Embrapa 2007 30-11-2014

Protocolos de Biologia
MoLecuLar aplicada
Produo Animal
Luciana Correia de Almeida Regitano

Simone Cristina Mo Niciura
Adriana Mrcia Guaratini Ibelli
Joo Jos de Simoni Gouveia
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Mdica Veterinria, Dra., Pesquisadora da Embrapa Pecuria Sudeste, Rod.
Washington Luiz, km 234, Caixa Postal 339, CEP: 13560-970, So Carlos, SP.
Endereo eletrnico:
Simone Cristina Mo Niciura

Mdica Veterinria, Dra., Pesquisadora da Embrapa Pecuria Sudeste, Rod.
Washington Luiz, km 234, Caixa Postal 339, CEP: 13560-970, So Carlos, SP.
Endereo eletrnico: simone@cppse.embrapa.br

Biloga, Universidade Federal de So Carlos, Rod. Washington Luiz, km 235, So
Carlos, SP.
Endereo eletrnico: adriana.ibelli@gmail.com

Mdico Veterinrio, Universidade Federal de So Carlos, Rod. Washington Luiz, km
235, So Carlos, SP.
Endereo eletrnico: MM
Gisele Batista Veneroni

Biloga, Universidade Federal de So Carlos, Rod. Washington Luiz, km 235, So
Carlos, SP.
Endereo eletrnico:
6 N
Gustavo Gasparin
Bilogo, Universidade Federal de So Carlos, Rod. Washington Luiz, km 235, So
Carlos, SP.
Endereo eletrnico:
6 N
NDICE
1. Regras de segurana no laboratrio...................................
2. Extrao de DNA ..................................................................
3. Extrao de RNA ..................................................................
4. Quantificao em espectrofotmetro ................................
12


Simone Cristina Mo
5. Reao em cadeia da polimerase (PCR) ............................ 14

Adelita Carolina Santiago
6. Enzimas de restrio ...........................................................
18
7. Eletroforese de cidos nuclicos .......................................
22


8. Seqenciamento ..................................................................
31
9. Sntese de DNA complementar (cDNA) .............................
38
Kerli Ninov
Lilian Giotto Zaros

10. PCR quantitativo em tempo real ....................................... 42

Helena Javiel Alves
11. Mapeamento de QTLs QTL Express .............................. 49

Millor Fernandes do Rosrio
Ktia Nones
12. Arranjos de DNA ................................................................. 55

Erika Cristina Jorge
Luiz Lehman Coutinho
13. Preparo de Solues .......................................................... 61

Referncias ............................................................................... 64
1. REGRAS DE SEGURANA EM LABORATRIOS

Segurana a prioridade nmero um em qualquer laboratrio qumico.

importante conhecer sempre o laboratrio como um ambiente global de
trabalho experimental.
J no incio deve-se familiarizar com todo equipamento de segurana
disponvel no laboratrio, sabendo onde encontr-lo e como utiliz-lo:
- lava-olhos;
- chuveiro de emergncia;
- extintores;
- sadas de emergncia;
Muitas regras de segurana envolvem apenas bom senso:
- no tocar em itens quentes;
- no comer, nem beber no laboratrio;
- no fumar dentro do laboratrio;
- no fazer brincadeiras;
O uso de Equipamentos de Proteo Individual (EPIs) obrigatrio, assim
como o uso de capela de exausto em caso de solventes.
Manter vidrarias sempre em condies adequadas de trabalho.
Manter as solues sempre identificadas e com os cuidados a serem tomados
em caso de acidentes.
Manter os frascos de reagentes sempre limpos, sem respingos para manter
uma boa condio de uso dos tcnicos e estagirios.
Usar sempre culos de segurana e avental de preferncias de algodo e

mangas longas.
No use saias, bermudas, ou calados abertos.
Pessoas de cabelos longos, mant-los sempre preso.
No trabalhe sozinho, principalmente fora do horrio de expediente.
Lave bem as mos ao deixar o laboratrio
Ao executar qualquer experimento esteja consciente de como proceder e os
cuidados.
Leia atentamente o protocolo at o fim, verificando se compreendeu todos os
procedimentos e se possui todo o material necessrio.
Nunca brinque no laboratrio.
Certifique-se da tenso de trabalho da aparelhagem antes de conect-lo
rede eltrica. Quando no estiverem em uso, os aparelhos devem ficar
desconectados.
No use nenhum equipamento para o qual no tenha sido autorizado ou
treinado a utilizar.
Respeite seus amigos de trabalho, no os distraindo com conversas
paralelas.
Caso perceba algo diferente ou mesmo anormal, recorra ao tcnico
responsvel, para tirar suas dvidas.
2. EXTRAO DE DNA
A extrao dos cidos nuclicos (DNA e RNA) o primeiro passo para a

realizao da maioria das metodologias de biologia molecular. Pode-se obter DNA a
partir de inmeros tipos de tecidos e clulas, e existe uma infinidade de protocolos
para realizao de tal procedimento. A escolha do protocolo de extrao de DNA
depender de diversos fatores como: tipo de tecido a ser utilizado, grau de pureza e
de integridade necessria para a aplicao em que o DNA ser utilizado (PCR,
seqenciamento, clonagem gnica, etc.) (Bartlett, 2003).
O primeiro relato sobre isolamento de DNA data de 1869 e foi realizado por
Friedrich Miescher, a partir de leuccitos presentes em pus. Miescher lisou estas
clulas com uma soluo alcalina e precipitou o material nuclear com soluo salina.
Este material nuclear que posteriormente seria conhecido como DNA, foi chamado
de nuclena (http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/historico2004.pdf, http://www.dnai.org ).
Basicamente, o processo de extrao de DNA consiste em duas etapas. A
primeira etapa a extrao propriamente dita e consiste no rompimento das
membranas celulares (e conseqente exteriorizao do DNA). A segunda fase
consiste na purificao do DNA em soluo, ou seja, retirada dos outros
componentes celulares da soluo (restos de membrana, protenas, RNA) (Romano,
1999).
O rompimento das membranas celulares geralmente feito com detergentes
(SDS ou CTAB). A utilizao de agentes caotrpicos como o tiocianato de guanidina
impede o DNA de se ligar nas outras molculas, facilitando sua separao na

segunda fase do processo. Aps esta fase, deve-se separar o DNA dos outros
componentes celulares. Isto feito por meio da adio de substncias que faam
com que a soluo torne-se heterognea e que o DNA fique dissolvido em apenas
uma das fases, como por exemplo, quando se utiliza fenol para desnaturar as
protenas, ficando o DNA na fase aquosa e as protenas na interface entre as fases
orgnica e aquosa. Uma alternativa utilizao dos solventes orgnicos como o
fenol fazer a separao das protenas utilizando altas concentraes de sal
(salting-out). Aps separar o DNA dos outros componentes celulares, pode-se
proceder uma precipitao do DNA para garantir a mxima pureza do material, esta
precipitao geralmente faz-se utilizando lcool (etanol ou isopropanol) que, em
presena de ctions monovalentes, promove uma transio estrutural na molcula
de cido nuclico, resultando em agregao e precipitao (Regitano, 2001;
Azevedo, 2003; http://www.etall.hpg.ig.com.br/cursopcr.html).
Os protocolos abordados neste captulo so utilizados na rotina do laboratrio
de Biotecnologia Animal do Centro de Pesquisa de Pecuria do Sudeste e so
adaptaes dos protocolos descritos em Regitano (2001).
O objetivo deste captulo fazer com que o aluno entenda os princpios deste
processo, a finalidade de cada reagente em um protocolo de extrao de DNA e, a
partir da, possa utilizar e adaptar os protocolos j existentes de acordo com sua
necessidade e disponibilidade de reagentes.
2.1. Extrao de DNA de Leuccitos

A) Obteno de Leuccitos
1. Coletar 5mL de sangue em tubos contendo EDTA potssico [50 L de
EDTA(K3) a 15%]
O EDTA uma substncia anticoagulante. Existem outras substncias com
esta finalidade (citrato e heparina), porm se o DNA for utilizado para PCR no se
deve utilizar heparina, pois esta substncia interfere na atividade da enzima Taq
DNA polimerase.
2. Transferir 2,5 mL do sangue para um tubo Falcon de 15mL
3. Adicionar 10mL de Soluo A e vortexar at homogeneizar
4. Centrifugar por 10 min a 700 xg
5. Dispensar o sobrenadante
6. Ressuspender o pellet em 5mL de Soluo A
7. Vortexar at dissolver completamente o pellet
8. Centrifugar por 10 min a 700 xg
9. Repetir os passos 4 9 at obter somente as clulas brancas (o pellet
deve estar branco cremoso).
Resduos de hemoglobina inibem a reao de PCR
10. Ressupender o pellet em 500 L de Soluo A e transferir para microtubos
de 1,5mL
11. Centrifugar 5 min a 16.000 xg e descartar o sobrenadante.
As clulas brancas assim preparadas podem ser armazenadas entre -20C e 80C
B) Extrao e purificao do DNA
1. Ressuspender o pellet em 500 L de Soluo B
2. Vortexar at o pellet desprender do fundo do tubo
3. Incubar a 55C por 4-6 horas (ou overnight). Vortexar periodicamente
durante a incubao para que a dissoluo do pellet seja completa
A Soluo B contm Tris HCl (pH 8,0) que uma soluo tampo, cuja
finalidade manter o pH constante. Como o pH timo para a ao de DNases
endgenas por volta de 7,0, este reagente ajuda a evitar a ao destas nucleases.
O SDS um detergente inico forte, cuja funo romper as membranas celulares,
o EDTA age quelando ons Mg2+ e Ca2+ (que so co-fatores de diversas enzimas
nucleares como as DNases) e a proteinase K hidrolisa as protenas.
Se houver disponibilidade de um bloco aquecido com agitador (termomixer),
deve-se deixar as amostras agitando durante a incubao.
4. Adicionar 210 L de TE (pH 7,6) e 240 L de NaCl 5M
O NaCl far com que as protenas precipitem por excesso de ons. O TE um
tampo.
5. Agitar os tubos por inverso at formar pequenos cogulos
6. Incubar em gelo por 10 min
7. Centrifugar por 15 min a 16.000xg
8. Recolher o sobrenadante dividindo-o em dois microtubos de 1,5mL

limpos (mximo de 500 L de sobrenadante por tubo)
9. Adicionar 1mL de etanol 100% (absoluto) gelado em cada tubo e
misturar por inverso
fundamental que o volume de etanol corresponda , no mnimo, 02 vezes
o volume da soluo para que a precipitao do DNA seja eficiente.
Alternativamente, pode-se utilizar 01 volume de isopropanol temperatura
ambiente.
O lcool torna o meio muito hidrofbico para o DNA, fazendo com que ele
precipite sobre sua prpria estrutura.
11. Descartar o sobrenadante
12. Secar em papel
13. Adicionar 500 L de etanol 70% gelado
O lcool 100% faz com que precipitem muitos sais juntamente com o DNA,
alm de dificultar a ressuspenso do DNA, por isso utiliza-se uma lavagem com
lcool 70%.
15. Descartar o etanol e secar o pellet
16. Adicionar 250 L de TE+RNase (10 g de RNase por mL de amostra) e
incubar por 1h a 37C
Este protocolo isola juntamente com o DNA uma quantidade considervel de

RNA, por isso o tratamento com RNase se faz necessrio para remover este
contaminante.
2.2. EXTRAO DE DNA DE SANGUE UTILIZANDO O KIT GFX

Mrcia Cristina de Sena Oliveira
1. Colocar 300 L de sangue e 900 L de soluo de lise em microtubo de 1,5

mL
2. Homogeneizar, centrifugar a 21.000 xg por 5 minutos e descartar o
sobrenadante
3. Homogeneizar e adicionar 500 L de soluo de extrao
4. Incubar por 5 minutos temperatura ambiente e transferir o contedo do
tubo para a coluna de extrao acoplada a um tubo coletor
5. Centrifugar a 5.000 xg por 1 minuto
6. Adicionar coluna 500 L de soluo de extrao e centrifugar a 5.000 xg
por 1 minuto
7. Adicionar coluna 500 L de soluo de lavagem e centrifugar a 21.000 xg
por 3 minutos
8. Transferir a coluna para um microtubo de 1,5 mL, limpo e livre de DNAses
9. Adicionar 100 L de gua bidestilada, autoclavada e aquecida a 70C.
Incubar por 1 minuto temperatura ambiente. Centrifugar a 5.000 xg por 1
minuto
3. EXTRAO DE RNA
Simone Cristina Mo
A anlise do RNA pode fornecer informaes importantes sobre expresso

gnica. Para que isto seja possvel, necessrio que seja feito uma purificao
eficaz do RNA, mantendo sua integridade e qualidade.
Os mtodos para isolamento de RNA baseiam-se na lise e na desnaturao
das clulas que permitem a liberao dos cidos nuclicos totais e na presena de
inibidores que impedem a ao de ribonucleases (RNAses) (Ausubel, 1987).
A principal dificuldade na extrao de RNA a presena de grande
quantidade de ribonucleases (RNAses) estveis e ativas nos tecidos, que permitem
que o RNA (altamente instvel) seja rapidamente degradado. Desta maneira, a
primeira etapa em todos os mtodos de isolamento de RNA aps a pulverizao dos
tecidos, a exposio deste material a tampes de extrao. Estes apresentam
substncias como o cloreto de ltio que auxilia a precipitao do RNA e isotiocianato
de guanidina que permite a manuteno do RNA intacto nas etapas posteriores da
extrao, atravs da degradao das ribonucleases endgenas (Sambrook, 2002).
Atualmente, h vrios reagentes comerciais como, por exemplo, Trizol
(Invitrogen) e Brazol (Lab Trade do Brasil) que possuem em sua composio
reagentes combinados, como isotiocianato de guanidina e fenol, possibilitando uma
extrao de RNA mais rpida que a dos protocolos convencionais e garantindo a
integridade do material (Sambrook, 2002).
necessria ainda a adio de clorofrmio ao tampo contendo RNA que

solubiliza os lipdios permitindo a sua remoo. Aps a centrifugao, trs fases
podero ser observadas: uma rsea formada pela presena do fenol, uma interfase
formada pelo clorofrmio e DNA e uma fase aquosa, onde estar presente o RNA.
A precipitao do RNA feita com um lcool, como por exemplo, o
isopropanol. Nesta etapa, observa-se uma nuvem branca contendo o RNA.
Posteriormente, uma limpeza com lcool permite a retirada de sais que tenham
ainda aderido ao precipitado de RNA (Ausubel, 1987).
Na extrao de RNA, alguns fatores alm da escolha do protocolo utilizado,
so extremamente importantes para a obteno e a manuteno do RNA de
qualidade.
Primeiramente, todas as solues utilizadas devero ser feitas com gua
DEPC (dietilporocarbonato) autoclavada. O DEPC atua inativando RNAses, pois
degrada as histidinas presentes.
Os almofarizes, pistilos, vidrarias e outros utenslios devem ser previamente
esterilizados em estufa a 180 C por um perodo de quatro horas.
As ponteiras, tubos de polipropilenos devem ser novos e livres de RNAses.
As micropipetas devem ser utilizadas apenas para os procedimentos com
RNA.
A bancada deve ser constantemente limpa com SDS 10% e com etanol 70%
e, se possvel, exclusiva para a manipulao de RNA.
E, principalmente, devem ser tomados cuidados com as luvas utilizadas, de
forma a mant-las livres das RNAses, normalmente liberadas abundantemente pelas
secrees da pele.
3.1. Protocolo de Extrao de RNA (adaptado de Chomczynski, 1987)
1. Macerar o tecido em nitrognio lquido

2. Para cada 50 a 100 mg de tecido adicionar 1 mL de trizol (em tubo de
polipropileno de 1,5 mL). Homogeneizar em vrtex
3. Incubar 5 min a temperatura ambiente
4. Acrescentar 200 L de clorofrmio
5. Agitar vigorosamente com as mos por 15 segundos
6. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente
7. Centrifugar a 16.000 xg/4 C durante 15 min
8. Remover a fase aquosa para tubo limpo
9. Adicionar 500 L de isopropanol. Homogeneizar com as mos
10. Incubar por 10 min a temperatura ambiente
11. Centrifugar a 13.000 xg/4 C por 10 min
12. Descartar o sobrenadante
13. Lavar com 1 mL de etanol 75% (feito com gua DEPC)
(Neste ponto, pode armazenar em freezer -20C por at um ano)
14. Centrifugar a 10.500 xg/4C por 5 min
15. Secar o pellet durante 15 min a temperatura ambiente
Obs. No pode ficar nada de etanol.
16. Ressuspender o pellet em gua DEPC (20 L a 50 L)
Obs. Verificar o tamanho do pellet, para avaliar em que volume ressuspender.
4. QUANTIFICAO EM ESPECTROFOTMETRO:
Os cidos nuclicos absorvem luz no comprimento de onda de 260 nm. Para

fazer a leitura no espectrofotmetro, normalmente se utiliza uma diluio em gua.
Para estimar a concentrao de DNA utiliza-se a seguinte relao: 1 OD260 = 50 g
DNA dupla-hlice (Regitano, 2001; Sambrook, 2002).
Dessa forma, a concentrao de DNA na amostra obtida pelo seguinte
clculo:
[DNA] = Valor da leitura em O.D. X 50 X Fator de diluio
As protenas absorvem luz no comprimento de onda de 280 nm. Sendo assim,
a relao A260/A280 fornece um parmetro de avaliao da qualidade das
preparaes de cidos nuclicos. Valores inferiores a 1,8 resultam de contaminao
com protena.
Utilize o espao abaixo para anotar o resultado da quantificao:
Amostra
OD260
OD280
Razo
Concentrao
A concentrao de RNA nas amostras tambm ser avaliada por

espectrofotometria, tendo uma alquota de amostra de RNA dissolvida em gua
deionizada, na proporo de 1:100 (5L de DNA: 495 L de gua deionizada
autoclavada). O grau de pureza do RNA ser estimado pela razo entre as

absorbncias medidas a 260 e 280 nm, que deve ser igual ou superior a 1,75
(Sambrook, 2002). Para uma amostra de RNA pura tem-se que: OD260/OD280 = 1,8 a
2,0. Uma densidade ptica igual 1,0 corresponde a 40 g de RNA (fita simples) por
mL. Desta forma a concentrao de RNA na amostra pode ser calculada atravs da
seguinte relao:
Concentrao de RNA (g/mL) = OD260 X Fator de diluio (100) X 40
Utilize o espao abaixo para anotar o resultado da quantificao:
Amostra
OD260
OD280
Razo
Concentrao
5. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Adelita Carolina Santiago
A reao em cadeia da polimerase nada mais do que a replicao in vitro do

DNA. Foi desenvolvida na dcada de 1980 por Karry Mullis, que conseguiu pela
primeira vez amplificar pequenos fragmentos de DNA. Em 1988, foi descoberta uma
enzima DNA polimerase termoestvel, isolada de Thermus aquaticus, permitindo
que este processo ganhasse automao (Saiki, 1988).
O impacto deste mtodo foi enorme, pois possibilitou facilidade, rapidez,
versatilidade na manipulao de cidos nuclicos, o que tornou a tcnica poderosa e
imprescindvel em grande parte dos procedimentos realizados atualmente.
utilizada, por exemplo, na realizao de seqenciamento, como diagnstico de
doenas, deteco de mutaes pontuais, entre outros.
Esta tcnica envolve trs etapas: desnaturao do DNA pelo calor entre 9495C, anelamento de primers seqncia alvo em fita simples, atuando de 3 a 5C
abaixo da temperatura de melting (35 a 60C) e uma etapa de extenso do primers
anelados por uma DNA polimerase termoestvel (72 a 78C)
Alguns componentes so essenciais para que ocorra a PCR:
1. presena de uma DNA polimerase termoestvel, como por exemplo, Taq
(Termus aquaticus) a ou Tfl (T. flavus);
2. presena de um par de primers, oligonucleotdeos que funcionam como
ponto de incio da polimerizao;
3. ctions divalentes, como MgCl2;
4. deoxinucleotdeos trifosfatados (dNTPs), com quantidades iguais de dATP,

dCTP, dTTP e dGTP;
5. DNA molde, podendo ser fita simples ou fita dupla;
6. Tampo para manuteno do pH, geralmente entre 8,3 e 9 temperatura
ambiente.
5.1. PROTOCOLO DE AMPLIFICAO DO MICROSSATLITE BMS1617
1. Retirar o DNA do freezer e deixar temperatura ambiente

2. Lavar as mos e colocar luvas
3. Limpar a bancada com lcool 70%
4. Marcar os tubos ou identificar a placa. Deve-se criar um registro das amostras
que sero amplificadas no caderno de laboratrio
5. Preparar o Mix de PCR.
Mix de PCR
Reagente [
]
do [ ] de uso
Vol.
Vol.
estoque
(1 amostra)
(__ amostras)
H2O
8,235 L
Tampo* 10X
1X
1,25 L
MgCl2*
20mM
1,5mM
0,94L
dNTP
20mM
0,2mM
0,125L
Primer F 5M
0,25L
0,1M
Primer R 5M
0,25L
0,1M
Taq
5U/L
1U
0,2L
TOTAL
11,25 L
* Sempre verifique se o tampo contm ou no MgCl2. Caso j contenha, no h
necessidade de acrescentar. Acrescente o volume correspondente ao MgCl2 no
volume de gua.
6. Distribuir 11,25L do MIX de PCR sem o DNA em cada tubo

7. Adicionar 1,25L de DNA (40 ng/L) em cada tubo
8. Levar ao termociclador
9. Utilizar o programa touch_54 do termociclador
ProgramaTouch_54
5 ciclos
20 ciclos
94C
94C
30
94C
64C*
30
30
54C
72C
72C
30
45
30
4C
* A cada ciclo, a temperatura de anelamento reduzida em
0,5C, at atingir a temperatura ideal do primer.
O BMS1617 um marcador molecular do tipo microssatlite de repetio tg,

localizado a cerca de 56,3 cM no cromossomo cinco em bovinos. Seus alelos
apresentam tamanho entre 143 e 171 bp.
Resultados:
Animal
Gentipo
5.2. PROTOCOLO DE AMPLIFICAO DO GENE DA TIREOGLOBULINA
1. Retirar o DNA do freezer

2. Lavar as mos e colocar luvas novas
3. Limpar a bancada
4. Tirar o DNA, o gelinho e reagentes (menos a Taq) do freezer
5. Marcar os tubos ou identificar a placa
6. Preparar o Emix
1X
15,54 L
2,5 L
2,44 L
0,25 L
0,82 L
0,82 L
0,13 L
H2O Milli Q
10x PCR Buffer
MgCl2 (20mM)
dNTP (20mM)
Pr up (5 M)
Pr down (5 M)
Taq (5u / l)
X
L
L
L
L
L
L
L
6. Distribuir 22,5L do Emix / tubo ou poo (se for placa de PCR), sempre
sobre um gelinho
7. Distribuir 2,5L DNA / tubo ou poo (se for placa de PCR)
8. Colocar as amostras em um termociclador, escolher o programa correto
para amplificao: Programa RFLP55.
Programa : RFLP55
35 ciclos
94.0
94.0
30
55.0
30
72.0
72.0
30
10
4.0
6. ENZIMAS DE RESTRIO
As enzimas de restrio, tambm chamadas de endonucleases de restrio,

reconhecem uma seqncia especfica de bases em uma molcula de DNA, e
clivam a molcula naquela seqncia ou prximo dela. A seqncia de
reconhecimento chamada de stio de restrio. Diferentes enzimas de restrio
reconhecem e clivam diferentes stios de restrio.
Elas so indispensveis na anlise da estrutura dos cromossomos, no
seqenciamento de DNA, no isolamento de genes, na criao de molculas novas
de DNA que podem ser clonadas e em tcnicas como RFLP. Uma caracterstica
marcante de muitos desses stios de clivagem que eles possuem uma dupla
simetria rotacional, isto , a seqncia de reconhecimento palindrmica e os stios
de clivagem so simetricamente posicionados.
6.1. DIGESTO DO DNA Tireoglobulina
gua Milli Q
BUFFER 10X
MboI (10 U/
l)
Total
Emix 1X
0,5 L
1,4 L
0,1 L
2 L
Emix X
L
L
L
L
Por reao colocar: 2,0 l Emix de digesto + 12l DNA amplificado (produto
de PCR). Realizar esta reao em uma placa de PCR ou em microtubos mdios,
mas sempre sobre o gelinho.
A reao de digesto ser incubada a 37C em aparelho Thermomixer 5436

(Eppendorff).
O volume final da reao ser de 14 L, sendo 12 L de produto de
amplificao e 2 L de Emix de digesto. Este ltimo consiste de 10 mM TrisHCl (pH
8.0); 50 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM 2-mercaptoetanol; 0,1 mg/mL de BSA e 1
unidade da endonuclease de restrio MboI (depende do fabricante). A reao de
digesto ser incubada a 37C (depende do fabricante) por 3 horas.
Para anlise dos gentipos, os produtos das digestes sero separados em
gel de agarose 4% com tampo de eletroforese TBE 1X (90 mM Tris base, 90 mM
cido brico e 2 mM EDTA pH 8,0), submetidos voltagem de 3 V/cm e, corados
com Brometo de Etdeo incorporado no gel. Em cada poo do gel sero aplicados 14
L do produto de digesto acrescidos de 2,8 L de loading buffer numa proporo
de 5:1 respectivamente e, no primeiro poo de cada fileira do gel ser aplicada uma
amostra de padro de tamanho de DNA de 100 pb tambm acrescido de loading
buffer na mesma proporo acima.
Os fragmentos sero detectados sob iluminao UV e registrados por uma
cmera fotogrfica digital. Os tamanhos dos fragmentos sero estimados por
comparao com padro de tamanho de DNA de 100 pb em cada gel e assim ser
possvel determinar os gentipos de cada animal.
Os primers utilizados na PCR amplificam uma regio de 545 pares de bases
do gene da tireoglobulina, como ilustrado a seguir:
>gi|790|emb|X05380.1| Bovine thyroglobulin gene exon 1 and flanks

AAGCTTCCTGCTGCCTTTTGGTTGTCTGACGTCCTGGGACAGAGGGGAAAGGG
GGATGACTACGAGTATGACTGTGCGTGTGTTTGGCTTATCTCATCAAAATCTCTA
CATTCTGTGTTAATGGATCTGCCTGTTTTGTTCCCTGCCATATCCTCATGGCCT
AGAATAGTGTCTGCTTCTCTATCAGACTCTAAAGAAACATTGCTAGGAGGGAAG
GAAGGAGCATGGATGAGGAGGGAGGGAGCATTGTGTTTCTCTCACGGTGGGCC
TGAACGTGTGGCCCACCAAGTTGTTAACTTTGGCCTTTACCCCTGAAGATGAATT
ATGAAGCCACACCCCCAGTTCTTCCTTGGTGGCTCAGATGGTCAAGAATCCACC
TGCAATGCGGGAGACCTGGGTTTGATCCCTGGGTTGGGAAGATCCCCTGGA
GAAGGGAATGGCTACCCACTCCAGTATTCTGGCCTGGAGAATCCCATGGACAG
AGGAGCCTGGCGGGATGCAGTCCATGGGGTCTCAGAGAGTCAGATGTGACTGA
GCGACTTTCACACACATTCGTCCCTGGTTCTGCTCCCCTACAGCCTCCACAAGA
TTTTCAC*CCCACACTGGCCACATGAGTGTCCTCCAGGGGAACAGACGCAGGTG
GAGGACCTCCTTGTGACCAGCAGAGAAAACAGGGTGGGCACTGCTTCCCTGAG
TGCCTGTGGGTGGGGGCTAAGTACCCACAGCAGTGCTATAAAGGCTCCTTGGC
CAGAGCCCTAAGGTGGGCAGCAGCTTCTAACCCTTCTCCCTGGAAGGCTCCCA
AGATGGCCCTGGCCCTATGGGTCTTCGGTCTGCTGGACTTAATCTGCTTGGCAT
CCGCCAACATCTTTGGTAAGTTCTGACCCTGCGGTCTCAGAGCATCGGGTTGG
GAGGGACCTCTGAGGCCAACTCCTTGTTAGCCAGGACCTGCCCCAGGGCCATG
GAACATTTGTGACCTCATTTAATCCTCAGTGTCCCGAGGTCAGTTATGCACTCTT
TCCTTTTCAGATGAAGAGACAGAGGGTCTGAGAAGTCACAGAGTCAGTGATC
Obs. Os stios de anelamento dos primers esto sublinhados.

Em negrito, podem ser observados os stios de restrio
Aps digesto com a enzima MboI, o alelo A caracterizado pela presena de

trs fragmentos de restrio, com 74, 193 e 278 pares de bases, respectivamente, o
alelo B produz fragmentos de 17, 74, 176 e 278 pares de bases.
Figura 1. Gel com fragmentos da tireoglobulina aps digesto com enzima de

restrio MboI. Na coluna 1, pode ser observado o padro de tamanho 100 pb, na
coluna 2, homozigoto AA, coluna 3, homozigoto BB e Coluna 4, heterozigoto AB.
Resultados
Animal
Gentipo
7. ELETROFORESE DE CIDOS NUCLICOS

A eletroforese uma tcnica utilizada para separar, identificar e purificar

molculas carregadas (como DNA e protenas) (Maniatis, 1987). Este mtodo foi
introduzido por Tiselius, no ano de 1937 (Brammer e Iorczeski, 2002) e simples,
rpido e capaz de separar fragmentos que no so adequadamente separados por
outras tcnicas (Sambrook e Russel, 2002).
A tcnica apresenta basicamente um sistema de suporte (gel de agarose, por
exemplo), um tampo no qual est imerso o gel e os eletrodos nas extremidades da
cuba onde esto contidos o tampo e o gel.
Sob a influncia de um campo eltrico, molculas carregadas e partculas
migram em direo ao plo oposto. A carga e a massa das molculas fazem com
que elas migrem em velocidades diferentes e, portanto, propiciam a separao
destas (Westermeier, 2005). Como os cidos nuclicos (DNA e RNA) possuem
carga eltrica negativa (devido ao grupamento fosfato) eles sempre migraro em
direo ao plo positivo. Ento, o fator determinante da taxa de migrao ser a
massa da molcula (quando se fala em cidos nuclicos, a massa diretamente
proporcional ao tamanho da molcula).
Existem vrios meios de suporte que podem ser utilizados (papel filtro,
membrana de celulose, gel de agarose, gel de poliacrilamida). No caso dos gis, a
porosidade (que tem uma relao direta com a concentrao de agarose) determina
o poder de separao (Brammer, 2002).
Na escolha do tampo, o principal fator a ser considerado sua capacidade

tamponante. Os dois tampes mais utilizados na eletroforese de cidos nuclicos
so o TAE (Tris, Acetato e EDTA) e o TBE (Tris, Borato e EDTA). O TAE mais
utilizado que o TBE, porm mais facilmente exaurido durante corridas longas ou
com alta voltagem. O TBE, apesar da melhor capacidade tamponante, deve ser
evitado quando se deseja purificar os cidos nuclicos do gel (Ausubel, 1994).
Alguns fatores alteram a migrao das molculas atravs do gel, dentre eles
podemos citar: concentrao de agarose, conformao do DNA e intensidade da
corrente.
A concentrao de agarose atua de forma importante na eletroforese, pois ela
determina a faixa de tamanho das molculas de DNA que podem ser separadas. As
relaes entre concentrao de agarose e resoluo de molculas lineares de DNA
so apresentadas na tabela abaixo (Maniatis et al., 1982).
Tabela 1. Limites de eficincia da separao de DNA em diferentes concentraes

de agarose (Maniatis, 1987)
Concentrao de agarose no Separao de molculas de DNA
gel (%)
(Kb).
Limites de eficincia
0,3
60 5,0
0,6
20 1,0
0,7
10 0,8
0,9
7 0,5
1,2
6 0,4
1,5
4 0,2
2,0
3 0,1
Para observar cidos nuclicos em gel de agarose, deve-se cor-los e

submet-los a uma luz ultravioleta. O corante mais comum o brometo de etdeo,
que se intercala entre as bases do DNA (Ausubel, 1994).
7.1. Protocolo para anlise de produtos de amplificao e fragmentos de

digesto em gel de agarose
gel 1% 0,3 g de agarose para 30 mL de gel, que deve ser preparado com
tampo Tris-Borato-EDTA 1X. Para isso, aplicar 5 l de produto de amplificao
+ 1 l de loading buffer.
gel 4% 1,2 g de agarose de baixo ponto de fuso para 30 mL de gel, que deve
ser preparado com tampo Tris-Borato-EDTA 1X. Utilizado para analisar o
resultado das digestes com enzimas de restrio. Aplicar todo o produto da
digesto (13 l) + 2,6 l de loading buffer.
1. Pesar a agarose
2. Coloc-la em um erlenmeyer contendo o volume necessrio de tampo TBE 1X
3. Aquecer no forno de microondas at iniciar a ebulio (aproximadamente 30
segundos em potncia mdia para um gel de 30 mL). Agitar o frasco e retornar
ao forno de microondas por mais alguns segundos
4. Aguardar a reduo da temperatura para aproximadamente 60
C e adicionar
Brometo de Etdio, na quantidade indicada para cada gel

5. Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes
6. Aps a solidificao, colocar o gel na cuba de eletroforese e cobrir com tampo
TBE 1X
7. Aplicar as amostras acrescidas de loading buffer e aplicar a corrente de acordo

com o tamanho do gel
A eletroforese deve ser realizada em TBE 1X, a uma voltagem constante na faixa
de 2 a 5 V/cm (considerando a distncia entre os eletrodos). Aps a corrida,
submergir o gel por 20 minutos em soluo de brometo de etdio a 0,5 g/mL e
visualiz-lo sob luz ultra-violeta. Caso o fundo do gel esteja muito corado, podese lavar o excesso de brometo por submerso em TBE 1X por 5 a 10 minutos
O Brometo de etdio um potente agente mutagnico. Utilizar luvas e mscara

para preparar a soluo estoque e manipular os gis
A luz ultra-violeta produz queimaduras severas. Utilize mscara/culos de
proteo adequados
7.2. GEL DESNATURANTE PARA RNA

Para analisar molculas de RNA podem ser utilizados gis de agarose e

poliacrilamida, desnaturantes ou no. As propriedades desta eletroforese so
basicamente semelhantes s de eletroforese de DNA (Patel, 1994).
A qualidade das molculas de RNA pode ser analisada em gel de agarose
normal, feito com tampo (TBE, TAE) com gua DEPC ou em gel desnaturante.
Devido a interaes intramoleculares, as molculas de RNA podem dobrar-se,
alterando a estrutura secundria e afetando a migrao das molculas no gel. O gel
desnaturante soluciona este problema, pois sob condies desnaturantes as pontes
de hidrognio so rompidas e o RNA migra como molcula de fita simples. Isto
permite avaliar com acurcia a qualidade e o peso molecular do RNA (Sambrook,

2002; Maseka, 2005).
Dentre os desnaturantes existentes, o mais poderoso, alm de caro e
altamente txico o hidrxido de metil mercrio. Porm, o mais freqentemente
utilizado o formaldedo, mas pode haver variantes de gis utilizando tiocianato de
guanidina, formamida e DMSO. A utilizao de cada um deles apresenta vantagens
e desvantagens de acordo com a escolha do tipo de gel, poliacrilamida ou agarose,
diferentes nveis de toxicidade e potencial de desnaturao (Patel, 1994).
Os gis polimerizados com formaldedo no coram satisfatoriamente as
amostras, de forma que o brometo de etido deve ser colocado em cada amostra
individualmente, e no no gel, como comumente utilizado (Regitano, 2001).
Outro diferencial no gel desnaturante de agarose a utilizao de MOPS (3N-morfolino cido propanosulfnico). O MOPS um excelente tampo para
manuteno de sistemas biolgicos em pH neutro. muito utilizado em biologia
molecular e bioqumica.
1
28S
18S
5S
Figura 2. Exemplo de separao eletrofortica. Nos nmeros 1 a 3 so mostradas

as bandas 28S, 18S e 5S do RNA, indicando integridade das amostras. O nmero 4
exemplifica uma amostra de RNA degradada.
7.2. PROTOCOLO DE GEL DESNATURANTE DE AGAROSE 1% COM

FORMALDEDO (adaptado de Lcia Elvira Alvares (2001):
Reagente
Quantidade
Agarose (1%)
0,3 g
Buffer 5X (1 x)
6,0 mL
Formaldedo (2,2M)* 5,4 mL
gua DEPC
18,6 mL
Total
30 mL
* verificar se o pH do formaldedo superior a 4
A vidraria utilizada para a preparao do gel, assim como a cuba de

eletroforese devem estar previamente tratadas contra ao de RNAses. Todas as
solues empregadas devem ser feitas com gua DEPC.
Tampo de corrida 5X
Reagente
MOPS (100 mM)
Acetato de sdio 0,05 M (40 mM)
EDTA 0,5 M pH 8,0 (5 mM)
Quantidade
20,6 g
800 mL
10 mL
1. Pesar o MOPS
2. Dissolv-lo em acetato de sdio 0,05 M. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 2N
e completar o volume para um litro de gua DEPC
3. Adicionar o EDTA 0,5 M pH 8,0. Guardar protegido da luz
4. Diluir este tampo para concentrao final de 1X com gua DEPC
Tampo da Amostra
Reagente
Tampo de Corrida 5X
Formamida (50 %)
Formaldedo (10 %)
Azul de bromofenol (0,4 %)
gua DEPC
Quantidade
300 L
750 L
150 L
0,004 g
300 L
1. Acrescentar 3 L do tampo da amostra para cada 1 L de RNA

2. Acrescentar 1 L de brometo de etdio (0,05 g/L)
3. Incubar as amostras por 15 minutos 65 C
4. Transferir para um recipiente contendo gelo
5. Centrifugar rapidamente para recolher o contedo no fundo do tubo
6. Manter em gelo at aplicar as amostras no gel
7.3. ELETROFORESE EM SISTEMA CAPILAR

Gustavo Gasparin
Durante dcadas, a eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose foi

intensamente utilizada como uma das ferramentas mais importantes dos laboratrios
de biotecnologia e bioqumica para a anlise de macromolculas. Nos ltimos anos,
porm, a eletroforese capilar tem apresentado vantagens em relao tcnica de
eletroforese em placas. Para a anlise simultnea de amostras, instrumentos de
eletroforese capilar com arranjo de capilares so os mais utilizados. Existem
aparelhos que possuem desde um nico capilar, at 384 capilares, possibilitando a
maximizao do tempo necessrio para as mais diferentes anlises, desde deteco
de resduos de explosivos e drogas, at testes de paternidade.
A separao das macromolculas conduzida em tubos de dimenses de 15
a 100 m de dimetro interno, e 36 a 100 cm de comprimento, preenchidos com um
eletrlito. O uso do capilar fornece vantagens sobre as placas de gel devido s
razes geomtricas, em que h uma elevada relao entre a rea superficial e o
volume interno, permitindo a dissipao eficiente do calor gerado pela corrente
eltrica, e possibilitando a aplicao de campos eltricos elevados (100 a 500 V/cm),
o que resulta em separaes de alta eficincia, alto poder de resoluo, e reduzido

tempo de anlise.
Em geral, um aparelho de eletroforese capilar bsico consiste de uma fonte
de alta tenso, capilares (geralmente de slica fundida), eletrodos (de platina,
normalmente), e um detector apropriado. A fonte de alta tenso aplicada nos
eletrodos de platina situados nos reservatrios contendo uma soluo eletroltica
apropriada. As extremidades do capilar so imersas nos reservatrios da soluo,
para completar o contato eltrico. As amostras normalmente so introduzidas no
capilar por mtodos eletrocinticos, nos quais uma diferena de potencial
estabelecida entre o capilar e o recipiente que contm a amostra, durante um tempo
pr-determinado.
O detector localiza-se em algum ponto do capilar, prximo ao reservatrio de
sada.
A eletroforese capilar em gel (CGE) utilizada exclusivamente para
separao de macromolculas, tais como oligonucleotdeos, fragmentos de DNA, e
protenas. Teve incio com a aplicao nas separaes de DNA por tamanho
molecular, utilizando colunas preenchidas com gel, denominados gis qumicos: um
capilar tratado com um reagente que estabiliza o gel junto parede do capilar,
atravs de ligaes covalentes. Esse mtodo foi descartado dado o grande nmero
de problemas que surgiram, tais como aparecimento de bolhas (perda de
condutividade), introduo limitada de amostra, reteno de fragmentos com alto
peso molecular, e degradao do gel por hidrlise. Tais problemas levaram
formulao de novos sistemas, que foram denominados gis fsicos.
Gis fsicos so matrizes polimricas hidroflicas, dissolvidas em tampo
apropriado, que no so ligados parede do capilar, podendo assim ser substitudos
a cada separao, o que permite o aproveitamento do mesmo capilar por centenas

de vezes, sem perda de eficincia. A uma dada concentrao de polmero, as fitas
polimricas individuais comeam a interagir umas com as outras, formando uma
estrutura em rede dentro do capilar, possibilitando a separao dos fragmentos de
DNA. A concentrao polimrica tima depende do tamanho do DNA a ser
separado.
7.4. PROTOCOLO PARA ANLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAO EM

SISTEMA CAPILAR
Antes da injeo no capilar, as amostras so desnaturadas em presena de

formamida, para evitar que a formao de estruturas secundrias afete a velocidade
de migrao. Um padro de tamanhos conhecidos aplicado junto com as amostras
para permitir a estimativa do tamanho dos fragmentos analisados.
Procedimento:
1. Preparar o MIX de formamida + padro interno de tamanho de fragmentos:
para cada amostra, colocar 8,85 L de formamida Hi-Di e 0,15 L de padro
(GS 500 ROX).
2. Aplicar esses 9 L de MIX em um pocinho da placa de corrida
3. Aplicar 1 L de produto de PCR da sua amostra por pocinho
4. Desnaturar as amostras (j na placa de corrida) durante 5 minutos 95C
5. Colocar as amostras imediatamente no gelo aps a desnaturao,
permanecendo por 5 minutos.
6.
Preparar a injeo das amostras no computador, atravs do software Data

Collection
8. SEQENCIAMENTO
Kerli Ninov
Lilian Giotto Zaros
As duas tcnicas mais importantes para o seqenciamento de DNA so o

mtodo qumico de degradao de bases desenvolvido por Allan Maxam e Walter
Gilbert em 1977 e o mtodo didesoxi ou terminao da cadeia de Fred Sanger e
colaboradores em 1978.
Os dois mtodos so baseados na produo de um conjunto de fitas simples
de DNA que so separadas pelo princpio de eletroforese (Okubo, 1992). Se
comparado ao seqenciamento de Maxam e Gilbert, o mtodo de terminao da
cadeia de Sanger gera dados que so mais facilmente interpretados. Por isso, essa
tem sido a tcnica mais utilizada em Projetos Genoma (Sterky & Lundeberg, 2000).
SEQENCIAMENTO DIDESOXI OU POR TERMINAO DA CADEIA
baseado
na
incorporao
de
desoxinucleotdeos
(dNTPs)
de
didesoxinucleotdeos (ddNTPs) a uma cadeia de DNA em crescimento, tendo como

molde o DNA de interesse.
Quando os ddNTPs so adicionados, a extenso da cadeia interrompida
pois esses didesoxinucleotdeos no apresentam um grupo hidroxila (OH) 3
necessrio para a ligao do prximo desoxinucleotdeo (dNTP). Como esses
ddNTPs so marcados, podem ser detectados e a seqncia dos nucleotdeos,
identificada.
Esse mtodo apresenta duas modalidades:
Seqenciamento Manual
No mtodo manual, a sequncia de bases do DNA lida manualmente, aps

a exposio das bases identificadas em um filme de raio-X. Para isso so
preparados 4 tubos de reao, cada um contendo o DNA molde, a DNA polimerase
e um primer. Cada tubo recebe uma pequena quantidade de um dos ddNTP (dATP,
ddTTP, ddCTP e ddGTP) junto com um dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP ou dGTP)
marcados com fsforo radioativo (P32).
Em qualquer um dos 4 tubos sero produzidos vrios comprimentos de
cadeia, cada um correspondente ao ponto no qual o respectivo ddNTP desse tubo
foi incorporado e ocasionando o trmino do crescimento da cadeia. As amostras de
cada tubo so submetidas eletroforese e posterior exposio em filme de raio-X
para que a posio das bases correspondentes possa ser determinada lendo-se ao
longo das 4 colunas do gel (www.dnai.org).
Seqenciamento Automtico
O seqenciamento automtico utiliza seqenciadores com eletroforese

vertical em placa ou eletroforese em capilar onde cada ddNTP possui marcao
fluorescente, ao contrrio do mtodo manual, em que estes apresentam uma mesma
marcao radioativa.
Para a gerao de fragmentos durante a reao de seqenciamento, os
dNTPs so adicionados nova fita e no momento da adio de um ddNTP, a
extenso da cadeia interrompida e conseqentemente marcada com o ltimo
didesoxinucleotdeo incorporado. No final de vrios ciclos tem-se vrias cadeias de
DNA de diferentes tamanhos terminadas com diferentes ddNTPs que posteriormente
sero identificados (lidos em seqenciador automtico).
A reao de seqenciamento ocorre em termociclador e caracterizada por

vrias etapas ou ciclos em diferentes temperaturas, repetidos por vrias vezes por
um determinado perodo de tempo. Suas etapas so:
1- Desnaturao - a primeira etapa da reao de seqenciamento na qual a
molcula de DNA separada em fita simples. Para ocorrer a desnaturao eleva-se
a temperatura a 96C durante 2 minutos.
2- Anelamento - Caracterizada pela utilizao de um nico primer que ir se
anelar fita de DNA na regio complementar sua seqncia. Para ocorrer o
anelamento diminui-se a temperatura para 50C durante 15 segundos.
3- Extenso - Aps o anelamento do primer, ocorre a extenso do fragmento
atravs da insero dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) pela Taq DNA
Polimerase. Como os ddNTPs esto em concentraes muito menores
que os
dNTPs, a sua insero na cadeia menos freqente. Essa etapa ocorre a 60C
durante 4 minutos. Quando os ddNTPs so inseridos no lugar dos dNTPs, a
extenso pra.
Aps a reao de seqenciamento, os produtos so submetidos
eletroforese capilar no seqenciador automtico. Os fragmentos marcados com
fluorescncia migram ordenadamente no interior dos capilares e medida que so
excitados por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda
que so detectados por uma cmara CCD. Em seguida essa informao
transmitida ao computador e processada para que ao final da corrida, os dados
possam ser recuperados em formato de eletroferograma ou de texto (fasta),
seguindo-se da anlise de bioinformtica.
8.1. PROTOCOLO DE REAO DE SEQENCIAMENTO

Para a realizao de uma reao de seqenciamento so necessrios os
seguintes componentes:
- DNA template na concentrao de 100 a 150 ng/L para DNA plasmidial e
de 50 a 80 ng/L para produto de PCR;
- Primer: oligonucleotdeo complementar determinada regio do fragmento
de interessse (Ex: primer universal M13 R ou F);
- dNTPs: Desoxinucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);
- ddNTPs: Didesoxinucleotdeos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP);
-Tampo contendo magnsio (Mg+2 ) e Tris-HCl, que atuam como co-fator
enzimtico e tampo para manuteno do pH, respectivamente;
- Enzima Taq DNA Polimerase
OBS: A enzima, os dNTPs e ddNTPs esto contidos no Kit ABI PRISM Big
Dye terminator v. 3.1 cycle sequencing.
Procedimentos:
1-Retirar as amostras e os reagentes do freezer e mant-los no gelo. Todos
devem estar totalmente descongelados;
2-Preparar o seguinte mix em microtubo de 1,5 mL:
Mix
Big dye (2,5 X)
Buffer Big Dye (5X)
Primer (3,2 pmol)
gua milliQ
DNA (10 ng)
Total
1X
2 L
1 L
1 L
5 L
1 L
10 L
3 - Manter o mix no gelo e vortex-lo por alguns segundos;

4 - Dispensar o mix na placa de seqenciamento de acordo com a quantidade
estipulada;
5 - Adicionar a quantidade desejada de DNA ressuspendendo a soluo e
observando se o DNA est se misturando ao mix;
6 - Cobrir a placa com um tapete de borracha e lev-la ao termociclador
utilizando o programa adequado, como por exemplo:
Pr-incubao: 94 C por 2 minutos
Amplificao:
96 C por 20 segundos
25 ciclos de
60 C por 04 minutos
Resfriamento: 4 C por .
A tabela abaixo mostra a quantidade de amostra utilizada em uma reao de

seqenciamento:
8.2. PURIFICAO DA REAO DE SEQENCIAMENTO

Aps a reao de seqenciamento necessrio purificar o material para que
os ddNTPs, dNTPs , primers e enzima no incorporados no interfiram na leitura no
seqenciador.
1. Adicionar 40L de isopropanol 65% a temperatura ambiente;
2. Vortexar alguns segundos e incubar no escuro a TA por 15 minutos;
3. Centrifugar por 25 minutos a 3000 xg a TA;
4. Descartar o sobrenadante por inverso e dar um pulso em centrfuga com a
placa invertida em um papel absorvente at 40 xg;
5. Adicionar 200L de etanol 60% e centrifugar por 5 minutos a 3000 xg a TA;
6. Descartar o sobrenadante por inverso e dar um pulso em centrfuga com a
placa invertida em um papel absorvente at 90 xg;
7. Secar no escuro por 1 hora;
8. Caso a aplicao em seqenciador automtico no seja feita imediatamente,
selar a placa com adesivo, embalar em papel alumnio e armazenar em
freezer 20C.
8.3. APLICAO EM ABI 3100

1. Ressuspender as amostras com 10L de formamida Hi-Di;
2. Desnaturar as amostras em termociclador por 5 minutos a 95 C;
3. Verificar a validade e a quantidade do polmero (POP6) e tampo (EDTA 10X).
O polmero vlido por cinco dias quando j no equipamento e o tampo tem
validade de 48 horas ou duas placas corridas. recomendvel a cada 15 dias retirar
o capilar, desmontar o aparelho e realizar uma limpeza em seus componentes;
4. Enquanto isso, montar a planilha de corrida no software Data Collection em

Plate View;
5. Nesse momento aberta uma nova planilha:
- Sample name (.g)
- Dye Set (F);
- Mobility File (DT3100POP6- BDV3-V1.mob);
- Bio LIMS (3100Project);
- Run Module 1 (StsSeq50_POP6 Default Module);
- Analysis Module 1 (BC_3100_SeqOffFtoff.saz);
- OK
6. Esfriar a placa em gelo;
7. Montar a placa nos acessrios prprios do seqenciador;
8. Colocar a placa no seqenciador verificando na planilha Run View se ela
est corretamente instalada;
9. Clicar em Status View (Verificar voltagem, laser e temperatura);
10. Caso esteja tudo OK, clicar em Run.
11. Aguardar para verificar possveis erros durante o incio da corrida;
12. Aps 40 minutos, possvel o acompanhamento da corrida pela visualizao
da imagem de cada capilar;
13. Ao trmino da corrida analisar os dados pelo software Sequence Analysis;
14. Adicionar a corrida desejada atravs do Add Files e clicar em Start;
15. Aguardar a execuo da tarefa;
16. Abrir os eletroferogramas e avaliar os resultados obtidos.
9. SNTESE DE DNA COMPLEMENTAR (cDNA)

A converso enzimtica de mRNA para cDNa foi descoberta na dcada de

1970 por Kacia, Ross, Verma e colaboradores (Sambrook, 2002).
A sntese da primeira fita de cDNA realizada por uma enzima transcriptase
reversa dependente de RNA, geralmente isoladas de vrus, que usa amostras de
RNA mensageiro (poli A) ou RNA total como molde. Atualmente, diversas espcies
de transcriptases reversas so comercialmente utilizadas, como Mo-MLV, ALV e
SuperScript RT II (manual do usurio, 2003).
Para que esta converso seja feita, so necessrios:
- dNTPs: altas concentraes de dNTPs so importantes para a obteno de
boa eficincia na sntese do cDNA.Em baixas concentraes (< 50 M) h
decrscimo significativo na produo da primeira fita. Geralmente, so utilizados
cerca de 200 a 250 M de cada dNTP (Maniatis, 1987).
- um oligonucleotdeo, sendo o mais utilizado o oligo dT, pois sintetiza a
primeira fita a partir de RNAs de cadeia poli A (manual do usurio, 2003).
- tampo: a presena deste reagente importante, pois a alterao do pH
acarreta a diminuio da eficincia da incorporao e da produo de transcritos. O
pH timo geralmente 8,3. J foi observado que pequenas alteraes de pH, de at
0,5 resultam em diminuio de at 5X na produo do cDNA (Maniatis, 1987).
- MgCl2: os ctions divalentes so importantes na transcrio reversa pois
auxiliam na produo de transcritos completos em concentraes de 6 a 10 mM.
Quando fragmentos muito longos sero transcritos, podem ser utilizados ctions
monovalentes, dentre eles, o mais indicado o potssio, que auxiliam na

manuteno da eficincia da transcrio.
- RNAse OUT (Invitrogen): degrada RNAses presentes durante a sntese do
cDNA (Manual do usurio, 2003).
- DTT ou ditiotreitol: um agente redutor que tem como principal funo
proteger oxidao de enzimas e protenas (Roche, 2004).
- RNAse H: utilizada no final da reao para remover hbridos RNA:cDNA
com a funo de aumentar a sensibilidade e a eficincia do PCR. A presena de
RNAse H durante a sntese do cDNA degrada o mRNA, causando um dficit na
produo desta molcula. Por isso, foram desenvolvidas transcriptases reversas que
apresentam atividade reduzida de RNAse H durante a produo da primeira fita e
que so adicionadas apenas no final da reao, para remoo de molculas hbridas
(Manual do usurio, 2003).
importante considerar que para que este procedimento tenha sucesso, o
RNA das amostras deve ser intacto e sua quantificao, precisa, para evitar
variaes na utilizao deste molde em tcnicas futuras, como por exemplo, em
arranjos de DNA ou PCR quantitativo.
9.1.PROTOCOLO DE SNTESE DE CDNA
1. Descongelar e homogeneizar brevemente cada componente abaixo.

Preparar o mix RNA/primer:
Componente
At 5 g de RNA total
10 mM dNTP mix
Oligo dT 0,5 g/L
gua DEPC (do kit)
Para uma amostra

Mximo de 8 L*
1 L
1 L
Completar para 10 L*
*o volume deste mix deve ser 10 L. Assim, o volume mximo de RNA a ser
utilizado 8 L contendo de 1 ng a 5 g de RNA total. Se for utilizado 8 L, a gua
DEPC do kit no adicionada ao mix.
2. Incubar a 65 C por 5 minutos;

3. Esfriar em gelo por 1 minuto;
4. Preparar o mix de reao adicionando cada componente a partir da
primeira linha da tabela. Este mix pode ser preparado em um tubo separado, junto
com a preparao do mix anterior. Se isso for feito, mant-lo sempre em gelo:
Componente
Buffer RT 10 X
MgCl2 (25 mM)
0,1 M DTT
RNAse out
Total
Para uma amostra

2 L
4 L
2 L
1 L
9 L
5. Adicionar os 9 L do mix acima em cada tubo contendo o RNA/primer. Dar

um spin;
7. Adicionar 1 L (50 U) da enzima SuperScript RTII em cada tubo
obs. Os tubos no podem ser colocados em gelo para adio da enzima RTII. A
temperatura deve continuar de 42 C;
9. Terminar a reao a 70 C por 15 minutos;
10. Esfriar no gelo e dar um spin;
11. Adicionar 1 L de RNAse H e incubar por 20 minutos a 37 C;
12. Estocar em freezer 20 C.
10. PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL

Helena Javiel Alves
O mtodo de PCR quantitativa em tempo real muito sensvel e pode ser

usado quando necessrio quantificar a expresso de RNAs mensageiros em
baixos nveis. Esse procedimento permite a deteco direta dos produtos da PCR
durante a fase exponencial da reao, combinando amplificao e deteco em um
s passo.
O princpio da tcnica de PCR em tempo real pode se utilizar de duas
descobertas importantes: a primeira a atividade exonuclease 53 da enzima Taq
DNA polimerase e a segunda a construo de sondas de oligonucletdeos
marcadas duplamente. Essas sondas so baseadas no princpio FRET (do ingls,
Fluorescence Resonance Energy Transfer) e emitem sinal de fluorescncia somente
quando clivadas. Com o objetivo de detectar o sinal de fluorescncia durante as
reaes foram desenvolvidas vrias tcnicas. Em PCR em tempo real utilizando
sondas TaqMan (Figura 3), a sonda, especfica para o gene de interesse, marcada
duplamente com um fluorforo reprter em uma extremidade e um fluorforo
silenciador na outra. Na forma ntegra, a transferncia de energia fluorescente
ocorre de forma que a emisso pelo reprter absorvida pelo silenciador. Quando
ocorre a degradao da sonda pela atividade exonuclease da enzima Taq DNA
polimerase, durante a PCR, os fluorforos reprter e silenciador so separados e a
emisso de fluorescncia do reprter no ser mais absorvida pelo silenciador
resultando em aumento de emisso de fluorescncia pelo reprter que ser
detectada e quantificada.
primer direto
silenciador
reprter
primer reverso
reprter
polimerase
silenciador
polimerase
Figura 3. Sistema TaqMan. (A) Aps a desnaturao, os primers e a sonda anelamse seqncia alvo. A emisso de fluorescncia no ocorre devido proximidade
entre o reprter e o silenciador. (B) Durante a fase de extenso, a sonda clivada
(53) pela atividade nuclease da enzima Taq DNA polimerase. Ento, reprter e
silenciador so separados, permitindo a emisso de fluorescncia pelo reprter.
Mais recentemente, outros sistemas sofisticados tm sido desenvolvidos
como, por exemplo, molecular beacons, scorpions e sondas para hibridizao.
Esses sistemas so baseados no princpio FRET, porm sem a necessidade de
hidrlise por atividade nuclease.
Outra forma de deteco a utilizao de corantes como SYBR Green
(Figura 4), que se liga ao DNA dupla fita emitindo fluorescncia. O uso desse
mtodo de deteco tem sido bastante empregado em ensaios de PCR quantitativa
em tempo real, pois tem a vantagem de ser mais barato em relao construo de
sondas marcadas. Um aspecto importante no uso de SYBR Green que os primers
utilizados na reao de PCR devem ser desenhados cuidadosamente para evitar a
amplificao de produtos inespecficos e formao de dmeros, uma vez que esse

corante se liga a qualquer DNA dupla fita.
SYBR Green
Seqncia alvo
fluorescncia
Figura 4. Sistema SYBR Green. (A) O corante livre na soluo no emite

fluorescncia. (B) Quando o corante se liga ao DNA fita dupla ocorre a emisso de
fluorescncia.
Usando qualquer uma das qumicas apresentadas, o aumento na emisso de
fluorescncia pode ser lido por um detector em tempo real, durante a reao de PCR
e uma conseqncia direta da amplificao da seqncia de DNA de interesse.
Um programa de computador calcula um
Rn usando a seguinte equao:
Rn= Rn+ - RnOnde: Rn+ = emisso de fluorescncia em cada ponto;

Rn- = emisso de fluorescncia na linha de base.
O computador constri os plots de amplificao usando os dados de emisso

de fluorescncia durante a PCR. Os valores de
Rn so plotados vezes o nmero
de ciclos de amplificao. Durante os ciclos iniciais da amplificao por PCR, os

valores de
Rn no excedem a linha de base. Portanto, um ciclo limiar (Ct)
arbitrrio escolhido baseado na variao da linha de base. Os valores de Ct so

ento calculados por determinao do ponto no qual a fluorescncia excede esse
limiar escolhido. O Ct definido como o nmero de ciclos nesse ponto (Figura 5).
Figura 5. Exemplo de construo dos plots de amplificao, onde
Rn plotado
contra o nmero de ciclos.

Existem dois mtodos mais comumente utilizados para analisar dados de
experimentos de PCR quantitativa em tempo real, so eles: o mtodo de
quantificao absoluta (mtodo da curva padro) e o mtodo de quantificao
relativa.
Mtodo de quantificao absoluta O nmero de cpias do gene de interesse
determinado relacionando-se o sinal da PCR com uma curva padro. Para a
construo da curva padro, so utilizadas diluies seriais de uma amostra de

concentrao conhecida. Esse mtodo tem a vantagem de que a curva padro
includa em cada PCR fornece um controle extra e correo na eficincia da PCR de
cada amostra individual, tornando mais confiveis as comparaes entre
experimentos.
Mtodo de quantificao relativa Esse mtodo mais usado quando existem
muitos genes a serem testados em muitas amostras. Nesse caso, feita a relao
entre o sinal da PCR de um gene de interesse entre um grupo tratado com uma
amostra controle (por exemplo, uma amostra no-tratada). Esse procedimento tem a
vantagem de no necessitar da construo de curvas padro. Por outro lado, as
eficincias de amplificao dos genes de interesse e controle tm que ser similares
para a obteno de resultados confiveis.
Em ambos mtodos so utilizados genes constitutivos para a normalizao
das amostras. Tais genes devem ter expresso constante em todos os tecidos e em
todas as fases de desenvolvimento, bem como no serem afetados pelos
tratamentos experimentais. O gene mais utilizado com esta finalidade o gene da actina.
O mtodo de PCR quantitativa em tempo real tem se mostrado uma
ferramenta de extrema importncia na quantificao de RNAs mensageiros em
baixos nveis, tornando a quantificao mais rpida e acurada.
10.1. PROTOCOLO DE UMA PCR EM TEMPO REAL

1. Preparar o Sybr Green mix* para 50 reaes. Este procedimento realizado
com o objetivo de padronizar os componentes da reao que sero distribudas para
cada amostra. O mix consta de:
100 L de tampo de reao 10X (tampo da enzima Taq DNA polimerase)
2 L de Sybr Green I 10X concentrado **
73 L de gua (ultra-pura)
25 L de DMSO
** Manter a soluo contendo Sybr Green ao abrigo da luz
2. Preparo do mix de PCR em tempo real:
Reagente
dNTP (10 mM)
Primer F (2,5 pmol/
L)
Primer R (2,5 pmol/
L)
MgCl2 (50 mM)
Taq (5U/
L)
Sybr Green mix *
BSA (20 mg)
gua
Volume final
Volume
1 reao (
L)
0,4
1,0
1,0
1,0
0,3
4,0
0,25
11,05
19
Concentrao
final
0,2 mM
0,125 pmol/L
0,125 pmol/L
2,5 mM
1,5 U
Vol.
(__ amostras)
0,25 g/reao
3. Colocar 19 L do mix de PCR em cada pocinho da placa;

4. Colocar 1 L do cDNA (25 ng/L) de cada amostra no respectivo pocinho da
placa; . Homogeneizar bem a mistura (amostra + mix);
5. Dar um pulso cuidadosamente (por centrifugao a 3000 rpm);
6. Colocar a placa no aparelho de PCR em tempo real;
7. Escolher o programa de amplificao do gene de interesse. Para o gene MCP1, utiliza-se o seguinte programa :
Pr-incubao: 95 C por 5 minutos

Amplificao:
55 ciclos de
56 C por 5 segundos
78 C por 3 segundos
Curva de melting:
95 C por 0 min
68 C por 15 min
95 C por 0 min
Resfriamento: 40 C por 30 s
11. MAPEAMENTO DE QTLs QTL EXPRESS

Millor Fernandes do Rosrio
Ktia Nones
O QTL EXPRESS (Seaton, 2002) o programa mais utilizado para mapear

QTLs em populaes parcialmente endogmicas, como nas espcies de animais
domsticos. Este programa pode ser acessado atravs de: http://qtl.cap.ed.ac.uk/.
Ele implementa o mapeamento por intervalo (Lander e Botstein, 1989) atravs da
aproximao de quadrados mnimos (Haley et al., 1994), realizando uma varredura
dos intervalos entre dois locos adjacentes, testando a hiptese inicial de que no h
QTL no intervalo considerado.
O programa considera que h fixao dos alelos contrastantes do possvel
QTL nas linhagens fundadoras da populao utilizada para mapear os QTLs.
Operacionalmente, a primeira linhagem parental relacionada no arquivo de
gentipos considerada como fixada para o alelo QTL Q e a segunda fixada para q.
Tambm se baseia na estimao das probabilidades de identidade por
descendncia (IBD) dos alelos em cada loco considerando um conjunto de dados
multilocos, alm de testar um modelo estatstico, podendo incluir efeitos fixos e
covariveis para as observaes (fentipos) e os coeficientes IBD.
O programa possui diferentes opes de anlises de acordo com o
delineamento utilizado na populao a ser estudada (F2 e half-sib so os mais
usados). Em cada uma dessas opes so encontradas instrues sobre os
formatos dos arquivos a serem utilizados no programa.
A seguir descrito o formato dos trs arquivos (gentipos, mapa e fentipos)
que devem ser criados para realizar as anlises no QTL EXPRESS utilizando a
opo F2 ANALYSIS. Todos os arquivos devem ser tipo texto, onde os dados so
separados por espaos ou tabulao.
ARQUIVO DE GENTIPOS:
1 linha Nmero de marcadores
2 linha Lista dos nomes dos marcadores qualquer caracter alfanumrico.
3 linha Nome dado a cada gerao (nome das linhagens parentais, F1 e F2)
4 linha Indicao de sexo (1-macho e 2-fmea, ou M-macho e F-fmea)
5 linha Smbolo que representa dados perdidos (*, ou -, ou 0)
6 linha Dados de cada indivduo, na seguinte ordem:
1) Identificao do indivduo, qualquer caracter alfanumrico.
2) Identificao do pai; no caso dos parentais onde a identificao do pai
desconhecida utilizar *, ou , ou 0.
3) Identificao da me, igual do pai.
4) Sexo, de acordo com o definido na linha 4.
5) Linhagem ou gerao, como definido na linha 3
6) Gentipos dos marcadores, cada dois valores correspondem aos alelos de
um marcador; os gentipos devem estar na mesma ordem da lista dos
marcadores (linha 2)
Este arquivo pode ser obtido reformatando o arquivo .gen do CRIMAP ou
criado atravs do EXCEL.
EXEMPLO:
14
MK1 MK2 MK3 MK4 MK5 MK6 MK7 MK8 MK9 MK10 MK11 MK12 MK13 MK14
LW MS F1 F2
12
0
1039 1529 1530 1 F1 4 1 4 7 1 2 1 2 5 2 1 1 2 5 4 2 1 2 1 3 2 4 6 3 1 2 5 2
1040 1529 1530 2 F1 4 1 4 7 1 2 1 2 7 2 1 1 2 5 2 5 1 2 1 3 2 4 1 3 4 2 0 0
ARQUIVO DO MAPA DE LIGAO:
1 linha Nmero de cromossomos.

2 linha Intervalo para clculo das probabilidades genotpicas e coeficientes em
cM.
3 linha Nome do primeiro cromossomo, nmero de marcadores deste
cromossomo, determinar se o mapa ser construdo para os dois sexos (=1) ou no
(=2).
4 linha Para o primeiro cromossomo ou grupo de ligao, indicar os nomes dos
marcadores em ordem, separados pelas distncias entre eles em cM. Os nomes dos
marcadores devem ser os mesmos utilizados no arquivo de gentipos. Se for feita a
opo pela utilizao do mesmo mapa para os dois sexos, esta linha aparece
apenas uma vez, se os dois sexos tiverem mapas separados esta linha aparece
duas vezes com diferentes distncias.
Repetir as linhas 3 e 4 para cada cromossomo.

EXEMPLO:
2
1
SSC1 7 1
MK2 42 MK1 28 MK7 8 MK10 28 MK3 3 MK4 22 MK5
SSC7 7 1
MK6 35 MK8 25 MK9 17 MK11 22 MK12 25 MK13 21 MK14
ARQUIVO DE FENTIPOS:
1 linha Nmero de efeitos fixos, covariveis e caractersticas, respectivamente.
2 linha Nome de cada efeito fixo, covarivel e caracterstica.
3 linha Cdigo para dados perdidos; os indivduos podem ter dados perdidos para
as caractersticas fenotpicas, mas todos devem ter valores para efeitos fixos e
covariveis.
4 linha Identificao do indivduo (mesma do arquivo de gentipos), seguida dos
valores de efeitos fixos, covariveis e caractersticas.
EXEMPLO:
211
Sexo Grupo Peso Esp_Toucinho

-999
1117 1 1 67800 19
1118 2 1 75400 24
1119 2 1 69800 29
1124 1 1 64800 18
1125 1 1 65800 19
Depois dos arquivos organizados conforme os modelos acima, seleciona-se o

delineamento a ser utilizado na anlise (Ex: F2 Analysis). Nesta janela temos acesso
aos arquivos atravs de um browse para cada um dos arquivos (gentipos, mapa e
fentipos) clicando em seguida no boto SUBMIT. Neste momento os gentipos
so checados para erros, pela comparao dos alelos nos parentais e nas
prognies, em famlias de irmos completos e meio-irmos. Os erros so indicados
em uma janela (Fatal errors) para anlise e correes.
Se no forem encontrados erros, a anlise avanar e uma nova janela
estar disponvel, indicando o nmero de famlias de irmos completos e o nmero
total da prognie que ser utilizada na anlise. Estar tambm disponvel uma tabela
indicando o nome e nmero de marcadores, suas distncias e o nmero de alelos
observados em cada marcador.
Para continuar o procedimento de anlise deve ser clicado o boto
CONTINUE; uma nova janela aparecer.
Nesta nova janela temos vrios campos para a escolha dos parmetros e dos
modelos a serem utilizados na anlise, juntamente com as caractersticas que se
deseja analisar. Depois de escolhidos todos os parmetros, clicar no boto
SUBMIT.
Uma nova janela se abrir apresentando o resultado do mapeamento por
intervalos (em cM), da anlise estatstica (F, razo de verossimilhana e LOD) e
estimativas do efeito aditivo e de dominncia, alm dos grficos do mapeamento por
intervalo, dos efeitos de aditividade e dominncia e das permutaes.
As permutaes so implementadas de acordo com a metodologia proposta

por Churchill e Doerge (1994) e tm por objetivo determinar os nveis de
significncia ou threshold no cromossomo ou no genoma. O QTL EXPRESS tambm
permite que os intervalos de confiana de cada QTL mapeado sejam estimados de
acordo com a proposta de Visscher et al. (1996) por meio do procedimento de
bootstrap com reamostragem.
12. ARRANJOS DE DNA

Erika Cristina Jorge
Luiz Lehmann Coutinho
O seqenciamento de etiquetas de seqncias expressas (do ingls,

Expressed Sequence Tags, ESTs) e de genomas de organismos modelo resultam
na identificao de inmeras seqncias-motivo, cujos domnios estruturais
conservados fornecem pistas sobre as funes biolgicas que estes genes exercem
no organismo. No entanto, nem sempre possvel definir a funo biolgica dos
genes apenas com a informao da seqncia. A deteco e a quantificao do
nvel de expresso dos genes tambm contribuem para adicionar informaes
funcionais quelas obtidas pelo seqenciamento, revelando transcritos que so coexpressos espacial e temporalmente, e tambm as relaes existentes entre eles.
O uso de ferramentas tradicionais de quantificao da expresso gnica
como Northern blot, dot blot e RT-PCR, por exemplo, apesar de precisos e robustos,
no apresentam a eficincia e a rapidez necessrias para acompanhar o ritmo de
descoberta de genes novos imposta pelo seqenciamento. Abordagens mais
eficientes para a anlise da expresso gnica constituem um desafio presente para
o estudo de um grande nmero de genes simultaneamente.
Os arranjos de DNA foram desenvolvidos justamente para permitir estudos de
expresso gnica em escala genmica. Surgiram como resultado da disponibilidade
das seqncias obtidas em projetos genoma e da robtica de alta preciso, capaz
de depositar inmeras pequenas amostras de DNA em superfcies slidas,
usualmente em uma lmina de microscpio ou membranas de nlion. O poder do
mtodo se deve ao fato de que os nveis de expresso de inmeros genes de
interesse podem ser mensurados em um nico experimento de hibridizao,

fornecendo tanto a informao de qual tecido o gene expresso, quanto a
informao dinmica da expresso, revelando como o padro de expresso de um
gene se relaciona com os outros.
A principal aplicao dos arranjos de DNA a anlise comparativa da
expresso gnica em larga escala. Outras aplicaes incluem ainda a anlise da
variao no DNA em escala genmica (genmica comparativa), caracterizao de
interaes moleculares e a descoberta de reagentes antisenso efetivos (Southern et
al., 1999).
Arranjos tambm vm sendo desenvolvidos para promover a
genotipagem de polimorfismos de base nica (do ingls, single nucleotide

polimorphisms, SNPs) em larga escala (Meaburn et al., 2005) e a determinao do
nmero de cpias de um segmento de DNA no genoma (Shaffer et al., 2006).
Este texto abordar os principais aspectos prticos da metodologia de
microarranjos para estudos de expresso gnica, procurando indicar os passos
desde a construo de uma plataforma at a anlise dos dados.
A construo da plataforma microarranjo

O primeiro passo do mtodo a seleo do conjunto de molculas de DNA
de interesse que sero impressas sobre a plataforma. Neste mtodo, as molculas
impressas so denominadas sondas e podem ser (1) colnias de bactrias fixadas
em membranas, contendo os fragmentos de DNA genmico ou cDNAs; (2) DNA ou
cDNA isolados, (3) produtos de PCR ou (4) oligonucleotdeos sintticos desenhados
para ensaiar genes particulares. A coleo de sondas imobilizadas no arranjo pode
representar genomas completos dos organismos de interesse, transcriptomas
tecido-especficos ou qualquer outro conjunto de genes de interesse.
Alm das sondas representando os genes de interesse, o arranjo deve ainda

incluir espaos aleatoriamente distribudos para genes referncia, usados no
processo de normalizao dos dados de expresso. Estas referncias so tanto
controles positivos, que correspondem a genes que no alteram o nvel de
expresso entre os tratamentos testados (tambm conhecidos como genes
constitutivos), quanto controles negativos (plasmdio vazio) e espaos vazios, que
so teis para conferir e estabelecer o valor de backgroud usado nos clculos de
expresso. A escolha destes controles e a distribuio no arranjo crtica para a
qualidade dos dados gerados.
O nmero de molculas de DNA que podem ser impressas em um arranjo
varia de acordo com a plataforma utilizada e o tipo de sonda a ser impressa sobre
ela, sendo que os microarranjos de oligonucleotdeos sintticos, sintetizados in situ
sobre lminas de microscpio, os que comportam uma maior densidade.
Affymetrix (www.affymetrix.com), umas das empresas que fabricam microarranjos

comercialmente, garante a sntese de DNA-chips contendo at 500.000 oligos em
uma nica lmina. J os arranjos de membranas suportam no mximo, ~9.200
clones impressos.
12.1. O MTODO
O princpio deste mtodo baseia-se na hibridizao de cidos nuclicos, que
bastante sensvel e especfica, em conseqncia das propriedades de
complementaridade entre fitas de cidos nuclicos (Duggan et al., 1999). A amostra
biolgica de interesse fornece a populao de RNAs mensageiro (RNAm) que se
pretende quantificar, aqui denominada alvo. A cintica de hibridizao linear e a
quantidade de alvo hibridizado em cada sonda proporcional abundncia de
RNAm do alvo e, portanto, correspondente ao nvel de expresso do gene na clula

ou no tecido do qual o alvo foi obtido.
Tipicamente, a transcrio reversa usada para obter os alvos, a partir de um
oligo-dT e na presena de nucleotdeos modificados, produzindo produtos marcados
na extremidade 3 de cada gene, diretamente complementar s sondas imobilizadas
no arranjo. Freqentemente, pools de RNA total so marcados, para maximizar a
quantidade de mensagem que pode ser obtida de uma dada quantidade de tecido.
A pureza do RNA um fator crtico na performance da hibridizao, uma vez que
lipdios, protenas e carboidratos celulares podem interferir e causar ligaes noespecficas dos alvos com as sondas. Para a deteco radioativa, P33-dCTP o
mais usado por ser um emissor de alta energia, permitindo distinguir os sinais entre
elementos fisicamente prximos um do outro. Para a deteco com marcadores
fluorescentes, Cye-3-dUTP e Cye-5-dUTP so os mais usados porque so de maior
eficincia
de
incorporao
pela
transcriptase
reversa,
apresentam
boa
fotosensibilidade e rendimento, alm de serem altamente separveis em espectros

de emisso, permitindo a discriminao por filtragem ptica (Duggan et al., 1999).
Quando hibridizado ao DNA impresso na plataforma, o alvo marcado emite
um sinal, que detectado por um filme especfico (chamado phosphor imager), no
caso dos experimentos radiativos; ou diretamente pelo scanner, no caso dos
fluorescentes, resultando em imagens digitalizadas dos arranjos. Estas imagens so
ento, utilizadas em programas especficos (ArrayVision ou ImageQuant, por
exemplo), que geram grids capazes de localizar cada um dos sinais no arranjo e de
convert-los em uma leitura quantitativa, relativa ao nvel de expresso do gene (Hal
et al., 2000).
12.2. A ANLISE DOS DADOS

Experimentos seqenciais de hibridizao de arranjos geram resultados que
consistem basicamente em listas de genes e de valores correspondentes que
representam o nvel relativo de expresso dos transcritos detectados. Estas listas
podem ser extremamente complexas, uma vez que os arranjos apresentam uma alta
densidade de genes e, para cada um deles, os experimentos geram informaes
quantitativas referentes expresso em tratamentos diferentes (a anlise de dois
tratamentos com trs repeties em um arranjo contendo 5.000 clones, por exemplo,
permite gerar uma matriz com 30.000 entradas). O enorme volume de dados torna
imperativo o uso de programas computacionais para administrar e maximizar a
quantidade de informaes extradas.
Harrington e colaboradores (2000) definiram os passos necessrios para uma
anlise eficiente dos dados de arranjos gerados aps a obteno da imagem
processada: (1) normalizao dos dados, (2) filtragem dos dados e (3) identificao
do padro. A normalizao necessria para permitir a comparao direta do
padro de expresso e deve ser efetuada tanto entre amostras no mesmo arranjo,
quanto para o conjuntos de experimentos. A filtragem importante para restringir o
volume de dados. Por exemplo, comum considerar apenas os genes expressos
acima de um determinado valor estipulado pelo experimentador, desconsiderando
aqueles que no apresentarem variao do nvel de expresso entre os tratamentos.
O ltimo passo talvez seja o mais complexo. Encontrar o padro ou os grupos
de dados que podem ser usados para a determinao do significado biolgico dentro
de um enorme volume de dados pode no ser uma tarefa direta. A interpretao dos
dados varia desde uma lista de genes que so induzidos e reprimidos em funo do
tratamento, at anlises de agrupamentos sofisticadas, como por agrupamento
hierrquico ou por sefl organizing maps (SOM). O agrupamento hierrquico tem

sido tradicionalmente utilizado em anlises filogenticas e usa uma combinao
progressiva de elementos mais similares para agrupar os genes por padro de
expresso. Os sefl organizing maps amostram o conjunto completo dos dados para
determinar as distncias entre eles e escolhe aleatoriamente pontos chamados
centrides, a partir dos quais, os genes so organizados (Harrington et al., 2000).
12.3. VANTAGENS E LIMITAES DO MTODO

Os arranjos fornecem um acesso ilimitado ao perfil de expresso dos genes
caractersticos de um tecido ou de um organismo, porque os genes, as ORFs (open
reading frames) e at mesmo regies intergnicas podem estar representadas na
plataforma. As informaes geradas por diversos experimentos podem ainda ser
integradas e utilizadas para a determinao de funes biolgicas dos genes
desconhecidos, para gerar uma viso global da atividade transcricional de um
genoma em resposta a qualquer estmulo ou para compreender os mecanismos que
controlam o desenvolvimento (Harrington et al., 2000).
Mas como todo mtodo, os arranjos tambm apresentam algumas limitaes.
A necessidade de conhecimento prvio da seqncia do gene preso plataforma
uma delas. Por isso, arranjos so construdos apenas para espcies que possuem
seqncias genmicas ou ESTs disponveis (Calsa Junior et al., 2004).
Outras
limitaes incluem o alto custo dos equipamentos e a disponibilidade dos arranjos,

tais como: problemas associados com hibridizao cruzada entre transcritos e
seqncias-alvo (causada pela duplicao de genes); e a restrita sensibilidade dos
arranjos de ESTs para transcritos pouco freqentes, pobremente representados nas
bibliotecas e normalmente genes regulatrios importantes.
13. PREPARO DAS SOLUES
Tris.HCl [tris(hydroxymethyl)aminomethane] - 1M
Dissolva 121g de Tris Base em 800 mL de gua MiliQ
Ajuste o pH desejado com HCl concentrado
Adicione gua at 1L
Autoclave
Cerca de 70 mL de HCl so necessrios para pH de 7,4 ; e cerca de 42 mL para pH
de 8,0.
Nota importante: O pH dos tampes com Tris muda significativamente com a
temperatura, caindo cerca de 0,028 para elevao de cada 1oC. O pH das solues
tamponadas com Tris deve ser ajustado na temperatura na qual as solues sero
usadas. Como o pK do Tris 8,08, o tampo no deve ser usado a pH abaixo 7,2
nem acima de 9,0.
No adicione DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) em solues com Tris, porque o DEPC
inativa essa substncia.
EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) - 0,5M (pH 8,0)

Dissolva 186,1g de Na2EDTA.2H20 em 700 mL de gua
Ajuste o pH para 8,0 com NaOH 10M (cerca de 50 mL)
Adicione gua MiliQ para 1 L.
Autoclave
TE pH 7,6 (tampo Tris/EDTA)

Reagente
Tris HCl pH 7,6
EDTA pH 8,0
Volume para uma amostra
Concentrao final
10mM
1mM
510 L
TBE(Tris/Borate/EDTA) 10X Tampo de Eletroforese

Soluo Estoque
Reagente
Tris Base (890 mM)
cido brico (890 mM)
EDTA 0,5M pH 8,0 (20 mM)
gua deionizada
Total
Quantidade
108 g
55 g
40 mL
Completar para 1L
1L
SOLUO DE RNase (10mg/mL)

Dissolver a enzima Ribonuclease A livre de DNase (Sigma R- 6513) em soluo
Tris.HCl 10mM (pH 7.5), NaCl 15mM.
Armazenar a -20C.
SOLUO DE PROTEINASE K (20mg/mL)

Dissolver 100 mg da enzima em 5 mL de soluo Tris-HCl 10mM (pH 7.5),
Cloreto de Clcio 20mM, Glicerol 50%.
Armazenar a -20C.
Loading Buffer 6 x
Bromophenol Blue 0,25%
Xileno Cianol 0,25%
Glicerol 30% em gua (estocar a 4C).
Soluo A (Tampo de Hemlise)

Para 1 amostra (25mL):
Reagente
Tris.Cl pH 7,6 1M
MgCl2 0,5M
NaCl 5M
gua deionizada
Concentrao final
10mM
5mM
10mM
X 1 amostra
250 L
250 L
50 L
Completar para 25 mL
Soluo B (Soluo de lise)

Reagente
Tris.Cl pH 8,0 1 M
NaCl 5 M
EDTA pH 8,0 0,5 M
SDS 20%
Proteinase K (20 mg/mL)
gua deionizada
Volume final
Volume x 1 amostra
5L
10L
10L
12,5L
2,5L
460,5 L
500 L
Concentrao final
10mM
100mM
10mM
0,5%
gua DEPC (dietilpirocarbonato):

Adicionar 100 L de DEPC para cada 100 mL de gua deionizada.
Agitar bem e incubar a 37C por 12 horas.
Autoclavar a gua DEPC por 45 minutos a 1 atm.
64
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Protocolos de Biologia

Luciana Correia de Almeida Regitano

Luciana Correia de Almeida Regitano

Simone Cristina Mo Niciura

Adriana Mrcia Guaratini Ibelli

Joo Jos de Simoni Gouveia

Gisele Batista Veneroni

1. Regras de segurana no laboratrio...................................

Luciana Correia de Almeida Regitano

2. Extrao de DNA ..................................................................

3. Extrao de RNA ..................................................................

4. Quantificao em espectrofotmetro ................................

Joo Jos de Simoni Gouveia

Adriana Mrcia Guaratini Ibelli

5. Reao em cadeia da polimerase (PCR) ............................ 14

6. Enzimas de restrio ...........................................................

7. Eletroforese de cidos nuclicos .......................................

Gisele Batista Veneroni

Joo Jos de Simoni Gouveia

9. Sntese de DNA complementar (cDNA) .............................

Adriana Mrcia Guaratini Ibelli

10. PCR quantitativo em tempo real ....................................... 42

11. Mapeamento de QTLs QTL Express .............................. 49

12. Arranjos de DNA ................................................................. 55

13. Preparo de Solues .......................................................... 61

1. REGRAS DE SEGURANA EM LABORATRIOS

Segurana a prioridade nmero um em qualquer laboratrio qumico.

Usar sempre culos de segurana e avental de preferncias de algodo e

A extrao dos cidos nuclicos (DNA e RNA) o primeiro passo para a

impede o DNA de se ligar nas outras molculas, facilitando sua separao na

2.1. Extrao de DNA de Leuccitos

8. Recolher o sobrenadante dividindo-o em dois microtubos de 1,5mL

Este protocolo isola juntamente com o DNA uma quantidade considervel de

2.2. EXTRAO DE DNA DE SANGUE UTILIZANDO O KIT GFX

1. Colocar 300 L de sangue e 900 L de soluo de lise em microtubo de 1,5

A anlise do RNA pode fornecer informaes importantes sobre expresso

necessria ainda a adio de clorofrmio ao tampo contendo RNA que

3.1. Protocolo de Extrao de RNA (adaptado de Chomczynski, 1987)

1. Macerar o tecido em nitrognio lquido

Os cidos nuclicos absorvem luz no comprimento de onda de 260 nm. Para

A concentrao de RNA nas amostras tambm ser avaliada por

autoclavada). O grau de pureza do RNA ser estimado pela razo entre as

5. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

A reao em cadeia da polimerase nada mais do que a replicao in vitro do

4. deoxinucleotdeos trifosfatados (dNTPs), com quantidades iguais de dATP,

5.1. PROTOCOLO DE AMPLIFICAO DO MICROSSATLITE BMS1617

1. Retirar o DNA do freezer e deixar temperatura ambiente

6. Distribuir 11,25L do MIX de PCR sem o DNA em cada tubo

O BMS1617 um marcador molecular do tipo microssatlite de repetio tg,

5.2. PROTOCOLO DE AMPLIFICAO DO GENE DA TIREOGLOBULINA

1. Retirar o DNA do freezer

As enzimas de restrio, tambm chamadas de endonucleases de restrio,

6.1. DIGESTO DO DNA Tireoglobulina

A reao de digesto ser incubada a 37C em aparelho Thermomixer 5436

>gi|790|emb|X05380.1| Bovine thyroglobulin gene exon 1 and flanks

Obs. Os stios de anelamento dos primers esto sublinhados.

Aps digesto com a enzima MboI, o alelo A caracterizado pela presena de

Figura 1. Gel com fragmentos da tireoglobulina aps digesto com enzima de

7. ELETROFORESE DE CIDOS NUCLICOS

A eletroforese uma tcnica utilizada para separar, identificar e purificar

Na escolha do tampo, o principal fator a ser considerado sua capacidade

Tabela 1. Limites de eficincia da separao de DNA em diferentes concentraes

Para observar cidos nuclicos em gel de agarose, deve-se cor-los e

7.1. Protocolo para anlise de produtos de amplificao e fragmentos de