Cromatografa de permeacin en

geles (CPG)
Qumica Analtica III

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Fundamentos
Modalidad de la cromatografa lquido-slido.
La FE es un material poroso, inerte, generalmente denominado gel.
La discriminacin de los solutos se hace segn su tamao y, en
algunos casos, su estructura molecular.
Los solutos de mayor tamao no entran en los poros de la FE y son
excludos, eluyendo con la FM.
Los solutos de menor tamao pueden entrar en el interior del material
poroso, los ms pequeos pueden difundir con ms facilidad que los
ms grandes.
La trayectoria recorrida es mayor cuanto menor sea el soluto, el cual
permanecer ms tiempo en la columna.

CROMATOGRAFA DE
EXCLUSIN
Fundamentos

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN

Aspectos diferenciales
La FE acta como un soporte inerte, aportando slo su
porosidad controlada.
Tericamente, no existe interaccin fisicoqumica solutoFE.
El mecanismo de retencin se establece ms por entropa
que por entalpa.
Las caractersticas de la FM no constituyen un factor
decisivo en la separacin.
La columna no se desactiva, debido a la no existencia de
interacciones.
La muestra no sufre alteraciones al pasar por la columna.

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN

Aspectos diferenciales

Dado que las fuerzas de interaccin son bajas, los

picos cromatogrficos son en general, angostos.
Los solutos a separar suelen ser sustancias
polimricas de un amplio rango de pesos moleculares.
El empleo de la modalidad de baja presin es mucho
ms frecuente que en otros tipos de CL.
Permite la determinacin de pesos moleculares en
mezclas polimricas complejas.

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Relaciones de retencin
En una columna cromatogrfica de exclusin, distinguimos los
siguientes volmenes:
Volumen total de la columna, Vt
Volumen muerto interparticular, V0
Volumen interno de las partculas porosas, Vi (contiene
la fase mvil estanca)
V t =V

+V +V g
i

Volumen ocupado por la matriz del gel, Vg

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Relaciones de retencin

Si una molcula de soluto > dimetro de poro del gel, eluir en VM

mL de FM (totalmente excluda)
Si una molcula de soluto < dimetro de poro del gel, eluir en (Vi
+ VM) mL de FM (libre difusin)
Si las molculas son de tamao intermedio, podrn acceder slo a
algunos de los poros y su volumen de elucin ser intermedio entre
VM y (VM + Vi) mL de FM (exclusin parcial)

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Relaciones de retencin
Se utiliza el volumen de elucin Ve: volumen de FM que
atraviesa la columna desde la introduccin de la muestra hasta
la aparicin del mximo de concentracin de soluto fuera de la
columna.
La separacin se completa cuando ha pasado un volumen de
FM equivalente a:
V V g = V
+V
t
M
i

La ecuacin general de la cromatografa ser en este caso:

Ve = V

+K

V
D i

Ve V
M
K
=
D
V
i

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Relaciones de retencin
Considerando despreciable la matriz del gel (Vg =0), Vi es igual a VtVM, pero como no es as, Vi es ms grande que esta cantidad, aunque
proporcional a ella.
Se define la cantidad Kacc K accesible:

Si

una molcula es
totalmente excluida, Ve =
VM y Kacc = 0
Si una molcula tiene
libre difusin, Ve = VM + Vi y
Kacc = 1

Ve V
M
K acc =
V V
t
M

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Discriminacin entre dos solutos con geles de diferente
porosidad

La pendiente de la recta
en la zona central
depende de la naturaleza
y porosidad del slido
El gel A separa un rango
mayor de pesos
moleculares que el gel
B, pero con menor
resolucin

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Eficiencia

Est ms restringida que en otras modalidades de CL, debido a

la restriccin en el rango de valores de Kacc
El valor de H se debe a la contribucin de la FM estanca (dentro
de los poros):
2
2
d

1
k

p u

H
=
MS
2
30 1 1 + k D M
es la fraccin de fase mvil total que est dentro de los poros y
es un factor de tortuosidad.
Debido al bajo coeficiente de difusin de los solutos empleados
(alto PM) puede despreciarse la difusin longitudinal.
Nmero de picos

Nmero de Platos
tericos

CGL

CLL

CPG

400

21

13

2500

51

31

11

10000

101

61

21

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Resolucin

Se emplea la definicin de Bly de resolucin especfica,

que tiene en cuenta los pesos moleculares de los solutos:

SP

=R

1
S log PM

V
2V

e2
e1

+
w
w
log
PM
PM
PM

1
2
1
2
2

Un dato interesante para una columna de exclusin es cul

es la mnima relacin de pesos moleculares (RM), para obtener
una resolucin RS = 1 (solapamiento de 2% entre picos
contiguos):
R

SP

1
log R

La resolucin especfica ser mayor cuanto menor sea la

mnima relacin de pesos moleculares.

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Caractersticas de los geles
Uniformidad del tamao de partcula.
Uniformidad en el tamao de poro (desviacin de entre 5 y 10%).

Posibilidad de obtener materiales con grados muy diferentes de

porosidad.
Estabilidad qumica y resistencia mecnica.

Clasificacin de los geles

Segn su naturaleza, pueden ser inorgnicos y orgnicos
Segn la flexibilidad de su estructura se distinguen dos tipos:
hinchables y rgidos
Segn su microestructura, se dividen en : aerogeles, xerogeles y
geles mixtos
Segn su origen pueden ser: naturales, sintticos y combinados

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Microestructura de los geles

Los geles inorgnicos son aerogeles, tienen estructura rgida,

de naturaleza silcea. La porosidad (7-300 nm) se consigue
mediante tratamiento con HF, metanol o lcali.
El rango de PM est comprendido entre 103 y 107.
Nombres comerciales: BIO-GLAS, CPG y Porasil.

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Geles orgnicos
Estructura
entrecruzada.

polimrica

Existen
cuatro
tipos
fundamentales: poliacrilamida,
dextrano,
agarosa
y
poliestireno
Geles de poliacrilamida
La concentracin de N,Nmetilen-bis-acrilamida
determina la porosidad
El rango de fraccionamiento
va desde 200 hasta 400000
unidades de PM.

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Geles orgnicos
Dextranos (Sephadex)
Son
polisacridos
derivados de la glucosa
entrecruzados
con
epiclorhidrina
La
porosidad
est
determinada por el PM del
dextrano,
su
concenttracin y la del
entrecruzante.
El
rango
de
fraccionamiento va entre
700 y 800000

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Geles de agarosa
Son de tipo natural
Constituyen la matriz no inica del gar
La agarosa forma geles espontneamente, con su estructura
reticular debida a los puentes de hidrgeno entre cadenas
polimricas.
Los diferentes rangos de fraccionamiento se obtienen a partir de
soluciones de diferente concentracin de agarosa
Geles de poliestireno
Polmeros sintticos de estireno + DVB
Tienen estructura rgida, que los hace aptos para trabajar a alta
presin.
Pueden presentar fenmenos de adsorcin.

Geles orgnicos usados en cromatografa

de exclusin
Tipo de gel
Poliacrilamida
(BioGel)

Dextrano
(Sephadex)

Agarosa
(BioGel A)

Poliestireno
(StyraGel)

P-2
P-4
P-6
P-10
P-30
P-60
P-100
P-150
P-200
P-300
G-10
G-15
G-25
G-50
G-75
G-100
G-150
G-200
0.5 m
10%
1.0 m
8%
1.5 m
2.0 m
6%
5.0 m
15.0 m
4%
50.0 m
150 m
2%
6x10 1
2
1x10
4x10 2
1x10 3
5x10 3
4
1x10
3x10 4
1x10 5
3x10 5
5
5x10
6
1x10

Rango de fraccionamiento
200-2000
500-4000
1000-5000
5000-17000
20000-50000
30000-70000
40000-100000
50000-150000
80000-200000
100000-400000
< 700
< 1500
100-5000
500-10000
3000-70000
4000-150000
5000-400000
5000-800000
10000-250000
25000-750000
10000-1000000
50000-2000000
10000-5000000
200000-15000000
100000-50000000
500000-150000000
800
2000
8000
20000
100000
200000
600000
2000000
6000000
10000000
20000000