PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE

ESCUELA DE INGENIERIA

ANLISIS, MODELACIN Y
SIMULACIN DEL CRECIMIENTO
DE Gibberella fujikuroi Y PRODUCCIN
DE CIDO GIBERLICO SOBRE
SUSTRATO SLIDO INERTE

CLAUDIO ANDRS GELMI WESTON

Tesis para optar al grado de

Magister en Ciencias de la Ingeniera

Profesores Supervisores:
RICARDO PREZ C.
IVN SOLAR M.

Santiago de Chile, 1999.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE

ESCUELA DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA Y BIOPROCESOS

ANLISIS, MODELACIN Y
SIMULACIN DEL CRECIMIENTO
DE Gibberella fujikuroi Y PRODUCCIN
DE CIDO GIBERLICO SOBRE
SUSTRATO SLIDO INERTE

CLAUDIO ANDRS GELMI WESTON

Tesis presentada a la Comisin integrada por los profesores:

RICARDO PREZ C.
IVN SOLAR M.
EDUARDO AGOSIN T.
GONZALO ACUA L.
BONIFACIO FERNNDEZ L.

Para completar las exigencias del grado

de Magister en Ciencias de la Ingeniera
Santiago de Chile, 1999.

A Claudio, Leonor, Jos Manuel y

Mara Milagro, por todo el tiempo
que me regalaron.

ii

AGRADECIMIENTOS
Me gustara agradecer a mis amigos: Andrea B., Andrea Ch., Ariel,
Guillermo, Ingrid, Jos Antonio, Kathleen, Lenka, Marcial, Mario y Mauricio. Gracias
por su vital e incondicional ayuda.
Me gustara agradecer adems a FONDECYT N1960360 y a la Beca
Shell Chile, por su apoyo econmico para la realizacin de esta tesis.

iii

NDICE GENERAL
Pg.
DEDICATORIA....................................................................................................... ii
AGRADECIMIENTOS ........................................................................................... iii
NDICE DE TABLAS ............................................................................................ vii
NDICE DE FIGURAS ......................................................................................... viii
RESUMEN.............................................................................................................. ix
ABSTRACT ............................................................................................................. x
I.

INTRODUCCIN......................................................................................... 11
1.1 Variables crticas de operacin............................................................... 12
1.1.1 Temperatura .................................................................................. 13
1.1.2 Contenido de agua del lecho slido ................................................ 13
1.1.3 pH......... ........................................................................................ 14
1.1.4 Agitacin....................................................................................... 14
1.1.5 Aireacin....................................................................................... 14
1.2 Modelacin............................................................................................ 15
1.2.1 Crecimiento de biomasa ................................................................. 16
1.2.2 Produccin de metabolitos secundarios .......................................... 18
1.2.3 Transferencia de masa y calor ........................................................ 18
1.2.4 Produccin de cido giberlico....................................................... 20

II.

ANLISIS Y TRATAMIENTO DE DATOS ................................................ 23

2.1 Materiales y mtodos............................................................................. 23
2.1.1 Preparacin de biomasa y medio de cultivo .................................... 23
2.1.2 Control de la aw y temperatura ....................................................... 24
2.1.3 Cultivos y toma de muestras .......................................................... 24
2.1.4 Registro de O2 y CO2 instantneos................................................. 24
2.1.5 Determinacin de biomasa total ..................................................... 25

2.1.6 Determinacin de urea en el medio................................................. 26

2.1.7 Determinacin de la fuente de carbono........................................... 26
2.1.8 Determinacin del cido giberlico................................................. 26
2.1.9 Determinacin de la velocidad mxima de crecimiento max ............ 26
2.10 Mtodos estadsticos ..................................................................... 27
2.2 Resultados y discusin ........................................................................... 28
2.2.1 Crecimiento de biomasa ................................................................. 28
2.2.2 Produccin de GA3 ........................................................................ 31
III.

MODELACIN Y SIMULACIN ............................................................... 35

3.1 Modelo .................................................................................................. 35
3.1.1 Biomasa viva ................................................................................. 35
3.1.2 Biomasa medida............................................................................. 35
3.1.3 Degradacin de urea ...................................................................... 36
3.1.4 Degradacin de la fuente de carbono.............................................. 36
3.1.5 Produccin de GA3 ........................................................................ 37
3.1.6 Produccin de CO2 ........................................................................ 37
3.1.7 O2 utilizado.................................................................................... 37
3.1.8 Ecuaciones constitutivas ................................................................ 38
3.2 Estimacin de parmetros ...................................................................... 39
3.2.1 Parmetros independientes del modelo ........................................... 39
3.2.2 Determinacin de parmetros mediante ajuste de EDO................... 42
3.3 Resultados y discusin ........................................................................... 44
3.3.1 Anlisis de sensibilidad................................................................... 48

IV.

CONCLUSIONES......................................................................................... 52

V.

NOMENCLATURA...................................................................................... 53

BIBLIOGRAFA .................................................................................................... 54
Anexo A: Clculo de max........................................................................................ 64
Anexo B: Curvas de crecimiento de biomasa medida ............................................... 69
Anexo C: Gases instantneos y degradacin de urea................................................ 70

Anexo D: Produccin de cido giberlico................................................................ 71

Anexo E: Gases acumulados y RQ .......................................................................... 72
Anexo F: Degradacin de almidn........................................................................... 73
Anexo G: Ajuste de las ecuaciones (3.16) y (3.17) .................................................. 74
Anexo H: Simulaciones de los cultivos.................................................................... 75
Anexo I: Anlisis de sensibilidad 25C y aw =0.992.................................................. 79
Anexo J: Clculo de la constante de muerte............................................................. 80

NDICE DE TABLAS
Pg.
Tabla 2.1: Modelos estadsticos ajustados a datos experimentales............................ 27
Tabla 2.2: max para distintas condiciones de cultivo ................................................ 29
Tabla 2.3: Biomasa final y GA3 mximo .................................................................. 32
Tabla 3.1: Parmetros del modelo bajo distintas condiciones de T y aw................... 45
Tabla 3.2: Anlisis de correlacin............................................................................ 46
Tabla 3.3: Parmetros ms relevantes del anlisis de sensibilidad ............................. 49

vii

NDICE DE FIGURAS
Pg.
Figura 2.1: Monitoreo y adquisicin de datos .......................................................... 25
Figura 2.2: Biomasa, gases instantneos y urea (25C, aw = 0.992) .......................... 30
Figura 2.3: CO2 acumulado ..................................................................................... 31
Figura 2.4: Produccin de GA3 y consumo de urea (36C, aw = 0.999) .................... 33
Figura 3.1: Anlisis cualitativo de ecuaciones (3.10) y (3.11)................................... 39
Figura 3.2: Ajuste de ecuaciones (3.16) y (3.17)...................................................... 41
Figura 3.3: Resumen de la calibracin del modelo.................................................... 43
Figura 3.4: Ejemplo de simulacin 25C y aw = 0.992 .............................................. 47
Figura 3.5: Parmetros ms relevantes del anlisis de sensibilidad............................ 50

viii

RESUMEN
En este trabajo se estudia la influencia de factores fsicos, tales como
temperatura (25, 31 y 36C) y actividad de agua (0.985, 0.992 y 0.999), adems de
factores nutricionales en el crecimiento del hongo Gibberella fujikuroi y la
produccin de cido giberlico (GA3) sobre sustrato slido inerte en columnas de
Raimbault. Condiciones de temperatura de 31C y actividad de agua (aw) de 0.9850.999 resultaron ser las mejores condiciones para la produccin del metabolito,
alcanzado valores aproximados de 0.70 (mg/g.s.i.).
Mediante experiencias a 25C aw = 0.992, 25C aw = 0.999, 31C aw =
0.985, 31C aw = 0.992 se desarroll un modelo matemtico de crecimiento sobre
sustrato slido inerte y produccin de metabolito secundario.

ix

ABSTRACT
This work presents the influence of the temperature (25, 31 and 36C),
the water activity (0.985, 0.992, 0.999) and the nutrients concentration (starch, urea)
on Gibberella fujikuroi growth and gibberellic acid (GA3) production on inert support
in Raimbault columns. The highest biomass concentration is reached when cultures
are performed at 31C and water activity 0.985 or 0.999. The gibberellic acid
concentration obtained under these conditions is 0.70 (mg/g.i.s.).
Experimental data (25C aw = 0.992, 25C aw = 0.999, 31C aw = 0.985,
31C aw = 0.992) have been used to developed a mathematical model for the growth
of the fungus and gibberellic acid production.

11

I.

INTRODUCCIN

En la mayora de los procesos biotecnolgicos comerciales, la produccin

de enzimas y compuestos orgnicos son realizadas en exceso de agua libre. Este tipo
de fermentaciones son conocidas como cultivos sumergidos y generalmente son
llevadas a cabo en reactores agitados. En cambio, aquellas realizadas bajo condiciones
restringidas de agua, se les denomina cultivos sobre sustrato slido (CSS).
Especficamente, los procesos CSS se refieren al crecimiento microbiano
y a la formacin de productos sobre y en el interior de una matriz slida, bajo
condiciones de humedad restringida. En este caso, parte del agua se encuentra
fuertemente ligada a las superficies slidas, parte est dbilmente ligada, y el resto
puede existir en forma libre en las regiones capilares del material, sin exceder la
capacidad de retencin hdrica de la matriz. De esta manera, se pueden distinguir 4
fases. La primera de ellas, corresponde a la fase gaseosa, la cual generalmente fluye en
forma continua a travs del lecho slido. La segunda fase consiste en un soporte
insoluble, el cual contiene a la tercera fase, una solucin acuosa rica en nutrientes.
Finalmente, la cuarta fase corresponde al microorganismo propiamente tal, el cual
crece dentro, alrededor y/o en los espacios libres del soporte [1].
Este tipo de procesos presenta varias caractersticas favorables para su
desarrollo industrial. En primer lugar, mayores rendimientos, lo cual hace que el CSS
sea econmicamente viable. Lo anterior lleva a que los reactores sean de menor
tamao y, por lo tanto, que los costos de produccin sean menores. Por ltimo, esta
tecnologa genera una menor cantidad de efluentes, reduciendo el impacto ambiental y
los costos de tratamiento [2].
A pesar de sus ventajosas caractersticas, los cultivos sobre sustrato
slido han tenido escasas aplicaciones en la industria. En parte sto se explica debido
a los problemas inherentes que enfrenta esta tecnologa [2]: tasas relativamente lentas
de crecimiento; capacidades limitadas para la disipacin del calor metablico
generado; problemas en la transferencia de masa, en particular, en la difusin de
nutrientes del sustrato al microorganismo; falta de sensores apropiados para este tipo

12

de procesos; escasa investigacin en modelos de reactores CSS, estrategias de control

y procedimientos de escalamiento.
Aunque las bacterias y levaduras pueden crecer sobre un sustrato slido,
son los hongos filamentosos los microorganismos que mejor se adaptan a este tipo de
cultivo [3] y, por lo tanto, son los ms utilizados en CSS [4]. El modo de crecimiento,
su tolerancia a bajas actividades de agua y altas presiones osmticas lo hacen eficiente
y competitivo para este tipo de medio [3]. La forma filamentosa que poseen, les
otorga ventajas sobre los organismos unicelulares en lo relativo a la colonizacin del
sustrato slido y a la utilizacin de los nutrientes disponibles. Adems, su particular
forma de crecimiento les permite penetrar al interior del sustrato slido,
incrementando con ello la disponibilidad de nutrientes [3].
En general, los sustratos empleados en procesos CSS son sub-productos
heterogneos provenientes de la agricultura o la agroindustria [3]. Todos los sustratos
slidos utilizados poseen una estructura macromolecular bsica (e.g. celulosa,
almidn, pectina, fibras, etc.), la cual les confiere la propiedad de slido al sustrato
[3]. Esta estructura proporciona una matriz inerte en donde las fuentes de carbono y
energa (e.g. azcares, lpidos, cidos orgnicos) son adsorbidas.
La biomasa es un parmetro fundamental en la caracterizacin del
crecimiento microbiano. Su medicin es esencial para realizar estudios cinticos en
CSS. No obstante, la determinacin directa es muy difcil, debido a los problemas que
involucra separar la biomasa del sustrato [3]. Se han desarrollado algunos mtodos
para medir biomasa en CSS, siendo los ms importantes: i) cuantificacin directa, ii)
inferencia de la biomasa a travs de la actividad respiratoria o metablica, iii)
medicin a travs de algn componente especfico de la biomasa (e.g. glucosamina).
1.1

Variables crticas de operacin

Las variables de operacin ms crticas para el control de reactores CSS,

lo constituyen la temperatura del lecho, pH y el contenido de agua del soporte slido
[2]. Lo anterior resulta del hecho que los microorganismos pueden crecer y producir
en un rango relativamente estrecho de condiciones de operacin. La agitacin y
aireacin del lecho slido tambin constituyen factores relevantes. Adems, la

13

concentracin de nutrientes y gases metablicos afectan a la biomasa y las tasas de

produccin de metabolitos, aunque estas variables son muy difciles de controlar [2].
1.1.1

Temperatura

Gradientes importantes (3 C/cm) pueden ser observados en

prcticamente todos los reactores estticos de CSS [2]. El calor metablico generado,
producto del crecimiento del microorganismo, debe ser retirado con el fin de no
alcanzar condiciones desfavorables de cultivo. El mtodo ms comnmente utilizado
en reactores piloto o de escala industrial es el flujo forzado de aire a travs del lecho
del reactor. En este caso, se puede manipular la temperatura de entrada y el flujo de la
corriente de aire. Sin embargo, probablemente el mtodo ms eficiente corresponde al
de enfriamiento por evaporacin del agua libre contenida en el lecho slido [2]. En
esta tcnica se regula la humedad relativa de la corriente de aire a la entrada del
reactor. De esta manera, es posible modificar la tasa de evaporacin desde el lecho
slido, logrando con ello la remocin del calor metablico generado. La principal
desventaja que presenta esta tcnica es la utilizacin de aire muy seco, lo cual obliga
el empleo de un sistema de control para el contenido de agua del reactor [2]. En esta
lnea, se han reportado buenos resultados utilizando enfriamiento del lecho por
evaporacin, para un reactor piloto de 50 (kg) de capacidad [5]. Estudios recientes de
simulacin [6, 7] establecieron la conveniencia de regular la temperatura del lecho
slido, mediante la manipulacin simultnea de la humedad relativa, temperatura y
flujo del aire de entrada.
1.1.2

Contenido de agua del lecho slido

La regulacin de la actividad de agua en el lecho slido es crucial, dado

que este factor determina directamente el crecimiento y la tasa de produccin de
metabolitos. El control del contenido de agua del lecho slido es difcil, dado que los
sensores en lnea son escasos, caros y poco fiables [2]. Sin embargo, esta limitacin
puede ser superada mediante mediciones secundarias en lnea, tales como el peso del
lecho slido [2]. La manera ms fcil para controlar la humedad del lecho es mediante
la adicin directa de agua fresca. El agua tambin puede ser proporcionada a travs de
la corriente de aire en forma de vapor. Sin embargo, el mtodo empleado depender

14

del tipo de reactor utilizado y la manera en que el control de temperatura es manejado

[2].
1.1.3

pH

El control de pH se ve dificultado debido a la gran capacidad buffer del

lecho slido y a la falta de sensores apropiados para sustrato slido [2]. Sin embargo,
la regulacin del pH puede ser realizada mediante la seleccin de nutrientes
suplementarios, los cuales pueden ser alimentados peridicamente durante la
fermentacin.
1.1.4

Agitacin
La agitacin en reactores de CSS cumple una serie de objetivos [2]:

mantener condiciones de operacin homogneas

permitir una distribucin uniforme del agua y nutrientes

remover el aire ocluido entre las partculas

evitar la aglomeracin de las partculas, crucial en el cultivo de hongos

filamentosos

Las polticas de agitacin son fundamentalmente empricas. Parmetros

asociados con agitacin son velocidad, sentido, y para reactores que emplean
agitacin intermitente lo son la frecuencia y la duracin de sta.
1.1.5

Aireacin

Como se mencion anteriormente, la aireacin es un factor clave para la

remocin del calor metablico, CO2 y metabolitos voltiles ocluidos entre las
partculas, junto con regular la humedad del lecho. Adems, la aireacin del reactor
permite que el crecimiento del microorganismo se realice en condiciones aerbicas.

15

1.2

Modelacin

Tradicionalmente los modelos matemticos utilizados en biotecnologa

pueden ser divididos en categoras, basadas principalmente en dos supuestos. El
primero de ellos se relaciona con la distribucin de la biomasa. Si las clulas son
indistinguibles unas de otras, el modelo es denominado no segregado. Por otro lado,
los modelos segregados toman en cuenta el hecho de que la biomasa puede
encontrarse en diferentes estados fisiolgicos. El segundo supuesto tiene relacin con
los procesos que ocurren dentro y alrededor del microorganismo. Si ste es tratado
como una caja negra, el modelo es denominado no estructurado. En cambio, los
modelos estructurados son aquellos en donde explcitamente se consideran los
procesos que ocurren al interior y alrededor del microorganismo. Los modelos ms
ampliamente utilizados son los modelos no segregados y no estructurados [8].
Mitchell et al. [4] clasifican a los modelos de CSS segn fenmenos de transporte
local o global. Es as como los modelos microscpicos combinan fenmenos de
transporte y condiciones ambientales locales. Estos modelos describen el crecimiento
microbiano a nivel particular, identificando los mecanismos responsables de ste.
Tienden a describir a la biomasa en mayor detalle, considerando aspectos tales como
variaciones en la densidad de la hifa o la existencia de distintos estados metablicos.
Por otro lado, los modelos macroscpicos describen un comportamiento global del
bioreactor y el principal objetivo es describir el crecimiento de la biomasa. Para esto
se requiere predecir perfiles de temperatura, concentraciones de oxgeno, nutrientes o
propiedades del lecho slido. Estos modelos deben ser desarrollados para contribuir
en el diseo, operacin, escalamiento, control y optimizacin de bioreactores [4].
Un modelo matemtico puede ser una poderosa herramienta, sin embargo,
su desarrollo en CSS presenta una serie de dificultades principalmente en la falta de
mediciones de biomasa, concentracin de nutrientes y gases, temperatura y pH. A lo
anterior, se suma la dificultad en modelar la produccin de metabolitos secundarios.
Estas limitaciones han retardado y complicado las aplicaciones y desarrollos en
control automtico y optimizacin, dificultando con ello la aplicacin industrial de
esta tecnologa.

16

1.2.1

Crecimiento de biomasa

En la literatura modelos no segregados y no estructurados, como la

ecuacin logstica, modelos de crecimiento lineal y exponencial son ampliamente
utilizados para describir la relacin entre biomasa, su tasa de crecimiento y actividad
[4, 9-14]. A continuacn se presentan las cinticas ms comunes:

Cintica de crecimiento lineal:

dX
= cte
dt

(1.1)

Cintica de crecimiento exponencial:

dX
= m X
dt

(1.2)

donde m representa la mxima velocidad especfica de crecimiento.

Ecuacin logstica:
dX
= m X
dt

1
X
m

(1.3)

donde Xm es la cantidad mxima de biomasa.

Dentro de este grupo, los modelos logsticos consideran una limitacin
para el crecimiento y, por tal razn, han sido utilizados en cultivos CSS. Estos
modelos representan de buena manera el crecimiento del microorganismo, hasta que
ste alcanza la etapa estacionaria. Sin embargo, los modelos logsticos no consideran
explcitamente limitaciones por sustrato o problemas difusionales y sus parmetros
deben ser determinados para cada nuevo sistema [4].
Otra manera de modelar el crecimiento de la biomasa, es asumir que ste
se relaciona con la concentracin de algn sustrato limitante. La ecuacin ms
utilizada para modelar sto, es la ecuacin de Monod, en donde el crecimiento

17

decrece una vez que los sustratos limitantes comienzan a agotarse. La ecuacin (1.4)
corresponde a una cintica Monod de crecimiento:
dX
= m X
dt

Cs

K s + Cs

(1.4)

En la ecuacin (1.4) el trmino Ks corresponde a una constante de

saturacin para el sustrato limitante (Cs). Otros modelos han sido desarrollados para
el caso de un nutriente limitante, tales como la ecuacin de Contois, Moser y Tessier
[8]. El modelo de Contois es considerablemente mejor que el modelo de Monod,
cuando las concentraciones de biomasa son altas. Modelos que dependen de varios
nutrientes limitantes y modificaciones a la cintica de Monod han sido ampliamente
discutidos [4, 15].
Otros modelos como el de Pirt [15], han sido ampliamente utilizados para
describir el crecimiento en CSS. Este modelo relaciona a la biomasa con la actividad
respiratoria del microorganismo. El principal supuesto es que la actividad respiratoria
es proporcional a la tasa de crecimiento y adems, una pequea parte de la actividad
respiratoria siempre se mantiene presente aun cuando el crecimiento haya cesado.
Esto ltimo se conoce como respiracin por mantencin.
La temperatura y el contenido de agua influyen de manera importante en
el crecimiento de la biomasa. Es as como algunos modelos han considerado el efecto
de la actividad de agua (aw) sobre la tasa de crecimiento [16]. El efecto de la
temperatura ha sido modelada en algunos trabajos utilizando diferentes expresiones
matemticas [4, 9, 10, 13, 17, 18]. Otros aspectos tales como el efecto de pH,
concentracin de CO2 y O2, han recibido escasa atencin.
Otros autores han desarrollado modelos de crecimiento que consideran
una cintica de muerte o inactivacin del hongo [4, 13, 19, 20]. En general, estas
cinticas se han asumido de primer orden [4]. Es importante considerar este aspecto
cuando se desea estudiar la produccin de metabolitos secundarios, ya que stos son
excretados una vez que la biomasa ha finalizado un perodo de crecimiento
balanceado.

18

Tcnicas ms recientes, como el anlisis de imagen mediante computador

han resultado prometedoras para caracterizar la morfologa y diferenciacin de
hongos filamentosos en medios de cultivo slido [21]. As tambin, se han utilizado
modelos hbridos [22] con el fin de describir el crecimiento de hongos filamentosos en
CSS. Como ejemplo, Thibault et al. [22] incorporaron un set de ecuaciones
diferenciales, las cuales describen en gran parte los procesos fenomenolgicos
involucrados y, por otro lado, utilizaron redes neuronales para obtener algunos
parmetros claves del modelo para el caso del hongo Gibberella fujikuroi.
1.2.2

Produccin de metabolitos secundarios

En general, el principal objetivo de los modelos matemticos en CSS ha

sido describir el crecimiento microbiano. A pesar de que muchos autores han
presentado resultados experimentales de produccin de metabolitos en CSS [23, 24],
la modelacin de este aspecto no ha sido tratada [2]. Como se mencion
anteriormente, en general, los modelos de crecimiento de biomasa describen la etapa
exponencial (e.g. modelo logstico) y no consideran una inactivacin o muerte del
hongo y, por lo tanto, slo son capaces de predecir la biomasa total. Sin embargo,
para modelar la produccin de algn metabolito secundario es necesario diferenciar
entre biomasa activa e inactiva [4]. A pesar de estos problemas, modelos de
formacin de productos desarrollados para medios sumergidos pueden ser aplicados a
CSS [25].
1.2.3

Transferencia de masa y calor

Mucho de los sistemas experimentales utilizados para el estudio del

crecimiento de biomasa en medio slido, son lo suficientemente pequeos como para
asegurar la homogeneidad del medio (e.g. columnas de Raimbault). De esta manera,
las concentraciones de biomasa, O2, nutrientes, contenido de humedad, temperatura y
pH son aproximadamente iguales a travs del lecho slido. Adems, es relativamente
fcil mantener las condiciones de operacin (temperatura, contenido de agua y O2)
bajo control. Para el caso de reactores piloto o de escala industrial, la situacin es
muy diferente. En este caso, es muy difcil regular las condiciones de operacin y
mantener la homogeneidad del medio de cultivo [2].

19

Algunos autores han desarrollado modelos capaces de predecir o explicar

la dependencia espacial y temporal de la temperatura, contenido de agua y O2 [2]. En
este caso, los modelos espaciales pueden ser clasificados en modelos de parmetros
concentrados o parmetros distribuidos. Los modelos de parmetros concentrados
son aquellos que no consideran una distribucin espacial y las variables del proceso
dependen solamente del tiempo. Este tipo de modelos son descritos por ecuaciones
diferenciales ordinarias. Cuando la distribucin espacial es considerada, las variables
del proceso son descritas por ecuaciones diferenciales parciales. Reactores estticos a
nivel industrial deben ser modelados como sistemas de parmetros distribuidos. Los
modelos temporales pueden ser clasificados como pseudo-homogneos o
heterogneos. Modelos que explcitamente no consideran distribucin al interior de la
partcula slida son denominados pseudo-homogneos, en cambio, modelos que
describen gradientes al interior de la partcula slida son denominados heterogneos
[2].
Raimbault [26] desarroll un modelo en CSS para el hongo Aspergillus
niger y cmo su crecimiento es limitado por la falta de superficie y agua libre. El
modelo utiliza una ecuacin logstica de crecimiento para biomasa. Adems, predice
variables tales como la evolucin de azcares, CO2, O2, agua y calor metablico.
Determin los coeficientes de mantencin para azcares, CO2 y O2, adems de
establecer una ecuacin estequiomtrica global de crecimiento. Las columnas
utilizadas para desarrollar su modelo, hoy llevan su nombre.
Ryoo [27], contribuy con la incorporacin del calor latente de
evaporacin en el balance de energa. Para modelar el crecimiento del hongo
filamentoso Rhizopus oligosporus utiliz un modelo logstico. Adems, el modelo
describe la evolucin de CO2, temperatura y contenido de agua. En su modelo
considera la cintica de degradacin del sustrato por el hongo.
Ms recientemente, Gutierrez-Rojas et al. [28] propusieron un modelo de
parmetros concentrados para el hongo Aspergillus niger en medio slido. Se estudi
el comportamiento del hongo en columnas de Raimbault. El modelo describe la
evolucin de biomasa, azcar, agua, CO2, O2 y la temperatura. El modelo propuesto
incorpora nuevas caractersticas: i) una cintica de crecimiento limitada por efectos

20

estricos y por sustrato, ii) dependencia de max con la temperatura, iii) un balance de
energa que considera conveccin, conduccin y calor metablico.
Saucedo-Castaeda et al. [10] aplicaron un modelo pseudo-homogneo
para describir la evolucin de los gradientes radiales de temperatura en un reactor de
CSS cilndrico, con aire forzado en rgimen laminar. El balance de energa incluye el
calor metablico generado y la transferencia de calor por dos mecanismos,
conduccin en el lecho slido y conveccin a travs de las paredes del reactor.
Rajagopalan & Modak [29] desarrollaron un modelo heterogneo, en
donde se considera la difusin de oxgeno al interior de una partcula slida. Los
mismos autores [30] desarrollaron un modelo de crecimiento sobre una partcula
esfrica de salvado de trigo. En este caso, la cintica de crecimiento incluye
simultneamente limitaciones por O2 y glucosa, utilizando la ecuacin de Monod en
ambos casos. Simulaciones empleando este modelo mostraron que el agotamiento de
oxgeno al interior del biofilm es la primera causa del cese del crecimiento. No
obstante, a medida que la fermentacin contina, el agotamiento de la glucosa marca
el fin del crecimiento. Por otro lado, para un lecho slido de partculas esfricas
altamente aireado, Thibault et al. [31] concluyeron que la difusin de oxgeno a travs
del biofilm es la limitante ms importante para la transferencia de oxgeno. En este
caso, se utiliz un modelo de transferencia de oxgeno calibrado mediante datos
publicados.
1.2.4

Produccin de cido giberlico

El cido giberlico (GA3) es un cido diterpenoico presente en plantas

superiores en las cuales participa en la regulacin del crecimiento y diferenciacin
vegetal. Se le confiere la calidad de hormona vegetal, debido a que se trata de un
compuesto natural de plantas superiores que se encuentra en muy pequea cantidad, y
que afecta un variado rango de procesos, tales como elongacin del tallo,
germinacin, floracin, etc..
Algunos hongos, como Gibberella fujikuroi (sinnimo: Fusarium
moniliforme), son capaces de producir GA3 en cantidades importantes. En este caso,
la fase exponencial de crecimiento en medios limitados por nitrgeno, se prolonga

21

hasta que este elemento se vuelve limitante, momento en el cual comienza una fase de
transicin y almacenamiento [32, 33]. Durante esta ltima, y en condiciones de
suficiencia en carbono, se observa un aumento sustancial de los triglicridos y
carbohidratos micelares, concurrentes con la sntesis de GA3. Posteriormente, el
cultivo entra en fase de mantencin, perodo en que ocurre gran parte de la sntesis de
cido giberlico. De esta forma, el GA3 es una hormona vegetal endgena,
biolgicamente activa, y tambin un producto del metabolismo secundario de ciertos
microorganismos. Esta ltima caracterstica ha permitido desde hace varios aos, la
produccin industrial masiva de esta hormona mediante cultivo sumergido.
Los principales usos agrcolas del GA3 incluye tanto a frutas (e.g.
naranjas, uva) como hortalizas (e.g. papas, alcachofas) y cereales. Sin embargo, ms
del 90% del cido giberlico empleado en el mundo, principalmente California, Chile e
Israel, se destina a la obtencin de uva de mesa apirnica (i.e. sin semilla).
En la actualidad, la demanda nacional por GA3 corresponde al 25% del
consumo mundial y el 100% del GA3 es importado. El cido giberlico tiene variados
usos comerciales en el sector agrcola, siendo uno de los ms importantes el caso de
la uva de mesa de exportacin. La aplicacin de GA3 a la uva es la nica forma de
regular el crecimiento de las bayas para obtener racimos de calidad exportable.
A nivel de laboratorio, la produccin de cido giberlico por Gibberella
fujikuroi ha sido estudiada ampliamente en cultivo agitado [32, 33, 34] y en medio
slido. En este ltimo caso, se ha investigado la influencia de factores nutricionales
[23, 35, 36], fsicos (humedad, tiempo de autoclavado, pH) [37], perfiles de
alimentacin fed-batch [35, 38], adems de diferentes sustratos de cultivo [23, 24]. Se
han desarrollado modelos matemticos de crecimiento de G. fujikuroi [39, 40], sin
embargo, no se ha modelado la produccin de GA3 en medio slido. Probablemente,
esto ltimo se deba a la dificultad en modelar la evolucin de la biomasa activa y la
limitacin de GA3 por nitrgeno.
Finalmente, a escala piloto se han desarrollado reactores de cultivo en
medio slido para la produccin de GA3 [5, 38, 41], con resultados prometedores.

22

De esta manera, el objetivo general de este trabajo es desarrollar un

modelo matemtico de crecimiento y produccin de cido giberlico (GA3) en un
CSS, a partir de datos experimentales a nivel de laboratorio. Este modelo permitir
posteriormente optimizar las condiciones iniciales del cultivo y sentar las bases para
el desarrollo de polticas de alimentacin fed-batch. En ambos casos, el fin es
maximizar la produccin de GA3.
Los objetivos especficos de este trabajo son:

Estudiar cmo condiciones de actividades de agua (0.985, 0.992 y 0.999),

temperaturas controladas (25, 31 y 36C) y nutrientes, afectan al crecimiento del
hongo y la produccin del metabolito, durante el cultivo sobre soporte inerte.

Determinar intervalos de 95% de confianza para los datos experimentales

presentados, con el fin de analizar la existencia de diferencias significativas en los
resultados.

Desarrollar un modelo matemtico de crecimiento de Gibberella fujikuroi y

produccin de cido giberlico sobre sustrato slido inerte.

23

II.

ANLISIS Y TRATAMIENTO DE DATOS

2.1

Materiales y mtodos

2.1.1

Preparacin de biomasa y medio de cultivo

El inculo se prepara a partir de la cepa Gibberella fujikuroi (ATCC

12616), cultivada sobre agar malta levadura. Una vez que el micelio es
homogeneizado, se utilizan 2 (ml) para inocular 100 (ml) de medio de propagacin
estril. La composicin del medio es: 80 (g/l) glucosa anhidra, 0.45 (g/l) sulfato de
magnesio, 5 (g/l) KH2PO4, 10 (ml/l) de sales rosadas (en g/l; 0.2 de FeSO47H2O, 0.2
de ZnSO47H2O, 0.1 de CaCl22H2O, 0.02 de CuSO45H2O, 0.02 de CoCl2, 0.02 de
Na2B4O710H2O, 0.02 de Na2MoO42H2O, 0.02 de MnSO4H2O y 0.6 de EDTA),
1.85 (g/l) de NH4NO3. Cada matraz es complementado con 200 (l) de clotrimoxazol
y luego es dejado en agitacin a 28C por 48 a 60 (h). Antes de mezclar con el
sustrato, se observ al microscopio ptico para comprobar la ausencia de bacterias
y/o levaduras.
Como soporte slido se utiliz la resina de intercambio inico, Amberlita
IRA 900 (SIGMA). La resina fue estabilizada a pH 4.5 con una solucin de Na2HPO4
(0.25 M, pH 4.5). Posteriormente fue secada en estufa a 50C hasta obtener una
humedad menor al 10%, luego sta se mezcl con maltodextrina, sales y urea. De esta
manera las relaciones C/N fueron: 40 (25C, aw = 0.992), 55 (25C, aw = 0.999), 87
(31C, aw = 0.985), 49 (31C, aw = 0.992), 6 (31C, aw = 0.999), 8 (36C, aw = 0.999)
y la humedad en todos los casos, fue de un 60% aproximadamente. Este medio slido
se carg en columnas de Raimbault, las cuales se mantuvieron con temperatura,
aireacin y actividad de agua (aw) controladas.

24

2.1.2

Control de la aw y temperatura

Para proporcionar una humedad controlada en el aire de entrada a las

columnas, se dispuso de un sistema de burbujeadores con soluciones agua-glicerol
(Figura 2.1). Se formularon mezclas agua-glicerol para obtener aw de 0.985, 0.992 y
0.999. Las concentraciones adecuadas de glicerol se obtuvieron usando el programa
computacional UNIFAC [42]:
aw = 0.985 Glicerol: 72.6 (ml/l)
aw = 0.992 Glicerol: 38.5 (ml/l)
aw = 0.999 Glicerol: 0.0 (ml/l)
Los burbujeadores se conectaron a las columnas por un tapn de goma, el
cual fue sellado. Las mangueras se conectaron a una salida de aire estril y todo el
sistema fue colocado en baos de agua termoregulados (THERMOMIX). Durante la
fermentacin el nivel de agua-glicerol fue controlado, agregando agua estril cuando
fue necesario.
2.1.3

Cultivos y toma de muestras

Los cultivos se realizaron en 46 columnas de Raimbault. Adicionalmente,

4 columnas fueron utilizadas como control. Las muestras y su duplicado fueron
tomadas a intervalos regulares durante 142 horas, con mayor frecuencia las primeras
20 horas.
2.1.4

Registro de O2 y CO2 instantneos

El sistema de monitoreo mide en lnea la composicin del gas de salida de

4 columnas, tres con inculo y una columna control. El sistema est compuesto por
una columna de slica gel para deshumidificar el aire de salida, un flujmetro msico
de gas (Aalborg Instruments GFM17), un sensor electroqumico de oxgeno
(Columbus Instruments 0135-0345) y un sensor infrarrojo de dixido de carbono
(Columbus Instruments 0135-190E). Una columna de sulfato de calcio (Drierite) fue
colocada entre el flujmetro msico y los sensores de O2 y CO2 para secado adicional
del gas de salida. El flujo de cada columna fue ajustado manualmente a 35 (ml/min); la
vlvula fue peridicamente ajustada con el fin de mantener el flujo constante. La

25

adquisicin de datos fue realizada mediante un Controlador Lgico Programable

(PLC) conectado a un computador personal (MITAC 386SX). El computador
registr el tiempo, el flujo de aire y el porcentaje de CO2 y O2 de las columnas cada
20 minutos (Figura 2.1). La informacin fue procesada posteriormente en una planilla
EXCEL, donde se determinaron las curvas instantneas y acumuladas de CO2 y O2.
3

5
6
2

Figura 2.1: Monitoreo y adquisicin de datos en lnea de gases. (1) regulador de

temperatura, (2) columnas de Raimbault, (3) regulador de presin para el aire
de entrada, (4) tubo de silica gel, (5) sensor de gas, (6) computador.

2.1.5

Determinacin de biomasa total

La biomasa total es medida indirectamente, a travs de un ensayo

colorimtrico de glucosamina, proveniente de la hidrlisis de quitina contenida en la
pared fngica [43, 44]. La hidrlisis se hace reaccionando el medio slido cultivado
con HCl (6 N) durante 16 horas a 80C. El hidrolizado es neutralizado con
CH3COONa. La glucosamina se hace reaccionar con 3-metil-2-benzotiazolona
hidrocloruro (MTBH), derivando posteriormente a un compuesto coloreado de
absorbancia mxima a 653 (nm). Para obtener la equivalencia de glucosamina y
biomasa, se hace crecer el hongo sobre un trozo de papel celofn, puesto sobre

26

amberlita con igual composicin de nutrientes. Posteriormente la biomasa se

desprende y se mide gravimtricamente, relacionando la cantidad de peso seco con la
de glucosamina. Los resultados experimentales indican que el contenido de
glucosamina de la biomasa es de un 8.3% (p/p) (datos no mostrados).
2.1.6

Determinacin de urea en el medio

Se determin la evolucin de la urea mediante el kit UREA S (laboratorio

Boehringer Mannheim), basado en el desdoblamiento con ureasa y posterior reaccin
de Berthelot. De esta reaccin se origina un complejo coloreado detectable a 600
(nm).
2.1.7

Determinacin de la fuente de carbono

Se midi el contenido de almidn en el medio a travs del mtodo

Orcinol-Sulfrico, el cual consiste en la hidrlisis con H2SO4 de las uniones
glicosdicas de los azcares. Los extremos libres son deshidratados en compuestos
furfurales que se condensan al orcinol, formando un compuesto anaranjado que se
detecta en espectrofotmetro a 425 (nm).
2.1.8

Determinacin del cido giberlico

El mtodo se basa en la deteccin del derivado fluorescente que se

produce al reaccionar el cido giberlico con H2SO4 [45]. El GA3 se extrae desde 2
(g) de muestra con 3x6 (ml) de isopropanol (60, 30 y 15 minutos). El extracto se
diluye con isopropanol y se hace reaccionar con H2SO4 al 85% durante 1 hora.
2.1.9

Determinacin de la velocidad mxima de crecimiento max

La mxima velocidad especfica de crecimiento, se obtiene a partir del

logaritmo natural de la curva acumulada de CO2 y O2, en el intervalo de mayor
pendiente [46]. El tramo comprendido entre las 0-8 (h) no es utilizado debido a la
mala calidad de los datos registrados. Un ejemplo de clculo se muestra en el Anexo
A.

27

2.10

Mtodos estadsticos

Debido a la gran dispersin observada en los datos experimentales

(biomasa total, fuente de carbono, cido giberlico, CO2 y O2 instantneos), se
procedi a utilizar herramientas estadsticas para el clculo de intervalos de 95% de
confianza en las estimaciones presentadas. El mtodo requiere de modelos
matemticos capaces de reproducir las dinmicas no lineales de las variables
experimentales. En la Tabla 2.1 se muestran los modelos utilizados para el ajuste de
los datos.
Tabla 2.1. Modelos estadsticos ajustados a datos experimentales.
Variables
Biomasa (X)

Modelo
X (t ) =

a
a

1 + 1 e c t
b

Fuente de carbono (S)

S (t ) = S 0 f 1 e g t

cido giberlico (GA3)

GA3 (t ) = a 0 + a1 t + a 2 t 2 + a 3 t 3 + a 4 t 4 + a 5 t 5

Gases instantneos

ig (t ) = i1 + i2 t i3 e i4 t

Los parmetros de los distintos modelos (Tabla 2.1) fueron calibrados

mediante la funcin nlinfit del toolbox estadstico de MATLAB 5.0. Esta funcin se
basa en el mtodo iterativo de Gauss-Newton, el cual minimiza la suma de los errores
cuadrticos entre los datos experimentales y las predicciones, en sistemas no lineales
[47, 48].
Para la determinacin de intervalos de 95% de confianza, se utilizaron las
funciones nlparci y nlpredci del mismo toolbox estadstico. Estas funciones basan sus
resultados en el test estadstico t de Student [49, 50]. Mediante los datos
experimentales y los modelos no lineales como entrada, estas funciones entregan los
intervalos de confianza para la media de la variable modelada.

28

2.2

Resultados y discusin

2.2.1

Crecimiento de biomasa

En primer lugar se puede apreciar en el Anexo B, que las cantidades

mximas de biomasa total fueron alcanzadas a 25C. En condiciones de aw = 0.992 se
registraron 40 (mg/g.s.i.), seguido de 31 (mg/g.s.i.) para aw = 0.999. Los niveles ms
bajos de biomasa se obtuvieron para condiciones de 31C y aw = 0.999, alcanzando
slo 8.4 (mg/g.s.i.). Por otro lado, en los cultivos a 25C y 31C, la cantidad mxima
de biomasa se logr con aw = 0.992. Para los cultivos a 31C, aw = 0.985 y aw = 0.999
no se percibieron diferencias significativas frente a variaciones en la actividad de agua
(aw). Los intervalos de confianza en este caso, permiten afirmar que los factores
fsicos influyen en el crecimiento del hongo, siendo ms importante su efecto a bajas
temperaturas (25C) y actividades de agua medias (0.992).
Los valores obtenidos de biomasa se encuentran dentro del rango de
valores reportados por otros autores. Estudios realizados por Kumar & Lonsane con
Gibberella fujikuroi [36, 51] han reportado concentraciones de 16 (mg biomasa/g
salvado de trigo seco) en 8 das de cultivo. Por otra parte, Ebner et al. [52] reportan
118 (mg biomasa/g sustrato inerte) en 160 (h) de cultivo. En este caso, los
investigadores utilizaron vermiculita como soporte inerte. De manera similar, Agosin
et al. [53] informan rendimientos de 94 (mg/g vermiculita). Para el caso del hongo
filamentoso Aspergillus niger, Auria & Revah [54] reportaron 103 (mg biomasa/g
soporte seco) en 28 (h) de cultivo, utilizando como soporte inerte la resina de
intercambio inico Amberlita IRA-900.
A escala piloto, Bandelier et al. [38] estudiaron el crecimiento de G.
fujikuroi en un reactor de 50 (l) de capacidad utilizando salvado de trigo como medio
de cultivo. Los rendimientos de biomasa total alcanzados fueron de 103 (mg /g masa
seca) en 11 das de cultivo.
La medicin de biomasa es difcil y poco confiable debido principalmente
a problemas de interferencia y separacin con el sustrato. Por ejemplo, algunos
investigadores han realizado estimaciones indirectas de biomasa mediante mediciones
de la actividad respiratoria del hongo.

29

Investigaciones realizadas por Borrow et al. [32, 33] en medio sumergido

demuestran que una vez agotado el nitrgeno extracelular, el hongo G. fujikuroi
acumulara grasas y carbohidratos. Debido a esto y al hecho de que el mtodo
experimental utilizado para medir biomasa supone una relacin constante de
glucosamina/biomasa, se podra estar subestimando los niveles reales de biomasa.
Estos antecedentes indican que se podran obtener concentraciones de biomasa an
mayores en Amberlita.
La Tabla 2.2 permite apreciar la variacin de la velocidad mxima
especfica de crecimiento (max), en funcin de la temperatura y aw. En este caso, el
valor de max fue calculado a partir del logaritmo natural de CO2 (N1) y O2 (N2)
acumulado. En su mayora, los intervalos de confianza para los distintos max se
superponen, por lo tanto, no es posible establecer diferencias significativas entre los
valores obtenidos. Sin embargo, a 31C aw = 0.999 y 36C aw = 0.999 se obtuvieron
los valores ms bajos para la velocidad especfica de crecimiento. Esto es consecuente
con los bajos valores de biomasa obtenidos en estos experimentos. En todos los casos
max se obtuvo en el intervalo 10-20 (h), dado que fue el perodo de mayor pendiente
para el logaritmo natural de los gases acumulados. Los valores presentados en la
Tabla 2.2 se encuentran dentro de aquellos reportados para otros hongos en CSS [3,
4, 46, 55], los cuales varan entre 0.05 y 0.5 (h-1). Estudios de G. fujikuroi en donde
se utiliza vermiculita como soporte inerte reportan un max de 0.17 (h-1) [52]. El valor
mximo reportado para G. fujikuroi en medio lquido es de 0.21 (h-1) [39]. A nivel de
reactor piloto Bandelier et al. [38] reportan un max de 0.018 (h-1). A pesar de los
altos valores obtenidos para max, nuestros niveles de biomasa son bajos,
presumiblemente por una alta tasa de muerte para el hongo y una baja velocidad
especfica promedio de crecimiento, debido al rpido agotamiento del nitrgeno
disponible.
Tabla 2.2. max calculados en base a la actividad respiratoria del hongo.
Temperatura aw
Xmax
max (h-1)
max (h-1)
(C)
(mg/g.s.i.)
(N1)
(N2)
25
0.992
39.71.3
0.210.02 0.210.02
25
0.999
30.72.8
0.230.04 0.230.03
31
0.985
11.31.0
0.200.03 0.180.02
31
0.992
18.40.8
0.200.03 0.190.02
31
0.999
--8.40.5
0.140.01
36
0.999
--13.70.8
0.160.02

30

En el Anexo C es posible apreciar la evolucin de los gases instantneos y

su relacin con el consumo de urea. En todos los casos, los niveles mximos de gases
instantneos y biomasa total, no fueron alcanzados en el mismo lapso de tiempo.
Como ejemplo consideremos el cultivo a 25C y aw = 0.992. En la Figura 2.2 se
observa que la desaparicin extracelular de urea coincide con los peaks de las curvas
de CO2 y O2 instantneos. Sin embargo, es posible apreciar que la biomasa total sigue
aumentando, aun cuando no existe urea disponible en el medio. Esto ltimo indicara
que el hongo Gibberella fujikuroi acumulara parte del nitrgeno proveniente de la
urea, para luego, bajo condiciones de limitacin externa, proceder a su consumo. Un
trabajo reciente [56] ha observado este fenmeno en el hongo Arthrobotrys
oligospora, el cual almacenara una protena y la utilizara posteriormente con el fin
de continuar su crecimiento, una vez agotado el nitrgeno del medio.
50

Biomasa (mg/g.s.i.)

25C, aw=0.992
40
30
20
10

(a)
0
0

50

100

150

2,4E-06
6,0

1,8E-06

(b)

4,5

1,2E-06
3,0
6,0E-07

1,5

0,0E+00
0

50

100

Urea (mg/g.s.i.)

Gases instantneos
(mol/g.s.i. min)

25C, a w =0.992

0,0
150

Tiempo (h)

Figura 2.2: (a) Datos experimentales de biomasa medida (); las lneas
superiores e inferiores representan los intervalos de 95% de confianza; la lnea
intermedia representa el valor promedio de biomasa. (b) Relacin entre
produccin de CO2 (), O2 () y evolucin de urea ().

31

Siempre las curvas de gases instantneos lograron su mximo valor

alrededor de las 20 (h), antes que las curvas de biomasa total. Por otro lado, el
periodo de mayor pendiente para la curva de gases instantneos, se obtuvo en el
intervalo 10-20 (h) aproximadamente, coincidiendo con aquel encontrado para la
velocidad mxima de crecimiento (max). La concentracin de CO2 (Figura 2.3) y O2
acumulado no mostraron una clara relacin con el crecimiento de la biomasa total.
Slo para el cultivo a 25C y aw = 0.992, la mxima produccin de CO2 y consumo de
O2, coincidi con la mxima produccin de biomasa.

CO2 acumulado (mol/g.s.i.)

0.005
25C, a w =0.992
31C, aw =0.985

0.004

31C, aw =0.992

0.003
36C, a w =0.999

0.002
31C, a w =0.999

0.001
25C, a w =0.999

0.000
0

50

100

150

Tiempo (h)

Figura 2.3: CO2 acumulado.

2.2.2

Produccin de GA3

La cantidad mxima de GA3 producido fue aproximadamente 0.73 (mg

GA3/g.s.i.) para el cultivo a 31C y aw = 0.985. Sin embargo, los intervalos de
confianza para los cultivos a 31C y actividades de agua 0.985-0.999 se superponen
(Anexo D). Lo anterior implica que no es posible establecer diferencias significativas
entre ambos resultados. Sin embargo, si es posible afirmar que esas fueron las
condiciones que lograron la mayor produccin de cido giberlico. Cabe destacar que
a partir de estos resultados para un cultivo limitado en el tiempo, maximizar la
produccin total de GA3 no sera equivalente a maximizar la produccin de biomasa
total. Esto tambin habra sido observado por otros investigadores [23]. La Tabla 2.3

32

muestra cmo los niveles mximos de biomasa no coinciden con la produccin

mxima de GA3, para las distintas condiciones de cultivo.
Tabla 2.3. Biomasa final y GA3 mximo.
Temperatura
(C)
25
25
31
31
31
36

aw
0.992
0.999
0.985
0.992
0.999
0.999

Xmax
(mg/g.s.i.)
39.71.3
30.72.8
11.31.0
18.40.8
8.40.5
13.70.8

(GA3)max
(mg/g.s.i.)
0.570.04
0.360.04
0.730.04
0.470.02
0.670.07
0.250.01

Produccin especfica
(mg GA3/mg biomasa)
0.0140.001
0.0120.002
0.0650.009
0.0260.002
0.0800.013
0.0180.002

Para las experiencias a 25C (aw = 0.992 y aw = 0.999) y 31C (aw =

0.999) (Anexo D) es posible observar una alta tasa de produccin de GA3. Esto
indicara que producciones ms importantes de cido giberlico se hubieran obtenido
con tiempos de cultivo ms largos. No obstante, los resultados presentados en la
Tabla 2.3 son significativamente menores a los reportados previamente por otros
autores. As, Kumar & Lonsane [36, 51] han obtenido rendimientos de 1.2 (mg GA3/g
salvado de trigo seco) en 7 das de cultivo. Estudios realizados por Qian et al. [37]
informan rendimientos de 19.3 (mg GA3/g de sustrato seco fermentado) en 18 das de
cultivo. Estos autores emplearon altas concentraciones de harina de maiz,
aproximadamente un 80% del medio de cultivo total. Los investigadores afirman que
los rendimientos obtenidos podran corresponder, en parte, a la mayor utilizacin del
sustrato, pero tambin a la satisfaccin de una necesidad de alto consumo de carbono
por el hongo. A nivel de laboratorio, Agosin et al. [53] informan rendimientos de 3.8
(mg GA3/g vermiculita) y 6.8 (mg GA3/g masa seca inicial) en 190 (h), empleando
salvado de trigo como medio de cultivo. En este ltimo caso, los investigadores
atribuyen la mayor produccin a una menor limitacin por carbono y posiblemente a
la presencia de algn compuesto desconocido que inducira fuertemente la produccin
de GA3.
Experiencias realizadas en reactor piloto de 50 (l) de capacidad reportan 3
(mg GA3/g materia seca final) en 11 das de cultivo [38]. El medio de cultivo utilizado

33

por los autores fue salvado de trigo enriquecido con una solucin nutritiva. Por otro
lado, utilizando un reactor piloto de 50 (kg) de capacidad, Agosin et al. [41] informan
rendimientos de 5.2 (mg GA3/g materia seca inicial) en 6 das de cultivo utilizando
salvado de trigo.
Se comprob que la produccin de cido giberlico comienza cuando la
concentracin del nutriente nitrogenado es baja, debido a que ste inhibe la aparicin
de GA3 [57, 58]. El GA3 excretado por el hongo present en algunos casos una clara
degradacin (31C aw = 0.985; 31C aw = 0.992; 36C aw = 0.999), posiblemente
producto de una hidrlisis qumica al entrar en contacto con el medio acuoso y a una
metabolizacin de ste por parte del hongo [59, 60]. La figura 2.4 ejemplifica lo
expuesto:

0,4

6,0

0,3

4,5

0,2

3,0

0,1

1,5

Urea (mg/g.s.i.)

GA3 (mg/g.s.i.)

36C, aw=0.999

0,0
0

50

100

150

Tiempo (h)

Figura 2.4: Produccin de GA3 (); las lneas superiores e inferiores

representan los intervalos de 95% de confianza; la lnea intermedia
representa el valor promedio de GA3. Concentracin de urea ().

34

Podemos concluir que el cultivo de Gibberella fujikuroi sobre sustrato

slido inerte tiene el potencial para lograr altas concentraciones de biomasa. Esto se
ve reflejado por los altos valores de max obtenidos, utilizando Amberlita como
soporte inerte. Sin embargo, podra ser el temprano agotamiento de la urea la causa
de los bajos niveles de biomasa mxima alcanzados. Altas concentraciones iniciales de
nitrgeno pueden aumentar los niveles de biomasa final, pero a su vez pueden inhibir
la produccin de GA3. Por lo tanto, una adicin programada de nitrgeno durante el
cultivo, permitira alcanzar valores altos de biomasa y de cido giberlico al mismo
tiempo.
Por ltimo, se puede agregar que la gran dispersin de los datos
experimentales de biomasa y almidn se podran deber a la gran cantidad de etapas
requeridas en los mtodos de determinacin. Adems de la participacin de varios
operadores en la realizacin y medicin durante los experimentos.

35

III.

MODELACIN Y SIMULACIN

3.1

Modelo

El modelo est constituido por 8 ecuaciones diferenciales de parmetros

concentrados, en su mayora no lineales. Las ecuaciones son capaces de reproducir el
crecimiento del hongo, la evolucin del CO2 producido y el O2 utilizado, junto con la
degradacin de los nutrientes almidn y urea, siendo este ltimo limitante. Adems, el
modelo simula los perfiles de concentracin del cido giberlico (GA3), metabolito
secundario que slo se manifiesta cuando la concentracin del nutriente nitrogenado
es baja [57].
Los principales supuestos del modelo son:

resistencia a la transferencia de oxgeno despreciable

el nutriente limitante es el nitrgeno

fuente de carbono no es limitante

temperatura y actividad de agua constantes durante el cultivo

3.1.1

Biomasa viva

La evolucin de biomasa activa queda definida por un balance de masa

dinmico, el cual considera una tasa de crecimiento especfica y un trmino de muerte
para el hongo. Se asumi una cintica de muerte de primer orden, ya que es la ms
ampliamente utilizada en la literatura [4].

dX
= X kd X
dt

3.1.2

(3.1)

Biomasa medida

El mtodo indirecto empleado para la determinacin de la biomasa total

(activa + inactiva) consiste en la medicin de glucosamina, componente de la quitina,
la cual es parte fundamental de la pared celular del hongo. Estas mediciones no son
capaces de diferenciar entre ambos tipos de biomasa. De esta manera, la siguiente

36

ecuacin reproduce la evolucin de la biomasa total (Xm) presentes en el medio para

cada instante de tiempo.
dX m
= X
dt
3.1.3

(3.2)

Degradacin de urea

La urea degradada se utiliza fundamentalmente para la formacin de

protenas estructurales, las cuales forman parte de las paredes del microorganismo. El
modelo utilizado supone que el nutriente nitrogenado limitante, urea, se descompone
a un derivado de sta (nitrgeno intermediario, ejemplo; amonio) el cual
posteriormente se incorpora a la biosntesis de compuestos nitrogenados [61],
siguiendo una cintica de orden cero.
dU
= k
dt

(3.3)

dN I
X
= 0.47 k
YX / N I
dt

(3.4)

En que el factor 0,47 utilizado en la ecuacin (3.4) corresponde al

porcentaje en peso de nitrgeno en la urea.
3.1.4

Degradacin de la fuente de carbono

El primer trmino de la cintica de degradacin de carbono est destinado

al crecimiento del hongo, aportando los elementos necesarios para la sntesis de
biomasa y la energa necesaria para este proceso. El segundo trmino corresponde al
de mantencin, el cual considera el aporte de energa para mantener vivo al
microorganismo y adems, aporta los materiales necesarios para la formacin de
productos extracelulares. En nuestro caso, esto ltimo es prcticamente despreciable
debido a las pequeas cantidades de metabolito producido.

37

dS
X
=
ms X
dt
YX / S

3.1.5

(3.5)

Produccin de GA3

La tasa neta de produccin de cido giberlico est representada por un

trmino de produccin especfica, el cual sigue una forma tpica de inhibicin por
sustrato [34] y un trmino de degradacin en medio acuoso. Este ltimo trmino
supone que el GA3 al entrar en contacto con el medio lquido sufre una hidrlisis
qumica [59, 60].

dGA
dt
3.1.6

= X k P GA 3

(3.6)

Produccin de CO2

Producto de la respiracin del microorganismo, el dixido de carbono es

eliminado al medio durante la fermentacin. El primer trmino de la ecuacin (3.7)
representa la produccin de CO2 debido al crecimiento del microorganismo y el
segundo, producto de la respiracin del hongo [4].
dCO 2
X
=
+ m CO 2 X
dt
Y X / CO 2
3.1.7

(3.7)

O2 utilizado

La ecuacin (3.8) corresponde a la cantidad de oxgeno empleado por el

hongo. El primer trmino de la ecuacin representa al O2 utilizado para el crecimiento
del hongo y el segundo representa al oxgeno empleado para su respiracin [4]. Como
se mencion anteriormente, ste no es considerado como limitante.
dO 2
X
=
+ m O2 X
dt
Y X / O2

(3.8)

38

La integracin de las ecuaciones diferenciales fue realizada mediante un

algoritmo corrector/predictor Runge-Kutta de 4/5 orden (funcin ODE45 de
MATLAB). El horizonte de tiempo simulado fue de 145 (h) de cultivo.
3.1.8

Ecuaciones constitutivas

Velocidad especfica de crecimiento

En general en fermentacin slida se modela el crecimiento de biomasa
con una curva logstica. sta es ms apropiada para describir su evolucin en la etapa
de crecimiento. Sin embargo, la produccin de cido giberlico comienza en la fase
estacionaria. Luego, es necesario modelar la evolucin de la biomasa en condiciones
de limitacin de nutrientes en el medio. De esta manera la dependencia de por
nitrgeno, se ajusta con una relacin de Monod [15].
=

max N I
(N I + k n )

(3.9)

Velocidad especfica de produccin de GA3

En este caso se modific el trmino de velocidad especfica propuesto por
Pastrana et al. [32]. Segn la ecuacin (3.10) planteada por los autores, una vez que
los niveles de nitrgeno son iguales a cero, la produccin de GA3 se detiene. Sin
embargo, esto no habra sido observado en experiencias de laboratorio. Por tal razn,
en la ecuacin (3.10) el trmino se tom igual a cero, resultando as la ecuacin
(3.11). Esta ltima presenta una clara inhibicin por nitrgeno intermediario y la
produccin de hormona comienza una vez que los niveles de intermediario son bajos,
siendo sta mxima una vez que las concentraciones del compuesto nitrogenado
llegan a su valor mnimo.
=

etam N I
+ N I + K i N I2

(3.10)

etam
1+ Ki NI

(3.11)

39

La Figura 3.1 muestra cualitativamente las diferencias entre las ecuaciones

(3.10) y (3.11).
1,2
1,0
Ecuacin (3.10)

0,8
0,6
0,4
Ecuacin (3.11)
0,2
0,0
0

10

NI

Figura 3.1: Anlisis cualitativo de ecuaciones (3.10) y (3.11).

3.2

Estimacin de parmetros

Los parmetros del modelo se obtuvieron mediante experiencias en

columnas de laboratorio bajo condiciones de temperatura y actividad de agua
controladas (25C aw = 0.992, 25C aw = 0.999, 31C aw = 0.985, 31C aw = 0.992,
31C aw = 0.999, 36C aw = 0.999).
La calibracin de todos los parmetros mediante optimizacin directa no
es posible, debido a la no convergencia de la solucin paramtrica global. Por tal
razn, se procedi a determinar de manera independiente la mayor cantidad de
parmetros del modelo y posteriormente, se realiz la calibracin del modelo
diferencial.
3.2.1

Parmetros independientes del modelo

Determinacin de max
En primer lugar, como fue analizado en el Captulo 2, el trmino max se
obtiene a partir del logaritmo natural de la curva acumulada de CO2 y O2, en el
intervalo de mayor pendiente [46] (ver Anexo F). Sin embargo, este mtodo

40

considera que todos los gases generados o utilizados son producto del crecimiento del
microorganismo, despreciando la respiracin por mantencin.
Determinacin de coeficientes de mantencin y muerte
El estudio de respirometra utilizado permiti obtener estimaciones de la
constante de muerte del hongo (kd) y los trminos de mantencin de CO2 y O2 (mCO2 y
mO2 respectivamente). En primer lugar, a partir de t0 horas de cultivo es posible
despreciar el trmino de crecimiento de la ecuacin (3.1), transformndose en:
dX
= k d X
dt

(3.12)

La solucin a la ecuacin diferencial (3.12) resulta ser la ecuacin (3.13),

si kd se supone constante:

X = X 0 e k d ( t t 0 )

(3.13)

De la ecuacin anterior t0 y X0 corresponden a constantes de integracin.

El mismo argumento empleado para la ecuacin de crecimiento de
biomasa es utilizado para la ecuacin de CO2. A partir de t0 horas de cultivo, el
trmino preponderante en la ecuacin (3.7), es el de mantencin (mCO2). Por lo tanto,
es posible despreciar el trmino de crecimiento, debido a que la biomasa a partir del
instante t0 se encuentra en fase seudoestacionaria. De esta manera la ecuacin (3.7)
toma la siguiente forma:
dCO2
= mCO2 X
dt

(3.14)

Reemplazando el trmino de biomasa (X) de la ecuacin (3.13) en la

ecuacin (3.14), se obtiene:

dCO2
= mCO2 X 0 e kd ( t t0 )
dt

(3.15)

41

La ecuacin (3.15) corresponde a una ecuacin diferencial de variables

separadas y, por lo tanto, se puede integrar para t y CO2 en forma independiente.
Hecho esto, se obtiene:
mCO2 X 0

CO2 (t ) = (CO +
0
2

kd

mCO2 X 0 e kd (t t0 )
kd

(3.16)

Por analoga y repitiendo los mismos pasos para la ecuacin de O2, es

posible obtener la siguiente expresin:
O2 (t ) = (O +
0
2

mO2 X 0
kd

mO2 X 0 e kd (t t0 )
kd

(3.17)

Los trminos CO20 , O20 y X0 corresponden a los niveles medidos de

dixido de carbono, oxgeno utilizado y biomasa viva en el instante de tiempo t0.
Utilizando la planilla de clculo EXCEL, se realiz un ajuste por mnimos cuadrados
obtenindose los trminos kd, mCO2 y mO2. La Figura 3.2 muestra el ajuste de las
ecuaciones (3.16) y (3.17) para condiciones de 25C y aw = 0.992. Ntese que ambas
curvas (experimental y ajuste) son practicamente idnticas.

0.25

CO2 y O2 acumulados
(gr/gr.s.i.)

25C, aw =0.992
0.20

CO2

0.15

O2

0.10
0.05
0.00
0

50

100

150

Tiempo (h)

Figura 3.2: Ajuste de las ecuaciones (3.16) y (3.17).

42

En el Anexo G se muestra el ajuste de las ecuaciones (3.16) y (3.17) para

el resto de las experiencias.
3.2.2

Determinacin de parmetros mediante ajuste de EDO

Una vez determinados los parmetros max, mCO2, mO2 y kd se procedi a

minimizar el error cuadrtico entre los valores experimentales (biomasa total, urea, S,
GA3, CO2 y O2) y los entregados por el modelo matemtico. Aqu se utiliz la funcin
constr del software MATLAB, la cual corresponde a una rutina de optimizacin
restringida, que utiliza un algoritmo de programacin cuadrtica secuencial [62-65].
Posteriormente se ajust la constante de degradacin de urea (ecuacin 3.3), ya que
es independiente del resto del modelo. Posteriormente, se ajustaron los parmetros kn
e YX/NI, debido a que ellos son los que determinan la forma de las curvas de biomasa
viva y medida, y por ende, afectan a las dems ecuaciones del modelo (S, GA3, CO2,
O2). Una vez calibradas las curvas de biomasa viva y medida, es posible encontrar los
parmetros (YX/S, ms, etam, Ki, kp, YX/CO2, YX/O2) de las ecuaciones (3.5), (3.6), (3.7) y
(3.8), las cuales poseen la propiedad de ser independientes entre s, facilitando con
ello enormemente la labor de optimizacin. Finalmente, los trminos de mantencin de
las ecuaciones de CO2 y O2 son recalibrados. La Figura 3.3 resume cul fue la
secuencia utilizada para ajustar el modelo matemtico.

43

X0, CO2, O2
Estimacin de max, mCO2,
mO2 y kd (EXCEL)

mediante EXCEL

U
Estimacin de la constante
de degradacin de urea (k)

mediante MATLAB (funcin constr)

X
Ajuste de kn
simultneamente

YX/NI

mediante MATLAB (funcin constr)

S
Ajuste de YX/S y ms

GA3
Ajuste de etam, Ki
y kp

CO2
Ajuste de YX/CO2 y
recalibracin mCO2

O2
Ajuste de YX/O2 y
recalibracn mO2

Figura 3.3: Resumen de la secuencia para determinar los parmetros del modelo.

44

3.3

Resultados y discusin

La Tabla 3.1 muestra los parmetros obtenidos mediante respirometra y

calibracin, bajo las distintas condiciones de cultivo. Es posible comparar algunos
parmetros del modelo con lo reportado en la literatura:

max (mxima velocidad especfica de crecimiento): como se mencion

anteriormente, los valores calculados se encuentran dentro de aquellos reportados
para otros hongos en CSS [3, 4, 9, 46, 55], los cuales varan entre 0.05 y 0.3 (h-1).
Estudios de G. fujikuroi en donde se utiliza vermiculita como soporte inerte [40],
reportan un max de 0.17. El valor mximo reportado [39] para G. fujikuroi en
medio lquido es de 0.21 (h-1).

kd (constante de muerte de biomasa): los valores obtenidos se encuentran en el

rango de valores publicados para otros hongos en medio slido [13, 66], los
cuales varan entre 0.005-0.086 (h-1).

YX/S (coeficiente de rendimiento biomasa/almidn): valores de rendimiento se han

reportado [67, 68] en el rango 0.20-0.68 (g X/g S) para hongos en cultivo sobre
sustrato slido. Estudios de G. fujikuroi en donde se utiliza vermiculita como
soporte inerte [40] reportan un valor de 0.54 (g X/g azcar).

ms (coeficiente de mantencin): valores para hongos [67] se encuentran en el

rango 0.04-0.17 (g fuente energa/g Xh).

YX/CO2 (coeficiente de rendimiento biomasa/CO2): estudios de G. fujikuroi en

donde se utiliza vermiculita como soporte inerte [40] reportan un valor de 1.67 (g
X/g CO2). Para el hongo Aspergillus oryzae en medio slido se han reportado [3]
valores de 0.8-1.1 (g X/g CO2). Estudios en donde se modela [12] el crecimiento
del hongo Rhizopus oligosporus en medio slido, reportan un valor de 1.31 (g
X/g CO2).

YX/O2 (coeficiente de rendimiento biomasa/O2): estudios de hongos en medio

lquido [25] reportan valores entre 0.17-1.50 (g X/g O2). En general, los valores
obtenidos por simulacin superan estos valores.

45

Tabla 3.1: Parmetros del modelo.

Parmetros

25C
aw=0.992

25C
aw=0.999

31C
aw=0.985

31C
aw=0.992

0.21

0.24

0.21

0.19

7.810-4

4.610-4

3.010-4

2.410-4

kd (1/h)

0.027

0.039

0.027

0.025

k (1/h)

1.310-4

510-4

1.510-4

1.310-4

YX/NI (g X/g NI)

21.0

17.0

5.0

9.6

YX/S (g X/g S)

0.89

0.18

0.12

0.18

ms (g S/g Xh)

0.09

0.08

0.85

0.21

YX/CO2 (g X/g CO2)

1.15

1.96

0.75

1.73

mCO2 (g CO2/ g Xh)

0.13

0.17

0.43

0.24

YX/O2 (g X/g O2)

2.60

3.80

1.22

2.56

mO2 (g O2/ g Xh)

0.05

0.07

0.24

0.12

etam (g GA3/g Xh)

6.1110-4

5.5810-4

3.110-3

8.810-4

Ki (1/ g NIg.s.i.)

2.95105

2.95105

9.53106

1.33105

0.0016

max (1/h)
kn (g NI/g.s.i.)

kp (1/h)

A los parmetros se les aplic un anlisis de correlacin multivariable [48,

50], tomando como variables independientes a la temperatura y actividad de agua
(aw). Mediante este procedimiento, fue posible establecer el grado de dependencia
lineal (R2) entre las variables fsicas y los parmetros ajustados. Adems, el anlisis
permiti establecer de manera cualitativa el tipo de influencia ejercida por la
temperatura y aw sobre los parmetros. Sin embargo, la interpretacin de este anlisis
debe tener en cuenta que existen problemas en la identificacin de los parmetros.
Esto ltimo significa que en algunos casos pueden existir varias combinaciones de
parmetros para una misma ecuacin de estado.

46

La Tabla 3.2 muestra los resultados ms relevantes del anlisis de

correlacin.
Tabla 3.2: Anlisis de correlacin.
Parmetros

R2 (T, aw)

aw

YX/CO2

0.98

YX/O2

0.98

kn

0.91

YX/NI

0.88

+
-

+
+
+

Destacan por su alto grado de correlacin (R2) los parmetros YX/CO2,

YX/O2, kn e YX/NI. En el primer caso, el parmetro de rendimiento YX/CO2 se vio
afectado positivamente (+) a medida que la temperatura y actividad de agua
aumentan. Para los trminos de rendimiento YX/O2 e YX/NI, stos mostraron disminuir
(-) a medida que la temperatura asciende, y por otro lado, mostraron un aumento (+)
a medida que la actividad de agua crece. Esta relacin entre YX/NI y la temperatura,
explicara en parte, el hecho de que a 25C se alcancen las mayores concentraciones
de biomasa. Finalmente, el parmetro de ajuste kn, demostr disminuir (-) a medida
que la temperatura (T) y la actividad de agua (aw) aumentan.
Todas las simulaciones comenzaron a las 0 horas (Anexo H), a excepcin
de aquella a 25C y aw = 0.999. En este caso la simulacin comenz a las 20 (h),
debido a que el modelo matemtico utilizado no es capaz de reproducir la fase lag.
Se apreci en todas las simulaciones que una vez agotado el nitrgeno
intermediario, finaliza el crecimiento neto de biomasa y se inicia la produccin de
cido giberlico. Esto ltimo sera consecuente con la ecuacin de velocidad
especfica planteada (ecuacin 3.11). Tomemos como ejemplo el cultivo a 25C y aw
= 0.992. En la Figura 3.4 es posible apreciar las curvas de biomasa, consumo de urea
y produccin de GA3 simultneamente.

47

50

Biomasa (mg/g.s.i.)

25C, aw=0.992
40
30
20

(a)
10
0
0

50

100

150

5,0

1,0

Urea (mg/g.s.i.)

4,0

0,8

3,0

0,6

2,0

0,4

(b)
1,0

0,2

0,0
0

50

Nitrgeno intermediario
(mg/g.s.i.)

25C, a w =0.992

0,0
150

100

25C, aw =0.992

GA3 (mg/g.s.i.)

0,60

0,45

0,30

0,15

(c)
0,00
0

50

100

150

Tiempo (h)

Figura 3.4: (a) curva de biomasa medida (lnea gruesa) y biomasa viva
(lnea punteada), (b) consumo de urea y nitrgeno intermediario, (c)
produccin de GA3.
Para las experiencias a 25C y actividades de agua 0.992 y 0.999, se
cumpli que una vez agotada la urea del medio, el nitrgeno intermediario se
encontraba en altas concentraciones. Esto ltimo permiti que la biomasa continuara
su crecimiento hasta agotarse el intermediario. Por otro lado, se observ que los
niveles de nitrgeno intermediario a 31C y aw = 0.985 y 0.992 se agotaron junto con
la urea, deteniendo con ello el crecimiento de la biomasa alrededor de las 25 (h). Los

48

niveles mximos de intermediario parecieran estar relacionados con las

concentraciones finales de GA3, ya que mientras mayores son las concentraciones de
nitrgeno intermediario, menores son las concentraciones de GA3 excretados por el
hongo al finalizar el cultivo.
En todos los casos estudiados, la cintica de degradacin de urea mostr
ser claramente de orden cero (ver Figura 3.4), desapareciendo del medio de cultivo
entre las 20-25 (h). La velocidad de degradacin de urea (k) pareciera no estar
relacionada con las condiciones fsicas de temperatura y actividad de agua.
Al examinar en conjunto las mximas concentraciones de biomasa y
produccin de cido giberlico, se concluye que maximizar la produccin total de
GA3, no necesariamente sera equivalente a maximizar la produccin de biomasa total.
Esto tambin habra sido observado por otros investigadores [23]. Ntese que a 31C
y aw = 0.985-0.999, se obtuvieron las mayores concentraciones de GA3 y se
alcanzaron las concentraciones ms bajas de biomasa medida.
El ajuste de la fuente de carbono, present pequeas desviaciones con
respecto a los datos experimentales. Esto podra deberse a las dificultades asociadas a
la medicin de dicha variable, producto de la tcnica empleada.
3.3.1

Anlisis de sensibilidad

Se perturbaron los parmetros nominales del modelo en 30%, con el fin

de medir su influencia en las variables simuladas. Se tom como caso de estudio el
cultivo realizado a 25C y aw = 0.992. La siguiente ecuacin corresponde al ndice de
sensibilidad empleado:

Si =

Xi

+ /
t

Xit*

Xit+ / Xit*
t
max

(3.18)

El trmino Si representa el anlisis de sensibilidad con respecto a la

variable i (biomasa viva, biomasa medida, nitrgeno intermediario, fuente de carbono,
GA3, CO2 y O2), Xit+/- es la variable de inters perturbada positiva o negativamente,

49

Xit* es la variable nominal y el denominador del ndice representa la mxima

perturbacin de la variable analizada. De esta manera, el trmino Si queda acotado
entre 0 y 1.
La Tabla 3.3 muestra los parmetros que ms influyen en las variables de
estado y, por lo tanto, cules de stos deben conocerse con una mayor precisin. En
primer lugar, la biomasa viva se ve afectada fuertemente por la constante de muerte
(kd). La biomasa medida, nitrgeno intermediario y almidn, se ven fuertemente
influenciados debido al parmetro YX/NI. Este parmetro afecta a la biomasa medida y
a la fuente de carbono de manera indirecta, ya que el trmino de rendimiento no
aparece explcitamente en estas ecuaciones de estado. La produccin de cido
giberlico fue ms sensible con respecto al parmetro kd, el cual tambin ejerce su
influencia de manera indirecta. En este caso, la produccin de hormona depende
directamente de las concentraciones de biomasa viva, la cual a su vez depende de la
constante de muerte. Finalmente, la produccin de CO2 y consumo de O2 presentaron
una gran sensibilidad con respecto a los trminos de mantencin mCO2, mO2 y a YX/NI.
Tabla 3.3: Parmetros ms relevantes del anlisis de sensibilidad.
Variables de estado

Parmetros

X
Xm
NI
S
GA3
CO2
O2

kd
YX/NI
YX/NI
YX/NI
kd
mCO2, YX/NI
mO2, YX/NI

La Figura 3.5 muestra grficamente cmo los parmetros de la Tabla 3.3,

afectan a las variables de estado. En todos los casos, se evidenciaron fuertes
desviaciones producto de perturbaciones positivas (+30%) y negativas (-30%)
efectuadas a los parmetros ms importantes del modelo. La concentracin de
biomasa medida y produccin de cido giberlico fueron las variables ms sensibles,
producto de perturbaciones en YX/NI y kd respectivamente.

50

60

1.2
25C, aw=0.992

(b)

Biomasa (mg/g.s.i.)

50

(a)

Nitrgeno intermediario
(mg/g.s.i.)

+P

25C, aw =0.992

+P
0.8

40

-P

30

-P
0.4

20
10

-P

+P

0
0

50

0
100

150

50

100

150

350
25C, aw =0.992

-P

0.45

210

0.30

140

-P

70

(c)
0
0

50

+P

0.15

(d)

+P

0.00
100

150

50

100

150

Tiempo (h)

0.30

Gases acumulados (g/g.s.i.)

0.60

GA3 (mg/g.s.i.)

Almidn (mg/g.s.i.)

25C, a w=0.992
280

+P

25C, a w =0.992
0.25

CO2

(e)
0.20

-P
0.15

+P
O2

0.10

-P

0.05
0.00
0

50

100

150

Tiempo (h)

Figura 3.5: Anlisis de sensibilidad. Caso de estudio 25C, aw = 0.992. Las lneas gruesas
representan el caso nominal. +P y P corresponden a las perturbaciones positivas
(+30%) y negativas (-30%) en los parmetros. En la curva de biomasa viva (a) y
produccin de GA3 (d) se perturb a kd. En la curva de biomasa medida (a), nitrgeno
intermediario (b) y almidn (c) se perturb al parmetro YX/NI. En las curvas de gases
acumuladas (e) fueron perturbados mCO2 y mO2.

51

El parmetro de rendimiento YX/NI aparece en el anlisis de sensibilidad

como uno de los ms importantes, siendo su influencia directa e indirecta. En este
caso, no es posible determinar su valor de manera experimental, dado que no se posee
informacin acerca del real intermediario utilizado por el hongo G. fujikuroi.
En el Anexo I se muestra el anlisis de sensibilidad realizado in extenso.

52

IV.

CONCLUSIONES

Bajas temperaturas (25C) y altas actividades de agua (aw = 0.992)

favorecen el crecimiento del hongo Gibberella fujikuroi. Sin embargo, a 31C y
actividades de agua 0.985-0.999 se obtuvieron las mayores concentraciones y
productividades de cido giberlico.
El cultivo de Gibberella fujikuroi sobre sustrato slido inerte tiene el
potencial para lograr altas concentraciones de biomasa. Esto se ve reflejado por los
altos valores de max obtenidos, utilizando amberlita como soporte inerte. Sin
embargo, podra ser el temprano agotamiento de la urea la causa de los bajos niveles
de biomasa mxima alcanzados. Altas concentraciones iniciales de nitrgeno pueden
aumentar los niveles de biomasa final, pero a su vez pueden inhibir la produccin de
GA3. Por lo tanto, una adicin programada de nitrgeno durante el cultivo, permitira
alcanzar valores altos de biomasa y de cido giberlico al mismo tiempo.
La modelacin del metabolito secundario no present mayores
dificultades al momento de emplear expresiones desarrolladas para medios
sumergidos. Esto se debera principalmente a que se diferenci entre biomasa activa e
inactiva. Los datos experimentales se ajustaron satisfactoriamente en la mayora de los
casos. Sin embargo, el anlisis de sensibilidad demostr que las variables de estado
presentan importantes desviaciones al perturbar los parmetros del modelo en 30%.
Con respecto a la estimacin de parmetros, urge la necesidad de determinar mtodos
adecuados para encontrar valores confiables y precisos. Esto es vital, sobre todo
cuando conclusiones son formuladas a partir de ellos.
El modelo desarrollado sienta las bases a la optimizacin del cultivo de
Gibberella fujikuroi, mediante polticas adecuadas de alimentacin fed-batch y
concentraciones iniciales ptimas del nutriente nitrogenado.
Por otro lado, el modelo aqu expuesto permitir el desarrollo de
estimadores en lnea de biomasa, sustrato, GA3 y la optimizacin de la adicin de
nutrientes durante el cultivo del hongo Gibberella fujikuroi.

53

V.

NOMENCLATURA

ai
b
ii
k
kd
Ki
kN
kp
mCO2
mO2
ms
NI
S
S0
Si
s.i.
t
U
X
Xit+/Xit*
Xm
YX/CO2
YX/NI
YX/O2
YX/S

etam

max

Parmetros de ajuste (i = 0...5)

Parmetro de ajuste
Parmetros de ajuste (i = 1...4)
Constante de degradacin de urea [1/h]
Constante de muerte [1/h]
Constante de inhibicin [1/ g NIg.s.i.]
Parmetro de ajuste [g NI/g.s.i.]
Constante de degradacin de GA3 [1/h]
Coeficiente de mantencin de CO2 [g CO2/g Xh]
Coeficiente de mantencin de O2 [g O2/g Xh]
Coeficiente de mantencin de almidn [g S/g Xh]
Nitrgeno intermediario [g/g.s.i.]
Fuente de carbono [g/g.s.i]
Almidn inicial [mg/g.s.i.]
Anlisis de sensibilidad con respecto a la variable i
Soporte inerte
Tiempo [h]
Nutriente urea [g/g.s.i.]
Biomasa viva [g/g.s.i.]
Variable de inters perturbada positiva o negativamente
Variable nominal
Biomasa medida [g/g.s.i.]
Coeficiente de rendimiento biomasa/CO2 [g X/g CO2]
Coeficiente de rendimiento biomasa/nitrgeno intermediario [g X/g NI]
Coeficiente de rendimiento biomasa/O2 [g X/g O2]
Coeficiente de rendimiento biomasa/almidn [g X/g S]
Tasa especfica de aparicin de GA3 [1/h]
Valor de ajuste [g GA3/g Xh]
Tasa especfica crecimiento de biomasa [1/h]
Mxima velocidad especfica de crecimiento [1/h]

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63

ANEXOS

64

ANEXO A: CLCULO DE MAX

Como ejemplo utilicemos el cultivo a 25C y aw = 0.992. En primer lugar,
se aplic un polinomio de tercer orden a los gases instantneos en el intervalo 10-30
(h). La Figura A (a) muestra el polinomio ajustado con intervalos de 95% de
confianza para las curvas de CO2 y O2 instantneas. Estas curvas son integradas en
EXCEL, obtenindose la curva acumulada para ambos gases (Figura A (b)). A los
gases acumulados se les aplica logaritmo natural y luego se calcula la pendiente en el
intervalo de mayor crecimiento (A (c)). Ntese que en ambos casos, los rangos de
valores son prcticamente idnticos.
1.6E-06

1.6E-06

25C, a w =0.992

1.2E-06

1.2E-06

8.0E-07

8.0E-07

O2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

CO2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

25C, a w =0.992

4.0E-07

4.0E-07

(a)

(a)
0.0E+00

0.0E+00
0

10

15

20

25

0.0008

10

15

0.0004

0.0004

0.0002

0.0002

O2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

0.0006

(b)

(b)
0

10

15

20

25

10

15

20

25

-6

10

15

20

25

10

15

20

25

-6

-7

-7
25C, a w =0.992

25C, a w =0.992

-8

ln(O2)

ln(CO2)

25

25C, a w =0.992

0.0006

-8

-9

-9

-10

y = 0.21x - 11.79

y = 0.21x - 12.21
y = 0.23x - 12.79

y = 0.24x - 12.52

-11

(c
)

y = 0.19x - 11.74

(c)

y = 0.19x - 11.30

-10

20

0.0008
25C, a w =0.992

CO2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

-11

Tiempo (h)

Tiempo (h)

Anexo A: 25C, aw = 0.992. (a) gases instantneos con intervalos de 95% de

confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c)
pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.

65

1.6E-06

1.6E-06
25C, aw=0.999

1.2E-06

1.2E-06

8.0E-07

8.0E-07

4.0E-07

O 2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

CO 2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

25C, aw=0.999

4.0E-07

(a)

(a)
0.0E+00

0.0E+00
0

10

15

20

25

30

6.0E-04

10

15

20

25

30

6.0E-04
25C, aw=0.999

25C, a w =0.999

4.5E-04

4.5E-04

3.0E-04

3.0E-04

1.5E-04

O2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

CO 2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

1.5E-04

(b)

(b)

0.0E+00

0.0E+00
0

10

15

20

25

30

10

15

20

25

30

-6

10

15

20

25

30

10

15

20

25

30

-8
0

-7

25C, aw=0.999

25C, aw=0.999

-9

-9
-10

ln(O 2)

ln(CO 2)

-8
-10

y = 0.20x - 13.26

y = 0.19x - 12.39

-11

-11

y = 0.23x - 13.22
y = 0.27x - 14.35

(c)

y = 0.23x - 13.80

(c)

y = 0.26x - 14.54

-12

-12

Tiempo (h)

Tiempo (h)

Anexo A: 25C, aw = 0.999. (a) gases instantneos con intervalos de 95% de

confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c)
pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.

66

1.6E-06

1.6E-06

31C, aw=0.985

1.2E-06

1.2E-06

8.0E-07

8.0E-07

4.0E-07

O2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

CO2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

31C, aw=0.985

4.0E-07

(a)

(a)

0.0E+00

0.0E+00
0

10

15

20

25

30

1.6E-03

10

15

20

25

31C, aw=0.985
1.2E-03

8.0E-04

8.0E-04

4.0E-04

O2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

1.2E-03

4.0E-04

(b)

(b)

0.0E+00

0.0E+00
0

10

15

20

25

30

10

15

20

25

30

10

15

20

25

30

10

15

20

25

30

-6

-6

31C, aw=0.985

31C, aw=0.985

-7

-7

-8

-8
y = 0.17x - 10.42

ln(O 2)

ln(CO 2)

30

1.6E-03
31C, aw=0.985

CO2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

y = 0.16x - 10.54

-9

-9
y = 0.19x - 10.93
y = 0.22x - 11.66

-10

y = 0.17x - 10.92

(c)

y = 0.20x - 11.42

(c)

-10

Tiempo (h)

Tiempo (h)

Anexo A: 31C, aw = 0.985. (a) gases instantneos con intervalos de 95% de

confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c)
pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.

67

1.6E-06

1.6E-06
31C, aw=0.992

1.2E-06

1.2E-06

8.0E-07

8.0E-07

4.0E-07

O 2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

CO 2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

31C, aw=0.992

4.0E-07

(a)

(a)

0.0E+00

0.0E+00
0

10

15

20

25

30

8.0E-04

10

15

20

4.0E-04

0.0004

2.0E-04

O2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

0.0006

0.0002

(b)

(b)

0.0E+00

0
0

10

15

20

25

30

10

15

20

25

30

-6

10

15

20

25

30

10

15

20

25

30

-7
31C, aw=0.992

31C, aw=0.992
-8

ln(O 2)

ln(CO 2)

0
-6

-7

-10

30

31C, aw =0.992

6.0E-04

-9

25

0.0008
31C, a w=0.992

CO 2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

-8

-9

y = 0.18x - 11.09

y = 0.18x - 11.57

y = 0.20x - 11.61

-10
y = 0.23x - 12.353

-11

(c)

(c)

y = 0.19x - 11.94
y = 0.21x - 12.41

-11

Tiempo (h)

Tiempo (h)

Anexo A: 31C, aw = 0.992. (a) gases instantneos con intervalos de 95% de

confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c)
pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.

68

1.6E-06

1.6E-06
36C, aw =0.999

1.2E-06

1.2E-06

8.0E-07

8.0E-07

4.0E-07

4.0E-07

CO2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

CO2 Instantneo
(mol/g.s.i. min)

31C, a w =0.999

(a)

(a)

0.0E+00

0.0E+00
0

10

15

20

25

30

0.0016

10

15

20

30

36C, a w =0.999
0.0012

0.0008

0.0008

0.0004

0.0004

CO2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

0.0012

(b)

(b)
0

0
0

10

15

20

25

30

10

15

20

25

30

-6

10

15

20

25

30

10

15

20

25

30

-6
0

31C, aw=0.999

36C, a w=0.999

-7

-7

-8

ln(CO2)

ln(CO2 )

25

0.0016
31C, a w =0.999

CO2 Acumulado
(mol/g.s.i.)

-8
y = 0.14x - 9.82
y = 0.14x - 9.93

y = 0.14x - 10.19

y = 0.15x - 10.05

-9

-9
y = 0.15x - 10.57

(c)
-10

(c)
y = 0.17x - 11.07

-10

Tiempo (h)

Tiempo (h)

Anexo A: 31 y 36C, aw = 0.999. (a) gases instantneos con intervalos de 95% de

confianza, (b) gases acumulados con intervalos de 95% de confianza, (c)
pendientes del logaritmo natural de los gases acumulados.

69

ANEXO B: CURVAS DE CRECIMIENTO DE BIOMASA MEDIDA

50

50
25C, aw=0.992

25C, aw=0.999

40

40

30

30

20

20

10

10
0

0
0

50

100

50

Biomasa (mg/g.s.i.)

150

50

100

150

100

150

100

150

50
31C, aw=0.985

31C, aw=0.992

40

40

30

30

20

20

10

10

0
0

50

100

150

50

50

50
31C, aw=0.999

36C, aw=0.999

40

40

30

30

20

20

10

10

50

100

Tiempo (h)

150

50

Tiempo (h)

Anexo B: Biomasa medida. () datos experimentales; las lneas superiores e

inferiores representan los intervalos de 95% de confianza; la lnea intermedia
representa el valor promedio de biomasa.

70

ANEXO C: GASES INSTANTNEOS Y DEGRADACIN DE UREA

2.4E-06

2.4E-06

25C, aw=0.992

25C, aw=0.999

6.0

1.8E-06
4.5
1.2E-06

4.5
1.2E-06

3.0
6.0E-07

1.5

0.0E+00
0

50

100

0.0
150

2.4E-06

3.0
6.0E-07

1.5

0.0E+00
0

50

100

0.0
150

2.4E-06

31C, aw=0.985

31C y aw=0.992

6.0

1.8E-06

6.0

1.8E-06

4.5
1.2E-06

4.5
1.2E-06
3.0

3.0
6.0E-07

1.5

0.0E+00
0

50

100

0.0
150

6.0E-07

1.5

0.0E+00
0

50

100

0.0
150

2.4E-06

2.4E-06
31C, aw=0.999

36C y aw=0.999

6.0

6.0

1.8E-06

1.8E-06

4.5

4.5
1.2E-06

1.2E-06

3.0

3.0
6.0E-07

1.5

0.0E+00
0

50

100

Tiempo (h)

0.0
150

6.0E-07

1.5

0.0E+00
0

50

100

0.0
150

Tiempo (h)

Anexo C: Relacin entre produccin de CO2 (), O2 () y evolucin de

urea ().

Urea (mg/g.s.i.)

Gases instantneos
(mol/g.s.i. min)

6.0

1.8E-06

71

ANEXO D: PRODUCCIN DE CIDO GIBERLICO

0.8

0.8

25C, aw=0.999

25C, aw=0.992

0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.2

C/N = 55

C/N = 40
0

cido giberlico (mg/g.s.i.)

50

100

150

200

0.8

50

100

150

200

0.8
31C, aw=0.985

31C, aw=0.992

0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.2

C/N = 49

C/N = 87
0

0
0

50

100

150

200

50

100

150

200

0.8

0.8
31C, aw=0.999

36C, aw=0.999

0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.2

C/N = 8

C/N = 6
0

0
0

50

100

Tiempo (h)

150

200

50

100

150

200

Tiempo (h)

Anexo D: Produccin de cido giberlico (), las lneas superiores e

inferiores representan los intervalos de 95% de confianza; la lnea intermedia
representa el valor promedio de GA3.

72

ANEXO E: GASES ACUMULADOS Y RQ

CO2 acumulado (mol/g.s.i.)

0.005
25C, a w =0.992
31C, aw =0.985

0.004

31C, aw =0.992

0.003
36C, a w =0.999

0.002
31C, a w =0.999

0.001
25C, a w =0.999

0.000
0

50

100

150

O2 acumulado (mol/g.s.i.)

0.005
0.004
31C, a w =0.985

25C, a w =0.992

0.003
0.002
31C, a w =0.992

0.001
25C, a w =0.999

0.000
0

50

100

150

Tiempo (h)

2.5

2.0

25C, aw=0.992

R.Q.

1.5

31C, aw=0.992

1.0
31C, aw=0.985

0.5
25C, aw=0.999

0.0
0

50

100

150

Tiempo (h)

Anexo E: CO2 y O2 acumulado por gramo de soporte inerte (g.s.i.). RQ de

las experiencias a 25C aw = 0.992, 0.999, 31C aw = 0.985 y 0.992.

73

ANEXO F: DEGRADACIN DE ALMIDN

400

400
25C, aw=0.992

25C, aw=0.999

300

300

200

200

100

100

50

100

400

Almidn (mg/g.s.i.)

150

50

100

150

400
31C, aw=0.992

31C, aw=0.985

300

300

200

200

100

100

50

100

150

50

100

150

400

400
31C, aw=0.999

36C, aw=0.999

300

300

200

200

100

100

0
0

50

100

Tiempo (h)

150

50

100

150

Tiempo (h)

Anexo F: Consumo de almidn (); las lneas superiores e inferiores representan

los intervalos de 95% de confianza; la lnea intermedia representa el valor
promedio de almidn.

74

ANEXO G: AJUSTE DE LAS ECUACIONES (3.16) Y (3.17)

0.25
25C, aw=0.999
0.20

CO2

0.15

0.10

O2
0.05

0.00
0

50

100

150

0.25

CO2 y O2 acumulados
[gr/gr.s.i.]

31C, a w =0.985
0.20

CO2
0.15

0.10

O2

0.05

0.00
0

50

100

150

0.25
31C, aw=0.985
0.20

CO2
0.15

0.10

O2

0.05

0.00
0

50

Tiempo [h]

100

150

75

ANEXO H: SIMULACIONES DE LOS CULTIVOS

50

5.0
25C, aw =0.992

40

4.0

30

3.0

20

Urea (mg/g.s.i.)

Biomasa (mg/g.s.i.)

25C, aw=0.992

2.0

(a)

(b)
1.0

10

0.0

0
0

50

100

150

50

100

150

1.2

25C, aw =0.992
280

Almidn (mg/g.s.i.)

Nitrgeno intermediario
(mg/g.s.i.)

350
25C, aw =0.992

210

0.8

(d)

(c)

140

0.4
70
0.0

0
0

50

100

150

50

100

150

0.25

Gases acumulados (g/g.s.i.)

25C, a w =0.992

25C, aw=0.992

0.60

GA3 (mg/g.s.i.)

0.20

CO2
0.45

0.15

O2

0.30

0.10

0.15

0.05

(e)

(f)

0.00

0.00
0

50

100

Tiempo (h)

150

50

100

150

Tiempo (h)

Anexo H: 25C, aw = 0.992. () datos experimentales. (a) lnea punteada

representa a la biomasa viva, (f) lnea delgada representa a los datos
experimentales.

76

50

5.0
25C, a w =0.999

40

4.0

30

3.0

20

2.0

(a)
10

Urea (mg/g.s.i.)

Biomasa (mg/g..s.i.)

25C, aw =0.999

(b)

1.0

0
0

50

100

150

0.0
0

50

100

150

350
25C, a w =0.999

1.2
280

Almidn (mg/g.s.i.)

Nitrgeno intermediario
(mg/g..s.i.)

25C, a w =0.999

210

0.8

(d)

(c)

140

0.4
70
0.0

0
0

50

100

150

50

100

150

0.25

Gases acumulados (g/g.s.i.)

25C, a w =0.999

25C, a w =0.999

0.60

GA3 (mg/g.s.i.)

0.20

CO2

0.45

0.15

0.30

0.10

0.15

O2

0.05

(e)

(f)

0.00

0.00
0

50

Tiempo (h)

100

150

50

100

150

Tiempo (h)

Anexo H: 25C, aw = 0.999. () datos experimentales. (a) lnea punteada

representa a la biomasa viva, (f) lnea delgada representa a los datos
experimentales.

77

50

5.0
31C, aw=0.985

31C, aw =0.985
4.0

30

Urea (mg/g.s.i.)

Biomasa (mg/g.s.i.)

40

3.0

(a)

(b)

20

2.0

10

1.0
0.0

0
0

50

100

150

50

100

150

350
31C, aw =0.985

31C, aw=0.985
280

Almidn (mg/g.s.i.)

Nitrgeno intermediario
(mg/g.s.i.)

1.2

210

0.8

(d)

(c)

140

0.4
70
0

0.0
0

50

100

150

50

100

150

0.25

Gases acumulados (g/g.s.i.)

31C, a w=0.985

31C, aw =0.985

0.60

GA3 (mg/g.s.i.)

0.20

CO2

0.45

0.15

0.30

O2

0.10

0.15

0.05

(e)

(f)

0.00

0.00
0

50

Tiempo (h)

100

150

50

100

150

Tiempo (h)

Anexo H: 31C, aw = 0.985. () datos experimentales. (a) lnea punteada

representa a la biomasa viva, (f) lnea delgada representa a los datos
experimentales.

78

50

5.0
31C, a w=0.992

40

4.0

(a)

(b)

30

3.0

20

2.0

10

1.0

Urea (mg/g.s.i.)

Biomasa (mg/g.s.i.)

31C, aw =0.992

0.0
0

50

100

150

50

100

150

350
31C, aw=0.992

1.2

280

Almidn (mg/g.s.i.)

Nitrgeno intermediario
(mg/g.s.i.)

31C, aw =0.992

210

0.8

(d)

(c)
140
0.4

70
0

0
0

50

100

150

50

100

150

0.25
31C, aw =0.992

GA3 (mg/g.s.i.)

0.60

0.20

0.45

CO2

0.15

0.30

0.10

0.15

O2

0.05

(e)

(f)

0.00

0.00
0

50

Tiempo (h)

100

150

50

100

150

Tiempo (h)

Anexo H: 31C, aw = 0.992. () datos experimentales. (a) lnea punteada

representa a la biomasa viva, (f) lnea delgada representa a los datos
experimentales.

Gases acumulados (g/g.s.i.)

31C, a w =0.992

79

ANEXO I: ANLISIS DE SENSIBILIDAD 25C Y AW =0.992

NI

+30%

-30%

S+

S-

<S>

S+

S-

<S>

S+

S-

<S>

S+

S-

<S>

0.27

0.147

0.58

0.73

0.66

0.15

0.27

0.21

0.60

0.66

0.63

0.15

0.29

0.22

0.40

0.36

0.38

0.11

0.13

0.12

0.66

0.46

0.56

0.12

0.12

0.12

0.86

1.00

0.93

0.04

0.04

0.04

0.27

0.15

0.21

0.51

0.70

0.61

0.45

0.56

0.51

0.12

0.19

0.16

1.00

0.70

0.85

0.11

0.20

0.16

10.110

-4

0.0346
-

Xm

1.7310

-4

5.4610

-4

0.0186
0.9310

-4

27.29

14.70

1.00

0.77

0.89

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.1618

0.6256

0.27

0.49

0.38

0.1186

0.0638

0.88

0.85

0.87

GA 3

CO 2

O2

Xi*

+30%

-30%

S+

S-

<S>

S+

S-

<S>

S+

S-

<S>

max

0.21

0.27

0.147

0.76

0.88

0.82

0.15

0.29

0.22

0.15

0.29

022

kn

7.810 -4

10.110 -4

5.4610 -4

0.69

0.53

0.61

0.11

0.12

0.12

0.12

0.12

0.12

kd

0.0266

0.0345

0.0186

1.00

1.00

1.00

0.58

0.81

0.70

0.58

0.80

0.69

1.3310 -4

1.7310 -4

0.9310 -4

0.18

0.29

0.24

0.11

0.21

0.16

0.11

0.21

0.16

Y X/NI

20.99

27.29

14.70

0.55

0.39

0.47

0.97

1.00

0.99

0.99

1.00

1.00

mCO 2

0.1322

0.1719

0.0925

1.00

1.00

1.00

Y X/CO 2

1.154

1.50

0.808

0.17

0.32

0.25

mO 2

0.0544

0.0707

0.0381

1.00

1.00

1.00

Y X/O 2

2.604

3.385

1.823

0.18

0.33

0.26

6.1110 -4

7.9410 -4

4.2810 -4

0.74

0.50

0.62

Ki

2.95105

3.8410 5

2.07105

0.10

0.10

0.10

kp

0.0016

0.0021

0.0011

0.05

0.03

0.04

80

ANEXO J: CLCULO DE LA CONSTANTE DE MUERTE

Otra manera de calcular la constante de muerte (kd) del microorganismo

es la que a continuacin se detalla.. A partir de t0 horas de cultivo es posible
despreciar el trmino de crecimiento de la ecuacin (3.1), transformndose en:
dX
= k d X
dt

(1)

El mismo argumento empleado para la ecuacin de crecimiento es

utilizado para la ecuacin de CO2 (ecuacin 3.7). A partir de t1 horas de cultivo, el
trmino preponderante en la ecuacin (3.7), es el de mantencin (mCO2). Por lo tanto,
es posible despreciar el trmino de crecimiento, debido a que la biomasa a partir del
instante t1 se encuentra en fase seudoestacionaria. De esta manera la ecuacin (3.7)
toma la siguiente forma:
dCO2
= mCO2 X
dt

(2)

Derivando la ecuacin (2) y reemplazando la ecuacin (1) se obtiene:

d 2CO2
dX
= mCO2
= mCO2 k d X
2
dt
dt

(3)

Despejando de la ecuacin (2) el trmino X y reemplanzando en la

ecuacin (3) se obtiene:
d 2 CO2
dCO2
= k d
2
dt
dt

(4)

81

La ecuacin (4) corresponde a una ecuacin diferencial de 2 orden cuya

solucin es:
CO2 (t ) =

e kd t1 CO22 e kd t2 CO21 CO21 CO22

+ kd t1
e kd t1 e kd t2
e kd t2
e

kd t
e

(5)

Donde CO21 y CO22 son las cantidades de CO2 acumulado para los
tiempos t1 y t2 respectivamente.