Apostila HistoquimicaPP

CENTRO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL
HISTOQUMICA E CITOQUMICA EM PLANTAS:

PRINCPIOS E PROTOCOLOS
Ana Cristina da Silva Figueiredo, Jos Manuel Gonalves Barroso,

Luis Manuel Gaspar Pedro, Lia Ascenso
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL
SECO DE BIOLOGIA CELULAR E BIOTECNOLOGIA VEGETAL
HISTOQUMICA E CITOQUMICA EM PLANTAS:

PRINCPIOS E PROTOCOLOS
Por:
Ana Cristina da Silva Figueiredo
Jos Manuel Gonalves Barroso
Luis Manuel Gaspar Pedro
Lia Ascenso
Figura da capa:
Colorao com Floroglucinol de vasos condutores xilmicos de Crithmum maritimum
(foto seleccionada no concurso fotogrfico Laboratrio de Imagens promovido pela
Associao Viver a Cincia em 2005)
FICHA TCNICA
Ttulo: Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos
(1993 - 1998) Figueiredo A. C., J. G. Barroso, L. G. Pedro, M. C. Pedroso. Textos de apoio para
Histoqumica e Citoqumica Vegetais, Faculdade de Cincias de Lisboa (edio anual dos
autores).
(1993 - 1999) Figueiredo A. C., J. G. Barroso, L. G. Pedro, M. C. Pedroso. Protocolos para
Histoqumica e Citoqumica Vegetais, Faculdade de Cincias de Lisboa (edio anual dos
autores).
(1999) Barroso J. G. Histoqumica e Citoqumica. Edio da Associao de Estudantes da
Faculdade de Cincias de Lisboa.
(2007) Figueiredo A. C., J. G. Barroso, L. G. Pedro, L. Ascenso. Histoqumica e Citoqumica em
Plantas: Princpios e Protocolos, Lisboa, 1 Edio. Edio Faculdade de Cincias da
Universidade de Lisboa, Centro de Biotecnologia Vegetal.
Autores:
Ana Cristina da Silva Figueiredo
Jos Manuel Gonalves Barroso
Luis Manuel Gaspar Pedro
Lia Ascenso
Edio:
Faculdade de Cincias da Universidade de Lisboa, Centro de Biotecnologia Vegetal.
Composio, Impresso e Acabamentos:

Repro2000
Tiragem:
1 Edio, Lisboa, Janeiro de 2007 - 30 exemplares
ISBN: 978-972-9348-17-4
Depsito Legal n: 256896/07
Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos
NDICE
I. HISTOQUMICA: PRINCPIOS........................................................................................................................1
Basofilia e Acidofilia.................................................................................................................................3
Metacromasia ..........................................................................................................................................3
Alocromasia .............................................................................................................................................4
Fluorescncia ..........................................................................................................................................5
1. Deteco de Protenas............................................................................................................................6
1.1. Em luz visvel....................................................................................................................................7
1.1.1. Colorao de tipos particulares de aminocidos ......................................................................7
Reaco de Sakaguchi para a arginina ..................................................................................7
1.1.2. Colorao de protenas por ligao do corante a grupos de aminocidos ...............................7
a) Corantes que formam ligaes covalentes...............................................................................8
Reaco Ninidrina - Schiff........................................................................................................8
Azul Mercrico de Bromofenol................................................................................................8
b) Corantes que formam ligaes electrostticas.........................................................................9
Reaco do Biureto ................................................................................................................9
Azul Brilhante de Comassie..................................................................................................10
1.1.3. Colorao selectiva de determinadas protenas ....................................................................10
1.2. Em UV ............................................................................................................................................10
a) Determinao da viabilidade celular.......................................................................................10
Diacetato de Fluorescena ....................................................................................................10
2. Deteco de Hidratos de Carbono.......................................................................................................10
2.1. Em luz visvel..................................................................................................................................11
2.1.1. Reaces ligadas deteco do grupo vic- glicol ou grupos aparentados.............................11
Reaco cido Peridico - Reagente de Schiff......................................................................11
2.1.2. Caracterizao diferencial dos hidratos de carbono...............................................................15
a) Polissacridos cidos.............................................................................................................15
Azul de Alciano .....................................................................................................................15
b) Amido .....................................................................................................................................16
Lugol .....................................................................................................................................16
c) Pectinas..................................................................................................................................16
Vermelho de Rutnio ............................................................................................................16
2.2. Em UV ............................................................................................................................................16
Laranja de Acridina ...............................................................................................................16
b) -Glucanos.............................................................................................................................17
Calcoflor..............................................................................................................................17
c) Calose ....................................................................................................................................17
Azul de Anilina ......................................................................................................................17
3. Deteco de Mucilagens e Mucopolissacridos cidos ...................................................................17
3.1. Em luz visvel..................................................................................................................................17
a) Mucilagens .............................................................................................................................17
cido Tnico / Cloreto Frrico................................................................................................17
b) Mucopolissacridos cidos.....................................................................................................18
Azul de Alciano .....................................................................................................................18
4. Deteco de Lpidos .............................................................................................................................18
4.1. Em luz visvel..................................................................................................................................19
4.1.1. Birrefringncia dos lpidos ......................................................................................................19
4.1.2. Deteco geral de lpidos.......................................................................................................19
Sudes..................................................................................................................................20
4.1.3. Deteco diferencial de lpidos .............................................................................................. 20

a) Lpidos cidos e neutros ........................................................................................................ 20
Sulfato Azul do Nilo .............................................................................................................. 20
b) Lpidos insaturados................................................................................................................ 21
Tetrxido de smio .............................................................................................................. 21
c) cidos gordos ........................................................................................................................ 21
Acetato de Cobre / cido Rubenico..................................................................................... 21
4.2. Em UV............................................................................................................................................ 21
Vermelho Neutro .................................................................................................................. 21
5. Deteco de Terpenides..................................................................................................................... 22
5.1. Em luz visvel ................................................................................................................................. 22
5.1.1. Deteco diferencial de terpenides...................................................................................... 22
a) Essncias e cidos resnicos ................................................................................................. 22
Reagente de Nadi................................................................................................................. 22
b) Esterides .............................................................................................................................. 22
Tricloreto de Antimnio......................................................................................................... 22
c) Terpenides com grupo carbonilo.......................................................................................... 23
2,4 - Dinitrofenilhidrazina ....................................................................................................... 23
d) Lactonas sesquiterpnicas..................................................................................................... 23
cidos fortes......................................................................................................................... 23
Reaco modificada de Abraham......................................................................................... 23
5.2. Em luz visvel e em UV .................................................................................................................. 24
a) Deteco de partculas de borracha ...................................................................................... 24
Oil Red O ou Oil Blue N........................................................................................................ 24
5.3. Em UV............................................................................................................................................ 24
Cloreto de Dansil .................................................................................................................. 24
6. Deteco de Fenis .............................................................................................................................. 24
6.1. Em luz visvel ................................................................................................................................. 25
6.1.1. Caracterizao geral de fenis .............................................................................................. 25
Cloreto de Ferro III ............................................................................................................... 25
Dicromato de Potssio ......................................................................................................... 25
Diazoreaco ....................................................................................................................... 25
6.1.2. Caracterizao diferencial de fenis ...................................................................................... 26
a) Deteco de lenhinas ............................................................................................................ 26
Floroglucinol ......................................................................................................................... 26
b) Deteco de taninos .............................................................................................................. 26
Vanilina Clordrica ................................................................................................................ 26
6.2. Em UV............................................................................................................................................ 26
a) Deteco de flavonides........................................................................................................ 26
Fluorocromos ....................................................................................................................... 26
7. Deteco de Alcalides ........................................................................................................................ 27
7.1. Em luz visvel ................................................................................................................................. 27
7.1.1. Caracterizao geral de alcalides ........................................................................................ 27
Dragendorff .......................................................................................................................... 27
7.2. Em UV............................................................................................................................................ 28
8. Mtodos de colorao dupla ............................................................................................................... 28
Verde Iodo-Carmim Aluminado e Azul de Astra-Safranina................................................... 28
Azul de Metileno - Azur A - Safranina ..................................................................................... 28
Azul de Toluidina .................................................................................................................. 29
PAS - Azul de Toluidina......................................................................................................... 29
9. Histoqumica em seces semifinas de resinas Epxi ..................................................................... 29
9.1.1. Deteco de hidratos de carbono .......................................................................................... 29
II
cido Peridico - Reagente de Schiff (PAS) .........................................................................29

9.1.2. Deteco de lpidos................................................................................................................29
Negro Sudo B .....................................................................................................................29
9.1.3. Deteco de protenas ...........................................................................................................29
II. CITOQUMICA: PRINCPIOS ............................................................................................................................30
1. Deteco Citoqumica de Protenas ....................................................................................................32
1.1. Mtodos de caracterizao geral....................................................................................................32
1.2. Mtodos de caracterizao de grupo..............................................................................................33
Visualizao de Ribo- e Desoxirribonucleoprotenas pelo mtodo da Contrastao
Regressiva ......................................................................................................................33
Deteco da actividade das fosfatases.................................................................................33
Deteco da actividade de oxidases.....................................................................................33
Deteco da actividade da celulase......................................................................................33
2. Deteco Citoqumica de Hidratos de Carbono .................................................................................34
2.1. Mtodos de caracterizao geral....................................................................................................34
Deteco de Polissacridos (PATAg) ...................................................................................34
2.2. Mtodos de caracterizao diferencial............................................................................................35
3. Deteco Citoqumica de Lpidos ........................................................................................................35
III. HISTOQUMICA: PROTOCOLOS ...............................................................................................................37
1. Deteco de Protenas..........................................................................................................................37
1.1. Em luz visvel..................................................................................................................................37
1.1.1. Colorao de tipos particulares de aminocidos ....................................................................37
Reaco de Sakaguchi para a arginina ................................................................................37
1.1.2. Colorao de protenas por ligao do corante a grupos de aminocidos .............................37
a) Corantes que formam ligaes covalentes.............................................................................37
Reaco Ninidrina-Schiff ......................................................................................................37
Azul Mercrico de Bromofenol..............................................................................................38
1.2. Em UV ............................................................................................................................................38
a) Determinao da viabilidade celular.......................................................................................38
2. Deteco de Hidratos de carbono .......................................................................................................39
2.1. Em luz visvel..................................................................................................................................39
2.1.1. Reaces ligadas deteco do grupo vic- glicol ou grupos aparentados.............................39
cido peridico - Reagente de Schiff [PAS] ..........................................................................39
2.1.2. Caracterizao diferencial dos hidratos de carbono...............................................................39
Azul de Alciano .....................................................................................................................39
b) Amido .....................................................................................................................................39
Lugol .....................................................................................................................................39
c) Pectinas..................................................................................................................................40
2.2. Em UV ............................................................................................................................................40
Laranja de Acridina ...............................................................................................................40
cido Peridico /Acriflavina-Pseudo Schiff [F-PAS]..............................................................40
b) -Glucanos.............................................................................................................................41
Calcoflor..............................................................................................................................41
c) Calose ....................................................................................................................................41
Azul de Anilina ......................................................................................................................41
III
3. Deteco de Mucilagens e Mucopolissacridos cidos ................................................................... 41

3.1. Em luz visvel ................................................................................................................................. 41
a) Mucilagens............................................................................................................................. 41
cido Tnico / Cloreto de Ferro ............................................................................................ 41
Vermelho de Rutnio............................................................................................................ 42
b) Mucopolissacridos cidos.................................................................................................... 42
Azul de Alciano..................................................................................................................... 42
4. Deteco de Lpidos ............................................................................................................................. 42
4.1. Em luz visvel ................................................................................................................................. 42
4.1.2. Deteco geral de lpidos ...................................................................................................... 42
Negro Sudo B ou Vermelho Sudo IV ................................................................................ 42
Vermelho Sudo 7B ............................................................................................................. 43
4.1.3. Deteco diferencial de lpidos .............................................................................................. 43
a) Lpidos cidos e neutros ........................................................................................................ 43
Sulfato Azul do Nilo .............................................................................................................. 43
b) Lpidos insaturados................................................................................................................ 43
Tetrxido de smio .............................................................................................................. 43
c) cidos gordos ........................................................................................................................ 43
Acetato de Cobre / cido Rubenico .................................................................................... 43
4.2. Em UV............................................................................................................................................ 44
Vermelho Neutro .................................................................................................................. 44
5. Deteco de Terpenides..................................................................................................................... 44
5.1. Em luz visvel ................................................................................................................................. 44
5.1.1. Deteco diferencial de terpenides...................................................................................... 44
a) Essncias e cidos resnicos ................................................................................................. 44
Reagente de Nadi................................................................................................................. 44
b) Esterides .............................................................................................................................. 44
Tricloreto de Antimnio......................................................................................................... 44
c) Terpenides com grupo carbonilo.......................................................................................... 45
2,4-Dinitrofenilhidrazina........................................................................................................ 45
d) Lactonas sesquiterpnicas..................................................................................................... 45
cido Sulfrico ..................................................................................................................... 45
Reaco Modificada de Abraham......................................................................................... 45
5.2. Em luz visvel e em UV .................................................................................................................. 45
Oil Red O ou Oil Blue N ....................................................................................................... 45
5.3. Em UV............................................................................................................................................ 46
Cloreto de Dansil .................................................................................................................. 46
Oil Red O/Cloreto de Dansil ................................................................................................. 46
6. Deteco de Fenis .............................................................................................................................. 47
6.1. Em luz visvel ................................................................................................................................. 47
6.1.1. Caracterizao geral de fenis .............................................................................................. 47
Cloreto de Ferro III ............................................................................................................... 47
Dicromato de Potssio ......................................................................................................... 47
Diazoreaco ....................................................................................................................... 47
6.1.2. Caracterizao diferencial de fenis ...................................................................................... 47
a) Deteco de lenhinas ............................................................................................................ 47
Fluoroglucinol ....................................................................................................................... 47
b) Deteco de taninos .............................................................................................................. 48
Vanilina Clordrica ................................................................................................................ 48
6.2. Em UV............................................................................................................................................ 48
a) Deteco de flavonides........................................................................................................ 48
Aco de Fluorocromos........................................................................................................ 48
IV
7. Deteco de Alcalides ........................................................................................................................48

7.1. Em luz visvel..................................................................................................................................48
7.1.1. Caracterizao geral de alcalides ........................................................................................48
Reagente de Dragendorff ....................................................................................................48
Reagente de Dittmar.............................................................................................................49
Reagente de Wagner............................................................................................................49
Reagente de Ellram ..............................................................................................................49
7.2. Em UV ............................................................................................................................................49
8. Mtodos de colorao dupla................................................................................................................50
Verde Iodo-Carmim Aluminado.............................................................................................50
Azul de Astra-Safranina ........................................................................................................50
Azul de Metileno - Azure A - Safranina ...................................................................................50
Azul de Toluidina ..................................................................................................................51
9. Histoqumica em seces semifinas de resinas Epxi......................................................................51
9.1.2. Deteco de hidratos de carbono ..........................................................................................51
cido peridico-Reagente de Schiff (PAS) ...........................................................................51
9.1.3. Deteco de lpidos................................................................................................................51
Negro Sudo B .....................................................................................................................51
9.1.4. Deteco de protenas ...........................................................................................................52
Azul Brilhante de Comassie R250 ........................................................................................52
IV. CITOQUMICA: PROTOCOLOS .................................................................................................................53
1. Deteco citoqumica de protenas .....................................................................................................53
Regressiva ......................................................................................................................53
Deteco da actividade fosfatsica cida .............................................................................53
Deteco da actividade adenosina trifosfatase.....................................................................54
Deteco da actividade inosina difosfatase ..........................................................................54
Deteco da actividade tiamina pirofosfatase.......................................................................55
Deteco da actividade peroxidsica da catalase ................................................................55
Deteco da actividade das peroxidases..............................................................................56
Deteco da actividade da celulase......................................................................................56
Digesto enzimtica por aco de uma pronase ..................................................................56
2. Deteco citoqumica de hidratos de carbono ...................................................................................57
Deteco de Polissacridos (PATAg) ...................................................................................57
3. Deteco citoqumica de lpidos..........................................................................................................57
Digesto enzimtica por aco de uma lipase......................................................................57
APNDICE .......................................................................................................................................................58
Soluo de -Naftol-Hipoclorito ............................................................................................58
Soluo de Piridina-Clorofrmio ...........................................................................................58
Reagente de Schiff ...............................................................................................................58
Pseudo Schiff........................................................................................................................58
Azul de Bromofenol...............................................................................................................58
Azul de Comassie .................................................................................................................58
Metabissulfito de Sdio 0.5%................................................................................................58
Sulfato de Azul do Nilo..........................................................................................................58
Reagente de Nadi .................................................................................................................59
Soluo Metanlica de Tiocianato Ferroso...........................................................................59
Fluorocromos para deteco de flavonides ........................................................................59
Reagente de Wagner............................................................................................................59
Reagente de Dittmar.............................................................................................................59
Reagente de Dragendorff .....................................................................................................59
Laranja de Acridina em PBS.................................................................................................59
Safranina ..............................................................................................................................60
Soluo saturada de Dimedona ........................................................................................... 60

Azul de Metileno-Azur A ....................................................................................................... 60
PBS (Phosphate Buffer Saline) Tampo Fosfato Salino (sem clcio nem magnsio)....... 60
Tampo Fosfato (0.1M) ........................................................................................................ 60
Tampo Veronal (0.1M) pH 7.4-8 ......................................................................................... 61
Tampo Tris (0.1M).............................................................................................................. 61
Tampo Tris- Maleato (0.1M) ............................................................................................... 61
Tampo Glicina .................................................................................................................... 62
Soluo de HCl 1N ............................................................................................................... 62
Deteco da actividade fosfatsica cida............................................................................. 62
Deteco da actividade adenosina trifosfatase .................................................................... 62
Deteco da actividade inosina difosfatase.......................................................................... 62
Deteco da actividade tiamina pirofosfatase ...................................................................... 63
Deteco da actividade peroxidsica da catalase ................................................................ 63
Deteco da actividade das peroxidases ............................................................................. 63
Deteco da actividade da celulase ..................................................................................... 63
BIBLIOGRAFIA................................................................................................................................................ 64
NDICE REMISSIVO......................................................................................................................................... 66
VI
I. HISTOQUMICA: PRINCPIOS
A Histoqumica tem como objectivo localizar in situ, os principais grupos qumicos que ocorrem
nos tecidos. Como tal, a histoqumica associa histologia, um aspecto qumico, o da
determinao da natureza das substncias presentes nos tecidos e da sua e localizao. Em
todos os mtodos histoqumicos necessrio evitar o deslocamento artificial da substncia a
caracterizar durante os tratamentos que precedem a reaco histoqumica, que detectada ao
microscpio por colorao especfica ou por emisso de radiao. Para alm disso, os mtodos
histoqumicos no permitem, na sua maioria, determinaes quantitativas.
Durante a execuo de uma reaco histoqumica podem distinguir-se duas etapas: pr tratamentos (a) e visualizao da(s) substncia(s) que se pretende(m) detectar (b).
a) Pr - tratamentos Raros so os tipos de materiais que apresentam espessura adequada
para poderem ser observados directamente ao microscpio ptico (clulas em cultura, clulas
sanguneas). Na maioria dos casos, o material tem de ser fixado, isto , submetido a todo um
conjunto de tratamentos para estabilizar as molculas de modo a impedir deslocamentos ou
perdas, preservando assim a estrutura celular num estado to prximo, quanto possvel, ao de in
vivo. Contudo, de realar que todos os tipos de fixao alteram mais ou menos
significativamente as molculas que estabilizam. Por exemplo, os dois nicos reagentes usados
para fixar lpidos, ou seja de os tornar insolveis em solventes orgnicos, o OsO4 e o cido
crmico, alteram substancialmente a reactividade qumica dos lpidos que fixam. A utilizao de
material criofixado em histoqumica vem obviar alguns destes problemas.
b) Visualizao da(s) substncia(s) que se pretende(m) detectar. Em alguns casos, raros, a
substncia em estudo directamente visualizada sem necessidade de manipulaes acessrias.
por exemplo o caso das substncias naturalmente coradas (pigmentos), das que absorvem os
raios UV (cidos nucleicos), ou os raios X (metais pesados) ou das substncias autofluorescentes
(vitamina A). Contudo, na maior parte dos casos, necessrio introduzir, ou criar, um cromforo,
na substncia a identificar, ou seja, um grupo visualizvel pela cor, pela absoro dos raios UV ou
por emisso de fluorescncia, por exemplo. A formao do cromforo pode resultar duma reaco
directa ou indirecta. No primeiro caso o reagente forma, com a substncia em estudo, um produto
de reaco imediatamente identificvel, enquanto no segundo, o produto de reaco s
visualizado por uma reaco secundria, na qual intervm outro reagente.
De um modo geral utilizam-se os chamados corantes biolgicos. Estes so substncias
incolores (cromognicas) ou coradas, orgnicas ou inorgnicas, que ao conferirem cor s
estruturas celulares (animais ou vegetais) permitem elucidar a sua estrutura e natureza qumica.
Ainda que muito esteja por explicar sobre a cor, sabe-se que certos grupos atmicos,
designados cromforos, lhe esto associados. Os mais importantes so C=C, C=O, C=S, C=N,
N=N, N=O e NO2, e destes, quanto maior for o seu nmero num determinado composto, mais
intensa a cor. Embora os cromforos difiram muito uns dos outros, todos tm em comum, a
propriedade de serem facilmente reduzidos: o grupo imina pode ser reduzido a amina; o grupo azo
pode ser reduzido, e 2 hidrognios podem ligar-se, um a cada um dos N, o mesmo acontecendo
aos cromforos com ligaes duplas. A reduo do cromforo, leva a que o composto perca a cor.
o caso da fucsina que, por reduo, d um composto incolor, designado leucofucsina, ou, mais
vulgarmente, Reagente de Schiff.
A cor resulta da absoro selectiva de radiao, de modo que a luz transmitida ou reflectida
por uma substncia possui um espectro que no apresenta os comprimentos de onda que foram
absorvidos. Por outras palavras, a substncia actua como se fosse um filtro, bloqueando certas
zonas do espectro. Os grupos cromforos conferem molcula este tipo de propriedade,
actuando, possivelmente, como um sistema de ressonncia que vibra ao mesmo ritmo dos
comprimentos de onda absorvidos. Os compostos insaturados mostram uma tendncia para a

ressonncia, nomeadamente a nvel das ligaes duplas dos cromforos. Com o aumento do grau
de insaturao e complexidade do composto, o espectro de absoro tende a passar do
ultravioleta para o infravermelho, isto , a cor transmitida (ou reflectida) muda do azul para
vermelho, passando pelo amarelo.
Para alm dos cromforos, existem grupos funcionais (-OH, -NH2, -Cl, -COOH, -SO3H)
designados auxocromos, que possuindo electres de valncia no ligantes absorvem radiao de
comprimento de onda <200nm. Os auxocromos revelam absoro intensa na banda do
UV-longnquo. Quando um auxocromo se liga a um cromforo verifica-se um deslocamento da
banda de absoro do cromforo para comprimentos de onda mais elevados (efeito
batocromtico). Em histoqumica o auxocromo responsvel pelas ligaes do corante s
estruturas celulares. Os auxocromos mais comuns so cidos sulfnicos ou carboxlicos, que se
ligam electrostaticamente a bases, presentes nos tecidos, ou sais iminio que se ligam aos grupos
cidos. Estas ligaes podem ocorrer directamente ou serem mediadas por um io metlico di- ou
trivalente (Al, Fe, Cr, W, Mo, Cu), que pode formar complexos de coordenao ou ligaes
inicas, quer com o auxocromo, quer com os grupos funcionais disponveis superfcie do tecido.
Nos corantes bsicos o grupo auxocromo uma amina primria, secundria ou terciria, o qual
por adio de um cido como o HCl, pode formar um sal. Contudo, as solues dos corantes
bsicos podem ter um comportamento moderadamente cido, porquanto o carcter cido do io
cloro se sobrepe ao carcter bsico do io iminio. O inverso igualmente verdade para os
corantes que formam fenolatos ou carbanolatos sdicos.
Num grupo importante de reaces histoqumicas, o cromforo um grupo funcional
introduzido na molcula a identificar. Por exemplo, na reaco de Feulgen, o cido
desoxirribonucleico posto em evidncia pela ligao da fucsina sulfurosa corada ao aldedo,
entretanto criado. Num outro grupo de reaces histoqumicas, o cromforo no introduzido na
molcula a identificar, como acontece, por exemplo, na deteco de vitamina C com nitrato de
prata. A vitamina C, fortemente redutora, reduz o sal de prata a prata metlica, que se deposita,
no local de reaco, sob a forma de um precipitado de cor negra. O cromforo criado (a prata
metlica), no introduzido na vitamina C, que continua invisvel.
Neste grupo de reaces histoqumicas importa introduzir dois conceitos: a) reaces
falsamente positivas e b) reaces falsamente negativas (Fig. 1).
Grupos da substncia com afinidade

para o cromforo
Reaco correcta
Cromforo
Reaco falsamente positiva
S Substncia a detectar
S
Reaco falsamente negativa
V Substncia vizinha
Fig. 1
a) Reaces falsamente positivas Resultam do facto de o cromforo se ligar a estruturas

diferentes das que lhe deram origem. Este tipo de reaco depende do tempo que medeia entre a
formao do cromforo e a sua imobilizao definitiva, e do grau de afinidade da outra substncia
para esse cromforo.

b) Reaces falsamente negativas - Resultam do facto do cromforo no ser retido nas
estruturas celulares, durante a sua formao.
Assim, a especificidade da reaco depende da velocidade de formao do cromforo, da sua
solubilidade no meio (em ambos os casos para evitar a sua disperso) e da afinidade para a
substncia a detectar.
Como se pode ento ter a certeza de que a localizao de uma substncia est correcta? Em
princpio, a concordncia dos resultados de diversos testes histoqumicos diminui a possibilidade
duma localizao errnea. Por outro lado, a execuo de controlos apropriados e a observao
crtica dos resultados obtidos de diferentes testes so, igualmente, factores determinantes para a
correcta interpretao dos resultados histoqumicos.
A caracterstica mais relevante das reaces histoqumicas , salvo rarissmas excepes,
identificar apenas grupos funcionais. o caso, por exemplo, dos grupos carbonilo (CH=O), ou
dos grupos sulfidrilo (SH), que ocorrem em substncias de origem e significado bioqumico bem
diversos. Noutros casos, a reaco revela apenas propriedades que so apangio comum a
muitos grupos funcionais, como, por exemplo, o carcter redutor, ou a afinidade para corantes
bsicos. Por exemplo a basofilia pode ser encontrada num grupo carboxilo, fosfato, sulfato, etc.,
isto , em protenas, lpidos, glcidos, pigmentos, entre outros. A utilidade prtica duma reaco
histoqumica depende pois, do conhecimento da localizao dos grupos funcionais passveis de
reagir nas condies de anlise e, entre outros, do tipo de pr-tratamento a que foi sujeito o
material (com ou sem fixao, tipo de fixador).
BASOFILIA E ACIDOFILIA
Em termos gerais, a fixao de um corante bsico, carregado positivamente, a uma substncia
cida ionizada, define uma reaco basfila. No entanto, esta reaco s tem significado
histoqumico quando efectuada sob condies experimentais bem definidas. Com efeito,
diversos factores influenciam a fixao do corante catinico. Assim, para alm da colorao ter de
ser efectuada dentro de certos limites de pH, importante ter em mente que a ligao
electrosttica, entre o corante e os componentes das estruturas celulares, pode ser inibida pela
presena de outros caties, quer endgenos, quer presentes no veculo da soluo corante. Por
outro lado, a penetrao deficiente das molculas do corante, no tecido, ou a inacessibilidade dos
grupos aninicos, por razes conformacionais, pode determinar a ausncia de colorao. Ao
contrrio, as estruturas celulares podem aparecer coradas e isso no se dever ao estabelecimento
de ligaes electrostticas, mas sim formao de ligaes covalentes, de hidrognio ou de van
der Waals.
semelhana da basofilia, a acidofilia tambm s tem significado histoqumico, quando h
controlo rigoroso das condies experimentais. No entanto, os corantes cidos, ao contrrio do
que se verifica com os bsicos, so pouco utilizados em histoqumica, por razes de natureza
essencialmente tcnica e porque a colorao , em geral, muito tnue.
METACROMASIA
Diversos corantes tm a capacidade de corar, selectivamente, as estruturas celulares com tons
de cor diferentes das do corante em soluo aquosa diluda (reaco metacromtica). Os corantes
com estas propriedades designam-se corantes metacromticos e as substncias s quais se
ligam recebem o nome de cromtropos. Embora tanto os corantes cidos como os bsicos sejam
susceptveis de evidenciar metacromasia, por definio s os corantes bsicos so
metacromticos.
Estudos espectrofotomtricos em corantes metacromticos, por exemplo Azul de Toluidina,
Violeta de Cristal ou Safranina O, revelam que estes no obedecem lei de Lambert-Beer, em
soluo aquosa, e que a cor da soluo corante se altera, significativamente, com a concentrao.
No entanto, a lei de Lambert-Beer respeitada, dentro de certos limites, quando o solvente no
aquoso (etanol, acetona ou cido actico).
So vrias as teorias que tentam explicar a metacromasia. Inicialmente, admitia-se que a
metacromasia era um fenmeno resultante da formao de tautmeros, com espectros de
absoro diversos dos da soluo original. Esta teoria no encontrou suporte experimental e foi
rapidamente abandonada. Ulteriormente, passou a admitir-se que a metacromasia resultava da
polimerizao do corante. Segundo esta teoria, a forma ortocromtica do corante correspondia a
um monmero e a forma metacromtica a um polmero. Os dmeros, os trmeros, os tetrmeros,
etc., seriam, neste contexto, responsveis pelos tons de cor intermdias. Tambm esta teoria no
encontrou suporte experimental. Actualmente, o fenmeno metacromtico explicado pela
alterao da distribuio de carga superfcie do corante.
Qualquer que seja o mecanismo da viragem metacromtica de uma soluo corante, o
importante, em histoqumica, saber quais os grupos qumicos que num tecido fixam o corante e
determinam a viragem metacromtica e quais os factores capazes de influenciar a reaco.
Os estudos efectuados revelam que a metacromasia no est ligada a nenhum grupo qumico
particular, mas depende, unicamente, da presena de elevada densidade de cargas negativas,
alinhadas e espaadas regularmente superfcie do cromtropo. Os cidos nucleicos, os lpidos
com carcter cido e os polissacridos cidos so consideradas, em histoqumica, como
substncias cromtropas
A densidade de carga factor determinante, quer da reactividade do cromtropo com o corante
metacromtico, quer da intensidade da metacromasia. necessria a distncia de cerca de 5 ,
entre os grupos aninicos, para que se verifique o fenmeno metacromtico. Nos casos em que
essa distncia inferior, a metacromasia mais intensa. Alm disso, a orientao paralela das
molculas do corante tambm factor determinante no aumento dessa intensidade. Para tal,
muito contribui a gua que, ao estabelecer ligaes de hidrognio com as molculas do corante,
leva a que este forme um falso polmero, com um espectro de absoro distinto do corante na sua
forma ortocromtica.
Tal como a basofilia, a metacromasia influenciada pelo pH e pela presena de caties, quer
na soluo corante, quer no tecido. A ausncia de reaco metacromtica, por parte de uma
macromolcula com grupos aninicos superfcie, pode dever-se sua ligao a outros caties,
que no os do corante (ies inorgnicos ou protenas), inacessibilidade dos grupos aninicos,
por razes conformacionais, ou insuficiente densidade de carga. Por outro lado, o estudo
histoqumico do fenmeno metacromtico, a pH controlado, permite obter informao sobre a
natureza qumica do grupo ionizvel do cromtropo.
ALOCROMASIA
Existe um outro grupo de corantes, tambm utilizado em histoqumica, que semelhana dos
corantes metacromticos cora as estruturas celulares com cor diversa (corantes alocromticos).
No entanto, o mecanismo de reaco distinto, a alocromasia resulta do facto de o corante no
ser uma substncia pura, mas possuir pequenas quantidades de compostos contaminantes,
tambm eles com propriedades tintoriais. O exemplo, que melhor se conhece, o da colorao
com Sulfato Azul do Nilo, em que os lpidos neutros ou cidos, em fase lquida, coram de rosa,
enquanto todas as substncias com carcter cido, lpidos ou no, coram de azul.
FLUORESCNCIA
Os corpos, que devido sua temperatura elevada, so auto-luminosos dizem-se
incandescentes, sendo todas as outras formas de emisso de luz designadas luminescentes. A
emisso de luz como resultado da absoro de energia luminosa designada fotoluminescncia e
inclui os processos de fluorescncia e fosforescncia.
A fluorescncia a propriedade que as molculas tm de emitir radiao electromagntica sob
a forma de luz, como resultado da absoro de energia luminosa.
Quando um tomo bombardeado por um foto animado de certa energia pode, em certos
casos, sofrer alterao da sua estrutura electrnica, que consiste na passagem de um electro de
uma rbita para outra mais afastada do ncleo, portanto para um nvel mais elevado de energia.
Um tomo nestas circunstncias denomina-se excitado e muito instvel, tendo tendncia a
regressar ao estado inicial de energia. Quando isso acontece, o excesso de energia libertado
sob a forma de um foto, o qual se propagar segundo um movimento ondulatrio em que
comprimento de onda depender da energia do foto. Devido a perdas de energia inevitveis
(trmicas e outras) a energia do foto emitido sempre menor do que a do foto perturbador da
estrutura electrnica (Fig.2).
Absoro
Perda de energia vibracional
1 estado de excitao
Fluorescncia
Estado fundamental
Fig. 2
Na microscopia de fluorescncia, caso se use, por exemplo, radiao na regio do ultra-violeta

(aproximadamente 350 - 450 nm) prxima do visvel, a luz emitida luz visvel, que pode ir do azul
ao vermelho. Este tipo de microscopia muito utilizado na caracterizao histoqumica de
diversas substncias. A sua importncia deriva, no s do facto de permitir detectar substncias
em muito baixa concentrao, mas tambm de pr em evidncia um grande nmero de
substncias, quer directamente, quer aps tratamento qumico.
Algumas molculas orgnicas so naturalmente fluorescentes (fluorescncia natural ou
primria), sendo as estruturas que as contm visveis quando irradiadas por UV. Contudo, na
maioria dos casos, as estruturas no possuem fluorescncia natural e ento necessrio tornlas fluorescentes corando-as com compostos fluorescentes (fluorescncia induzida ou
secundria). Os compostos que exibem fluorescncia so denominados fluorocromos ou
fluorforos e apresentam caractersticas espectrais diversas como resultado das suas diferentes
configuraes electrnicas.
As alteraes observadas no espectro de excitao e emisso dos fluorocromos, como
resultado da sua ligao aos componentes de uma qualquer estrutura celular, permitem obter
informao sobre a conformao das molculas s quais se ligam.
1. DETECO DE PROTENAS
As protenas so as macromolculas mais abundantes nas clulas e dos tecidos, e por isso a
sua deteco selectiva foi, durante muito tempo, considerada pouco relevante. Contudo, em
muitos casos, importante evidenciar a presena de determinadas protenas e/ou de aminocidos
particulares, ou demonstrar a sua ausncia em algumas clulas ou tecidos.
Para alm das protenas estruturais e enzimticas, algumas protenas vegetais desempenham
um papel importante como material de reserva, em particular nas sementes e nas razes.
As protenas podem ser caracterizadas, quer pela sequncia de aminocidos, quer pela sua
conformao tridimensional. Como todas as protenas so constitudas por aminocidos, a sua
colorao histoqumica determinada e limitada pelas propriedades fsico-qumicas dos
aminocidos. Contudo, possvel caracterizar e localizar in situ tipos particulares de protenas de
modo mais preciso do que corando apenas os grupos de aminocidos. Em alguns casos pode
fazer-se uso de propriedades de absoro caractersticas, evidenciadas por algumas protenas
como a hemoglobina. Mtodo diferente requer a localizao de enzimas, em que se recorre s
suas actividades bioqumicas especficas e /ou s suas propriedades antignicas, utilizando neste
caso anticorpos. Algumas protenas conjugadas (glicoprotenas, lipoprotenas, nucleoprotenas,
fosfoprotenas e as cromoprotenas como hemoglobinas, hemocianinas e flavoprotenas, etc.)
podem ainda ser detectadas mais ou menos selectivamente com base no grupo no proteico (por
ex., o PAS pode ser utilizado na deteco de glicoprotenas).
Em muitos casos, os tecidos so previamente fixados, antes de se proceder deteco
histoqumica das protenas. Deste modo, convm realar que no se conhece, at agora, nenhum
processo de fixao capaz de, em simultneo, preservar a morfologia celular e manter a
reactividade das protenas. Esta , em maior ou menor grau, alterada por:
a) Deslocamento relativo das cadeias, o que implica distoro morfolgica das estruturas:
b) Desaparecimento dos grupos reactivos da superfcie das cadeias, por inactivao ou
bloqueio, pelo fixador, ou por terem sido utilizados para criao de novas ligaes entre as
molculas. A ttulo de exemplo, refira - se que o formaldedo forma pontes metileno entre os grupos
aminados (-NH-CH2-HN-); o cloreto de mercrio forma pontes entre os grupos sulfidrilo (-S-Hg-S), etc. Os fixadores como o lcool e a acetona desnaturam as protenas e aproximam as cadeias
polipeptdicas, ao eliminarem as molculas de gua que revestem as protenas, permitindo assim
a formao de ligaes electrostticas.
c) Aparecimento de novos grupos reactivos como consequncia da desnaturao das
protenas. Devido deslocao das cadeias, alguns grupos anteriormente inacessveis no interior
da cadeia vm superfcie e tornam - se acessveis deteco histoqumica. Isto
particularmente evidente no caso dos grupos sulfidrilo das protenas. Por exemplo, a albumina
desnaturada reage positivamente ao teste do nitroprussiato para os grupos -SH, enquanto a
albumina nativa no.
Atendendo s caractersticas das protenas e aos pontos anteriormente mencionados podemos
considerar basicamente cinco tipos de colorao histoqumica de protenas: 1) Colorao de tipos
particulares de aminocidos, 2) Colorao de protenas por ligao do corante a vrios grupos de
aminocidos; 3) Colorao selectiva de determinadas protenas; 4) Colorao de protenas com
fluorocromos, 5) Deteco de protenas atravs das suas propriedades fsico-qumicas. Em
qualquer dos casos, a colorao determinada, entre outros factores, pela quantidade total de
protena, pela presena de grupos reactivos e, de entre estes, pela percentagem dos que esto
acessveis ao corante.
1.1. EM LUZ VISVEL

1.1.1. Colorao de tipos particulares de aminocidos
A grande limitao deste tipo de colorao deve-se ao facto de no fornecer uma ideia correcta
da quantidade total de protenas. Indica-nos apenas a quantidade de um tipo especfico de
aminocido ou de um nmero restrito de resduos, uma vez que se baseia na identificao de
aminocidos particulares. Por exemplo, a taxa de tirosina varia entre 11 % e 0 %, respectivamente
nas cerdas e gelatina e a da arginina entre 87 % e 1,5 %, respectivamente na salmina e cerdas.
Reaco de Sakaguchi para a arginina
Baseia - se no desenvolvimento de um produto corado, resultante da reaco da arginina com o
- naftol e subsequentemente com o hipoclorito ou hipobromito, em meio fortemente alcalino. A
reaco considerada especfica para a arginina, pelo menos nas clulas animais. A colorao
resultante (vermelho - alaranjado) contudo instvel (Fig. 3).
Arginina
OH
H 2N
NH2
H2 H2 H 2
C C C CH
H
N
NH
-Naftol
Oxidao
OH
Grupo guanidino
(hipoclorito)
N R
C
N
1,2-Naftoquinona
Fig. 3
1.1.2. Colorao de protenas por ligao do corante a grupos de aminocidos

Existem numerosas reaces coradas, destinadas caracterizao geral de protenas
(reaces gerais), que so outras tantas tentativas de adaptao, aos cortes histolgicos, de
mtodos utilizados em qumica orgnica. No entanto, a maioria destes testes no tem qualquer
utilidade em histoqumica, quer por serem demasiado agressivos e destrurem o material
biolgico, quer por as coloraes serem muito tnues, quer ainda por no possurem qualquer
especificidade.
Alguns dos mtodos, que a seguir se referem, tm sido aplicados na deteco de protenas em
agregados cristalinos que ocorrem, em plantas, nos ncleos de clulas glandulares de tricomas. A
funo destas incluses intranucleares ainda desconhecida. Para alguns autores constituem
reservas proteicas, uma vez que em alguns casos esto s presentes no Vero, desaparecendo
sempre que as plantas se encontram em dfice nutritivo. Muitas vezes estes agregados formam
complexos com hidratos de carbono, pelo que reagem tambm positivamente ao teste de PAS.
a) Corantes que formam ligaes covalentes

Reaco Ninidrina - Schiff
Todos os aminocidos proteicos, excepo da prolina e de hidroxiprolina, reagem com a
ninidrina (hidrato de indano-1,2,3-triona) dando origem ao mesmo anio de cor prpura. Nas
protenas, as amina primrias terminais ou da cadeia lateral da lisina reagem da mesma forma
com a ninidrina. Alm do anio forma-se um carbonilo superfcie da protena que pode ser
revelado pelo Reagente de Schiff (Fig. 4). A presena de ies Cu2+, mesmo em concentraes
reduzidas pode impedir a oxidao pela ninidrina.
Os mtodos histoqumicos, baseados, no emprego da ninidrina, como nico reagente, revelamse, no entanto, de pouca utilidade, dada a elevada instabilidade e difusibilidade do produto corado
O
R
2
O
O
O-
H3+N
Aminocido
N
O
O
C
O
R
CO2
Fig. 4
Anio de cor prpura
Azul Mercrico de Bromofenol

Este corante no foi de incio utilizado em histoqumica e, mesmo hoje, as opinies quanto
sua aplicabilidade so controversas. Segundo alguns autores, o Azul Mercrico de Bromofenol
(HgBPB) um bom corante, sendo a quantidade de corante ligado proporcional quantidade de
protena para uma vasta gama de concentraes. Todavia, de acordo com outros autores, a
colorao pouco especfica e apresenta muitas limitaes. Com efeito, sendo o azul de
bromofenol um corante cido, natural que se ligue a substncias ionizadas, com carga positiva,
como o caso das protenas. Por outro lado, nas condies experimentais da prtica
histoqumica, existe a possibilidade real do corante estabelecer ligaes inicas com substncias
ionizadas, com carga negativa, por intermdio dos ies de mercrio, presentes na soluo (Fig. 5).
Isto mostra claramente que as substncias, que potencialmente podem corar com o Azul
Mercrico de Bromofenol, no se restringem ao grupo das protenas.
Tal como acontece com outros ies metlicos, o Hg2+ complexa - se com os grupos carboxilo e
hidroxilo das protenas (COOH e OH). O mercrio possui tambm afinidade para os grupos
sulfidrilo, sendo, neste caso, a ligao mais estvel, podendo levar formao de ligaes entre
cadeias de protenas adjacentes. No entanto, nem todos os grupos -SH esto acessveis devido
conformao tridimensional da protena.
Algumas molculas orgnicas, que normalmente no apresentam afinidade para as protenas,
formam com elas complexos fortes na presena de ies metlicos, que actuam como pontes de
ligao. Os metais mais eficazes neste processo so: Hg, Cu, Ag, Ni, Zn, Co e Mn. A formao
destes complexos pode levar a que grupos hidroxilo, envolvidos em ligaes de hidrognio
intramoleculares, possam tornar-se disponveis para estabelecer ligaes de hidrognio com o

corante (Fig. 5).
O
Br
O
Br
Br
Br
C
Br
C
Br
HO
O
S
-
OH
O
+
NH3
Br
O
O-
Br
NH2
O-
S
O
Hg2+
C NH2
+
NH
NH3
O-
CH2
(CH2)4
(CH2)2
(CH2)3
(CH2)4
(CH2)2
H
N C C N C C N C C N C C N C C N C C N C C
H
H
H
H
H
H
H
O H
O H
O H
O H R O H
O H
O
Fig. 5
b) Corantes que formam ligaes electrostticas

A carga elctrica de uma protena e o modo como ela criada pelos resduos de aminocidos,
de importncia primordial em histoqumica de protenas. Quase todas as protenas, que ocorrem
nos tecidos animais e vegetais, so anfteras (apresentam propriedades de cido e de base
fracas), embora algumas estejam em tais extremos, que so virtualmente sempre bsicas ou
cidas. Em condies de pH neutro, a maioria das protenas tm uma carga positiva e, como tal,
liga- se a corantes cidos (com carga negativa, como a Eosina). Por outro lado, os cidos
nucleicos do ncleo possuem uma carga negativa a pH neutro, e portanto estas molculas ligam se a corantes bsicos, como o caso da Hematoxilina. A colorao dupla Hematoxilina - Eosina
baseia - se exactamente nesta dualidade: o ncleo cora de azul e o citoplasma de vermelho. Em
alguns casos, como acontece com o nuclolo que contm cido nucleicos e protenas bsicas,
pode ocorrer uma certa competio entre os dois corantes.
As protaminas, devido predominncia de arginina e lisina, e as histonas, so exemplos de
protenas de carcter fortemente bsico, enquanto que as albuminas e as escleroprotenas so
ligeiramente cidas e as globulinas variam de ligeiramente cidas a neutras.
Reaco do Biureto
A Reaco do Biureto, uma reaco corada, clssica da
qumica, que permite detectar a presena de ligaes
peptdicas em compostos com mais de trs resduos de
aminocidos (Fig. 6). Em meio alcalino, as ligaes peptdicas
formam complexos corados de cor prpura com os ies de
cobre.
Apesar da sua elevada especificidade para as protenas, a
transposio da Reaco do Biureto para a prtica histoqumica
revelou-se inadequada. O teste revela baixa sensibilidade e
destri o material biolgico.
NH
H
N
C
R
C
O
2+
Cu
O
C
O
NH
R
R
N
H
Fig. 6
Azul Brilhante de Comassie

O Azul Brilhante de Comassie um corante muito sensvel que existe sob duas formas, uma
vermelha e uma azul. Por ligao do corante protena, a forma vermelha convertida na forma
azul, provocando um desvio na banda de absoro mxima de 465 para 595 nm. Tal facto permite
determinar por espectrofotometria a quantidade da protena de uma amostra.
1.1.3. Colorao selectiva de determinadas protenas

Em histologia animal, em particular em histopatologia, utilizam-se vrios mtodos para detectar
a presena de tipos especficos de protenas, tais como a queratina, o colagnio, a reticulina, a
elastina e a fibrina. Do ponto de vista da histoqumica vegetal as nucleoprotenas so as nicas
detectadas selectivamente, pela Reaco de Feulgen.
1.2. EM UV
Os corantes, referidos anteriormente para deteco de protenas, so diacromos. Contudo,
alguns deles, como a Eosina e o Naphtol Yellow podem ser utilizados como fluorocromos, embora
sejam menos eficientes. Os fluorocromos no so de aplicao convencional, no estudo
histoqumico de protenas, mas encontram grande aplicao no campo da imunofluorescncia, em
que, um anticorpo conjugado com um fluorocromo, se liga especificamente ao antignio
correspondente.
Um dos fluorocromos mais utilizados na deteco de protenas o Isotiocianato de
Fluorescena (FITC), que produz fluorescncia de cor verde quando irradiado com UV. Este
reagente liga-se a grupos amina de protenas celulares.
a) Determinao da viabilidade celular
Diacetato de Fluorescena
O Diacetato de Fluorescena (FDA) um fluorocromo utilizado na determinao da viabilidade
celular. O FDA atravessa livremente a membrana celular, mas s nas clulas viveis sujeito
aco de uma esterase que quebra os resduos acetato, libertando a fluorescena, que se
acumula intracelularmente (retida pela membrana celular intacta), originando uma intensa
fluorescncia amarelo-esverdeada.
2. DETECO DE HIDRATOS DE CARBONO

Os hidratos de carbono, polihidroxi-aldedos ou cetonas, compreendem monossacridos (uma
cetose ou aldose; ex. glucose), dissacridos (duas unidades; ex. sacarose), oligossacridos (4-10
unidades de monossacridos), polissacridos (molculas lineares ou ramificadas com centenas
ou milhares de unidades de monossacridos; ex. celulose, glicognio). Os polissacridos de
massa molecular elevada, frequentemente agrupados em polissacridos estruturais (celulose,
calose, quitina, mucopolissacridos cidos e neutros) e os polissacridos de reserva (amido e
glicognio), constituem a maioria dos hidratos de carbono que ocorrem na natureza.
Nas plantas, os polissacridos mais comuns so o amido e a celulose, embora se possam
encontrar outros polissacridos, que contm diversos tipos de acares para alm da glucose.
Estes polissacridos de reserva (xiloglucanos - amilides - e galactomananos) acumulam-se a
nvel das paredes celulares do endosperma, albmen e embrio e so utilizadas aquando da
germinao.
10
Os monossacridos so os glcidos mais simples que, para alm de carbono, oxignio e

hidrognio, possuem, em alguns casos, tomos de azoto e enxofre. Os monossacridos podem
ocorrer, nas clulas, sob a forma livre, ou ligar-se covalentemente entre si para originar molculas
com diversos graus de complexidade, oligossacridos (di-, trissacridos, etc.) e polissacridos.
Muitos oligossacridos, com trs ou mais resduos de monossacridos, e bem assim alguns
polissacridos (polissacridos conjugados), encontram-se associados, quer com pptidos, quer
com lpidos. Nestes complexos macromoleculares, os glcidos podem estabelecer,
nomeadamente com as protenas, ligaes fortes, do tipo covalente, ou ligaes mais fracas, do
tipo inico e/ou de hidrognio.
Do ponto de vista estritamente histoqumico, o problema da fixao dos glcidos pe-se de
forma diversa, consoante se pretenda preservar monossacridos ou polissacridos simples, ou
conjugados.
A elevada difusibilidade dos monossacridos levanta problemas delicados no que refere sua
preservao nos tecidos. Existe apenas um mtodo que permite preservar e detectar a glucose e
outras hexoses e pentoses. Este mtodo baseia-se na precipitao dos monossacridos pelo
metanol, saturado com hidrxido de brio. O complexo acar-brio, insolvel em metanol,
seguidamente transformado num complexo acar/prata, por tratamento do material com uma
soluo alcolica de nitrato de prata. Esta , por sua vez, reduzida a prata metlica, pelo
formaldedo, o que permite a sua fcil visualizao ao microscpio ptico. Os estudos efectuados,
sobre a especificidade do teste, revelam que este permite detectar diversas hexoses e pentoses.
Contudo, a N-acetilglucosamina, a sacarose e as oses fosfatadas no se revelaram sensveis ao
mtodo, pelos menos nos ensaios in vitro.
Em histoqumica, caracterizam- se essencialmente polissacridos e hidratos de carbono
conjugados quer com protenas (glicoprotenas), quer com lpidos (glicolpidos). A sua deteco
realizada atravs de reaces que caracterizam um ou mais radicais ou grupos funcionais (tais
como grupos 1,2 - glicol, grupos carboxilo ou sulfato, etc.), que podem pertencer a diferentes
classes de hidratos de carbono ou a substncias no glucdicas. Deste modo, h necessidade de
efectuar reaces mltiplas para distinguir as diferentes classes e reaces de controlo para
determinar a especificidade dos mtodos de deteco escolhidos.
O estudo histoqumico dos polissacridos baseia- se em quatro tipos de reaces: a) Reaces
ligadas presena do grupo vic - glicol (- CHOH - CHOH) ou grupos aparentados; b) Reaces
ligadas presena de grupos cido (ster sulfrico - OSO3H e carboxilo - COOH), o que permite a
distino entre polissacridos cidos e polissacridos neutros, c) Reaco do grupo hidroxilo
(- OH); d) Mtodos de digesto enzimtica. De entre os diferentes mtodos includos em cada um
dos grupos, a Reaco cido Peridico- Reagente de Schiff (PAS) e os mtodos de digesto
enzimtica so os mais relevantes. Pela sua larga utilizao, a Reaco cido PeridicoReagente de Schiff ser tratada com maior detalhe.
2.1. EM LUZ VISVEL

2.1.1. Reaces ligadas deteco do grupo vic-glicol ou grupos aparentados
Estas reaces permitem detectar, para alm de polissacridos e mucoprotenas neutras,
tambm hidratos de carbono de natureza cida.
Reaco cido Peridico - Reagente de Schiff
A tcnica do PAS (Periodic Acid Schiff) das mais utilizadas na caracterizao geral de
polissacridos.
11
1 Fase. Por tratamento com cido Peridico (HIO4), os compostos com dois ou mais grupos
-OH em carbonos vicinais (1,2 - glicol = vic- glicol, ou - glicol, - CHOH - CHOH) so oxidados com
ruptura das ligaes carbono-carbono e consequente formao de dois carbonilos aldedicos
(Fig. 7).
Embora a oxidao dos 1,2 - glicol seja facilitada pela configurao cis dos grupos hidroxilo, a
configurao trans no pe dificuldades, porquanto se verificam alteraes conformacionais
durante a reaco. A oxidao com o cido peridico ocorre, igualmente, quando o substituinte do
carbono alfa uma amina primria, secundria, ou um grupo carbonilo (aldedo ou cetona) (Fig.
8), formando-se neste caso um s grupo aldedo.
A aco oxidante do cido peridico no se limita aos grupos j mencionados, tambm os
grupos 1,2 - metoxilo e os 1,2 - dicetona (- CO - CO -) so igualmente sensveis, no se formando,
neste caso, grupos aldedo. O tempo de reaco com o cido peridico deve ser reduzido ao
mnimo indispensvel, no devendo exceder por norma os 10 min, uma vez que se torna
necessrio impedir a oxidao ulterior dos aldedos nos correspondentes cidos carboxlicos. Se
tal acontecer, a reaco histoqumica inconsequente, pois no se forma o complexo corado com
o Reagente de Schiff. Os aldedos endgenos livres, que reagem do mesmo modo com o
Reagente de Schiff, originando falsas localizaes, podem ser previamente bloqueados com
dimedona (5,5 - dimetilciclohexano - 1,3 - diona) (Fig. 9), ou reduzidos com tetrahidreto borato de
sdio. A dimedona estabelece ligaes com os aldedos, de tal forma que duas molculas de
dimedona bloqueiam um grupo aldedo. O tetrahidreto borato de sdio um redutor fraco, que
reduz apenas os carbonilos nos correspondentes lcoois.
R1
R1
HO
R2
R1
OH
HO
OH
IO4-
NH2
H 2N O
CH3 CH3
H
H
IO3-
Fig. 8
CH3
C
H
IO3-
Fig. 7
CH3
OH
IO4-
H
H
O-
CH3 CH3
O
O
I
O O
H2O
O
OH
O
R2
-Hidroxicetona
OH
OH
O
O
HO
HO
-Alquilaminolcool
OH
R1
NH
R3
NH 2
H2O
O
R2
HO
-Aminolcool
vic-Glicol
O
HO
R2
OH HO
C
H
12
Fig. 9
Para visualizar histoquimicamente os grupos aldedo, formados pela aco do cido peridico
(sensibilidade da reaco PAS), estes tm de existir em concentrao elevada para serem
revelados pelo Reagente de Schiff, dando origem a um produto intensamente corado. ainda
necessrio que se mantenham covalentemente ligados ao resto da molcula e no difundam
durante a reaco. Tal facto nem sempre se verifica, o que explica que compostos, que de acordo
com a sua constituio molecular, deviam dar uma reaco PAS positiva, sejam PAS negativos.
2 Fase. Numa segunda etapa, os aldedos formados pela aco do cido peridico
condensam com a fucsina do Reagente de Schiff, formando um complexo corado (Fig. 10).
Durante a preparao do Reagente de Schiff, a fucsina reage com o metabissulfito de sdio, e,
em consequncia de alteraes na estrutura da sua molcula, em particular no grupo quinonide,
obtm-se uma soluo incolor. A fucsina do Reagente de Schiff, ao reagir com os dialdedos
readquire o grupo quinonide, originando - se um produto de reaco corado.
NH2
HO
HO
H2O3S C
NH2
O O
H
HO
O O
H
HO
O O
C
H
H
O C
H O
C
O
C
Resduo de polissacrido oxidado
SO3H2
NH2
H2N
HO
O
C
H
O
O3S HN
HO
HO
-
O3S O
O
C
O C +
NH O
H
O O
C
H
O
O3S HN
HO
-
O3S O
CH
O C
NH
H
SO3H2
C+
H3N+
H3N+
Fig. 10
Especificidade histoqumica. Na interpretao dos resultados da reaco importante

considerar os resultados positivos e os negativos. Embora os mtodos utilizados permitam, em
geral, visualizar os grupos 1,2-glicol dos polissacridos, h excepes que no podem ser
ignoradas. A maioria dos polissacridos (Fig. 11, intervalo [1]) reage positivamente ao teste,
contudo h polissacridos (Fig. 11, intervalo [2]), como por exemplo a calose e todos os hidratos
de carbono com ligaes 1,3 que no so sensveis. Verifica-se ainda, que alguns compostos de
natureza no glucdica (Fig. 11, intervalo [3]), nomeadamente lpidos, do reaco positiva.
[1] Polissacridos com reaco positiva: Os compostos detectados possuem grupos vic- glicol
livres. Quanto mais regulares e menos ramificadas forem as cadeias polissacardicas, mais
intensa a reaco (ex., amilose no amido). A ramificao reduz o nmero de grupos vic- glicol
disponveis e, quando a molcula compacta, como a celulose cristalina, s os grupos exteriores
podem reagir. De um modo geral, verifica-se que o reagente Schiff difunde livremente apenas
atravs de interstcios com dimetro superior a 1.2 nm.
13
[2] Polissacridos com reaco negativa: Quando grupos vic- glicol no esto acessveis,
devido a numerosas ramificaes laterais ou substituies, a reaco fraca. Se no polissacrido
existirem ligaces 1,3-glucano, a reaco no ocorre.
TESTE POSITIVO
POLISSACRIDOS
-
Fig. 11
[3] Compostos no polissacardicos com reaco positiva: Certos cidos gordos e polipptidos
sofrem oxidao pelo cido peridico, reagindo positivamente ao teste PAS. A situao
problemtica quando se estudam estruturas que possuem glicoprotenas ou glicolpidos.
Estas limitaes no reduzem o valor do mtodo, reforam apenas a importncia de ter sempre
em conta o mecanismo da reaco e o tipo de composto(s) em estudo. O estudo qumico das
reaces demonstrou que os nicos grupos reactivos so os grupos: 1,2 - glicol, 1 - hidroxi - 2amino, 1 - hidroxi - 2 - alquilamino, - hidroxialdedo e - hidroxicetona. Com base nestes dados
difcil estabelecer uma lista completa das substncias susceptveis de serem detectadas
histoquimicamente em seces de tecidos animais ou vegetais, normais ou patolgicos.
absolutamente indispensvel efectuar controlos que permitam avaliar da especificidade do teste,
tais como, bloqueio de grupos qumicos reactivos, extraces selectivas, e omisso ou
modificao de passos crticos do mtodo.
Reaces de controlo de especificidade: A especificidade da reaco pode ser controlada
de duas maneiras: a) Por bloqueio da reaco, com o objectivo de controlar a especificidade geral
da reaco, ou b) Por verificao da natureza glucdica de compostos PAS-positivos para eliminar
certas substncias lipdicas complexas (glicolpidos, fosfolpidos e lipopigmentos) susceptveis de
darem uma reaco PAS-positiva.
a) Reaces de bloqueio
Bloqueio dos grupos vic- glicol (antes da aco do agente oxidante)
Os grupos hidroxilo (- OH) dos vic- glicol podem ser esterificados com anidrido actico ou
cloreto de benzoilo. O tratamento do material com uma mistura de anidrido actico - piridina ou
cloreto de benzoilo-piridina leva formao dos correspondentes steres. Esta reaco, que
decorre em tempo varivel consoante a temperatura (Fig. 12a), impede o desenvolvimento normal
da reaco histoqumica. Os steres dos vic- glicis no so susceptveis oxidao pelo cido
peridico. A reaco de esterificao reversvel quando o material tratado com solues
diludas (0.1 N) de HCl, KOH, NaOH ou lcool amoniacal (Fig. 12b). Contudo, os diferentes
hidratos de carbono no reagem de forma constante e idntica esterificao e, por outro lado, a
esterificao seguida de saponificao pode interferir na reaco PAS subsequente.
R CH CH R'
OH OH
CH 3CO
CH 3CO
R CH CH R'
O O
O
Piridina
CH3 C
O
14
C CH3
O
+ H 2O
Fig. 12a
R CH CH R'
O O
CH3 C
O
C CH3
+ 2 KOH
R CH CH R'
OH OH
+ 2 CH3 CO2K
Fig. 12b
Os vic-glicis podem ainda ser bloqueados por tratamento prolongado com lcool metlico. O
mecanismo da metilao incerto e o seu interesse , por isso, limitado.
Bloqueio dos grupos aldedo (antes da visualizao pelo Reagente de Schiff)
possvel impedir a visualizao dos aldedos formados por oxidao dos grupos vic- glicol,
atravs da aco de agentes de bloqueio dos grupos aldedo, tais como, a dimedona (durante
toda a noite), a hidroxilamina (tratamento eficaz durante 1 a 3 h a pH 4.5 - 4.7), a fenilhidrazina
(bloqueio rpido e completo), entre outros. Os aldedos podem tambm ser reduzidos a lcoois
por tratamento com tetrahidreto borato de sdio (30 min).
b) Verificao da natureza glucdica de substncias PAS-positivas
O material no fixado, pode ser sujeito a extraces sucessivas com acetona, para eliminar a
possibilidade de algumas substncias lipdicas darem reaco PAS-positiva (mtodo muito
destrutivo).
2.1.2. Caracterizao diferencial dos hidratos de carbono

Existem diversos mtodos para a caracterizao diferencial dos glcidos, nomeadamente dos
hetersidos, baseados na afinidade dos seus grupos cidos para os corantes bsicos. Dos vrios
corantes disponveis, o Azul de Alciano , pela simplicidade do mtodo, o corante bsico mais
utilizado na deteco destas substncias. Merecem ainda destaque alguns outros reagentes,
frequentemente utilizados na deteco de polissacridos e/ou molculas aparentadas.
a) Polissacridos cidos
Azul de Alciano
O Azul de Alciano, utilizado em histoqumica, a forma solvel de uma ftalocianina cprica
substituda (Fig. 13). Embora o mecanismo da colorao tenha sido alvo de alguma discusso,
actualmente no parecem existir muitas dvidas sobre a participao dos grupos isotiournio do
corante neste processo.
semelhana de outros corantes bsicos, a afinidade do Azul de Alciano para os
polissacridos cidos depende do pH do veculo do corante. Neste contexto, possvel determinar
a natureza dos grupos funcionais responsveis pela reteno do corante, sempre que se trabalha
em condies de pH controlado. Assim, ao utilizar-se uma soluo corante a pH 2,4-2,6, a
alcianofilia registada pode dever-se presena de grupos carboxilo, fosfato e/ou sulfato. No
entanto, se o pH for inferior ao pK dos grupos carboxilo e fosfato (pH 1,0), muito provvel que a
colorao se deva presena de grupos sulfato, os quais so ionizveis, mesmo a este valor de
pH. Importa, todavia, realar que na prtica histoqumica, a interpretao da basofilia, em funo
do pH, uma tarefa delicada, pois no possvel avaliar as alteraes verificadas nos grupos
reactivos, durante a manipulao do material. Para alm disso, outras substncias com grupos
15
aninicos, nomeadamente os cidos nucleicos e as protenas, podem igualmente fixar o corante.
N
N+
N
N
S
N+
N
N
N
S
Cu N
N
Cl-
N+
Cl-
ClS
N
N
Cl-
Fig. 13
b) Amido
Lugol
O Lugol constitudo por Iodeto de Potssio (KI), um sal inico, que provoca a ruptura das
pontes de hidrognio e a consequente separao das vrias unidades de glucose que constituem
a macromolcula de amido. O KI permite, desta forma, que o iodo se acumule na molcula de
amido.
c) Pectinas
Vermelho de Rutnio
O Vermelho de Rutnio um composto catinico hexavalente que, in vitro, na ausncia de
Tetrxido do smio reage com substncias cidas de natureza muita diversa. utilizado em
histoqumica na deteco de pectinas e de mucilagens vegetais. Nas Angiosprmicas a maioria
das mucilagens vegetais so cidas, derivadas dos cidos urnicos (glucornico e galactronico).
Vrios autores sugerem o emprego de corantes metacromticos para distinguir polissacridos
cidos de polissacridos neutros. Do ponto de vista histoqumico, a caracterizao diferencial dos
glcidos, por meio de corantes metacromticos, deve ser cautelosa. A metacromasia, como j foi
anteriormente referido, no caracteriza nenhum composto, nem nenhum grupo funcional
particular, alm de que um fenmeno estritamente dependente da elevada densidade de carga
superfcie do cromtropo. As pectinas, por exemplo, que possuem graus de esterificao dos
resduos de cido galacturnico da ordem dos 30%, podem no revelar metacromasia, se os
grupos aninicos no ocorrerem com a periodicidade adequada. A ausncia de metacromasia,
no nega, s por si, o carcter cido dos polissacridos.
2.2. EM UV
Laranja de Acridina
Vrios reagentes do tipo Schiff so obtidos por adio de anidrido sulfuroso (SO) a solues
16
aquosas de corantes bsicos da srie aminoacridina. A Acriflavina e o Laranja de Acridina tm

sido recomendados por alguns autores como eficientes substitutos da fucsina bsica na colorao
de PAS. A colorao com Laranja de Acridina, um fluorocromo metacromtico catinico, permite,
por exemplo, distinguir DNA, que emite fluorescncia de cor verde, de RNA, DNA desnaturado e
polissacridos cidos, que emitem fluorescncia de cor vermelha.
b) -Glucanos
Calcoflor
O Calcoflor um fluorocromo comercialmente usado, como agente branqueador, no fabrico
de detergentes.
Em histoqumica tem sido utilizado com sucesso para detectar -glucanos. Quando irradiado
com UV o complexo calcoflor / -glucano fluoresce intensamente de azul.
c) Calose
Azul de Anilina
O Azul de Anilina induz, em luz azul a baixa concentrao, uma fluorescncia amarela muito
intensa em reas da parede ricas em calose. Embora o Azul de Anilina se ligue de uma forma
fraca a uma grande variedade de -1,3 e -1,4 glucanos, a intensa fluorescncia observada, em
reas da parede ricas em calose, pode dever-se rpida penetrao do fluorocromo nestas
regies da parede. Contudo, a natureza exacta desta reaco no foi ainda estabelecida.
3. DETECO DE MUCILAGENS E MUCOPOLISSACRIDOS CIDOS

As mucilagens, ou gomas vegetais, so substncias de natureza polissacardica que, quando
dispersas em gua, intumescem para formar gis, disperses pegajosas ou solues viscosas. As
propriedades viscoso-pegajosas variam segundo o grau de hidratao ou com o pH. Os
mucopolissacridos so glucosaminoglicanos (contm acares aminados), com que tm elevada
afinidade para a gua, que ocorrem em condies fisiolgicas, sob a forma de gis mais ou
menos viscosos.
3.1. EM LUZ VISVEL

a) Mucilagens
cido Tnico /Cloreto Frrico
As mucilagens vegetais so polissacridos, quase puros, de elevada massa molecular. So
polmeros de cido urnico, bem diferentes das mucilagens animais que so glicoprotenas.
O cido tnico complexa - se com as aminas das mucilagens, sendo o complexo cido tnico amina revelado pelo cloreto frrico. Da reaco resulta um precipitado escuro, que pe em
evidncia a presena de mucilagens animais. Assim, este teste tem pouca ou nenhuma aplicao
nos vegetais.
O emprego de proteases, no fabrico da cerveja, para prevenir a formao de complexos entre
as protenas e os taninos, que precipitam a baixas temperaturas, o exemplo mais tpico deste
tipo de reaco (Fig. 14).
17
c.
Tnico
NH2
OH
OH
NH2
Fe3+
Protena
c.
Tnico
O
O Fe+
Protena
Fig. 14
Vermelho de Rutnio
O Vermelho de Rutnio parece ser, de acordo com a maioria dos autores, o melhor corante
para detectar mucilagens em plantas [vide 2.1.2 c) Pectinas].
b) Mucopolissacridos cidos
Azul de Alciano
Como referido anteriormente [vide 2.1.2 a) Polissacridos cidos] o Azul de Alciano um
corante vulgarmente utilizado na deteco deste tipo de compostos.
4. DETECO DE LPIDOS
A designao genrica de lpidos abrange um conjunto muito heterogneo de compostos, que
tm em comum uma reduzida solubilidade em gua e uma forte solubilidade em solventes
orgnicos.
As reservas lipdicas encontram-se, em geral, sob a forma de gotculas dispersas no
citoplasma. As ceras e as cutculas so igualmente ricas em compostos lipdicos e seus
derivados.
Do ponto de vista histoqumico, as distines mais importantes dos lpidos, so entre lpidos
hidrfobos / hidrfilos e lpidos em estado slido / estado lquido. As propriedades das molculas
de lpidos determinam o seu comportamento preferencial por solventes orgnicos ou aquosos.
Alguns fosfolpidos, por exemplo, tm propriedades mais polares o que implica que sejam
miscveis em gua, enquanto que as ceras e os steres de glicerol ou de colesterol apresentam
uma predominncia de grupos no polares o que os torna hidrfobos. Por outro lado, lpidos com
um ponto de fuso prximo de 37 C podem cristalizar temperatura ambiente e, portanto, no
reagem s coloraes como o fariam in vivo. Os triglicridos, os lpidos mais abundantes nos
animais e plantas, so hidrfobos e sudanoflicos, excepto quando cristalinos.
De todos os grandes grupos de compostos detectados histoquimicamente, os lpidos parecem
ser os mais sujeitos a artefactos. A maioria dos lpidos no apresenta in vivo o mesmo
comportamento que in vitro. Por outro lado, in vivo, esto, em muitos casos, conjugados com
protenas e hidratos de carbono. O processo de fixao pode ainda alterar a solubilidade dos
lpidos, o que implica a alterao da sua reaco aos reagentes. Depsitos de clcio, por exemplo
resultantes da fixao com Formol - Clcio, podem tambm causar artefactos, j que em tcnicas
em que se utilizam sais de metais pesados (Co++ e Pb++), estes so substitudos pelo Ca++ levando
a uma reaco falsamente positiva. De tudo isto ressalta a necessidade de se efectuarem
controlos positivos e negativos. No caso dos controlos positivos, utilizam - se compostos-padro,
que so aplicados numa rodela de papel de filtro que tratado como o tecido a estudar. Nos
controlos negativos procede-se remoo dos lpidos com acetona ou com uma mistura de
clorofrmio, metanol, HCl e gua. A extraco com acetona anidra permite a remoo de gorduras
18
e colesterol, mas no de fosfolpidos. Se a acetona no for anidra os fosfoglicridos so extrados

juntamente com os lpidos apolares. A mistura clorofrmio, metanol, HCl e gua promove uma
remoo mais completa dos lpidos, j que a gua facilita a dissoluo dos fosfolpidos e o HCl
quebra as ligaes lipoproteicas.
4.1. EM LUZ VISVEL

4.1.1. Birrefringncia dos lpidos
Os lpidos no podem ser classificados apenas com base nas suas propriedades pticas, mas,
em alguns casos, a observao de uma preparao, corada com Oil Red, em luz polarizada, d
informaes importantes. Os lpidos slidos so muito birrefringentes e contrastam com as
gorduras, que em fase lquida coram de vermelho.
4.1.2. Deteco geral de lpidos

Os corantes utilizados na deteco de lpidos no possuem auxocromo e, consequentemente,
no so ionizados, nem ionizveis. A colorao deve-se a um processo puramente fsico, isto ,
os reagentes que coram apresentam maior afinidade para os lpidos do que para os solventes
em que esto dissolvidos, o que significa que o seu coeficiente partio lpido/solvente elevado.
Os compostos utilizados para corar os lpidos por um processo deste tipo designam-se por
lisocromos.
Os Sudes so os lisocromos mais utilizados na deteco de lpidos. Contudo, apenas
detectam os lpidos que se encontrem em fase lquida temperatura ambiente. A sudanofilia do
lpido depende do seu ponto de fuso, do nmero de ligaes duplas e do comprimento da cadeia
carbonada.
Solvente
Lpido
Coef. Partilha
Baixo
Lpido / Solvente
Elevado
Fig. 15
A elevada tenso superficial de qualquer gordura, na interface lpido - gua, f - la tomar uma
forma globular, impermevel aos reagentes aquosos, mas muito permevel aos Sudes. No
entanto, a maioria dos Sudes no cora nem os fosfolpidos nem o colesterol livre. Para facilitar a
penetrao dos Sudes nas gorduras, estas devem ser dissolvidas em solventes orgnicos, que
tm estar suficientemente diludos para evitar a sua extraco. Porm, observa-se sempre uma
certa extraco, sobretudo de cidos gordos e fosfolpidos.
Na escolha do solvente para um lisocromo deve ter-se em conta a no dissoluo da
substncia que se pretende corar (os cidos gordos so extrados com etanol), a boa dissoluo
do lisocromo e o coeficiente de partio lpido/solvente deve ser elevado (Fig. 15). Alguns lpidos
podem ser estabilizados pela adio de bromo. Os cidos gordos e as lecitinas, por exemplo,
tornam-se resistentes extraco etanlica e o colesterol convertido num derivado halogenado
lquido que sudanfilo.
19
Sudes
O Negro Sudo B considerado, pela maioria dos autores, como o melhor corante para
lpidos. o nico Sudo diiminoazico, i.e, possui dois grupos azicos e um anel heterocclico
contendo dois tomos de azoto (Fig. 16). J o Vermelho Sudo IV (Fig. 16) um corante orto oxiazico com um grupo azico (N = N) em posio orto (grupo cromforo). Ao contrrio dos outros
Sudes, o Negro Sudo B possui dois componentes distintos, um cora gorduras de azul - negro e o
outro, um corante bsico, cora os fosfolpidos de cinzento.
N N
N N
CH3
N
N CH3
N CH3
N
CH3 NO
N N
Negro Sudo B
N N
Vermelho Sudo IV
Fig. 16
4.1.3. Deteco diferencial de lpidos

Em muitos casos, necessrio proceder caracterizao mais detalhada dos lpidos,
detectados pelos mtodos de caracterizao geral. Existem diversos mtodos histoqumicos que
permitem, por exemplo, distinguir lpidos cidos e/ou de neutros, determinar a sua natureza
insaturada e detectar cidos gordos.
a) Lpidos cidos e neutros
Sulfato Azul do Nilo
O Sulfato Azul do Nilo um corante alocromtico utilizado na deteco diferencial de lpidos,
os lpidos neutros coram de vermelho e os cidos de azul (Fig. 17). Segundo alguns autores, no
caso particular das plantas, os terpenos neutros tendem a corar de rosa e os cidos resnicos de
violeta a azul.
N+
N
O
H 2N
Oxazina (Azul do Nilo)
Oxazona (Vermelho do Nilo)
Fig. 17
A colorao diferencial com o Sulfato Azul do Nilo deve - se presena de duas substncias,
uma oxazona de cor vermelha (lisocromo), que se dissolve nos lpidos neutros (gorduras), e uma
oxazina de cor azul, uma base livre que reage com os grupos carboxilos dos cidos gordos livres
e com os resduos de cido ortofosfrico dos fosfolpidos. importante realar, que a colorao
azul no especfica dos lpidos cidos, pode ser tambm devida reaco da oxazina com
quaisquer outros compostos basfilos presentes na clula.
A colorao roxa, que frequentemente se obtm por aplicao deste teste, deve-se presena
de uma mistura de lpidos nos tecidos. Neste caso, devem-se extrair previamente os cidos
gordos com acetona.
20
Convm no esquecer, que em material fixado com Formol - Clcio, a acetona no retira os
cidos gordos, j que os sabes de clcio so insolveis e coram tal como os fosfolpidos.
b) Lpidos insaturados
Tetrxido de smio
O OsO4 pode ser utilizado na deteco de lpidos insaturados. A presena de ligaes duplas
(C = C) nos cidos gordos evidenciada pelo OsO4, o qual reduzido, formando um composto
negro de smio (Fig. 18).
CH
R'
CH
R
R'
Os
O
C O
C O
O
Os
O
Fig. 18
O OsO4, no detecta especificamente lpidos. Com efeito, o OsO4 pode reagir com outros
grupos funcionais como por exemplo lcoois, tiis, aminas, aldedos e cetonas. Por exemplo o
OsO4 reage rapidamente com orto- dihidroxifenis (Fig. 19). Deste modo, o OsO4 apenas
utilizado para detectar lpidos insaturados quando, por outro mtodo, a presena de lpidos j foi
revelada.
OH
OH
O O O
Os
O O O
O
Os
Fig. 19
c) cidos gordos
Acetato de Cobre /cido Rubenico
Os mtodos de deteco histoqumica de cidos gordos livres baseiam-se todos no emprego
de metais pesados. Na generalidade dos mtodos, o material tratado com acetato de cobre que,
reagindo com os cidos gordos livres, forma sabes cpricos que so, ulteriormente, revelados
por procedimento adequado. Dos diversos reagentes empregues para este fim, o cido rubenico
(ditioxamida) o que d resultados melhores e mais consistentes. Os ies metlicos que no
formam ligaes com os cidos gordos so eliminados pelo EDTA (etileno diamina tetractica),
sendo os fixados, revelados pelo cido rubenico. Podem ocorrer reaces falsamente positivas,
quando os depsitos de clcio e de ferro so substitudos pelo cobre.
4.2. EM UV
Vermelho Neutro
O Vermelho Neutro, como fluorocromo para lpidos, induz uma fluorescncia amarela ou azul
esverdeada, que depende da composio dos diferentes tipos de lpidos.
21
5. DETECO DE TERPENIDES
Os isoprenides ou terpenides, apesar do seu carcter lipdico, so aqui tratados parte, no
s por desempenham uma grande variedade de funes, mas tambm por constituem uma das
classes de metabolitos com vasta distribuio nas plantas. Os terpenides acumulam-se
preferencialmente em estruturas glandulares especializadas (tricomas, idioblastos, canais, bolsas
e laticferos), que secretam misturas mais ou menos complexas de terpenos (como os que
ocorrem nos leos essenciais, nas resinas e no ltex), o que torna difcil a sua deteco
histoqumica.
5.1. EM LUZ VISVEL

5.1.1. Deteco diferencial de terpenides
a) Essncias e cidos resnicos
Reagente de Nadi
O Reagente de Nadi um reagente de preparao extempornea, uma vez que por mistura
dos seus dois componentes (-naftol e cloridrato de dimetil-p-fenilenodiamina) resulta, por
oxidao, Azul de Indofenol (Fig. 20).
Cloridrato de dimetil-p-fenilenodiamina
NH2 Cl -
OH
+
-Naftol
H3C
CH3
N
CH3
H3C
Azul de Indofenol
Fig. 20
O Azul de Indofenol, um composto fortemente lipossolvel, altera a cor por variao do pH,
permitindo uma colorao diferencial de essncias e cidos resnicos.
b) Esterides
Tricloreto de Antimnio
A presena de terpenides evidenciada por uma colorao vermelha que ocorre
provavelmente devida quelao do io antimnio Sb3+ pelo aldedo e pelo hidroxilo ligado ao C-7
de alguns terpenides relacionados com o gossipol (Fig. 21).
O
OH
OH
HO
OH
HO
H3C
CH3
OH
CH3
CH3
H3C
Gossipol
22
CH3
Fig. 21
Alguns autores verificaram o aparecimento de cor vermelho com alguns esterides,

nomeadamente diosgenina, yamogenina e seus derivados (acetatos, glicsidos, galactsidos). A
reaco parece depender da presena de uma ligao dupla em C - 5 (5) e no do grupo
hidroxilo em C - 3. Com molculas sem insaturao em C - 5 no se observa formao de produto
corado. Esta hiptese parece ser apoiada pelo facto do cido perclrico, usado na reaco, levar
formao de colesta - 3,5 - dieno a partir de 3 - hidroxi - 5- esterides, quando esta presente em
excesso (Fig. 22).
H3C
H3C
H3C
CH3
H3C
CH3
C H3
C H3
H3C
H3C
CH3
CH3
Excesso de HClO4
HO
3-Hidroxi-5-esteride
(Sitosterol)
Colesta-3,5-dieno
Fig. 22
c) Terpenides com grupo carbonilo

2,4 - Dinitrofenilhidrazina
A 2,4 - Dinitrofenilhidrazina um reagente, utilizado na deteco de compostos com grupo
carbonilo que reage com aldedos e cetonas para formar dinitrofenilhidrazonas coradas (Fig. 23).
OO
H3C
O-
H3C
O
O
H2N
NH
N HN
O-
Aldedo
N+
H
2,4-Dinitrofenilhidrazina
2,4-Dinitrofenilhidrazona
Fig. 23
d) Lactonas sesquiterpnicas
cidos fortes
As lactonas sesquiterpnicas reagem com os cidos fortes, como o cido sulfrico, dando
origem a compostos intensamente corados de vermelho-acastanhado.
Reaco Modificada de Abraham
A Reaco Modificada de Abraham um mtodo de deteco de perxidos que pode ser
utilizado para revelar lactonas sesquiterpnicas, uma vez que estas so frequentemente perxidos
de natureza terpnica.
23
5.2. EM LUZ VISVEL E EM UV

a) Deteco de partculas de borracha
Oil Red O ou Oil Blue N
A borracha, um politerpenide de elevada massa molecular com cerca de 1500 a 6000
unidades de isopreno, ocorre, sob a forma de partculas, no ltex de alguns laticferos de
Angiosprmicas. A sua produo e acumulao so especialmente elevadas em espcies
arbreas tropicais, donde extrada para fins industriais. Algumas plantas laticferas produzem,
em vez de borracha, um outro hidrocarboneto poli-isoprnico, a gutta, um estereoismero da
borracha. O cido frmico coagula as partculas de borracha que so reveladas por estes
lisocromos, corando de vermelho em luz visvel e com fluorescncia vermelho plido em UV.
5.3. EM UV
Cloreto de Dansil
O Cloreto de Dansil, sulfonato de dimetilaminonaftaleno, reage com os aminocidos e
protenas dando origem a um complexo secundrio fluorescente de cor esbranquiada. A
ocorrncia desta fluorescncia, em seces a que previamente se extraram as resinas, os lpidos
e as protenas, permite assumir que se deve presena de partculas de borracha.
6. DETECO DE FENIS
Designam-se por fenis ou compostos fenlicos uma grande variedade de compostos qumicos
que tm em comum um anel aromtico ao qual esto ligados um ou mais grupos hidroxilo. As
substncias fenlicas so, dum modo geral, solveis em gua, j que se encontram normalmente
glucosiladas, mas podem tambm apresentar-se sob a forma de agliconas (agliconas flavonlicas,
por exemplo) em secretados de plantas com natureza lipofilica.
Alguns compostos fenlicos, como a lenhina e os taninos, esto amplamente distribudas nas
plantas. A lenhina, que confere resistncia s paredes das clulas de esclernquima e xilema, so
polifenis que resultam da polimerizao de trs monmeros: lcool coumarlico, lcool coniferlico
e lcool sinaplico (Fig. 24).
CH2 OH
HC
6
5
CH 2OH
CH 2OH
HC
CH
CH
OH
OH
HC
CH
2
3
Fenilpropano
C6-C 3
lcool
coumarlico
OCH 3
lcool
coniferlico
CH3 O
OH
OCH 3
lcool
sinaplico
Fig. 24
Os taninos so polifenis responsveis pela adstringncia dos alimentos e bebidas,
24
particularmente do ch, caf e vinhos. H dois tipos de taninos, os condensados e os

hidrolisveis. Os condensados, frequentes nas plantas lenhosas, so formados pela polimerizao
de unidades de flavonides e como originam, por hidrlise com cidos fortes, antocianidinas, so
muitas vezes designados pro-antocianidinas. Os taninos hidrolisveis so polmeros heterogneos
contendo cidos fenlicos, particularmente cido glico, e acares simples. So molculas mais
pequenas e podem ser hidrolisados mais facilmente com cidos diludos.
6.1. EM LUZ VISVEL

6.1.1. Caracterizao geral de fenis
Cloreto de Ferro III
Este um mtodo clssico para a deteco de fenis simples. Os orto- dihidroxifenis
complexam o Fe3+, formando precipitados cuja colorao pode variar do verde intenso, prpura,
azul a negro (Fig. 25).
O
OH
Fe 3+
OH
Fe+
Fig. 25
Dicromato de Potssio
Os grupos - OH livres dos fenis, condensam com o crmio da mistura reagente, formando um
produto castanho-avermelhado.
Diazoreaco
Este mtodo consiste, essencialmente, na formao de um complexo azico corado, por
condensao do fenol com um sal de diaznio, em meio alcalino (Fig. 26).
CH3
OH
H 3C
O
N
F en o l
HO
N
Fast B lue B
Fe nol
HO
OH
C o m p lexo corado
Fig. 26
Tanto o fenol como o sal de diaznio so substncias incolores, contudo, o produto da reaco
vermelho.
25
A azoreaco caracterstica dos compostos fenlicos com um grupo - OH livre e sem

substituintes em posio orto ou para, relativamente ao - OH. Os nicos compostos que podem
reagir nas mesmas condies dos fenis, so os compostos heterocclicos.
6.1.2. Caracterizao diferencial de fenis

a) Deteco de lenhina
Floroglucinol
A deteco de lenhina, pelo mtodo de Wiesner, baseia - se no facto do Floroglucinol reagir, em
particular, com o cido coniferlico (Fig. 24) dando um cromforo vermelho em meio clordrico.
b) Deteco de taninos
Vanilina Clordrica
O mtodo da Vanilina Clordrica fundamenta-se na formao de um produto de condensao
resultante da reaco dos grupos aldedicos da vanilina com os fenis.
6.2. EM UV
A lenhina autofluorescente, apresentando uma colorao amarela ou amarela-esverdeada
caracterstica. Alm disso, os compostos fenlicos so todos aromticos e, como tal, a sua
maioria, e em particular os flavonides, pode ser detectada por induo de fluorescncia na banda
dos UV.
a) Deteco de flavonides
Fluorocromos
Segundo alguns autores a utilizao de fluorocromos, para a deteco de compostos fenlicos,
no s uma tcnica muito sensvel, mas tambm mais especfica do que a diazoreaco.
Os flavonides (Fig. 27) formam quelados com os fluorocromos. Utilizando cloreto de alumnio,
acetato de magnsio e acetato neutro de chumbo possvel detectar flavonides (flavonas) com
grupos hidroxilo livres em 3' ou 5' (Fig. 28).
Na presena de acetato de sdio, o cido brico quelado por todos os grupos orto-dihidroxilo
dos flavonides, excepto os ligados aos carbonos C5 e C6.
OH
3'
2'
8
7
6
A
5
OH
4'
HO
5'
6'
4
OH O
Estrutura molecular base de

todos os flavonides
OH
Quercetina
26
Fig. 27
R
OH
HO
OH
O
HO
+ Al 3+
OH O
OH O
Al+
O
Fig. 28
7. DETECO DE ALCALIDES
Os alcalides constituem um grupo vasto de metabolitos secundrios, que se podem definir
genericamente como substncias bsicas com um ou mais tomos de azoto, geralmente fazendo
parte dum anel heterocclico.
Os alcalides acumulam-se nos vacolos, particularmente em clulas epidrmicas e
hipodrmicas e laticferos. Muitas vezes acumulam-se longe do local de sntese, como seja a
nicotina, que sintetizada nas razes e, depois, translocada e acumulada nas folhas.
Os alcalides precipitam por aco de bases, de cidos oxigenados, de sais de metais
pesados e de halogneos, o mesmo sucedendo com outros compostos que possuam grupo
bsico azotado.
7.1. EM LUZ VISVEL

7.1.1. Caracterizao geral de alcalides
Reagente de Dragendorff
De todos os reagentes propostos para a deteco de alcalides o reagente de Dragendorff o
mais utilizado. Permite detectar o azoto tercirio ou quaternrio (Fig. 29), e no revela as aminas
primrias e secundrias, a no ser que se encontrem em concentrao elevada. Outros
compostos com carbonilos , insaturados ou lactonas reagem positivamente ao Reagente de
Dragendorff (Fig. 30). De acordo com alguns autores, compostos com um grupo hidroxilo e uma
ligao dupla isolada, ou compostos como as coumarinas, psoralenos, monoterpenos, triterpenos,
esterides e polietilenos podem apresentar reaco positiva a este teste.
Classificao do tomo de azoto
R
R'
CH 2
NH 2
H2 C
Primrio
CH 2
NH
Secundrio
R'
R'
R CH 2
H2 C N CH 3
R CH 2
H2 C N CH 3
+ CH 3
Quaternrio
Tercirio
CH3
H
O
C C C C R
H
H H H
Carbonilo , insaturado
Fig. 29
CH3
Nepetalactona
27
Fig. 30
O reagente de Dragendorff cora a maioria dos alcalides de laranja-acastanhado, contudo,

alguns alcalides como a boldina, morfina e nicotina perdem essa colorao rapidamente. A cor
pode ser intensificada por tratamento com uma soluo de nitrito de sdio. Os alcalides coram
ento de castanho-escuro (morfina) ou de violeta-acastanhado (atropina), mas a colorao da
pilocarpina e nicotina permanece instvel.
7.2. EM UV
Alguns alcalides possuem, quando irradiados com UV, autofluorescncia azul, que intensifica
em alguns casos com o tempo de irradiao, como a serpentina, quinino, quinidina, cefaleina,
emetina, ioimbina, noscapina. Alcalides, como a cinchonina e a cinchonidina, apresentam
fluorescncia violeta, aps algum tempo de irradiao, outros como a berberina e sanguinarina
revelam autofluorescncia amarela.
8. MTODOS DE COLORAO DUPLA

A utilizao sequencial de dois corantes ou de dois testes histoqumicos (colorao dupla)
permite corar em simultneo e de forma diferencial dois ou mais constituintes celulares de
natureza qumica diversa. Os resultados negativos, que por vezes se obtm com a aplicao
sequencial de coloraes comuns em histoqumica, devem-se frequentemente ao facto do
primeiro tratamento inactivar ou extrair o(s) composto(s) que seria(m) evidenciados pela segunda
reaco.
Algumas duplas coloraes, de fcil aplicao mas de reduzida especificidade e sensibilidade,
so rotineiramente utilizadas em Anatomia, como a colorao Verde Iodo - Carmim Aluminado,
Azul de Astra - Safranina e Azul de Metileno - Vermelho de Rutnio que permitem distinguir paredes
celulares lenhificadas, suberificadas ou cutinizadas de paredes pecto-celulsicas. Para alm
destas coloraes, outras como o Azul de Metileno - Azur A-Safranina, a Toluidina ou o
PAS- Toluidina so de igual modo usadas em Anatomia, como coloraes gerais de material
fresco ou includo em parafina ou resina.
Em seces de material fresco deve-se previamente extrair o contedo celular por imerso
prolongada em hipoclorito de sdio, ou utilizar, alternativamente, material extrado e/ou
diafanizado.
Verde Iodo-Carmim Aluminado e Azul de Astra-Safranina
Com o Verde Iodo - Carmim Aluminado as paredes celulares lenhificadas, suberificadas ou
cutinizadas coram de verde enquanto que com o Azul de Astra - Safranina coram de rosa. De igual
modo, as paredes pecto-celulsicas coram de rosa com a primeira colorao e de azul, com a
segunda.
Azul de Metileno - Azur A - Safranina
O Azul de Metileno - Azur A liga- se aos constituintes basfilos dos tecidos, conferindo - lhes
coloraes que variam entre o azul e o prpura, enquanto que a Safranina cora de vermelho as
paredes celulares lenhificadas, suberificadas, cutinizadas ou ricas em esporopolenina.
28
Azul de Toluidina
O Azul de Toluidina um corante que pertence ao mesmo grupo que o Azur A e o Azul de
Metileno (grupo das tiazinas). No mtodo original o corante dissolvido em Tampo Fosfato 0.1 M
pH 6.8, contudo pode ser utilizado outro tampo, sendo apenas crucial manter o pH acima de 4,
uma vez que pHs inferiores a intensidade da colorao vermelha, metacromtica, muito
reduzida.
PAS- Azul de Toluidina
Frequentemente para realar a colorao do PAS, para deteco de polissacridos, pode usarse uma contra-colorao com o Azul de Toluidina (colorao metacromtica)
9. HISTOQUMICA EM SECES SEMIFINAS DE RESINAS EPXI

Dos blocos de material biolgico, includo em resina para realizao de cortes ultrafinos para
microscopia electrnica de transmisso, podem ser feitos cortes mais espessos de 0,5-1m,
seces semifinas, para observao em microscopia ptica. As seces semi finas de resinas
epxi permitem acompanhar, a nvel histolgico, as clulas que se esto a estudar em
microscopia electrnica de transmisso, podendo ser observadas sem colorao em microscopia
de contraste de fase, ou aps colorao, em campo claro.
Na sua maioria, os mtodos utilizados na colorao de seces semi finas derivam dos usados
para colorao de seces de material impregnado em parafina. A colorao e contraste
desejados dependem do material e do tipo de resina utilizada, devendo ser optimizados para cada
caso em particular.
9.1.1. Deteco de hidratos de carbono

cido Peridico - Reagente de Schiff (PAS)
Como referido anteriormente [vide 2.1.1. Reaces ligadas deteco do grupo vic- glicol ou
grupos aparentados], o cido Peridico - Reagente de Schiff (PAS) um corante vulgarmente
utilizado na deteco deste tipo de compostos.
9.1.2. Deteco de lpidos

Negro Sudo B
O Negro Sudo B [vide 4.1.2. Deteco geral de lpidos] um corante de utilizao corrente na
deteco de lpidos.
9.1.3. Deteco de protenas

Azul Brilhante de Comassie
Como referido anteriormente [vide 1.1.2. Colorao de protenas por ligao do corante a
grupos de aminocidos], o Azul Brilhante de Comassie um corante vulgarmente utilizado na
deteco de protenas.
29
II. CITOQUMICA: PRINCPIOS

A Citoqumica em plantas, tal como outras reas da Biologia Vegetal, desenvolveu-se a partir
de metodologias inicialmente propostas e aplicadas a tecidos animais, nomeadamente de
mamferos, incluindo o prprio Homem. Apenas os mtodos desenvolvidos para a caracterizao
da actividade do malato sintetase foram excepo a esta regra. As plantas, devido s suas
caractersticas particulares, apresentam, tambm neste campo de estudo, problemas especficos.
Por exemplo, a parede celular constitui uma barreira penetrao de reagentes, sendo um
problema difcil de ultrapassar em estudos de imunocitoqumica.
O objectivo da citoqumica efectuar, in situ, reaces qumicas especficas, a nvel das
estruturas celulares, de modo a conhecer a sua composio ou a localizar a actividade das
enzimas de determinadas vias metablicas. Este tipo de aproximao introduz vrios problemas,
tcnicos e metodolgicos:
Visualizao: pelo menos um dos produtos finais tem de ser opaco aos electres, i. e., conter
um metal pesado
Resoluo: o produto final opaco tem de ser insolvel, e suficientemente fino para permitir
uma boa localizao ultrastrutural, no podendo difundir do local de reaco (risco de reaces
falsamente positivas)
Acessibilidade: o reagente deve ser suficientemente permevel para ter acesso s estruturas
reactivas
Preservao: as reaces no devem ser agressivas para no haver destruio da
organizao celular.
Os passos fundamentais dum teste citoenzimolgico realizado directamente no material so:
1. Pr-fixao: para preservar a estrutura celular e diminuir a extraco utiliza-se, em geral, o
glutaraldedo, evitando-se normalmente a utilizao do OsO4 devido ao seu forte poder oxidante.
Contudo, preciso no esquecer que os fixadores aldedicos estabelecem ligaes cruzadas,
imobilizando os constituintes proteicos, nomeadamente das enzimas, o que pode induzir
alteraes conformacionais das protenas e diminuio da sua actividade enzimtica. Para alm
disso, outros factores podem igualmente promover, durante a pr-fixao, alteraes no
comportamento das enzimas:
Durao da fixao: algumas enzimas so demasiado sensveis e apenas toleram alguns
minutos de exposio ao fixador. Na maioria dos casos a fixao no excede 1-2h a baixa
temperatura, sendo conveniente que decorra no mais curto perodo de tempo. Para tornar mais
rpida a penetrao do fixador utilizam-se muitas vezes misturas de de glutaraldedo e
paraformaldedo e permeabilizantes (DMSO), diminuindo-se concomitantemente a espessura do
bloco.
Concentrao do fixador: o glutaraldedo pode ser usado numa gama de concentraes que
varia entre 0.5%-6.0%, sendo a de 1% a mais utilizada, atendendo que as altas concentraes
destroem a actividade enzimtica por excesso de ligaes, e as baixas preservam mal a estrutura
celular.
Temperatura: a pr-fixao decorre normalmente a baixa temperatura. Embora as
temperaturas elevadas aumentem a velocidade de penetrao do fixador e a velocidade das
reaces entre este e as enzimas, promovem tambm a autlise celular e uma maior extraco de
compostos.
pH: o pH utilizado normalmente entre 7.0-7.3, mas depende da espcie e da enzima a
estudar, do fixador e do tampo utilizados.
Tampo: a escolha do tampo depende do fixador, da enzima que se pretende estudar e da
durao da pr-fixao. Com os fixadores aldedicos no aconselhvel a utilizao de tampes
30
com grupos amina, j que h reaco entre o tampo e o fixador. No caso da fosfatase
desaconselha-se a utilizao do Tampo Fosfato, por ser o fosfato o produto de reaco
catalizado por aquela enzima. Este tampo tambm no deve ser usado quando se adiciona
Cl2Ca ao meio, porque se forma fosfato de clcio que precipita. Os tampes mais utilizados so o
Pipes e o Cacodilato.
2. Lavagem: para retirar o excesso de fixador e evitar os precipitados que se podem formar no
processamento ulterior, utiliza-se normalmente o tampo que serviu de veculo ao fixador.
3. Incubao: com a incubao promove-se a reaco catalisada pela enzima, fornecendo o
substracto apropriado. O produto de reaco capturado em seguida com a formao de
precipitados, geralmente electrodensos ou osmifilos. Vrios factores podem influenciar o correcto
desenrolar deste passo:
Temperatura: as baixas temperaturas diminuem a actividade enzimtica tornando-a insuficiente
para ser detectada. Por este motivo a temperatura mais utilizada prxima da temperatura
ambiente.
pH: o pH deve ser prximo do pH ptimo da enzima a detectar. Por vezes utiliza-se um pH
inferior ou superior, de molde a diminuir a difuso do produto no precipitado. Apesar disso,
podem surgir problemas como a desnaturao da enzima, solubilizao do precipitado ou
actividade de outras enzimas que do origem ao mesmo produto.
Tampo: geralmente os produtos de hidrlise so cidos pelo que necessrio o uso de um
tampo para evitar a inactivao da enzima por desnaturao. Ao seleccionar o tampo h de ter
em conta que alguns inibem a actividade enzimtica, por exemplo, o malato forma quelados com
ies de metais pesados.
Substracto: a concentrao de substracto deve ser tal que no interfira com a cintica
enzimtica (inibio, combinao com o agente de captura).
Controlos: um teste enzimtico s tem validade quando acompanhado de controlos
adequados, que se obtm quer por utilizao de inibidores especficos, por omisso do substracto
ou por inactivao das enzimas por aquecimento. Os mtodos de extraco, quer qumicos, quer
enzimticos, aumentam a possibilidade duma localizao correcta e diminuem o nmero de falsas
reaces positivas.
Para alm dos factores condicionantes de uma correcta incubao, existe ainda a possibilidade
de ocorrerem artefactos:
Por difuso do produto de reaco: devido baixa velocidade de precipitao, ou por baixa
concentrao do reagente de captura, por ocorrer uma hidrlise no enzimtica do substracto, ou
ainda por o produto de reaco se formar em concentraes tais que inibe a enzima ou se liga ao
substracto.
Por penetrao lenta dos agentes de captura.
4. Lavagem: aps a incubao procede-se a vrias lavagens para eliminar o excesso do meio
de incubao, de forma a evitar a formao de precipitados no especficos entre os componentes
do meio de incubao (substracto e agente de captura) e o fixador utilizado na ps-fixao.
5. Ps-fixao: como na maioria dos casos a pr-fixao de curta durao, torna-se
necessria uma ps-fixao para completar a estabilizao da ultrastrutura e da marcao
citoqumica.
6. Lavagem, desidratao, impregnao e seccionamento: semelhante ao do processamento
de material para microscopia electrnica de transmisso. O seccionamento muitas vezes difcil
devido dureza dos precipitados formados, o que leva obteno de cortes vibrados e faa com
as facas tenham curta durao.
Referimo-nos, at agora, a reaces citoqumicas efectuadas directamente no material, em que
o espcime tratado antes ou depois da fixao aldedica e se evita a utilizao do OsO4. Uma
31
das grandes limitaes desta metodologia a falta de proteco do material aquando da

incubao, a outra, o risco de deslocao, durante a desidratao e incluso, dos produtos de
reaco, e a sua possvel adsoro a locais diferentes dos de formao. Por estes motivos, a
citoqumica sobre cortes colocados em grelhas muitas vezes preferida. A barreira principal neste
caso a natureza hidrfoba das resinas, que diminuem a acessibilidade dos reagentes s
estruturas celulares. Este bice pode ser reduzido, incluindo o material em resinas hidrfilas ou
utilizando criotcnicas.
As tcnicas citoqumicas em grelha no requerem equipamento especial, a no ser a utilizao
de grelhas de ouro para recolher os cortes ou de uma ansa para transferi-los de recipiente para
recipiente de acordo com o mtodo que se est a usar.
A gama de deteces citoqumicas passveis de serem actualmente aplicadas em microscopia
electrnica de transmisso extremamente variada.
1. DETECO CITOQUMICA DE PROTENAS

Os mtodos para a deteco citoqumica de protenas so, em geral, pouco especficos. Dos
diversos mtodos propostos, apenas trs revelam alguma selectividade.
1.1. MTODOS DE CARACTERIZAO GERAL

O mtodo para a deteco de protenas, por via indirecta, utilizando a acrolena como fixador,
foi inicialmente desenvolvido para microscopia ptica e ulteriormente adaptado microscopia
electrnica. Como todos os aldedos ,-insaturados, a acrolena susceptvel de sofrer uma
reaco de adio nuclefila sobre o tomo de carbono etilnico-, em vez do carbono carbonlico
(Fig. 31). O grupo aldedo deixado livre, pode ento ser revelado, com uma soluo de nitrato de
prata amoniacal, directamente sobre os cortes montados em grelha.
R
C
O
O
N
H
NH2
R
N-Terminal da protena
H2C
O
C
Acrolena
O
N
H
H
N
C
R
Fig. 31
Em termos de especificidade, este teste no deixa dvidas quanto possibilidade das

protenas reagirem com a acrolena, atravs dos grupos, tiol, amina, imidazol ou fenol, e serem
detectadas em microscopia electrnica. No entanto, quer os fosfolpidos, com grupos amnicos
livres, quer os polissacridos, com acares aminados, quer ainda outros compostos nuclefilos,
podem reagir com o fixador e serem fonte de falsas localizaes positivas.
O segundo mtodo para a caracterizao geral de protenas, em microscopia electrnica,
utiliza o cido fosfotngstico, a pH cido (pH 4,0-5,0). Nestas condies, a contrastao parece
dever-se ligao dos polianinicos do fosfotungstato aos grupos amnicos das protenas,
carregados positivamente. Este mecanismo de reaco hipottico apoiado pela ausncia de
contrastao em material previamente acetilado ou sujeito a digesto enzimtica. Em todo o caso,
a ausncia de marcao em material acetilado no pode constituir prova da natureza proteica das
estruturas reactivas, porquanto a acetilao uma reaco que bloqueia todos os grupos
amnicos, independentemente de estarem ligados, ou no, a protenas.
32
1.2. MTODOS DE CARACTERIZAO DE GRUPO

Vrias tentativas tm sido feitas no sentido de detectar, citoquimicamente, o grupo tiol dos
resduos da cistena. No entanto, nenhum mtodo de aplicao geral foi at agora desenvolvido.
Esta dificuldade parece dever-se ao facto de o grupo tiol se encontrar em pequena concentrao
em muitas protenas e, alm disso, poder ser mascarado, quer pelo fixador, quer pelos
componentes da resina de incluso.
Dos diversos mtodos propostos, o que utiliza o complexo de metenamina de prata, o que d
melhores resultados. Embora se obtenham depsitos electrodensos, de prata reduzida, em
estruturas celulares ricas em cistena, no possvel excluir a hiptese da reaco se dever,
tambm, ao grupo dissulfeto da cistina. Com efeito, a alquilao com iodoacetato, reagente que
bloqueia o grupo tiol, apenas reduz parcialmente a reaco. Por outro lado, a reduo das
ligaes dissulfeto da cistina, com benzilmercaptano, seguida de alquilao com iodoacetato,
elimina por completo a formao de depsitos electrodensos.
O mtodo da metenamina de prata pode ser considerado especfico para a deteco
citoqumica de protenas ricas em enxofre, sempre que a formao dos depsitos electrodensos
seja inibida por reaces de reduo e alquilao e, desde que se assegure, que no resultam da
revelao dos grupos carbonilo (aldedo), introduzidos pela fixao, ou da quelao dos ies de
prata, por compostos de natureza qumica diversa.
Regressiva
Este mtodo permite distinguir zonas com desoxirribonucleoprotenas (DNP) de zonas com
ribonucleoprotenas (RNP). Embora no se conhea em pormenor o mecanismo desta
contrastao, sabe-se que o urnio ligado s RNP menos susceptvel de extraco pelo EDTA
do que o ligado s DNP.
Deteco da actividade das fosfatases
As fosfatases constituem um vasto grupo de enzimas que tm em comum a capacidade de
hidrolizar uma grande diversidade de steres fosfricos. Este mtodo baseia-se na formao de
precipitados insolveis, resultantes da reaco de caties metlicos presentes no meio de
incubao (chumbo, clcio e crio) com os ios fosfato libertados, por hidrlise enzimtica, dos
vrios fosfatos orgnicos que servem de substracto.
Deteco da actividade de oxidases
A 3,3'-diaminobenzidina (DAB) utilizada como reagente para a deteco inframicroscpica
das oxidases. O mtodo baseia-se na formao de um composto insolvel, por polimerizao
oxidativa e consequente ciclizao, resultante da actividade da enzima. Este composto, em
presena de OsO4 origina um produto electrodenso.
Deteco da actividade da celulase
As celulases so complexos multienzimticos que hidrolizam os glucanos com ligaes (14).
Este mtodo baseia-se na reduo dos sais de cobre, pelos acares redutores libertados pela
aco das enzimas, o que origina um precipitado electrodenso de xido de cobre.
33
2. DETECO CITOQUMICA DE HIDRATOS DE CARBONO

2.1. MTODOS DE CARACTERIZAO GERAL
Deteco de Polissacridos (PATAg)
Diversos mtodos tm sido sugeridos para a deteco inframicroscpica de glcidos. De entre
eles, o teste PATAg (cido peridico /tiosemicarbazida ou tiocarbohidrazida /protenato de prata),
dos mais utilizados para a caracterizao geral de oligo- e polissacridos. Este teste, que
efectuado directamente sobre seces ultrafinas, uma adaptao, para microscopia electrnica,
do teste clssico PAS e baseia-se na deteco, pelo protenato de prata, da tiosemicarbazida
(TSC) ou da tiocarbohidrazida (TCH) ligada aos carbonilos, formados pela oxidao dos vic-glicis
dos resduos monossacardicos (Fig. 32).
HO
O O
H
HO
O O
H
S
O
+ n H2N
N
H
NH2
N
H
Tiocarbohidrazida
Resduo de polissacrido oxidado
NH2
H2N
HN
NH
S
HO
HN
N O
H
S
NH
N O
HO
N
HN
H2N
NH2
HN
HN
HO
N O
H
Ag
HN
S
Ag
NH
NH2
NH
O
N
HO
HN
NH
S
NH
S
H2N
NH
S
NH
HN
NH2
H2N
Fig.32
A prata reduzida permite visualizar os locais de ligao da tiocarbohidrazida aos carbonilos dos
polissacridos oxidados. Este teste tido como muito especfico para as substncias PASpositivas. No entanto, podem verificar-se falsas localizaes positivas, pela reaco da TSC ou da
TCH, quer com metais pesados ligados s estruturas celulares, quer com carbonilos endgenos
(aldedos ou cetonas) ou introduzidos durante a fixao. Artefactos desta natureza podem ainda
dever-se presena de protenas ricas em cistina e/ou cistena (o grupo tiol reduz a prata do
protenato de prata), adsoro no especfica da prata ou presena de tetrxido de smio.
importante que as seces no tenham quaisquer vestgios deste agente fixador, pelo que se
34
aconselha a utilizao de material fixado s com glutaraldedo. Caso se tenha utilizado uma dupla
fixao o smio reduzido dever ser convenientemente retirado com perxido de hidrognio ou
cido peridico.
Apesar do grande nmero de artefactos que podero causar falsas localizaes positivas, este
teste de grande confiana e sensibilidade quando acompanhado de controlos adequados. Os
aldedos endgenos e os introduzidos pela fixao devem ser bloqueados ou, de preferncia,
reduzidos antes da oxidao com cido peridico. Tambm os grupos tiol podem ser alquilados,
antes da oxidao com cido peridico. Para alm disso, a prata adsorvida, uma vez que no se
encontra na sua forma metlica, pode ser retirada das seces com tiossulfato de sdio. Revestese igualmente de grande importncia o bloqueio ou a reduo dos aldedos formados por
oxidao dos vic-glicis, para que se possa avaliar a especificidade geral desta reaco. De uma
forma geral, todas as consideraes feitas a propsito do teste PAS so vlidas tambm para o
teste PATAg.
2.2. MTODOS DE CARACTERIZAO DIFERENCIAL

Os polissacridos cidos podem ser tambm detectados em microscopia electrnica utilizando,
por exemplo, Ferro Coloidal. Neste caso, o teste pode ser efectuado, quer en bloc aps a
fixao, quer directamente sobre as seces recolhidas na grelha. O produto de reaco
electrodenso parece resultar da interaco inica das partculas de ferro coloidal, carregadas
positivamente, com os grupos aninicos dos polissacridos cidos (Fig. 33). Os resultados obtidos
so consistentes e reprodutveis e o teste parece ser altamente especfico para os polissacridos
cidos, quando efectuado a pH 1,2-2,4.
Fe3+
-
O C
O
HO
Fe3+
-
O
O C
OH O
O C
OH O
O C
OH O
HO
HO
O-
Resduo polissacardico cido
O
OH
HO
Fig. 33
Em alternativa pode utilizar-se o Vermelho de Rutnio, um composto catinico hexavalente,

usado em microscopia ptica na deteco de pectinas. Na variante para microscopia electrnica,
o Vermelho de Rutnio utilizado na ps-fixao, em combinao com o OsO4. Embora no se
conhea o mecanismo de reaco, sabe-se, no entanto, que a formao do produto electrodenso
depende da presena do OsO4 e influenciada pelo tipo de tampo utilizado na fixao.
Ensaios in vitro revelaram que o Vermelho de Rutnio, na ausncia do OsO4, reage com
substncias cidas de natureza qumica muito diversa. Estes resultados, embora sugerindo falta
de especificidade, no reflectem a realidade citoqumica. Com efeito, quando utilizado em ensaios
citoqumicos, a pH cido, o Vermelho de Rutnio muito mais selectivo.
3. DETECO CITOQUMICA DE LPIDOS

No existem muitos mtodos para a deteco citoqumica de lpidos e, os que existem, so de
utilidade muito limitada. Apesar da baixa selectividade, a fixao com OsO4 muito utilizado na
caracterizao inframicroscpica dos lpidos. As objeces, feitas anteriormente, ao uso deste
reagente, na deteco histoqumica de ligaes duplas, so tambm vlidas para este caso. Os
35
resultados falsamente negativos, que frequentemente se obtm em material includo em resinas

epoxdicas, podem dever-se extraco de lpidos durante a desidratao e impregnao. Este
problema pode, no entanto, ser ultrapassado pela utilizao de resinas hidrossolveis. O emprego
destas resinas permite caracterizar vrios grupos de lpidos, com base na sua solubilidade
diferencial em solventes orgnicos.
Para a deteco de esteris, no esterificados, usa-se um mtodo que considerado, por
muitos autores, como especfico. Baseia-se na formao de complexos insolveis entre os
esteris e a digitonina, adicionada ao fixador. Embora o colesterol e o sitosterol sejam
convenientemente preservados nas clulas, outro tanto no se verifica com vrios esteris
vegetais que, dificilmente, formam digitonitos. De um modo geral, a preservao celular boa,
embora possam ocorrer algumas espculas, ligadas s membranas.
36
III. HISTOQUMICA: PROTOCOLOS
IMPORTANTE:
Observar sempre as seces antes de terem sido submetidas a qualquer teste
histoqumico.
Nota: Vide em Apndice o modo de preparao dos reagentes assinalados com *
1. DETECO DE PROTENAS
1.1. EM LUZ VISVEL
1.1.1. Colorao de tipos particulares de aminocidos
Reaco de Sakaguchi para a arginina (McLeish e Sherrat 1958)
1. Soluo de - Naftol - Hipoclorito*
2. Lavagem rpida em H20
3. Soluo de Piridina - Clorofrmio*
15 min
2 min
Controlo Positivo: Aplicar algumas gotas duma soluo de protenas sobre uma rodela de papel
de filtro, deixar secar e tratar como o material vegetal.
Controlo Negativo: Cortes previamente submetidos aco de uma soluo de Anidrido Actico
10 % em Piridina durante 2 a 4 h. Lavar em gua antes de efectuar o teste.
Resultado: As protenas coram de vermelho - alaranjado. Observar imediatamente porque a
colorao tem tendncia a desaparecer.
1.1.2. Colorao de protenas por ligao do corante a grupos de aminocidos

a) Corantes que formam ligaes covalentes
Reaco Ninidrina-Schiff (Yasuma e Ichikawa 1953)
1. Soluo de Ninidrina a 0.5 % em Etanol, a 37 C
2. Lavagem em H20
3. Reagente de Schiff*, temperatura ambiente
Controlo Positivo e Negativo: Idnticos ao teste anterior.
Resultado: As protenas coram de vermelho.
37
durante toda a noite (16 - 20 h)

5 min
30 min
Azul Mercrico de Bromofenol (Mazia et al. 1953)

1. Soluo de Azul de Bromofenol*
2. Soluo de cido Actico a 0.5 %
4. Tampo Fosfato de Sdio 0.1 M pH 7.0
10 min
3x5min
3 min
Controlo Positivo e Negativo: Idntico ao referido em 1.1.1. Colorao de tipos particulares de

aminocidos.
Resultado: As protenas coram de azul claro.
Azul Brilhante de Comassie (Fischer 1968)

1. Soluo de Azul de Comassie R250 a 0,25% em cido Actico a 7%
10 min temperatura ambiente ou a 60C
2. Soluo de cido Actico a 7 %
3 x5 min
Controlo Positivo e Negativo: Idntico ao referido em 1.1.1. Colorao de tipos particulares de
aminocidos.
Resultado: As protenas coram de azul.
1.2. EM UV
a) Determinao da viabilidade celular
Diacetato de Fluorescena (Widholm 1972, Larkin 1976)
1. Montar as seces de material numa gota de gua.
2. Adicionar uma gota de Diacetato de Fluorescena*
5 min
Resultado: As clulas viveis apresentam uma fluorescncia secundria, normalmente amarela e s verdeada.
38
2. DETECO DE HIDRATOS DE CARBONO

2.1. EM LUZ VISVEL
2.1.1. Reaces ligadas deteco do grupo vic-glicol ou grupos aparentados
cido peridico - Reagente de Schiff [PAS] (McManus 1948)
1. Soluo de Tetrahidreto Boreto de Sdio a 1 % (recm preparada)
2. Soluo de cido Peridico a 1 %
4. Reagente de Schiff
5. Lavagem em soluo de Metabissulfito de Sdio a 0.5 %*
6. Lavagem em H20
30 min
10 min
15-30 min
3 x2 min
Controlo Positivo: Aplicar algumas gotas duma soluo de polissacridos sobre uma rodela de
papel de filtro, deixar secar, e tratar como o material vegetal.
Controlo Negativo: Aplicar o mtodo, omitindo o tratamento com cido peridico.
Resultado: Os polissacridos coram de rosa. O amido e os polissacridos da parede celular
coram intensamente de rosa assim como alguns fenis. A celulose e a calose no coram.
2.1.2. Caracterizao diferencial dos hidratos de carbono

Azul de Alciano (Pearse 1980)
Este teste igualmente utilizado na Deteco de Mucopolissacridos cidos.
1. Soluo de Azul de Alciano 8 GX a 1% em cido Actico a 3% pH 2,5
2. Lavagem em H20
30min
5min
Controlo Positivo: Idntico ao anterior.

Resultado: Os mucopolissacridos cidos das paredes celulares ou das secrees coram de
azul-turquesa.
b) Amido
Lugol (Jensen 1940)
1. Soluo de Lugol (soluo de Iodo a 0,5 % adicionada de Iodeto de Potssio a 1%) 5 - 10 min
2. Lavagem em H2O
Controlo Positivo: Idntico ao referido em 2.1.1. Reaces ligadas deteco do grupo vic- glicol
ou grupos aparentados.
Resultado: O amido cora de roxo ou de castanho
39
c) Pectinas
Vermelho de Rutnio (Johansen 1940)
1. Soluo de Vermelho de Rutnio a 1000 p.p.m. (recm preparado)
2. Lavagem em H20
5 - 10 min
Resultado: As pectinas coram intensamente de rosa.
2.2. EM UV
Laranja de Acridina (Armstrong 1956)
1. Lavagem em Soluo Salina de Tampo Fosfato (PBS)*
2. Soluo de Laranja de Acridina *
3. Lavagem em PBS
4. Montagem em PBS
2min
15 min
2 x2 min
Resultado: Para detectar de forma diferenciada (metacromasia), cidos nucleicos e incluses
virais. Fluorescncia verde a amarelo DNA (cromatina e cromossomas); laranja a vermelho
RNA (citoplasma, nuclolo) e polissacridos cidos.
cido Peridico/Acriflavina-Pseudo Schiff [F-PAS] (Clark 1981)

1. Soluo de Tetrahidreto Boreto de Sdio a 1 % (recm preparado)
2. Soluo de cido Peridico 1%
4. Pseudo-Schiff* saturado com Dixido de Enxofre
5. Lavagem em H20
30 min
10 min
15 - 30 min
Controlo Negativo: Aplicar o mtodo, omitindo o tratamento com cido peridico.
Resultado: Os polissacridos fluorescem de amarelo a laranja.
40
b) -Glucanos
Calcoflor (Hughes e McCully 1975)
1. Soluo de Calcoflor (Calcofluor White MR2) a 0,01 % (recm preparada)
5-10 min
Resultado: A celulose, os polissacridos carboxilados, os -1,3 e os -1,4 glucanos, as pectinas e
alguns polissacridos das mucilagens fluorescem de amarelo - esverdeado a azul plido.
c) Calose
Azul de Anilina (Smith e McCully 1978a, 1978b)
1. Soluo de Azul de Anilina a 0,05 % em Tampo Fosfato de Potssio 0,06 M pH 8
(recm preparado ou armazenado no frigorfico)
5 min
Resultado: A calose fluoresce intensamente de amarelo plido.
3. DETECO DE MUCILAGENS E MUCOPOLISSACRIDOS CIDOS

3.1. EM LUZ VISVEL
a) Mucilagens
cido Tnico / Cloreto de Ferro (Pizzolato e Lillie 1973)
1. Soluo de cido Tnico a 5%
2. Lavagem em H20
3. Soluo de Tricloreto de Ferro a 3%
10min
1min
Controlo Positivo: Aplicar algumas gotas duma soluo de polissacridos sobre uma rodela de
papel de filtro, deixar secar, e tratar como o material vegetal.
Controlo Negativo: Cortes tratados apenas com cido Tnico ou com Tricloreto de Ferro.
Resultado: As mucilagens coram de negro.
41
Vermelho de Rutnio (Gregory e Baas 1989)

1. Soluo de Vermelho de Rutnio*
2. Lavagem em H20
10 min
Controlo Positivo: Idntico ao referido em 3. Deteco de Mucilagens e Mucopolissacridos

cidos.
Resultado: As mucilagens vegetais coram de rosa brilhante
b) Mucopolissacridos cidos
Azul de Alciano (Pearse 1980)
1. Soluo de Azul Alciano 8 GX a 1 % em cido Actico a 3 % a pH 2,5
2. Lavagem em H20
30 min
5min
Controlo Positivo: Idntico ao referido em 3. Deteco de Mucilagens e Mucopolissacridos

cidos.
Resultado: Os mucopolissacridos cidos das paredes celulares ou das secrees coram de
azul-turquesa.
4. DETECO DE LPIDOS
4.1. EM LUZ VISVEL
4.1.2. Deteco geral de lpidos
Negro Sudo B ou Vermelho Sudo IV (Pearse 1980)
1. Soluo saturada (0.3 %) de Negro Sudo B ou de Vermelho Sudo IV em Etanol 70 %,
(filtrar antes de usar)
5-15 min
2. Lavagem rpida em Etanol 70 %
Controlo Positivo: Aplicar, numa rodela de papel de filtro, padres dissolvidos em clorofrmio e
secretado da planta. Tratar como o tecido vegetal.
Controlo Negativo: Cortes previamente tratados em metanol / clorofrmio / H20 / HCl (66 : 33 : 4 : 1)
durante 1 h, temperatura ambiente. Em alguns casos pode utilizar - se acetona anidra, 20 min
a 1 h, a 4 C.
Resultado: Os lpidos coram de azul negro com o Negro Sudo B e vermelho com o Vermelho
Sudo IV.
42
Vermelho Sudo 7B (Brundrett et al. 1991)

1. Vermelho Sudo 7B a 0.1% em Polietilenoglicol 400 e Glicerol a 90 % (v/v)
60 min
Controlo Positivo e Negativo: Idntico ao anterior.

Resultado: Os lpidos coram de carmim.
4.1.3. Deteco diferencial de lpidos

a) Lpidos cidos e neutros
Sulfato Azul do Nilo (Cain 1947, Ganter e Jolls 1969, 1970)
1. Soluo de Sulfato de Azul do Nilo 1 %*, a 37 C
2. Soluo de cido Actico a 1 %
5-30 min
1/2 - 2 min a 60C
Controlo Positivo e Negativo: Idntico ao referido em 4.1.2. Deteco geral de lpidos.

Resultado: Os lpidos neutros coram de rosa e os lpidos cidos coram de azul.
b) Lpidos insaturados
Tetrxido de smio (Ganter e Jolls 1969, 1970)
1. Soluo de Tetrxido de smio a 0.1 %
2. Lavagem em H20
60 min (na hote)

Resultado: Os lpidos insaturados coram de negro.
c) cidos gordos
Acetato de Cobre / cido Rubenico (Ganter e Jolls 1969, 1970)
1. Soluo de Acetato de Cobre a 0.05%
2. Soluo de Na2EDTA a 0.1% em Tampo Fosfato de Sdio 0.1M pH 7
3. Lavagem em H20
4. Soluo de cido Rubenico a 0.1% em Etanol a 70% (recm preparada)
5. Lavagem em Etanol a 70%
Resultado: Os cidos gordos coram de verde-escuro.
43
1-3h
5-15min
10min
30min
5min
4.2. EM UV
Vermelho Neutro (Kirk 1975)
1. Soluo de Vermelho Neutro a 0.1% em Tampo Fosfato de Sdio a 0.1%, pH 6.5 10-20min
Resultado: Fluorescncia amarela ou azul-esverdeada, dependendo da composio dos
diferentes tipos de lpidos.
5. DETECO DE TERPENIDES
5.1. EM LUZ VISVEL
5.1.1. Deteco diferencial de terpenides
a) Essncias e cidos resnicos
Reagente de Nadi (David e Carde 1964)
1. Reagente de Nadi*, temperatura ambiente, no escuro
2. Lavagem em Tampo Fosfato de Sdio 0.1 M pH 7.2
60 - 90 min
2 min

Resultados: As essncias coram de azul e os cidos resnicos coram de vermelho escuro. As
misturas de leos essenciais e cidos resnicos so evidenciadas por uma colorao que vai
de violeta a prpura, de acordo com a predominncia de um ou de outro componente.
b) Esterides
Tricloreto de Antimnio (Hardman e Sofowora 1972, Mace et al. 1974)
1. Montar directamente os cortes numa soluo saturada de Tricloreto de Antimnio em cido
Perclrico 60 %
2. Observar ao fim de 3 a 10 min, em luz visvel e ultravioleta.
Controlo Positivo: Idntico ao referido em 4.1.2. Deteco geral de lpidos.
Controlo Negativo: Cortes previamente tratados com uma soluo de Tetrahidreto Boreto de
Sdio a 1 % (recm preparado) durante 10 min, seguido de lavagem em H20 (3 x15 min).
Realizar tambm um controlo utilizando apenas cido Perclrico.
Resultado: Os esterides coram de vermelho-alaranjado em luz visvel e de amarelo a prpura
em luz ultravioleta.
44
c) Terpenides com grupo carbonilo

2,4-Dinitrofenilhidrazina (Ganter e Jolls 1969, 1970)
1. Soluo saturada de 2,4 - Dinitrofenilhidrazina em HCl 2 N, a 25 C
10 min

Alternativamente aplicar o mtodo a cortes previamente tratados com uma soluo de
Tetrahidreto Boreto de Sdio a 1 % (recm preparada) durante 10 min e ulteriormente lavados
em gua (3 x15 min). Realizar tambm um controlo utilizando apenas o cido Clordrico 2N,
durante 1 min.
Resultado: Os terpenides coram de vermelho-alaranjado.
d) Lactonas sesquiterpnicas
cido Sulfrico (Geissmen e Griffin 1971)
1. Montar os cortes directamente em cido Sulfrico e observar imediatamente
Resultado: As lactonas sesquiterpnicas coram de vermelho-acastanhado.
Reaco Modificada de Abraham (Caniato et al. 1989)

1. Soluo Metanlica de Tiocianato Ferroso* (recm preparada)
fechado
15-20 min, em recipiente
Controlos Positivo e Negativo: Aplicar o mtodo a seces previamente tratadas com

Clorofrmio durante 20 min.
Resultado: As lactonas sesquiterpnicas coram de vermelho-acastanhado.
5.2. EM LUZ VISVEL E EM UV

Oil Red O ou Oil Blue N (Pearse 1968 modificado por Jayabalan e Shah 1986)
1. Soluo saturada de Oil Red O ou de Oil Blue N em cido Frmico a 90%
3 - 5 min
2. Lavagem em H20
3. Montagem em glicerina para luz visvel ou em glicerina a 50% para fluorescncia.
Resultado: As partculas de borracha coram de vermelho em luz visvel e fluorescem de vermelho
plido em UV.
45
5.3. EM UV
Cloreto de Dansil (Jayabalan e Shah 1986)
1. Para extraco de resinas
Mistura de Acetona/gua 88:12 (v/v)
3 x15min a 55C
2. Para extraco de lpidos
Mistura de Clorofrmio/Metanol 1/1 (v/v)
30 min
3. Lavagem em Hidrxido de Sdio a 5% em Etanol a 95% durante 30 s com agitao.
4. Lavagem em cido Clordrico 2N
2 x3 min
5. Lavagem em H20
6. Para extraco de protenas
Pepsina (pH 6)
6h
7. Para remover as protenas precipitadas
Lavagem rpida, com agitao, em cido tricloroactico a 10%
8. Etanol a 70% durante 5min
9. Lavagem em gua
10. Lavagem em Bicarbonato de Sdio a 1% (pH 8 9)
11. Cloreto de Dansil (1mg/4ml de acetona)
2 - 3 min
12. Lavagem em H20
13. Montagem em Bicarbonato de Ssdio a 1% (para evitar o background durante a fotografia).
Resultado: As partculas de borracha fluorescem de branco.
Oil Red O/Cloreto de Dansil (Jayabalan e Shah 1986)

1. A reaco realiza-se em seces em que as resinas, os lpidos e as protenas foram
extrados de modo idntico ao do teste anterior.
2. Soluo saturada de Oil Red O em cido Frmico a 90%
3 - 5 min
3. Cloreto de Dansil (1 mg /4 ml de Isopropanol a 60%)
2 - 3 min
4. Lavagem em H20
5. Montagem em soluo de Bicarbonato de Sdio a 1%
Resultado: As partculas de borracha fluorescem de branco.
46
6. DETECO DE FENIS
6.1. EM LUZ VISVEL
6.1.1. Caracterizao geral de fenis
Cloreto de Ferro III (Johansen 1940)
1. Soluo de Tricloreto de Ferro a 10 %
15 - 30 min
Controlo Positivo: Aplicar, numa rodela de papel de filtro, padres dissolvidos em metanol e
secretado da planta. Tratar como o tecido vegetal.
Resultado: Os fenis coram de verde intenso, prpura, azul ou negro.
Dicromato de Potssio (Gabe 1968)

1. Soluo de Dicromato de Potssio a 10 %
15 - 30 min
Controlo Positivo: Idntico ao anterior.

Resultado: Os fenis coram de castanho avermelhado a castanho-escuro.
Diazoreaco (Ganter e Jolls 1969, 1970)

1. Soluo Fast Blue B a 0.1 % em Tampo Veronal 0.1 M pH 7.5 - 8.5 (recm preparado) a 4 C
1 - 2 min
2. Lavagem em HCl a 1 % em Etanol a 70 %
3 x2 min
Controlo Positivo: Idntico ao referido em 6.1.1. Caracterizao geral de fenis.
Resultado: Os fenis coram de vermelho.
6.1.2. Caracterizao diferencial de fenis

a) Deteco de lenhina
Fluoroglucinol (Johansen 1940)
1. Soluo de Fluoroglucinol a 1 %
2. Montar em HCl a 50 %
20 min

Resultado: A lenhina cora de vermelho (em particular o monmero lcool coniferlico).
47
b) Deteco de taninos
Vanilina Clordrica (Mace e Howell 1974, Gardner 1975)
1. Vanilina a 0,5 % em cido Clordrico (HCl) a 9 %
2. Montagem em HCl a 9 % (cuidado com os vapores de HCl)
10 min
Controlo Positivo: Idntico ao referido em 6.1.1. Caracterizao geral de fenis. Observar

igualmente seces montadas apenas em HCl a 9%.
Resultado: Os taninos coram de vermelho a castanho.
6.2. EM UV
Os fenis apresentam, em geral, autofluorescncia azul em UV e autoflorescncia amarelaesverdeada, muito intensa, em luz azul.
a) Deteco de flavonides
Aco de Fluorocromos (Charrire-Ladreix 1976)
1. Soluo do fluorocromo*
2. Lavagem rpida no solvente
15 - 30 min

Controlo Negativo: Cortes no submetidos ao tratamento com os fluorocromos. Verificar,
tambm, se a fluorescncia no se deve aos fluorocromos s por si.
Resultado: Os flavonides emitem, em geral, uma fluorescncia secundria amarelo - e s verdeada
em presena dos fuorocromos (Cloreto de Alumnio, Acetato de Magnsio e Acetato Neutro de
Chumbo). As agliconas flavonlicas apresentam uma fluorescncia secundria amarela muito
intensa com o Reagente de Wilson.
7. DETECO DE ALCALIDES
7.1. EM LUZ VISVEL
7.1.1. Caracterizao geral de alcalides
Reagente de Dragendorff (Svendsen e Verpoorte 1983)
1. Reagente de Dragendorff*
2. Passagem numa Soluo de Nitrito de Sdio a 5 %
5 - 10 min
Controlo Positivo: Aplicar, numa rodela de papel de filtro, padres e secretado da planta. Tratar
como o tecido vegetal.
Controlo Negativo: Cortes previamente tratados com cido Tartrico a 5 % em Etanol a 95 %,
durante 48 - 72 h.
Resultado: Os alcalides coram de castanho-avermelhado.
48
Reagente de Dittmar (Furr e Mahlberg 1981)

1. Reagente de Dittmar*
5 - 10 min
Controlo: Idntico ao teste anterior.

Resultado: Os alcalides coram de castanho-avermelhado.
Reagente de Wagner (Furr e Mahlberg 1981)

1. Reagente de Wagner*
5 - 10 min
Controlo Positivo e Negativo: Idntico ao referido em 7.1.1. Caracterizao geral de alcalides.

Resultado: Os alcalides coram de laranja vivo a castanho-avermelhado.
Reagente de Ellram (Furr e Mahlberg 1981)

1. Reagente de Ellram (Soluo de Vanilina a 1% em cido Sulfrico a 40%)
5 - 10 min
Controlo Positivo e Negativo: Idntico ao referido em 7.1.1. Caracterizao geral de alcalides.

Resultado: Os alcalides coram de laranja vivo a castanho-avermelhado.
7.2. EM UV
Autofluorescncia azul: serpentina, quinino, quinidina, cefaleina, emetina, ioimbina, noscapina.
Autofluorescncia azul a violeta (dependendo do tempo de irradiao): cinchonina e a
cinchonidina.
Autofluorescncia amarela: berberina e sanguinarina.
49
8. MTODOS DE COLORAO DUPLA

Verde Iodo-Carmim Aluminado (Mirande 1920, modificado)
1. Hipoclorito de Sdio
2. Lavagem em gua actica 1 %
3. Verde iodo
4. Lavagem em H20
5. Carmim Aluminado
6. Lavagem em H20
30-40 min
2 min
10 seg
1 min
10 min
Resultado: As paredes lenhificadas, suberificadas e cutinizadas coram de verde enquanto que as

pecto-celulsicas coram de vermelho
Azul de Astra-Safranina (Bukatsch 1972, modificado)

1. cido Actico a 5%
2. Lavagem em gua destilada
3. Soluo de Azul de Astra a 1% /Safranina a 1%, 9:1 (v/v)
4. Lavagem em gua destilada
5. Secagem e montagem
1-2min
5-15min
1-2min
Resultado: As paredes lenhificadas, suberificadas e cutinizadas coram de vermelho enquanto que

as pecto-celulsicas coram de azul. Os ncleos coram de vermelho.
Azul de Metileno - Azure A - Safranina (Warmke e Lee 1976)

1. Soluo de Azul de Metileno - Azure A* aquecida a 60C
2. Lavagem em gua corrente
3. Soluo de Safranina* aquecida a 60C
4. Lavagem em gua corrente e depois em gua destilada.
30min a 60C
2min a 60C
Resultado: Celulose (vermelha); cutcula e intina (laranja - avermelhado); exina (azul esverdeado); calose, plastos, mitocndrias e invlucro nuclear (prpura); cromatina e nuclolo
(prpura-escura); nucleoplasma (prpura-clara); citoplasma (prpura - rosa claro).
50
Azul de Toluidina (Feder e O'Brien 1968)

1. Soluo a 0.05 % de Azul de Toluidina
2. Lavagem em gua corrente e depois em gua destilada
3. Secagem e montagem.
5 min a 55 C
Resultado: Paredes do xilema e esclernquima (verde ou azul - esverdeado); paredes do

colnquima e parnquima, (vermelho - prpura); lamela mdia e paredes do floema (vermelho).
A calose e o amido no coram.
9. HISTOQUMICA EM SECES SEMIFINAS DE RESINAS EPXI

9.1.2. Deteco de hidratos de carbono
cido peridico-Reagente de Schiff (PAS) (Feder e O'Brien 1968)
1. Bloqueio dos Aldedos
a. Soluo saturada de Dimedona* (5,5 - dimetilciclohexano - 1,3 - diona)
b. Lavagem em gua corrente
16 a 24 h
20 - 30 min
ou
a. Soluo de Tetrahidreto Boreto de Sdio a 1%
b. Lavagem em gua
2. Soluo de cido Peridico a 1 %
4. Soluo de Reagente de Schiff
5. Soluo de Metabissulfito de Sdio a 0.5 %
3 x 2 min
30 min
1 min
10 min
5-10 min
20-30 min
10 min
Controlo: Omisso do tratamento com o cido Peridico.

Resultado: O amido e alguns polissacridos complexos (especialmente os compostos da lamela
mdia) coram de vermelho. A celulose geralmente no cora.
9.1.3. Deteco de lpidos

Negro Sudo B (Bronner 1975, Parham e Kaustinen 1976)
1. Soluo saturada de Negro Sudo B (filtrar e aquecer a 60 C)
2. Lavagem em Etanol 70 %
3. Lavagem rpida em gua destilada
1- 2 h a 60 C
1 min
Controlo: Observao em microscopia de contraste de fase de cortes no corados.

Resultado: Os lpidos coram de azul a negro e os taninos de castanho alaranjado.
51
9.1.4. Deteco de protenas

Azul Brilhante de Comassie R250 (Fisher 1968)
1. Soluo de Azul Brilhante de Comassie a 1% em cido actico a 7%
2. Diferenciao em cido Actico a 7%
3. Lavagem rpida em gua destilada
Controlo: Observao de seces de material fresco.
Resultado: As protenas coram de azul.
52
3-10 min a 30C
IV. CITOQUMICA: PROTOCOLOS

1. DETECO CITOQUMICA DE PROTENAS
Regressiva (Bernhard, 1968; Bernhard, 1969)
(Mtodo efectuado em seces recolhidas em grelhas de ouro)
1. Soluo de cido Peridico a 2%
30min
2. Soluo de Acetato de Uranilo a 1% em metanol
1min
3. Lavagem em Metanol
4. Lavagem em H20
5. Soluo de cido Etilenodiaminotetractico (EDTA) 0.2M, pH 7.0
30-90min
6. Lavagem em H20
7. Soluo de Citrato de Chumbo a 0.4%
5min
(na preparao da soluo de citrato de chumbo, por cada 100ml de H20 adiciona-se 1ml de
NaOH 10N de forma a dissolver o Citrato de Chumbo)
8. Lavagem em H20
Controlo: Omisso do tratamento com EDTA (ponto 5).
Deteco da actividade fosfatsica cida (Hulstaert et al. 1983, modificado)

(Mtodo efectuado em bloco)
1. Fixao em Paraformaldedo 2 % e Glutaraldedo 2.5 % em Tampo PIPES 0.05 M pH 7.4
20 min a 4 C
2. Lavagens no tampo da mistura fixadora
3x10min
3. Pr-incubao*
durante a noite a 4C
4. Incubao*
1h30min a 37C
5. Lavagem em Tampo PIPES 0.05 M pH 6.0.
6. Fixao em Paraformaldedo 2 % e Glutaraldedo 2.5 % em Tampo PIPES 0.05 M pH 7.4
2 h temperatura ambiente
3 x10min
8. Ps-fixao em OsO4 1 % em Tampo PIPES 0.05 M pH 6.8
9. Desidratao, impregnao e incluso.
Controlos: Incubao do material no meio sem -Glicerofosfato de Na (substracto) e incubao
em meio completo na presena de Fluoreto de Sdio 0,01M (inibidor).
53
Deteco da actividade adenosina trifosfatase (Wachstein e Meisel 1957, modificado)

1. Fixao em Paraformaldedo 2% e Glutaraldedo 2.5% em Tampo Cacodilato 0,02M pH 7.2
1h a 4C
2. Lavagens em Tampo Tris-Maleato 0,05M pH 7,2
3x20min
3. Incubao*
2h a 22C
5. Lavagens em Tampo Cacodilato 0,02M pH 7,2
6. Ps-fixao em OsO4 1% em Tampo Cacodilato 0,02M pH 7,2 2h temperatura ambiente
Controlos: Incubao do material no meio sem Nitrato de Chumbo (substracto) e incubao em
meio completo na presena de Fluoreto de Sdio 0,01M (inibidor).
Deteco da actividade inosina difosfatase (Novikoff e Goldfisher 1961, modificado)

1. Fixao em Paraformaldedo 2 % e Glutaraldedo 2.5 % em Tampo Cacodilato 0,02M pH 7.2
1h a 4 C
3x20min
3. Incubao*
2h a 22C
6. Ps-fixao em OsO4 1% em Tampo Cacodilato 0,02M pH 7,2 2 h temperatura ambiente
7. Desidratao, impregnao e incluso
54
Deteco da actividade tiamina pirofosfatase (Goldfisher et al. 1971, modificado)

1. Fixao em Paraformaldedo 2 % e Glutaraldedo 2.5 % em Tampo Cacodilato 0,02M pH 7.2
1h a 4 C
3x20min
3. Incubao*
2h a 22C
6 Ps-fixao em OsO4 1% em Tampo Acetato-Cacodilato 0,02M pH 7,2
Deteco da actividade peroxidsica da catalase (Silverberg e Sawa, 1973 modificado)

1. Fixao em Paraformaldedo 2 % e Glutaraldedo 2.5 % em Tampo Cacodilato de Sdio
0.1 M pH 7.2
3 x10 min
3. Incubao*, durante 1 h 30 min, a 37 C, no escuro e em agitao permanente
4. Paragem da incubao em gelo fundente e
5. Lavagem em Tampo Glicina / NaOH 0.05 M pH 10
3 x15 min
6. Lavagem em Tampo Cacodilato de Sdio 0.1 M pH 7.2
3 x15 min
5. Ps-fixao em OsO4 1 % em Tampo Cacodilato de Sdio 0.1 M pH 7.2
2h
temperatura
ambiente
Controlos: O controlo efectuado sujeitando o material a pr-incubao numa soluo de
aminotriazole (3-amino-1,2,4-triazole) 0.02M, em Tampo Glicina/NaOH 0.05M pH 10, sem
perxido de hidrognio, durante 30min, temperatura ambiente, e ulterior incubao no meio
completo em presena de 3-amino-1,2,4-triazole 0.02M.
55
Deteco da actividade das peroxidases (Graham e Karnovsky 1966 modificado)

1. Fixao em Glutaraldedo 2.5 % em Tampo Cacodilato de Sdio 0.075 M pH 7.2 3 h a 4 C
3 x10 min
3. Incubao*
90 min a 37 C, no escuro e em agitao permanente
4. Lavagem em Tampo Cacodilato de Sdio 0.075 M pH 7.2
3 x15 min
5. Ps-fixao em OsO4 1 % em Tampo Cacodilato de Sdio 0.075 M pH 7.3
Controlo: O controlo efectuado por omisso do Perxido de Hidrognio do meio de incubao.
Deteco da actividade da celulase (Bal 1974)

1. Fixao em Paraformaldedo/Glutaraldedo (Karnovsky) em Tampo Fosfato de Na 0,02M
pH 7.2
1h a 4C
18h (pelo menos 10 lavagens)
3. Incubao*
5-10min a 22-25C
4. Soluo de Benedict a 70-100 C
5-10min
5. Lavagens em gua destilada
6. Ps-fixao em OsO4 1% em Tampo Fosfato de Na 0,02M pH 7,2
1h temperatura ambiente
Controlo: Incubao do material no meio sem carbometilcelulose (substracto)
Digesto enzimtica por aco de uma pronase (Monneron 1966)

1. Perxido de Hidrognio a 10%
2. Lavagem em H2O bidestilada
3. Soluo de Pronase a 0.5% em Tampo Fosfato de Sdio 0.1M pH 7.4
4. Lavagem cuidadosa em H2O bidestilada
20min
3min
2-6h a 37C
Controlo: Incubao no Tampo desprovido de enzima ou em soluo de pronase inactivada pelo

calor (fervura), durante o mesmo tempo e nas mesmas condies do teste
56
2. DETECO CITOQUMICA DE HIDRATOS DE CARBONO

Deteco de Polissacridos (PATAg) (Thiry, 1967)
1. Soluo de cido Peridico a 1%
2. Lavagens rpidas em H20
3. Soluo de Tiocarbohidrazida a 0.2% em cido Actico a 20%
(centrifugada a 6000g imediatamente antes de usar)
4. Lavagens cuidadosas em soluo de cido Actico a 20%
6. Proteinato de Prata a 1% (s escuras)
30min
2x
6h
3x
2x
30min
3x
Controlo: Reduo prvia dos aldedos com soluo de Tetrahidreto Boreto de Sdio a 1 %
30 min
3. DETECO CITOQUMICA DE LPIDOS

Digesto enzimtica por aco de uma lipase (Morii et al., 1982)
Uma unidade de lipase liofilizada de pncreas de porco (tipo VI da SIGMA), a pH 7.7 e a 37C
durante 1 h, hidroliza 1 microequivalente de cido gordo dum triglicrido, quando utilizado o
leo de azeitona como substracto.
1. Soluo de Perxido de Hidrognio a 10%
20min
3min
2. Lavagem em H20 bidestilada
3. Soluo de Lipase a 0.2% em Tampo Fosfato de Sdio 0.1M pH 7.4
3-6h a 37C
4. Lavagem cuidadosa em H20 bidestilada
Controlo: Incubao no Tampo desprovido de enzima ou em soluo de lipase inactivada pelo
calor (fervura), durante o mesmo tempo e nas mesmas condies do teste
57
APNDICE
Soluo de -Naftol-Hipoclorito
NaOH 1 %
- Naftol 1% em Etanol 70 %
Hipoclorito de Sdio 1 %
200 ml
10 ml
20 ml
Soluo de Piridina-Clorofrmio
(trabalhar na hote)
Piridina
Clorofrmio
90 ml
30 ml
Reagente de Schiff
Dissolver 2 g de Pararosanilina (Fucsina Diamante) em 60 ml de HCl 1 N. Juntar 300 ml de
gua destilada qual se adicionaram 2 g de Metabissulfito de Sdio. Misturar bem e
deixar repousar 24 h, em frasco rolhado. Adicionar 1.2 g de carvo activado e agitar
durante 2 min. at ficar incolor. Filtrar a soluo e manter no escuro a 4 C (por um
perodo mximo de dois meses).
Pseudo Schiff
Acriflavina a 0,1% saturada com SO por adio de 2 a 3 gotas de cloreto de tionil a 40 ml
da soluo corante ou por adio de 0,5 g de Metabissulfito de Potssio e de 10 ml de
HCL 1N (8% HCL concentrado) a 50 ml da soluo corante. Neste segundo caso
esperar cerca de 12 h antes de usar.
Azul de Bromofenol
Azul de Bromofenol 0.1 % em Etanol 95 % adicionado de Cloreto de Mercrio (10 % final).
Azul de Comassie
Azul de Comassie R250 a 0,25 % em cido actico a 7 %.
Metabissulfito de Sdio 0.5%
Metabissulfito de Na ou K ou Bissulfito de Na
HCl 1 N
H 20
1g
10 ml
190 ml
Vermelho de Rutnio
Vermelho de Rutnio
Acetato de Chumbo a 10%
8 mg
10ml
Sulfato de Azul do Nilo

Adicionar 10 ml H2SO4 1 % a 200 ml de Sulfato Azul do Nilo a 1 %. Ferver durante 4 h,
deixar arrefecer e filtrar.
A soluo deve ficar a pH 2 para diminuir a colorao doutras substncias no lipdicas.
58
Reagente de Nadi
(preparar no momento)
- Naftol 0.1 % em EtOH 40 %
Cloridrato de dimetilparafenileno diamina 1 %
Tampo Fosfato de Sdio 0.05 M pH 7.2
0.5 ml
0.5 ml
49.0 ml
Soluo Metanlica de Tiocianato Ferroso

Soluo Metanlica saturada de Sulfato Ferroso
1V
Soluo Metanlica saturada de Tiocianato de Amnio 1V
Fluorocromos para deteco de flavonides
Cloreto de Alumnio 5 - 15 % (sol. aquosa ou metanlica)
Acetato de Magnsio 5 % (sol. metanlica)
Acetato Neutro de Chumbo 1 - 3 % (sol. aquosa)
Mistura Citrobrica de Wilson: 1 vol. de cido Ctrico 10 % em Acetona + 1 vol. de cido
Brico em Acetona.
Reagente de Wagner
Iodeto de potssio
Iodo
H 20
2g
1.27 g
100 ml
Reagente de Dittmar
Iodeto de potssio
Nitrito de sdio
cido Clordrico
H 20
1g
1g
30 ml
30 ml
Reagente de Dragendorff
Misturar as solues I e II. Esta soluo stock pode ser guardada 6 meses. Na altura de
usar retirar 5 ml desta soluo, juntar 10 ml de cido actico e diluir para 100 ml de
gua.
I. Nitrato de Bismuto 12.5 % em H20 contendo 25 % de cido Actico
II. Iodeto de Potssio 40 %
25 ml
10 ml
Diacetato de Fluorescena
Diacetato de Fluorescena 0.5 % em Acetona. Guardar no escuro, e no armazenar mais
de 3h.
Laranja de Acridina em PBS
Laranja de Acridina 0.1 % aquoso: PBS (1:9)
59
Safranina
Safranina
Tampo Tris 0.2 M pH 9.0
0.1 g
100 ml
Soluo saturada de Dimedona

0.5 g em 100 ml H20 com agitao durante 5 h e filtrar.
Azul de Metileno-Azur A
Azul de Metileno
Azur A
Glicerol
Metanol
Tampo Fosfato de Sdio 0.1 M pH 6.9
gua destilada
0.13 g
0.02 g
10 ml
10 ml
30 ml
50 ml
PBS (Phosphate Buffer Saline) Tampo Fosfato Salino (sem clcio nem magnsio)
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
Para 1 l de gua
8.0 g
0.2 g
1.15 g
0.2 g
Tampo Fosfato (0.1M)

A. Soluo stock: Tampo Fosfato 0.2 M
1. Soluo de Fosfato de Sdio Dibsico 0.2 M
Na2HPO4.7H20
2.68 g (ou 3.58 g Na2HPO4.12H20)
gua Destilada
50 ml
2. Soluo de Fosfato de Sdio Monobsico 0.2 M
NaH2PO4.7H20
1.38 g
gua Destilada
50 ml
B. Soluo de Trabalho: Tampo Fosfato 0.1M
Para um determinado pH, misturar os volumes das solues de Fosfato de Sdio Dibsico
e Monobsico, de acordo com a Tabela I, e perfazer para um volume de 100ml com
gua Destilada.
pH
6.8
7.0
7.2
7.4
Tabela I
Fosfato de Sdio 0.2 M
Monobsico (ml)
Dibsico (ml)
25.5
24.5
19.5
30.5
14.0
36.0
9.5
40.5
60
Tampo Veronal (0.1M) pH 7.4-8

A. Soluo Actica
Acetato de Sdio
gua destilada
0.2 g
10 ml
B. Soluo Veronal
Veronal Sdico (barbital)
gua destilada
0.26 g
10 ml
10 ml de A + 10 ml de B + 20 ml de gua destilada. Acertar o pH com HCl 0.1 N.

Tampo Tris (0.1M)
Solues stock: Tampo Tris 0.2 M
1. Soluo de Tris(hidroximetil)aminometano 0.2 M: 24,2g em 1000 ml
2. HCl 0.2 M
Para um determinado pH, misturar os volumes das solues Tris e HCl, de acordo com a
Tabela II, e perfazer para um volume de 100ml, com gua Destilada.
pH
7.2
8.0
8.6
9.0
Tabela II
Tampo Tris 0.2 M
Soluo Tris (ml)
HCl (ml)
50
44.2
50
26.8
50
12.2
50
5.0
Tampo Tris- Maleato (0.1M)

A. Soluo stock: Tampo Tris-Maleato 0.2 M
1. Soluo de Tris- Maleato 0.2M
Tris (hidroximetil) aminometano
cido Mlico
Ou
Anidrido Mlico
24,2 g
23,2 g
19,6 g
2. Soluo de NaOH 0.2 M

B. Soluo de Trabalho: Tampo Tris-Maleato 0.1M
Para um determinado pH, misturar 50ml da soluo Tris-Maleato 0,2M com o volume de
NaOH, de acordo com a Tabela III, e perfazer para um volume de 100ml com gua
Destilada.
pH
7.0
7.2
7.4
7.6
Tabela III
Tris-Maleato 0.2 M
NaOH (ml)
48.0
51.0
54.0
58.0
61
Tampo Glicina
Dissolver 751mg de glicina em 80ml de gua Destilada. Ajustar para pH 10 com NaOH 1N e
perfazer para um volume de 100ml, com gua Destilada.
Soluo de HCl 1N
O HCL fumante tem:
Peso molecular
Densidade
Percentagem em soluo
36.46 g
1.19
37 %
Para preparar 100 ml de HCl 1 N:

36.46 g / l de HCl para 1N
100 g de soluo - 37 g de HCl 98.55 g de soluo
sendo a densidade 119 g - 100 ml ento os 98.55 g de sol. esto em 82.8 ml de HCl
fumante
Em 82.8 ml de HCl fumante existem 36.46 g de HCl
Para 100 ml: 82.8 ml - 1 l 8.28 ml de HCl fumante preencher para 100ml de gua destilada.
Deteco da actividade fosfatsica cida
Meio de pr-incubao:
Tampo Tris-maleato pH 5.0
Cloreto de Crio III
100mM
1mM
Meio de incubao:
Tampo Tris-maleato pH 5.0
Cloreto de Crio III
-Glicerofosfato de Na
O pH final do meio de incubao 5.0
100 mM
1 mM
7 mM
Deteco da actividade adenosina trifosfatase

Meio de incubao:
Tampo Tris-Maleato 0.05 M pH 7.2
ATP (disdico)
Nitrato de Chumbo
Nitrato de Magnsio
200mM
2mM
2mM
2mM
Deteco da actividade inosina difosfatase

Meio de incubao:
Inosina Difosfato (sdico)
Nitrato de Chumbo
Nitrato de Magnsio
200mM
2mM
2mM
2mM
62
Deteco da actividade tiamina pirofosfatase

Meio de incubao:
Tiamina Pirofosfato (cloreto)
Nitrato de Chumbo
Nitrato de Magnsio
ATP (disdico)
200mM
2mM
2mM
2mM
2mM
Deteco da actividade peroxidsica da catalase

Meio de incubao:
Tampo Glicina / NaOH 0.05 M pH 10
DAB (3,3'-diaminobenzidina, free base)
Perxido de Hidrognio 3 %
O pH final do meio de incubao 9.5 - 10
5 ml
1 mg
0.1 ml
Deteco da actividade das peroxidases

Meio de incubao:
Tampo Tris - HCl 0.05 M pH 7.6
DAB (3,3-diaminobenzidina, free base)
Perxido de Hidrognio 1 %
10 ml
5 mg
0.1 ml
Deteco da actividade da celulase

Meio de incubao:
Carbometilcelulose
Tampo Fosfato de Na 0.01M pH 6.0
0.2 g
10 ml
Soluo de Benedict:
Soluo A
Citrato de Sdio
17.3g
Carbonato de Sdio Anidro
10.0g
gua destilada aquecida a 60C
80ml
(A soluo deve ser filtrada e deixada a arrefecer antes de se misturar com a soluco B)
Soluo B
Sulfato de Cobre
gua destilada
1.7g
10ml
Misturar as solues A e B e perfazer com gua destilada at um volume de 100ml.
63
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65
Cloreto de Ferro III ....................................... 25, 47

Colesterol ............................................... 18, 19, 36
Colorao diferencial.............................. 20, 22, 28
Colorao dupla ....................................... 9, 28, 50
Contrastao Regressiva ............................. 33, 53
Controlos ...................................... 3, 14, 18, 31, 35
Cromforo ........................................ 1, 2, 3, 20, 26
Cromognicas ......................................................1
Cutcula .............................................................. 50
Desoxirribonucleoprotenas................................33
Diacetato de Fluorescena...................... 10, 38, 59
Diaminobenzidina ......................................... 33, 63
Diazoreaco ..................................................... 26
Dicromato de Potssio ................................. 25, 47
Difusibilidade .................................................. 8, 11
Digesto enzimtica ..................................... 11, 32
Dimedona ..................................................... 12, 15
Dinitrofenilhidrazina ...................................... 23, 45
Dixido de Enxofre ............................................. 40
Dissacridos.......................................................10
DNA.............................................................. 17, 40
Dragendorff ...................................... 27, 28, 48, 59
EDTA...................................................... 21, 33, 53
Eosina ............................................................ 9, 10
Esclernquima.............................................. 24, 51
Essncias ........................................................... 22
Esterides ........................................ 23, 27, 36, 44
Estruturas glandulares........................................ 22
Exina .................................................................. 50
Fenis .................................. 24, 25, 26, 39, 47, 48
Ferro Coloidal..................................................... 35
Fixao1, 3, 6, 11, 18, 30, 31, 33,
34, 35, 53, 54, 55, 56
Flavonides ...................................... 25, 26, 48, 59
Floroglucinol ................................................... 3, 26
Fluorescncia..1, 5, 10, 17, 21, 24, 26,
28, 38, 45, 48
Fluoreto de Sdio ................................... 53, 54, 55
Fluorocromos ................................. 5, 6, 10, 26, 48
fluorforos ............................................................5
Fluoroglucinol ..................................................... 47
Formol - Clcio .............................................. 18, 21
Fosfatases..........................................................33
Fosfolpidos .......................... 14, 18, 19, 20, 21, 32
Fosforescncia .....................................................5
Fucsina................................................. 1, 2, 13, 17
Glicognio .......................................................... 10
Glicsidos...........................................................23
Glucosaminoglicanos ......................................... 17
Gomas vegetais ................................................. 17
Grupo vic- glicol ................................ 11, 39, 40, 41
Grupos aldedo....................................... 12, 13, 15
Grupos funcionais .......................... 2, 3, 11, 15, 21
HCl 1N.....................................................VI, 58, 62
Hematoxilina - Eosina............................................9
NDICE REMISSIVO
Absoro ........................................1, 2, 4, 5, 6, 10
Acetato de Cobre / cido Rubenico ............ 21, 43
Acetato de Uranilo ..............................................53
cido Etilenodiaminotetractico..........................53
cido Perclrico..................................................44
cido Peridico............... 12, 13, 14, 34, 35, 39, 40
cido Rubenico ................................................21
cido Sulfrico..............................................45, 49
cido Tnico ................................................17, 41
Acidofilia ...............................................................3
cidos fortes.......................................................23
cidos gordos.............................14, 19, 20, 21, 43
cidos resnicos .....................................20, 22, 44
Actividade adenosina trifosfatase .................54, 62
Actividade da celulase ........................................63
Actividade das peroxidases ..........................56, 63
Actividade fosfatsica cida .........................53, 62
Actividade inosina difosfatase ......................54, 62
Actividade peroxidsica da catalase.............55, 63
Actividade tiamina pirofosfatase ...................55, 63
Agliconas ......................................................24, 48
Alcalides .........................................27, 28, 48, 49
Alocromasia..........................................................4
Alocromticos .......................................................4
Amido .........................................10, 13, 16, 39, 51
Artefactos ...............................................18, 31, 35
Autofluorescncia ...................................28, 48, 49
Auxocromos..........................................................2
Azoreaco.........................................................26
Azul Brilhante de Comassie..............10, 29, 38, 52
Azul de Alciano.................................15, 18, 39, 42
Azul de Anilina..............................................17, 41
Azul de Astra ................................................28, 50
Azul de Bromofenol ..................................8, 38, 58
Azul de Comassie.........................................38, 58
Azul de Indofenol................................................22
Azul de Metileno .....................................28, 50, 60
Azul de Metileno-Azur A-Safranina.....................28
Azul de Metileno - Vermelho de Rutnio..............28
Azul de Toluidina ................................................29
Azur A...........................................................28, 60
Basofilia ......................................................3, 4, 15
Bloqueio dos Aldedos ........................................51
Bolsas.................................................................22
Borracha .................................................24, 45, 46
Calcoflor .....................................................17, 41
Calose ............................ 10, 13, 17, 39, 41, 50, 51
Canais ................................................................22
Carbonilos ..............................................12, 27, 34
Celulase........................................................33, 56
Celulose................................ 10, 13, 39, 41, 50, 51
Ceras ..................................................................18
Citrato de Chumbo .............................................53
Cloreto de Dansil ..........................................24, 46
66
Quitina ............................................................... 10
Reaco cido Peridico- Reagente de Schiff... 11
Reaco de Sakaguchi ...................................7, 37
Reaco do Biureto ............................................. 9
Reaco metacromtica ...................................... 3
Reaco Modificada de Abraham .................23, 45
Reaco Ninidrina-Schiff ................................8, 37
Reaces falsamente negativas .......................... 2
Reaces falsamente positivas ................2, 21, 30
Reagente de Dittmar.....................................49, 59
Reagente de Dragendorff .................................. 27
Reagente de Ellram ........................................... 49
Reagente de Nadi...................................22, 44, 59
Reagente de Schiff.1, 8, 11, 12, 13, 15, 29,
37, 39, 51, 58
Reagente de Wagner............................... V, 49, 59
Reduo dos aldedos ....................................... 35
Resinas...........................22, 24, 29, 32, 36, 46, 51
Ribonucleoprotenas .......................................... 33
RNA ..............................................................17, 40
Safranina ............................................4, 28, 50, 60
Sal de diaznio .................................................. 25
Seces semi finas .......................................29, 51
Soluo de Benedict .....................................56, 63
Soluo de Piridina - Clorofrmio ..................37, 58
Soluo de Tiocarbohidrazida ........................... 57
Soluo de -Naftol-Hipoclorito ....................37, 58
Soluo saturada de Dimedona......................... 60
Substracto ......................31, 33, 53, 54, 55, 56, 57
Sudes .........................................................19, 20
Sulfato Azul do Nilo ................................20, 43, 58
Tampo ..........................29, 30, 31, 35, 53, 55, 56
Tampo Acetato-Cacodilato .............................. 55
Tampo Cacodilato.................................54, 55, 56
Tampo Fosfato.. 28, 31, 38, 40, 41, 43,
44, 56, 57, 59, 60, 63
Tampo Fosfato de Na ...................................... 56
Tampo PIPES .................................................. 53
Tampo Tris .........................54, 55, 60, 61, 62, 63
Tampo Tris- Maleato........................................ 61
Tampo Tris-Maleato....................................54, 55
Tampo Veronal ...........................................47, 61
Taninos.......................................17, 24, 26, 48, 51
Temperatura.5, 14, 18, 19, 30, 31, 37,
38, 42, 44, 53, 54, 55, 56
Terpenides............................................22, 44, 45
Tetrahidreto Boreto de Sdio12, 15, 39, 40, 44,
45, 51, 57
Tetrxido de smio ............................................ 34
Tiocarbohidrazida .............................................. 34
Tiocianato Ferroso........................................45, 59
Tiosemicarbazida............................................... 34
Toluidina .............................................4, 28, 29, 51
Tricloreto de Antimnio.................................22, 44
Tricloreto de Ferro ........................................41, 47
Hidratos de carbono..7, 10, 11, 13, 14, 15,

18, 29, 39, 51, 57
Hipoclorito de Sdio ..................................... 50, 58
Histoqumica....... 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 28, 29, 35, 51
Idioblastos.......................................................... 22
Imunocitoqumica............................................... 30
Incubao ...........31, 32, 33, 53, 54, 55, 56, 62, 63
Intina .................................................................. 50
Iodeto de Potssio ................................. 16, 39, 59
Isoprenides ...................................................... 22
Isotiocianato de Fluorescena ............................ 10
Lactonas ................................................ 23, 27, 45
Laranja de Acridina .......................... 16, 17, 40, 59
Laticferos .............................................. 22, 24, 27
Lenhina .................................................. 24, 26, 47
Ligaes covalentes ...................................... 8, 37
Ligaes duplas ............................. 1, 2, 19, 21, 35
Ligaes electrostticas............................... 3, 6, 9
Lipase ................................................................ 57
Lpidos..1, 3, 4, 11, 13, 18, 19, 20, 21,
24, 29, 35, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 57
Lisocromos................................................... 19, 24
Lugol ............................................................ 16, 39
Luz visvel.............7, 11, 17, 19, 22, 24, 25, 27,
37, 39, 41, 42, 44, 45, 47, 48
Metacromasia ................................ 3, 4, 16, 29, 40
Metenamina de prata ......................................... 33
Monossacridos........................................... 10, 11
Mucilagens................................. 16, 17, 18, 41, 42
Mucopolissacridos ......................... 10, 17, 39, 42
Naphtol Yellow ................................................... 10
Negro Sudo B ................................ 20, 29, 42, 51
Nitrato de Chumbo........................... 54, 55, 62, 63
Nitrito de Sdio ............................................ 28, 48
Oil Red............................................. 19, 24, 45, 46
Oligossacridos ........................................... 10, 11
Oxidases ............................................................ 33
PAS..6, 7, 11, 13, 14, 15, 17, 28, 29,
34, 35, 39, 40, 51
PATAg ................................................... 34, 35, 57
PBS........................................................ 40, 59, 60
Pectinas ........................................... 16, 35, 40, 41
Perxido de Hidrognio.......................... 56, 57, 63
Polietilenoglicol .................................................. 43
Polissacridos4, 10, 11, 13, 15, 16, 17,
29, 32, 34, 35, 39, 40, 41, 51
Polissacridos cidos................................... 11, 35
Pr-fixao................................................... 30, 31
Pr - tratamentos .................................................. 1
Pronase ................................................... V, 56, 65
Protenas3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 18,
24, 29, 30, 32, 33, 34, 37, 38, 46, 52, 53
Protenato de prata ............................................ 34
Pseudo Schiff............................................... 40, 58
67
Tricomas.........................................................7, 22
Triglicridos ........................................................18
UV..1, 2, 5, 10, 16, 17, 21, 24, 26, 28,
38, 40, 44, 45, 46, 48, 49
Vacolos.............................................................27
Vanilina Clordrica ........................................26, 48
Verde Iodo - Carmim Aluminado....................28, 50
Vermelho de Rutnio.16, 18, 35, 40, 42, 58
Vermelho Neutro ..........................................21, 44
Vermelho Sudo.....................................20, 42, 43
Visualizao .............................................1, 11, 15
Xilema.................................................................24
68

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CENTRO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL

HISTOQUMICA E CITOQUMICA EM PLANTAS:

Ana Cristina da Silva Figueiredo, Jos Manuel Gonalves Barroso,

CENTRO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL

HISTOQUMICA E CITOQUMICA EM PLANTAS:

Composio, Impresso e Acabamentos:

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

4.1.3. Deteco diferencial de lpidos .............................................................................................. 20

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

cido Peridico - Reagente de Schiff (PAS) .........................................................................29

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

3. Deteco de Mucilagens e Mucopolissacridos cidos ................................................................... 41

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

7. Deteco de Alcalides ........................................................................................................................48

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Soluo saturada de Dimedona ........................................................................................... 60

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

comprimentos de onda absorvidos. Os compostos insaturados mostram uma tendncia para a

Grupos da substncia com afinidade

Reaco falsamente negativa

a) Reaces falsamente positivas Resultam do facto de o cromforo se ligar a estruturas

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

para esse cromforo.

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Na microscopia de fluorescncia, caso se use, por exemplo, radiao na regio do ultra-violeta

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

1.1. EM LUZ VISVEL

1.1.2. Colorao de protenas por ligao do corante a grupos de aminocidos

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

a) Corantes que formam ligaes covalentes

Anio de cor prpura

Azul Mercrico de Bromofenol

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intramoleculares, possam tornar-se disponveis para estabelecer ligaes de hidrognio com o

b) Corantes que formam ligaes electrostticas

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Azul Brilhante de Comassie

1.1.3. Colorao selectiva de determinadas protenas

2. DETECO DE HIDRATOS DE CARBONO

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Os monossacridos so os glcidos mais simples que, para alm de carbono, oxignio e

2.1. EM LUZ VISVEL

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Resduo de polissacrido oxidado

Especificidade histoqumica. Na interpretao dos resultados da reaco importante

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

2.1.2. Caracterizao diferencial dos hidratos de carbono

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

aninicos, nomeadamente os cidos nucleicos e as protenas, podem igualmente fixar o corante.

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

aquosas de corantes bsicos da srie aminoacridina. A Acriflavina e o Laranja de Acridina tm

3. DETECO DE MUCILAGENS E MUCOPOLISSACRIDOS CIDOS

3.1. EM LUZ VISVEL

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

Histoqumica e Citoqumica em Plantas: Princpios e Protocolos

e colesterol, mas no de fosfolpidos. Se a acetona no for anidra os fosfoglicridos so extrados

4.1. EM LUZ VISVEL

4.1.2. Deteco geral de lpidos