XII CURSO ANUAL de ANTIMICROBIANOS

CARACTERIZACION FENOTIPICA Y GENOTIPICA DE LA RESISTENCIA

A LOS ANTIMICROBIANOS

9 de junio, 2009

Dra. Marcela Radice

Laboratorio de Resistencia Bacteriana,
Facultad de Farmacia y Bioqumica

Mecanismos de resistencia
1. Enzimas inactivantes
2. Mecanismos de Eflujo
3. Impermeabilidad
4. Alteracin de las PBPs

Combinacin de todos
los mecanismos

Impermeabilidad
Exclusivo de Gram negativos

Dficit de porinas

Bajo nivel de resistencia

Combinacin con otros
mecanismos

Algunos ejemplos
OmpK 36 en Kpn
OprD en Pae
Car O A. baumanii

CIM de carbapenemes
frente a cepas isognicas de P. aeruginosa

Cepa

AmpC

OprD

Imipenem

Meropenem

Desreprimida

0,25

Deficiente

0,25

0,125

Desreprimida

16

Deficiente

0,5

Imipenem tiene la capacidad de seleccionar mutantes deficientes en OprD,

que varios estudios han cifrado en torno al 15-20%.

Martinez Martinez, Hernndez. SEIMC

Bombas de Eflujo

Sistema multicomponente
FC: mantener bajas cc. de sust. txicas
Especficas inespecficas
Plsmido cromosoma
Constitutiva - inducible
Resistencia a mltiples antibiticos:

aminoglucsidos, quinolonas, tetraciclinas,

cloranfenicol, -lactmicos, sales de amonio
cuaternarias

Bajo nivel de resistencia

Bombas de Eflujo

Familias:
ABC (ATP binding cassette)
MF (major facilitator),
MATE (multidrug and toxic efflux)
SMR (small multidrug resistance)
MT (drug/metabolite transporter

RND (resistance nodulation division)

(Pae, Aba)
MexA-MexB-OprM,
MexC-MexD-OprJ,
MexE-MexF-OprN,
MexX-MexY-OprM

Resistencia no enzimtica a
carbapenemes en P. aeruginosa

Resistencia a
meropenem (radical lipofilico)
*Hiperproduccin de
MexAB-OprM
extruye todos los betalactmicos (excepto
imipenem) y quinolonas

Resistencia a
imipenem
*dficit de OprD
*dficit OprD +
alteracin de PBP4

* MexEF-OprN extruye:
quinolonas, tetraciclina,
cloranfenicol, imipenem

CARBAPENEMASAS

Metalo-enzimas
Clase Molecular B

Serino-enzimas

Clase Molecular A
NMCA (1990) (Ecl)
Sme-1, -2, -3 (1990, 2000)
(Smar)
IMI-1 (1996) (Ecl)

Inhibibles por el c. clavulnico

No hidrolizan C3G
Cromosmicas
Principales en enterobacterias

Clase Molecular D

KPC-1, -2, -3, -4 (2001, 2003,

2004) (Kpn, Smar, Ecl, Pae)

Inhibibles por el c. clavulnico

Hidrolizan C3G
Plasmdicas
Principales en
enterobacterias/Pae

GES-type, 2-4 (2002, 2004) (Ecl, Kpn)

Inhibibles por el cido clavulnico
Hidrolizan C3G
Plasmdicas
Principales en enterobacterias
GES-2 Principalmente en Pae

Tipo OXA (OXA-carbapenemasas)

Hidrolizan: penicilinas, C1G,
carbapenemes
Principales en Acinetobacter

Carbapenemasas tipo OXA

OXA 23: 23 27

60%

Europa, Australia, EEUU, China, Corea, Brasil,

Argentina
Codificacin plasmdica-cromosmica
Asociada a ISAba1, ISAba4

OXA 24: 24 - 25 - 26 40

OXA 58

56%

Espaa, Portugal, Belgica, Francia,

EEUU
Codificacin cromosmica
(plasmdica OXA 40)
No asociada a IS

47%

48%

Francia, Blgica, Espaa, Italia, UK

Australia, Argentina, EEUU,
Codificacin plasmdica-cromosmica,
Asociada a ISAba1, ISAba2, ISAba3,
IS1B

OXA 51 Intrnseca de Aba

63%

2005, inicialmente Argentina

alto nivel = secuencia de insercin
ISAba1 upstream

59%

Metalo-enzimas
Carbapenemasas de clase B
metaloenzimas clase molecular B de Ambler,
grupo 3f de K. Bush.
Hidrolizan: amino- carboxi y ureidopenicilinas,
cefalosporinas y carbapenemes
No hidrolizan: aztreonam
No inhibibles por inhibidores clsicos
Inhibibles por EDTA
IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, AIM, NDM

Metalo-- lactamasas

IMP-1/16
IMP
fines de los 80 en Japn
24 enzimas tipo IMP
Asia, Europa y Amrica
BGNNF y enterobacterias

VIM-1/11

SPM-1

GIM-1

VIM
fines de los 90 en Italia
22 enzimas tipo VIM
Europa y Asia
BGNNF y enterobacterias

Integrn de clase 1
IMP, VIM, GIM-1, SIM-1
59 pb

5-CS

3-CS

Pc

intI1

qacE1

sul1

attI

Integrasa 1

R: sales de
amnio

sulfonamidas

Metalo--lactamasas
VIM-2 y VIM-11 en Pseudomonas aeruginosa Pagniez, G., M. Radice, A.
Cuirolo, O. Rodriguez, H. Rodriguez, C. Vay, A. Famiglietti, and G. Gutkind. 2006. Rev Argent
Microbiol 38:33-7.

VIM-11 en Pseudomonas aeruginosa Pastern F., Faccone D., Petroni A., Rapport
M., Galas M., VazquezM., Procopio A. 2005. AAC 49:474-5

IMP-13 en Pseudomonas aeruginosa Cuirolo, A., M. Almuzara, M. Radice, and G.

Gutkind. 2006. Presented at the 46th. ICAAC Abstr. C2-415

IMP-16 en Pseudomonas aeruginosa Andres, P., A. Petroni, A. Fernandez, M.

Tokumoto, M. Galas, and F. Pastern. 2006. Congreso Sadebac 2006. Abstr. 16612.

VIM-2 Pseudomonas putida Almuzara, M., M. Radice, N. de Garate, A. Kossman, A.

Cuirolo, G. Santella, A. Famiglietti, G. Gutkind, and V. Vay. 2007. Emerg Infect Dis 13:668-9.

Resistencia a carbapenemes
Algunos ejemplos

Klebsiella pneumoniae

Resistentes: AMP, AMS, CTN, CTX, CAZ,
FEP, MERO, AKN, Genta.

Sensible/ Intermedio: IMI

No extrapolar datos de IMI y MERO

Klebsiella pneumoniae
n=6, recuperadas de pacientes internados en el Hospital de Clnicas

Caracterizacin de -lactamasas
PCR +

CTX-M-grupo 2
SHV d

PER-2

8,2
8,2
7,6
7,6

5,4
5,4

Todas productoras de BLEE: CTXM (4), PER-2 (1), SHVd (1).

No se detectaron carbapenemasas

Klebsiella pneumoniae
Estudio de protenas de membrana externa
kDa
kDa

45
45

31
31

Mer
MerRR

Mer
MerSS

mut
mutMer
MerRR

Conclusin: BLEE + Impermeabilidad

R MER, Sd IMI

Pseudomonas aeruginosa
Hospital de Clnicas Jos de San Martn (Bs.As) (n=91)

Perodo: 2003-2004

Susceptibilidad por difusin en medio slido
(CLSI): PIP, PTZ, CAZ, FEP, AZT, IMI, MER, AKN, GEN, CIP

Ensayo de inhibicin con EDTA 1 mol/disco

Deteccin de los genes codificantes

bla

IMP

bla

VIM

bla

SPM-1

bla

GIM-1

Localizacin de los genes

Tipificacin clonal: rep-PCR (REP-PCR, ERICPCR)

Ensayo de susceptibilidad segn

recomendaciones Subcom. de ATB,
SADEBAC, AAM
MBLs
MBLs

Bsqueda de carbapenemasas
deBsqueda
clase A de carbapenemasas
de clase A

PTZ

20
mm

EDTA

15
mm
EDTA

IMI

15 mm

15 mm
Bsqueda de
Enzimas tipo GES

Pseudomonas aeruginosa productora de VIM-11

EDTA

ED
TA

15
mm

CAZ

15
mm

P. aeruginosa productora de VIM-11

P. aeruginosa productora de VIM-2

Detecci
n molecular de MBLS
Deteccin

PCR simple: primers especficos de cada familia

Multiplex PCR: primers vim, imp, spm, gim y sim.

Ellington et al. JAC(2007) 59:321-322

Anlisis del entorno gentico:

amplificacin de intI por PCR

amplificacin de regin variable de integrones de clase 1

amplificacin del gen codificante de MBLs: Nested-PCR

Secuenciacin de los productos amplificados

Resultados
(n=91)
R IMI : 5

R MER: 6

R IMI + MER: 80

S AZT: 14

Doble disco MBL +: 10

bla VIM +: 10

Estructura del integrn de clase 1

5-CS

VIM-2 like
Pc blaVIMcassette

intI1

5959-be

aac(6)-II
cassette

3-CS

5959-be

qacE1

sul1

attI
7

7
7

0.9

3 0.4 4
0.8
8 5
9
3
3
11
11
1.8
1.6
4

13 0.3 14 15 0.4 16
0.8
16
6
13
1.8
10
1.7
14
2.3
16
1.2
14
1.8
16
12

EMBL:AJ628983

Tipificacin molecular : REP-PCR

Primers REP
REP-1: IIIGCGCCGICATCAGGC

REP-2: ACGTCTTATCAGGCCTAC

6
7
8
5
3
1
2
9
10
4
0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00


Prevalencia de MBLs: 10%

Conclusiones

Sensibilidad a AZT: VP+:71% , VP-:100%

Sensibilidad y especificidad EDTA 1mol: 100%

VIM- 2 (n=3) VIM-11 (n=7)

Genes vim localizados en integrones de clase 1

No correspondieron a un nico clon

Primer reporte de MBLs en Argentina

Pseudomonas aeruginosa
Hospital de Eva Pern, (Bs.As) (n=20)
Perodo: diciembre 2004 diciembre 2005
Resistencia a CAZ
Susceptibilidad por difusin en medio slido (CLSI): PIP, PTZ,
CAZ, FEP, AZT, IMI, MER, AKN, GEN, CIP
Deteccin de MBLs: EDTA 1 mol/disco
Deteccin de los genes codificantes

bla IMP
bla VIM
bla SPMSPM-1
bla GIMGIM-1
Localizacin de los genes
Tipificacin clonal: PFGE

Pseudomonas aeruginosa
(n=20), resistentes a CAZ

15/20

Antibiograma

5/20

Sensibles a
imipenem

Resistentes a
imipenem

(16mm<

(halo<13mm)

halo<21mm)
Screening de metalo carbapenemasas

EDTA (1mol)
20/20 Positivo

Ubicacin estratgica de los discos

Sensibles a IMI

Resistentes a IMI

Deteccin de MBLs

EDTA

EDTA

P. aeruginosa productora de IMP-13

P. aeruginosa productora de IMP-13

isolate number

date of

hospital

clinical

(identification)

isolation

ward

specimen

Antibiotic susceptibility (mm/interpretation) / (g/ml/interpretation)

PIP

PTZ

CAZ

FEP

AZT

IMI

MER

CIP

GEN

AKN

1. (M2179)

14/12/04

ICU

Af

23 S

22 S

6R

10 R

18 I

20 S/4 S

18 S/ 4 S

6R

6R

18 S

2. (H2515)

30/12/04

ICU

blood/cat

22 S

23 S

7R

9R

14 R

21 S/ 2 S

17 S/ 4S

6R

6R

17 S

3. (H86)

11/1/05

ICU

blood

23 S

22 S

6R

8R

17 I

20 S/ 2 S

16 S/ 4 S

6R

6R

15 I

4. (F742)

7/4/05

ICU

BAL

22 S

23 S

6R

9R

13 R

21 S/ 2 S

21 S/ 4 S

6R

6R

16 I

5. (F1135)

18/5/05

ICU

BAL

21 S

23 S

6R

8R

15 R

20 S/ 2 S

16 S/ 2 S

6R

6R

17 S

6. (M838)

16/5/05

GW

bone

22 S

23 S

6R

8R

17 I

21 S/ 2S

17 S/ 4 S

6R

6R

18 S

7. (M908)

26/5/05

ICU

cat

24 S

23 S

6R

8R

15 R

21 S/ 2 S

17 S/ 4 S

6R

6R

15 I

8. (F1280)

3/6/05

ICU

BAL

24 S

25 S

6R

10 R

15 R

21 S/ 2 S

21 S/ 4 S

6R

6R

18 S

9. (F1622)

11/7/05

ICU

BAL

23 S

24 S

6R

9R

16 I

21 S/ 2 S

20 S/ 4 S

6R

6R

15 I

10. (F1624)

11/7/05

ICU

BAL

22 S

19 S

6R

9R

16 I

18 S/ 2 S

19 S/ 2 S

6R

6R

17 S

11. (F1681)

15/7/05

ICU

BAL

23 S

23 S

6R

9R

18 I

21 S/ 2 S

19 S/ 4 S

6R

6R

17 S

12. (F1759)

23/7/05

ICU

BAL

22 S

18 S

6R

9R

15 R

18 S/ 4 S

17 S/ 8 I

6R

6R

17 S

13. (M1632)

9/9/05

ICU

Asf

24 S

25 S

6R

9R

17 I

6 R/ 64 R

6 R/ 128 R

6R

6R

16 I

14. (M2256)

11/12/05

ICU

Af

21 S

20 S

6R

8R

14 R

6 R/ 32 R

6 R/ 128 R

6R

6R

16 I

15. (M2257)

11/12/05

GW/S

St

21 S

21 S

6R

10 R

15 R

6 R/ 32 R

6 R/ 128R

6R

8R

18 S

16. (F3077)

11/12/05

GW

BAL

22 S

22 S

6R

10 R

13 R

7 R/ 32 R

6 R/ 128 R

6R

8R

17 S

17. (H2939)

30/12/05

GW

blood/cat

24 S

23 S

6R

9R

13 R

6 R/ 32 R

6 R/ 128 R

6R

6R

17 S

18. (M7)

2/1/06

GW/S

St

23 S

20 S

6R

8R

16 I

20 S/ 2 S

20 S/ 2 S

6R

6R

16 I

19. (M45)

6/1/06

ICU

Af

23 S

24 S

6R

9R

18 I

21 S/ 2 S

21 S/ 2 S

6R

6R

17 S

20. (Asp)

28/12/05

asp

21 S

21 S

6R

9R

15 R

16 S/ 2 S

19 S/ 2 S

6R

6R

18 S

Table 1: Epidemiological data and antimicrobial profile of the isolates

Note: carbapenem-resistant isolates are remarked
ICU: Intensive Care Unit GW: General Ward GW/S: General Ward/ Surgery Af: abdominal fluid asp: aspirator device St: soft tissues cat: catheter Asf: ascites fluid
BAL: Bronchoalveolar Lavage

Resultados:
n=20, 19 materiales clnicos, 1 aspirador
Resistentes: CAZ, FEP, CIP
Intermedio: AZT
Sensibles: PIP, PTZ
IMI, MER
Sensibilidad disminuida: (halo < 21mm): 15
Resistentes: 5

Doble disco MBL +: 20

bla IMP +: 20

Confirmacin gnica por PCR y Secuenciacin

100% identidad con IMP-13

5-CS
intI1

3-CS
qacE1 sul1

Pc

attI

blaIMPIMP-13

aac(6)-II

Ensayos de Tipificacin Molecular

PFGE
S

ms de un 95% de identidad

F1135
M838
H86
F742
Asp
M2179
H2515
F3077
H2939
M7
M45
F1622
F1624
M908
F1280
F1681
F1759
M2256
M2257
M1632

Resultados

Deteccin de MBLs: + 20/20

IMP-13

Integron de clase 1 (+ AAC)

relacionadas clonalmente: 95% de similitud

19 aislamientos clnicos; 1 aislamiento ambiental

La misma enzima.1 slo clon..

Porqu existen diferencias fenotpicas en

la resistencia a carbapenemes ??
Algunos aislamientos R
y otros S??

Evaluacin del nivel de Expresin de IMP-13

Medicin espectrofotomtrica de la actividad enzimtica de los
extractos, utilizando imipenem y cefalotina como ATB reporter

Niveles de expresin no
diferenciables

Promedios

AE IMI

AE CTN

AE IMI/AE CTN

Promedio R

2,70E-07

1,74E-07

1,54E+00

SD R

6,4E-08

3,1E-08

0,15

Promedio S

4,19E-07

2,20E-07

1,82E+00

SD S

2,0E-07

6,9E-08

0,38

Anlisis de las protenas de membrana externa

R

46 kDa

Extraccin de OMP con

sarkosyl y SDS-PAGE
GRUPO FENOTIPICAMENTE RESISTENTE: AUSENCIA DE PORINA
GRUPO FENOTIPICAMENTE SENSIBLE: CONSERVA PORINA

Inhibicin de Sistemas de Eflujo con

PAN

Expresin de MexAB y CD tanto en grupo R como S

Expresin de MexEF slo en grupo R

Mutaciones en mexT

Mex EF-OprN

MexT +

OprD

CONCLUSIONES y muchas preguntas

IMP-13 no parece ser capaz, por si sola, de conferir
resistencia fenotpica a carbapenemes, siendo necesaria la
coexistencia de otro mecanismo

Aquellos aislamientos que slo expresan IMP-13 no pueden

ser detectados como R a carbapenemes con los puntos de
corte del CLSI (Subcomisin de Antimicrobianos: 21 mm)

Los aislamientos R se seleccionaron a partir de los S???

Puede ocurrir intratratamiento???
Con qu frecuencia ocurre???
Cmo lo informamos???
Cul es la implicancia clnica???

Acinetobacter baumanii
Hospital de Clnicas Jos de San Martn (Bs.As)

CIM en medio slido: PIP, PTZ, CAZ, CFP, IMI,

GEN, AKN, TMS, CIP.

Deteccin fenotpica de carbapenemasas:

Mtodo de Hodge
Inhibicin con EDTA 1 mol/disco
E-test IMI / IMI-EDTA

Deteccin de genes codificantes

Multiplex MBLs
Multiplex OXA- carbapenemasas

Tipificacin molecular por PFGE

RESULTADOS

n= 54 (32 (56%)de materiales respiratorios)

Porcentaje de R: PIP: 96%, PTZ: 84%, CAZ: 92%, CFP: 84%, IMI: 60%,
GEN: 92%, AKN: 84%, TMS: 92%, CIP: 96%.

22/54 (40%) productor de carbapenemasas tipo Oxa

No se detectaron MBLs

4 tipos clonales, clones prevalentes III y IV en UCI.

OXA: 23, 58, 51

Bibliografa consultada

Nordmann P, Poirel L (2002) Clin Microbiol Infect. 8:321-331.

Pagniez G, Radice M, Amoroso A, Famiglietti A, Gutkind G (2004)

Rev. Arg. Microbiol. 38:33-7

Pasteran F, Faccone D, Petroni A, Rapoport M, Galas M, Vzquez M,
Procopio A (2005) Antimicrob. Agents Chemother. 49:474-475.
Walsh T, Toleman MA, Poirel L, Nordmann P (2005). Clinical
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Santella G., Famiglietti A., Gutkind G., Vay C. Emerging Infectious
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Poirel L, Pitout J, Nordmann P. (2007) Future Microbiol 2:50-12
Walsh T. (2008) Current Opin. Infec. Dis. (2008) 21: 367-71
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