencializao do edema no tempo 60 min (92%)
(FIGURA 7).
Esses dados confirmam a ineficcia dos PLS utilizados em inibir o edema de pata
induzido pelos estmulos utilizados at agora. Porm, existe a possibilidade da varivel
tempo de pr-tratamento estar interferindo com os efeitos desses sobre o desenvolvimento
dos edemas avaliados. Portanto, no experimento seguinte foi realizado o pr-tratamento dos
animais com os PLS em diferentes tempos.
47
salina (0.01 ml/100g)

Cg (2 mg/pata)
Champia feldmannii (0,9 mg/Kg)
Solieria filiformes (0,9 mg/Kg)
Botryocladia occidentalis (0.9 mg/Kg)
1,4
1,2
A
Edema (ml)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
250
*#
B
*
ASC (unidadesarbitrrias)
200
150
100
50
salina
C. feldmannii S. filiformis B. occidentalis
Carragenina 2 mg/pata

Solieria filiformis no inibem o edema de pata induzido por carragenina. O PLS foram administrados e.v.
(0,9 mg/Kg) 30 min. antes da injeo de Cg. O grupo controle positivo recebeu Cg (2 mg/pata). O grupo
controle negativo recebeu salina (0,1 mL/100g de peso corporal; e.v. e s.c.). O edema foi medido antes (tempo
zero) e nos tempos 30, 60, 120, 180 e 240 min aps a injeo de Cg e expresso como a variao dos volumes
das patas (mL) entre os vrios tempos e o tempo zero. (Painel A). As reas sob as curvas (ASC) foram
determinadas utilizando-se o mtodo do trapzio (Painel B). Cada ponto representa a mdia E.P.M. da
variao de volume de pata de 6 ratos. * p < 0,05 em relao ao grupo salina. #p<0,05 C. feldmannii em
relao a Cg.
48
5.4 Efeito do polissacardeo sulfatado de Champia feldmannii

administrado em diferentes tempos de pr-tratamento sobre o
desenvolvimento do edema de pata induzido por carragenina
A injeo de carragenina (2 mg/pata; s.c.) promoveu intenso edema de pata que

atingiu um pico mximo na 4 hora (0,83 0,006 mL) de seu desenvolvimento. A injeo
e.v. (0,9 mg/Kg) dos PLS de Champia feldmannii, em tempos variados (concomitante, 10
ou 30 min) anteriores a administrao de carragenina no foi capaz de inibir o
desenvolvimento do edema causado por este estmulo inflamatrio. Houve ainda uma
potencializao do edema elicitado por Cg aos 120 min. (FIGURA 8).
Devido o pico de ao pr-inflamatria dos PLS de C. feldmannii coincidir com o
pico pr-inflamatrio da dextrana, no se investigou a varivel tempo na ao desses PLS
no edema elicitado por esse agente edematognico. Em funo dos resultados obtidos at
agora, decidiu-se investigar a atividade dos PLS de C. feldmannii frente a estmulo, com
ao diferente das drogas utilizadas at agora, o zimosan. Esta substncia apresenta ao
pr-inflamatria via influxo de moncitos e ativao da cascata do sistema do complemento
(DAMAS & PRUNESCO, 1990).
49
salina (0.01ml/Kg)
Cg (2mg/pata)
C. feldmannii (concomitante)
C.feldmannii (10 min)
C. feldmannii (30 min)
1,4
1,2
A
1,0
Edema (ml)
*
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
300
Tempo(min)
250
200
*
*
150
100
50
salina
Carragenina
concomitante
10 minutos
30 minutos
Champia feldmannii (0,9 mg/Kg)
Figura 8- O Polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii pr-tratado em diferentes tempos no

inibe o edema de pata induzido por carragenina. O PLS de C. feldmannii (0,9 mg/Kg) foi administrado
e.v. nos tempos zero, 10 ou 30 min. antes da injeo de Cg. O grupo controle positivo recebeu Cg (2 mg/pata)
s.c. O grupo controle negativo recebeu salina (0,01 mL/Kg de peso corporal; e.v. e s.c.). O edema foi medido
antes (tempo zero) e nos tempos de 30, 60, 120, 180, 240 e 300 min aps a injeo de Cg e expresso como a
variao dos volumes das patas (mL) entre os vrios tempos e o tempo zero. (Painel A). As reas sob as
curvas (ASC) foram determinadas utilizando-se o mtodo do trapzio (Painel B). Cada ponto representa a
mdia E.P.M. da variao de volume de pata de 6 ratos. *p<0,05 comparado ao grupo salina. #p<0,05 C.
feldmannii (concomitante) em relao a Cg.
50
5.5 Efeito do polissacardeo sulfatado de Champia feldmannii

sobre o edema de pata em ratos induzido por zimosan
A injeo subcutnea intraplantar de zimosan (1 mg/pata) promoveu intenso edema
de pata que atingiu um pico mximo na 1 hora (1,12 0,09 mL) de seu desenvolvimento.
O PLS de C. feldmannii injetado e.v. (0,9 mg/Kg) concomitantemente com a administrao
de zimosan, no promoveu reduo do edema, provocando por outro lado, uma
potencializao do efeito pr-inflamatrio no tempo 60 e 120 min de 28 e 13%,
respectivamente (FIGURA 9).
Com esse conjunto de resultados percebe-se a ausncia de atividade antiinflamatria
dos PLS testados no modelo de edema de pata. Fica sugerida, em funo das
potencializaes do edema, sua atividade edematognica. partir do prximo experimento,
avalia-se ento a atividade pr-inflamatria dos polissacardeos das algas B. occidentalis,
C. feldmannii e S. filiformes em dois modelos experimentais, edema e peritonite.
51
salina (0,01mL/Kg)
Zimosan (1mg/Kg)
C. fedmannii (0,9mg/Kg)
1,4
1,2
#
Edema (ml)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
300
360
Tempo (min)
B
400
ASC (unidades arbitrarias)
350
300
250
200
150
100
50
0
salina
C. feldmannii
Zimosan (1mg/pata)
Figura 9- O polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii no inibe o edema de pata

induzido por zimosan. O PLS de C. feldmannii foi administrado e.v. (0,9 mg/Kg de peso corporal)
concomitantemente com a injeo de zimosan. O grupo controle positivo recebeu zimosan (1
mg/pata) contido em 0,2 mL de salina; s.c. O grupo controle negativo recebeu salina (0,01 mL/Kg
de peso corporal; e.v. e s.c.). O edema foi medido antes (tempo zero) e nos tempos de 30, 60, 120,
180, 240, 300 e 360 min aps a injeo de zimosan e expresso como a variao dos volumes das patas
(mL) entre os vrios tempos e o tempo zero. (Painel A). As reas sob as curvas (ASC) foram
determinadas utilizando-se o mtodo do trapzio (Painel B). Cada ponto representa a mdia
E.P.M. da variao de volume de pata de 6 ratos. *p<0,05 em relao a salina. #p<0,05 C.
feldmannii em relao ao zimosan.
52
5.6 Efeito edematognico dos polissacardeos sulfatados de

Botryocladia occidentalis, Champia feldmannii e Solieria
filiformis em ratos
Os PLS de cada alga foram injetados por via s.c. intraplantar na dose de 0,9 mg/Kg.
O tratamento dos animais com os PLS causou edema em todos os tempos (30, 60, 180 e
240 min) analisados ao longo do experimento. Nos grupos tratados com S. filiformes e C.
feldmannii o pico de atividade ocorreu em 30 e 60 minutos, respectivamente, tendo o
edema decrescido partir dos 60 minutos aps a administrao dos PLS. O grupo que
recebeu os PLS de B. occidentalis apresentou edema significativo apenas na 1 hora do
experimento (FIGURA 10).
Observa-se que todos os PLS apresentaram atividade edematognica, sendo aquela
produzida pelos PLS de C. feldmannii a mais pronunciada. Com esse dado que afirma a
maior atividade pr-inflamatria da alga C. feldmannii, decidiu-se analisar a correlao
entre a variao da dose e a atividade edematognica dos PLS dessa, investigando-se,
portanto a existncia de uma atividade dose-resposta.
53
salina (0,01 mL/kg)

Botryocladia occidentalis (0,9mg/kg)
Champia feldmannii (0,9mg/kg)
Solieria filiformis (0,9mg/kg)
0,8
Edema (mL)
0,6
*
*
0,4
*
*
*
*
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
125
100
75
*
50
*
25
salina
B. occidentalis C. feldmannii S. filiforme
Solieria filiformis induzem a formao de edema de pata. Os PLS foram administrados s.c. (0,9 mg/Kg) na
pata traseira direita de ratos. O grupo controle negativo recebeu salina (0,01 mL/Kg de peso corporal; s.c.) na
pata traseira esquerda. O edema foi medido antes (tempo zero) e nos tempos de 30, 60, 120, 180 e 240 min
aps a injeo dos PLS expresso como a variao dos volumes das patas (mL) entre os vrios tempos e o
tempo zero. (Painel A). As reas sob as curvas (ASC) foram determinadas, utilizando-se o mtodo do
trapzio (Painel B). Cada ponto representa a mdia E.P.M. da variao de volume de pata de 6 ratos. (Painel
B). * p<0,05 comparado ao grupo salina.
54
5.7 Efeito dos PLS de Champia feldmannii administrados em

diferentes doses sobre o edema de pata
Em todas as doses testadas os PLS de C. feldmannii administrados por via s.c.
intraplantar provocaram intenso edema, com um pico de ao j nos primeiros 30 minutos
(dose 0,3 mg/Kg) e 60 minutos (dose 0,1 e 0,9 mg/Kg) ocorrendo o decrscimo do edema
nos tempos posteriores de acompanhamento. Porm, na dose de 0,9 mg/Kg ocorreu o efeito
mais pronunciado (0,5 0,02 mL, na 1 hora) de todos (FIGURA 11).
A demonstrao da atividade edematognica mais intensa destes PLS na dose de 0,9
mg/Kg nos levou a selecionar essa dose para avaliar um outro parmetro inflamatrio, ou
seja, as alteraes vasculares nos tecidos das patas dos animais, que esto ocorrendo devido
a ao destas substncias.
55
Salina (0,01mL/Kg)
C. feldmannii (0,1mg/Kg)
C. feldmannii (0,3mg/Kg)
C. feldmannii (0,9mg/kg)
0,6
edema (ml)
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
120
*
100
* #
80
60
40
20
0
salina
0,1
0,3
0,9
C. feldmannii (mg/kg)
Figura 11- Os polissacardeos sulfatados da alga Champia feldmannii provocam edema de pata em ratos
em diferentes doses. Os PLS de C. feldmannii (0,1; 0,3 e 0,9 mg/Kg, contidos em 1 mL de salina estril)
foram injetados por via s.c. intraplantar. O grupo controle negativo recebeu injeo s.c. intraplantar i.p de
salina estril (0,01 mL/Kg). O edema foi medido antes (tempo zero) e nos tempos de 30, 60, 120, 180 e 240
min aps a injeo dos PLS e expresso como a variao dos volumes das patas (mL) entre os vrios tempos e
o tempo zero (Painel A). As reas sob as curvas (ASC) foram determinadas, utilizando-se o mtodo do
trapzio (Painel B). Cada ponto representa a mdia E.P.M. da variao de volume de pata de 6 ratos. (Painel
B) *p<0,05 comparado ao grupo salina e # p<0,05 em relao ao grupo C. feldmannii 0,9 mg/Kg.
56
5.8 Efeitos dos PLS de C. feldmannii sobre o aumento da

permeabilidade vascular
A injeo s.c. intraplantar dos PLS (0,9 mg/Kg) induziu, no pico de ao destas
substncias nessa dose, ou seja, 1 hora aps sua administrao, um aumento significativo da
permeabilidade vascular (p<0,05) quando comparado aos animais controle, que receberam
o mesmo volume de salina estril s.c. intraplantar (FIGURA 12).
Este dado, somado ao conjunto de experimentos anteriores, confirma a capacidade
pr-inflamatria dos PLS de C. feldmannii atravs da avaliao de um outro parmetro, a
quantidade de protena extravasada para os tecidos da pata. Porm, desconhecida a
atividade destes PLS na fase tardia do edema delineou-se ento um experimento para
acompanhamento do edema dos PLS de C. feldmannii no somente nas fases iniciais de
edema (fase aguda).
57
45
40
Azul de evans (ug/g)
35
30
25
20
15
10
5
0
salina
Champia feldmannii
Figura 12 Os PLS de C. feldmannii induzem um aumento de permeabilidade vascular em pata de

ratos. Os animais foram tratados s.c. com os PLS (0,9 mg/Kg) ou salina (controle negativo) (0,01 mL/Kg).
Todos os animais receberam azul de Evans (25 mg/Kg, e.v.), 1 h antes do sacrifcio, o qual ocorreu na
primeira hora aps a injeo dos PLS. Os resultados foram expressos como mdia E.P.M de g de azul de
Evans/g de pata. *p<0,05 em relao ao grupo salina.
58
5.9 Estudo do desenvolvimento do edema de pata induzido pelos

polissacardeos
sulfatados
da
alga
marinha
vermelha
Champia feldmannii na fase tardia do edema

Como demonstrado anteriormente os PLS de C. feldmannii causam edema de pata
em ratos quando injetados em diferentes doses por via subcutnea intraplantar
acompanhado at a 4 hora. Foi comprovado mais uma vez com esse experimento que estas
substncias quando administradas (0,9 mg/Kg, s.c) induzem a intenso edema com pico
mximo de atividade na primeira 1 hora (1,01 0,03 mL) aps sua administrao quando
comparado com o grupo controle que recebeu salina (0,01 mL/Kg). O edema em questo
foi significativamente diferente do grupo controle negativo desde os primeiros 30 min e
manteve-se elevado (p<0,05) durante 12 h de seu desenvolvimento, regredindo a nveis
basais somente aps 24 h da administrao dos PLS (FIGURA 13).
Este dado demonstra a significativa atividade pr-inflamatria dos PLS em questo
atestando tambm que os mesmos parecem no induzir a processos caractersticos a fase
crnica devido o edema ter retornado a nveis basais depois de 24 horas da injeo dos
mesmos. Por outro lado, no se tem conhecimento sobre as alteraes teciduais que podem
estar ocorrendo, como a migrao de clulas, processo esse fundamental em todas as
respostas e fases envolvidas nos eventos inflamatrios. Para testar tal parmetro foi
investigado ento as alteraes na migrao de clulas provocadas por estes PLS no modelo
de peritonite.
59
salina (0,01ml/kg)
Champia feldmannii (0,9mg/Kg)
1,2
1,0
Edema (mL)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
6 7 8 9 10
Tempo (horas)
11 12 24 48
Figura 13- O polissacardeo sulfatado de Champia feldmannii provoca edema de pata nas primeiras 12
h aps sua administrao em ratos. Os animais receberam o PLS de C. feldmannii via subcutnea
intraplantar (0,9mg/kg de peso corporal). O controle negativo recebeu salina (0,01mL/kg de peso corporal;
s.c. intraplantar). O edema foi medido antes (tempo zero) e nos tempos de , 1 - 12, 24 e 48h aps a injeo
dos PLS ou salina e expresso como a variao dos volumes deslocados pelas patas (mL) entre os vrios
tempos e o tempo zero.
60
5.10 Efeito dos PLS de Champia feldmannii sobre a migrao de

neutrfilos para a cavidade peritoneal de ratos
Este protocolo foi delineado para avaliar a capacidade dos PLS de C. feldmannii em
alterar o nmero de neutrfilos da cavidade abdominal de ratos em tempo coincidente com
o pico edematognico (1 hora aps sua administrao) dessas substncias na dose de 0,9
mg/Kg. Para isso, os mesmo foram administrado por via intraperitoneal dissolvidos em 1
mL de salina estril. Esta injeo induziu j na primeira hora aps sua administrao, um
aumento na migrao de neutrfilos em cerca de 6 vezes (p<0,05) quando comparado ao
grupo de animais controle negativo, que receberam apenas salina estril em volume e via
correspondente ao grupo teste (FIGURA 14).
Este dado sugere que os polissacardeos sulfatados de C. feldmannii contribuem
com os processos que induzem a migrao de neutrfilos, que so clulas
caracteristicamente encontradas nas primeiras 24 horas do desenvolvimento do processo
inflamatrio, por um mecanismo desconhecido, caracterizando assim uma neutrofilia.
Apesar de confirmada a alterao na permeabilidade, na migrao de clulas e da
atividade edematognica dos PLS, no se tem conhecimento sobre quais os mediadores
envolvidos neste edema. Para elucidar quais so as substncias que podem estar induzindo
estes processos inflamatrios, foram utilizados diferentes bloqueadores farmacolgicos de
alguns mediadores inflamatrios no modelo de edema de pata.
61
4500
4000
n de leuccitos
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
total
neutrfilos
salina
total
neutrfilos
Champia feldmannii
Figura 14- O polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii provoca aumento da migrao de
neutrfilos para a cavidade peritoneal de ratos. Os PLS de C. feldmannii (0,9 mg/Kg, contidos em 1 mL de
salina estril) foram injetados em um grupo por via intraperitoneal. O grupo controle negativo recebeu injeo
i.p de salina estril (1 mL por cavidade). A coleta do fluido peritoneal seguido da contagem de clulas foi
realizado 60 min aps a injeo dos estmulos. Os resultados foram expressos como mdia E.P.M. do
nmero de neutrfilos/L. *p < 0,05 em relao aos seus respectivos controles negativo de migrao (salina).
62
5.11 Modulao da atividade pr-inflamatria dos polissacardeos

sulfatados de Champia feldmannii atravs de bloqueio
farmacolgico
Com o intuito de investigar o mecanismo ou via atravs da qual os PLS de C.
feldmannii desempenham sua atividade pr-inflamatria, foram administradas diferentes
substncias (bloqueadores) que apresentam efeito inibitrio no processo inflamatrio por
diferentes vias, avaliando-se assim a participao de diferentes mediadores inflamatrios,
no mecanismo da ao pr-inflamatria dos PLS de C. feldmannii .
Neste modelo experimental cada grupo de animais recebeu pr-tratamento com um
dos seguintes bloqueadores farmacolgicos de acordo com os dados da literatura:
indometacina, um inibidor de prostaglandinas; L-NAME, inibidor da sntese de xido
ntrico (NO); pentoxifilina, inibidor de TNF e IL1, meclizina, anti-histamnico ou
dexametasona, um glicocorticide. Aps 1/2 ou 1 hora, de acordo com o bloqueador
considerado, da administrao destes os animais receberam os PLS C. feldmannii (0,9
mg/kg; s.c.).
Os bloqueadores meclizina, dexametasona, indometacina e pentoxifilina reduziram
o edema elicitado pelos PLS em 5; 15; 25 e 29%, respectivamente. Esses dados sugerem a
participao de vrios mediadores ocorrendo uma maior participao de citocinas, em
funo do maior percentual de inibio na atividade pr-inflamatria desta substncia
(FIGURA 15 e TABELA 01).
Alm dos estudos correlacionados a atividade pr-inflamatria do polissacardeo
sulfatado de Champia feldmannii na inflamao tambm foram delineados estudos de suas
possveis aes antinociceptivas.
63
salina (0,01 mL/Kg)

C. feldmannii (0,9 mg/Kg)
dexametasona (1mg/Kg)
indometacina (5mg/Kg)
pentoxifilina (90mg/Kg)
L-NAME (25mg/Kg)
meclizina (30mg/Kg)
1,0
Edema (mL)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
300
360
Tempo (min)
Figura 15- Meclizina, dexametasona, indometacina e pentoxifilina inibem o edema de pata induzido por
Champia feldmannii. A avaliao do edema foi feita por pletismografia antes da injeo do PLS (0,9 mg/kg,
s.c) e 30; 60; 120; 180 e 240 min aps sua administrao. Controle negativo: salina estril (0,01 mL/Kg, s.c)
apenas. Bloqueadores farmacolgicos: L- NAME (25mg/kg; e.v), indometacina (indo; 5mg/kg s.c), meclizina
(mecli; 30mg/Kg s.c.) e dexametasona (dexa; 1mg/kg s.c.), administrados 1h antes do PLS; e a pentoxifilina
(pentoxi; 90mg/kg, s.c.) e celecoxib (30 mg/Kg, s.c), 30 min antes do PLS. * p< 0,05 em relao a salina. #
p< 0,05 em relao a Champia feldmannii.
Grupos
Volume do edema (mL)
% Inibio
0,00
Champia feldmannii
0,69 0,11 (18)
Meclizina
0,66 0,11 (6)
Dexametasona
0,59 0,10 (12)
~15
Indometacina
0,52 0,09 (6)
25
Pentoxifilina
0,49 0,08 (6)
29
L-NAME
0,60 0,10 (6)
Salina
Tabela 01 - Meclizina, dexametasona, indometacina e pentoxifilina inibem o edema de pata induzido

por Champia feldmannii. Valores representam a mdia E.P.M. ( ) nmero de animais.
64
5.12 Efeito dos PLS de Champia feldmannii no modelo de

contores abdominais induzidas por cido actico (teste
writhing)
O pr-tratamento dos animais com os PLS de C. feldmannii (0,2; 1; 5 e 25mg/Kg,
i.p), 30 minutos antes da administrao do cido actico 0,6% foi capaz de diminuir o
nmero de contores abdominais em todas as doses utilizadas, sendo que o maior efeito
antinociceptivo (96%) ocorreu na dose de 1mg/Kg (FIGURA 16 e TABELA 02). Pode-se
observar tambm o efeito dependente da dose com comportamento em sino.
Apesar do promissor resultado obtido, a resposta sobre por qual via os PLS podem
estar produzindo o seu efeito incerta devido este estmulo qumico produzir uma resposta
nociceptiva de alta intensidade e durao ser inespecfica, com a resposta podendo ser
bloqueada por muitas classes de drogas tais como anti-histamnicos, hipotensores,
estimulantes e depressores do SNC (HENDERSONHOT & FORSAITH, 1959, LINO,
1995).
65
35
25
20
*#
*#
15
*#
*
10
n de contores abdominais
30
5
0
0.2
25
(mg/kg)
Champia feldmannii
cido actico 0,6%
Figura 16- O polissacardeo sulfatado da alga vermelha Champia feldmannii apresenta efeito
antinociceptivo no teste de contores abdominais (teste writhing) em camundongos. O PLS foi injetado
em doses crescentes (0,2; 1; 5 e 25mg/kg; e.v.) 30 min antes do cido actico 0,6% (0,1ml/10g, i.p.). Aps 10
minutos foi realizada a contagem do nmero de contores abdominais durante 20 min. *p<0,05 em relao
ao grupo cido actico (controle positivo).# p<0,05 em relao ao grupo C. feldmannii 1 mg/Kg.
Grupo
mg/Kg; via de
Nmero de
% de inibio
administrao
contores (20 min)
de contores
-
Controle
cido actico
33 1,44
positivo
0,6%
(10)
(0,1 ml/10g i.p.)

C. feldmannii
0,2 (mg/Kg, i.p.)
16,5 1,19
50 7,2*
(10)
C. feldmannii
1 (mg/Kg, i.p.)
6,6 1,28
96,96 19,39*
(10)
C. feldmannii
5 (mg/Kg, i.p.)
16,16 1,92
51,03 11,88*
(10)
C. feldmannii
25 (mg/Kg, i.p.)
10,75 1,03
67,42 9,58*
(10)
Tabela 02. O polissacardeo sulfatado da alga vermelha Champia feldmannii apresenta efeito
antinociceptivo no teste de contores abdominais (teste writhing) em camundongos. Valores
representam a mdia E.P.M. * p < 0,05 Student-Newman-Keus Method (comparado ao grupo controle).
( ) nmero de animais
66
6 DISCUSSO
Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que os polissacardeos
sulfatados das algas vermelhas Botryocladia occidentalis, Champia feldmannii e Solieria
filiformes, administrados por via endovenosa, no apresentaram efeitos antiinflamatrios no
modelo de edema de pata induzido pelos agentes edematognicos carragenina, dextrana ou
zimosan em ratos. Dentre os polissacardeos sulfatados testados no modelo de edema de
pata induzido por carragenina e dextrana, os PLS de C. feldmannii apresentaram uma
potencializao dos edemas testados. Alm disso, os polissacardeos da mesma alga
apresentaram atividade pr-inflamatria, estimulando o edema de pata assim como o
aumentando da permeabilidade vascular nas patas e a migrao de neutrfilos para a
cavidade peritoneal destes animais. Estes mesmos PLS de C. feldmannii tambm
apresentaram significativa atividade antinociceptiva, no modelo de contores abdominais
provocadas por cido actico.
O pr-tratamento endovenoso dos animais com os PLS de C. feldmannii em
diferentes doses antes da induo do edema por dextrana, alm de no inibirem o edema
causado por esta substncia causaram uma potencializao deste efeito entre 25 e 53%, na
2 e 4 hora, respectivamente, aps sua administrao, parecendo contribuir com a liberao
de mediadores ativos neste tipo de edema, at o ltimo tempo de acompanhamento do
mesmo.
A carragenina caracteriza-se por ser um agente edematognico que induz a
liberao temporal de diversos mediadores inflamatrios em duas fases, com grande
infiltrao leucocitria (LO et al., 1982). Na primeira fase libera histamina, bradicinina,
serotonina e NO formado pela nNOS e na fase tardia, prostanides e NO formado pela
iNOS (Al-SWAYEH et al., 2000; DIROSA et al., 1971; VINEGAR, et al., 1969). J a
dextrana induz um edema osmtico acelular, com efeito mximo j nos primeiros 30 min,
com participao exclusiva de mediadores como histamina, serotonina e bradicinina (LO et
al., 1982).
Com relao a carragenina o resultado negativo da ao dos PLS de C.
feldmannii como agentes antiinflamatrios se repetiu. Houve tambm neste caso uma sutil
potencializao (p< 0,05) do edema do agente inflamatrio, apesar do pr-tratamento dos
67
animais em diferentes tempos, ocorrendo maior induo de edema exatamente na 1 hora de

experimento, tempo no qual no corresponde ao pico de atividade edematognica da
carragenina. Esse resultado parece indicar mais uma vez que os PLS em questo
contribuem de alguma forma com a liberao ou ao dos agentes edematognicos
caractersticos dos eventos iniciais do processo inflamatrio.
Fucanas sulfatadas extradas de algas marrons possuem significativa propriedade
antiinflamatria, apresentando potente inibio do sistema do complemento humano
(BLONDIN et al., 1994), sendo capazes de inibir de maneira dose dependente, as vias
clssica e alternativa do sistema do complemento. Baseado nesses estudos investigamos a
atividade dos PLS extrados de C. feldmannii sobre o edema induzido por zimosan. Visto
que esta substncia induz a formao de edema, com um pico j na primeira hora, via
influxo de moncitos e ativao da cascata do sistema do complemento (DAMAS &
PRUNESCO, 1990). Apesar da demonstrao de atividade de PLS de algas marrons
inibindo os eventos da cascata do sistema do complemento, os PLS de algas vermelhas,
como o caso de C. feldmanni, parecem no interferir com os eventos relacionados com o
edema de pata causado pelo zimosan, mesmo estes tendo sido administrados
concomitantemente, ou seja, no mesmo tempo em que o zimosan, evitando assim uma
possvel ligao dos PLS a outras molculas presentes no plasma ou sua filtrao a nvel
renal.
Apesar dos PLS testados no apresentarem atividades antiinflamatrias nos edemas
utilizados, o uso de substncias sintticas ou de origem natural, com ao anti ou prinflamatria, como ferramenta nos estudos dos eventos inflamatrios (WINTER; RISELY;
NUSS, 1962), fundamental nos estudos farmacolgicos. A carragenina um
polissacardeo derivado de Condrus crispus, uma espcie de alga marinha vermelha, que
produz efeitos pr-inflamatrios altamente reproduzveis na induo do edema de pata em
animais experimentais (WINTER; RISELY; NUSS, 1962).
Com estas informaes e devido o fato dos PLS de C. feldmannii terem
potencializado, em certos momentos, os edemas investigados at aqui, optou-se por
investigar as propriedades pr-inflamatrias dos PLS das trs algas utilizadas neste
trabalho.
68
Aps administrao por via subcutnea intraplantar (0,9 mg/Kg) os PLS de B.

occidentalis, C. feldmannii e S. filiformes induziram a edema de pata em ratos, sendo que
os PLS de C. feldmannii apresentaram efeito mais pronunciado (acima de 120%) que os das
outras algas. Estes dados definem os PLS de C. feldmannii como substncias que merecem
uma investigao mais detalhada sobre o seu potencial em elicitar o edema de pata e assim
como o estudo do mecanismo desse efeito.
O caracterstico edema causado pelos PLS de C. feldmannii descrito anteriormente
tambm ocorreu em doses mais baixas (0,1 e 0,3 mg/Kg) que as utilizadas nos
experimentos anteriores (0,9 mg/Kg), sendo que nessas doses o pico de edema tambm
ocorreu at a primeira hora aps sua injeo. Com a avaliao da continuidade deste edema,
na dosagem que apresentou o melhor efeito pr-inflamatrio, tambm na fase tardia do
processo inflamatrio observou-se que o mesmo, quando acompanhado durante 48 horas,
mantm-se elevado nas primeiras 12 horas aps sua aplicao regredindo a nveis basais
aps 24 horas de sua administrao. Esse resultado soma-se aos anteriores, que demonstram
a potencializao do efeito sobre o edema da carragenina e dextrana em 18 e 19%,
respectivamente, no que diz respeito a ao dessa substncia, de maneira mais pronunciada,
exatamente nos momentos iniciais do processo inflamatrio. Caracteriza-se assim um
processo inflamatrio agudo que tem durao relativamente curta, mas que persiste tambm
na fase crnica que apresenta uma durao mais longa, estando, associada
histopatologicamente a presena de linfcitos e macrfagos, proliferao vascular, fibrose e
necrose tecidual (SEDGWICK &WILLOUGHBY, 1985).
Aps a confirmao da ao relevante no edema de pata causado pelos PLS de C.
feldmannii foi avaliada a relao entre a atividade edematognica desses PLS e a migrao
de neutrfilos. Estas clulas predominam sobre outros tipos celulares nas primeiras 24
horas do processo inflamatrio. A migrao destas clulas para o foco inflamatrio um
processo multimediado e de fundamental importncia para a manuteno da normalidade
tecidual, desde que ocorra em intensidade e em tempo adequado. Com os resultados obtidos
nesta etapa fica evidente a ao dos PLS de C. feldmannii como agente indutor da migrao
de neutrfilos, sendo esta confirmada pela observao de intenso infiltrado neutroflico,
confirmando mais uma vez a ao na fase aguda do processo inflamatrio. A ao direta ou
indireta desses PLS neste fenmeno no foram investigadas.
69
Sabendo-se que o acmulo de neutrfilos no local inflamado contribui para os

eventos vasculares da inflamao tais como aumento de permeabilidade com exudao
protica, hiperemia e leso vascular (ISSEKUTZ, 1984; WEDMORE & WILLIAMS,
1981) foi avaliada a capacidade dos PLS em aumentar a permeabilidade vascular. Os
resultados encontrados fortalecem a idia dos PLS como agentes desencadeantes da
liberao de mediadores envolvidos nos eventos vasculares do processo inflamatrio,
confirmando mais uma vez a ao destas molculas no processo inflamatrio agudo.
Provavelmente a ao destas substncias esteja ocorrendo atravs do aumento das
concentraes dos mediadores caractersticos desse momento do processo inflamatrio. So
mediadores da fase aguda do processo inflamatrio a bradicinina, serotonina, a histamina,
as protaglandinas da srie E e da srie I. Portanto, o desconhecimento por qual via estas
substncias podem estar agindo nos levou a investigar os mediadores que podem estar
envolvidos na atividade edematognica destes polissacardeos.
A meclizina um antagonista histaminrgico H1. A dexametasona uma
glicocorticide sinttico com aes antiinflamatrias e imunossupressoras, destacando-se
dentre estas, a inibio da expresso de molculas de adeso e de enzimas que produzem
mediadores que participam do processo inflamatrio como a fosfolipase A2,
ciclooxigenase-2 (induzida) e oxido ntrico sintase, alm de inibir a sntese de vrias
citocinas inflamatrias (interleucina 1 e 12, TNF-, interferon-) e a degranulao
mastocitria (JAFFUEL et al., 1999; KIM; MOON; KIM, 2003). A indometacina um
inibidor no especfico da atividade de ambas as isoformas da ciclooxigenase (COX-1 e
COX-2), enzima responsvel pela metabolizao do cido araquidnico com conseqente
produo de prostaglandinas (KANKURI et al., 2001). A pentoxifilina uma metilxantina
inibidora de fosfodiesterase, tendo ao anti-inflamatria por inibir a sntese de citocinas
hiperaglsicas e inflamatrias: TNF-, IL-1, IL-6 e IL-8 (VALE, 1999) por diversos tipos
celulares. O L-NAME reconhecido por inibir inespecificamente as isoformas da enzima
xido ntrico sintase, inibindo a produo de xido ntrico (MONCADA; PALMER;
HIGGS, 1991). Foi observado que o pr-tratamento dos animais com a meclizina, a
dexametasona, a indometacina e a pentoxifilina inibiram significativamente em 5, 15, 25 e
29% o edema provocado pelos PLS de C. feldmannii. O mesmo pr-tratamento com LNAME no foi capaz de inibir tal edema. Este resultado sugere que o mecanismo da
70
atividade edematognica dos PLS de C. feldmannii parecem no ter a participao de xido

ntrico. Alm disso, apesar da ao inespecfica do glicocorticide dexametasona tornar
difcil a proposio de uma hiptese para o mecanismo destes PLS, j que esta droga age
inibindo a ativao de diferentes vias de formao de mediadores inflamatrios, os
resultados obtidos com indometacina e pentoxifilina sugerem que no mecanismo prinflamatrio dos PLS de C. feldmannii, excluindo a possibilidade de contaminao por
endotoxina, parece haver uma maior participao de citocinas, prostaglandinas e
histaminas.
Alm dos estudos correlacionados a atividade pr-inflamatria dos polissacardeos
sulfatados de Champia feldmannii tambm foram delineados estudos de suas aes antinociceptivas. Para o estudo desta possvel atividade foi utilizado o modelo de contores
abdominais induzidas por cido actico. Esse modelo experimental baseado na aplicao
de um estmulo qumico de alta intensidade, o cido actico. Esta substncia produz uma
resposta nociceptiva de curta durao, sendo essa inespecfica. O cido actico induz dor
indiretamente, pois no estimula os receptores nociceptivos peritoneais de forma direta,
mas por liberar substncias endgenas que excitam as terminaes nervosas, ou seja,
produz inflamao aguda na rea peritoneal (NORTHOVER, 1963; GYIRES & KNOLL,
1975). Alm das prostaglandinas, que aumentam consideravelmente quando da injeo
intraperitoneal do cido actico, outros componentes inflamatrios, como o caso do
envolvimento dos componentes simpticos, podem ser responsveis pelo estmulo doloroso
(DUARTE; NAKAMURA; FERREIRA, 1988). A pronunciada atividade antinociceptiva
apresentada pelos PLS de C. feldmannii na dose de 1 mg/Kg indica a eficcia destas
substncias como antinociceptivas. Essa dose utilizada no apresenta nenhum efeito txico
agudo nos animais testados, assim como no apresentaram toxicidade aguda as doses mais
elevadas testadas de 5 e 25 mg/Kg (dado no mostrado). Porm, este modelo experimental
tem a desvantagem de ser inespecfico, com a resposta sendo bloqueada por muitas classes
de drogas, tais como, anti-histamnicos, hipotensores, estimulantes e depressores do SNC
(HENDERSHOT & FORSAITH, 1959; LINO, 1995). Portanto, a proposio de um
mecanismo para a ao antinociceptora dessa substncia fica distante de ser elucidada.
O aparente efeito antinociceptivo frente a ineficcia antiinflamatria destes PLS
assemelha-se a ao de drogas opiides como a morfina, que apesar de ser um potente
71
analgsico no apresenta efeito antiinflamatrio, podendo assim ser proposta, apesar dos
dados serem inconclusos, uma possvel ao destes PLS sobre o sistema nervoso central.
Diante disso, os resultados obtidos nesse trabalho mostram que os PLS da alga
vermelha Champia feldmannii possuem uma significativa atividade edematognica e
antinociceptiva. Estudos adicionais utilizando outra srie de ensaios farmacolgicos sero
necessrios para elucidar os mecanismos envolvidos nas aes destas substncias, pouco
estudadas in vivo. Os mesmos resultados sugerem que as molculas aqui avaliadas possam
ser utilizadas como ferramentas para no estudo de processos inflamatrios e de nocicepo
ou mesmo o uso destes polissacardeos sulfatados em situaes clnicas em que seja
necessria a ativao do sistema imunitrio.
72
7 CONCLUSO
Os polissacardeos sulfatados das algas vermelhas Botryocladia occidentalis,
Solieria filiformes e Champia feldmannii, quando injetados por via endovenosa, no
demonstraram atividade antiedematognica em modelo experimental de edema de pata em
ratos induzido por carragenina e dextrana. C. feldmannii tambm no apresentou efeito
sobre o edema induzido por zimosan. Os mesmos PLS injetadas por via subcutnea
intraplantar apresentaram efeito edematognico, sendo o edema elicitado pelos PLS de C.
feldmanni o mais intenso de todos.
Os PLS de C. feldmannii apresenta efeito edematognico comprovado por dois
parmetros, sendo que essa atividade edematognica, nos modelos experimentais de edema
de pata, parece ser mediada em maior parte por citocinas e prostaglandinas.
Os polissacardeos sulfatados de C. feldmannii, quando administrados por via
endovenosa, apresentam uma potente atividade antinociceptiva no modelo experimental de
contores abdominais induzidas por cido actico.
Os PLS administrados endovenosamente no apresentaram toxicidade aguda nas
doses utilizadas.
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Efeitos de Galactanas Sulfatadas Das Algas Marinhas Botryocladia Occidental

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR

DANIEL MAGALHES GOMES

EFEITOS DE GALACTANAS SULFATADAS DAS ALGAS

DANIEL MAGALHES GOMES

EFEITOS DE GALACTANAS SULFATADAS DAS ALGAS

Dissertao apresentada ao Curso

Gomes, Daniel Magalhes

DANIEL MAGALHES GOMES

Aprovada em: 14/07/2006

meus pais, todos os meus

orientadora Ana Maria Sampaio

A todos os professores do Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgicas que pela

todos os meus demais colegas lafacienses Ricardo, Cladia, Samile Albertina,

Aos colegas do Curso de Mestrado em Cincias Fisiolgicas: Nilson, Hermgenes, Kalina,

Fundao Cearense de Amparo a pesquisa (FUNCAP) pela concesso de bolsa de estudo

A todos a minha mais sincera gratido.

Palavras-chaves: polisacardeos sulfatados; inflamao aguda; nocicepo.

Keywords: sulfated polysaccharides; acute inflammation; nociception.

rea sob a curva

Fragmento menor do sistema do complemento ativado

Fragmento maior do sistema do complemento ativado

Quinto componente (fragmento menor) do sistema complemento

Isoforma 1 da enzima cicloxigenase

Isoforma 2 da enzima cicloxigenase

Isoforma 3 da enzima cicloxigenase

Dose que produz letalidade em 50% dos animais

Erro padro da mdia

Isoforma endotelial da enzima xido ntrico sintase

Isoforma induzida da enzima xido ntrico sintase

Isoforma neuronal da enzima xido ntrico sintase

Lipoprotena de alta densidade

ICAM-1 e ICAM-2 = Molcula de adeso intercelular-1 e 2

Lipoportena de baixa densidade

Lectina ligante de manose

Nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato associada ao

Nicotinamida adenina dinucleotdeo associado com um grupamento

Isoforma neuronal da enzima xido ntrico sintase

Enzima xido ntrico sintase

Fator de ativao de plaquetas (do ingls: platelet activator factor)

Molcula de adeso de clula endotelial e plaqueta

Fator de necrose tumoral alfa (do ingls: Tumoral Necrosis Factor-)

Lipoprotena de muito baixa densidade (do ingls: very-low density

Foto da alga marinha Botryocladia occidentalis

Foto da alga marinha Champia feldmannii

Foto da alga marinha Solieria filiformis

Esquema geral de extrao dos polissacardeos sulfatados totais

Os polissacardeos sulfatados das algas Botryocladia occidentalis,

O polissacardeo sulfatado de Champia. feldmannii administrado em

Os polissacardeos sulfatados das algas Botryocladia occidentalis, Champia

O Polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii pr-tratado em

O polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii no inibe o edema

Os polissacardeos sulfatados das algas Botryocladia occidentalis, Champia

Os polissacardeos sulfatados da alga Champia feldmannii provocam edema

Os PLS de C. feldmannii induzem um aumento de permeabilidade vascular

- Meclizina, dexametasona, indometacina e pentoxifilina inibem o edema de

O polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii provoca aumento da

O polissacardeo sulfatado de Champia. feldmannii provoca edema de pata

O polissacardeo sulfatado da alga vermelha Champia feldmannii apresenta

Meclizina, dexametasona, indometacina e pentoxifilina inibem o edema de

O polissacardeo sulfatado da alga vermelha Champia feldmannii apresenta

1.1 ALGAS MARINHAS

4.7 ENSAIO DE TOXICIDADE AGUDA

5.1 EFEITO DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS DE BOTRYOCLADIA OCCIDENTALIS,

5.2 EFEITO DA ADMINISTRAO DE DIFERENTES DOSES DOS POLISSACARDEOS