Laminillas protozoarios

INTRODUCCION
En la mayora de los casos los protozoarios intestinales se pueden observar
Bien con tinciones temporales, como es el caso de los exmenes directos con
lugol, solucin salina o Sudn, como se vi en prcticas anteriores. En algunas
ocasiones es necesario teir los parsitos en forma definitiva, para obtener
preparaciones permanentes; otras veces estas tinciones son necesarias porque
se necesita distinguir algunas de sus estructuras celulares, usando tinciones
especiales permanentes. Algunos parsitos requieren tinciones especiales, para
poder observarse. El inmunodiagnstico puede realizarse recurriendo a la tincin
con anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes, permitiendo una
identificacin ms fcil.
Las preparaciones fecales permanentes son hechas por diferentes razones:
- Proporcionan informacin sobre el material estudiado. ( ej: tincin de
Romanowsky)
- Utiles en la identificacin exacta de flagelados (eJ: tincin de Romanowsky,
tincin de Fierro-hematoxilina)
- Cuando el parsito no puede ser detectado en preparaciones en fresco o por
tcnicas de concentracin, la tincin permanente de material fecal fresco puede
revelar la presencia de parsitos intestinales (ej: tincin de Romanowsky,
tincin Trichromo, Tincin de ziehl Neelsen modificada)
- Son tiles en la demostracin de patrones nucleares de quistes, facilitando la
identificacin (Tincin de fierro-hematoxilina, tincin Tricromo).

MATERIALES Y METODOS

1. Tincin de Romanowsky

a) Tincin modificada rpida de Field:

Es una modificacion de la tincin de Field, que permite una tincion rpida de
frotes delgados y fijados de varias muestras clnicas. Es muy til para tinciones
de frotes fecales, exudados fecales y aspirados duodenales. Una tincin
permanente de Romanowsky (ej: Giemsa o tincion rpida de Field) debe ser
usada para diarrea sanguinolenta y para heces semi-formadas con sangre y/o
muco. Proporciona informacin sobre el exudado presente, presencia de
trofozotos de flagelados como Giardia lamblia. Permite determianr la presencia
de protozoarios que son difciles de detectar o no son detectados en
preparaciones en fresco, como Blastocystis hominis.

Metodo.
a. Haga un frote delgado de heces o de exudado fecales. Deje secar al aire libre.
b. Fije con metanol por 1 minuto.
c. Cubra el frote con 1 ml de colorante de Field (colorante B) (diluido 1:4 con
agua destilada)
d. Aada inmediatamente un volumen igual de colorante concentrado de Field
(colorante A), mezcle bien y deje colorear por 1 minuto.
e. Enjuague con agua de la llave y escurra para secar.
f. Los flagelos, cilios y ncleos se tien de rojo, mientras que el citoplasma de

azul.

b). Tincin de Giemsa

El colorante de Giemsa puede ser usado para frotes de heces no-formadas,
exudados fecales y aspirados duodenales.

Mtodo
a. Haga un frote delgado de exudado fecal. Deje secar al aire libre.
b. Fije en metanol por 1 minuto. Escurra y deje secar.
a. Cubra el frote con colorante Giemsa diluido 1:10 con agua destilada. Cada
vez debe prepararse el colorante.
b. Deje colorear por 20-25 minutos.
c. Lave con agua de la llave y no deje precipitar el colorante en el frote. Deje
secar al aire libre.
d. Examine el frote a 100 X.
e) Los Flagelos, cilios y ncleos se tien de rojo y el citoplasma azul.
Colorante de Giemsa: 1 g de polvo de Giemsa + 66 mL de glicerina calentado a
50
grados durante 2 horas, aadir 66 mL de actohol metlico absoluto, dejar a
temperatura
ambiente 7-14 das (maduracin). Filtrar antes de su empleo.

2. Tincin de Tricromo
El mtodo de tricromo para teir protozoarios es recomendado especialmente
para identificar caractersticas de quistes y trofozoitos de amibas

Solucion A: fijador de Schaudinn .

Solucion B: Yodo-alcohol.
Para preparar la solucin concentrada, aada cristales de yodo al 70% en
etanol para hacer una solucin oscura.
Para preparar la solucin de trabajo, diluya la solucin concentrada, adicionando
etanol 70% (la solucin debe quedar del color del t poco cargado). No es
importante la concentracin exacta.
Solucin C: Etanol Acido.
Acido acetico glacial 0.5 ml
Etanol 90% 100 mL

Metodo
a. Haga un frote delgado de material fecal en un portaobjetos.
b. Mientras el frote aun esta hmedo sumerja el portaobjetos en un vaso de
Coplin conteniendo fijador de Schaudin (solucion A.) durante 5 minutos a 50 C
o a temperatura ambiente 1 hora.

Tincin.
c. Yodo-alcohol (solucin B) 10 minutos.
d. Etanol de 70% por 3-5 minutos.
e. Etanol de 80% por 3-5 minutos.
f. Colorante Trichromo Parapak por 10 minutes.
g. Alcohol Acido (solucion C) 2 sumergidas rapidas

h. etanol de 95% sumergir dos veces, 5 minutos cada vez.

i. etanol 100% por 3 minutos.
l. Xileno 5 minutos.
m. Monte con un cubreobjetos con DPX no permita que el xileno se seque en
el portaobjetos.
Se tien de rojo los nucleos, las barras cromaticas, la cromatina, los eritrocitos y
las bacterias, el citoplasma se tine de azul-verde. El fondo y las levaduras se
tinen ded verde.

4. Fierro-Hematoxilina
Esta tincin es til para demostrar la cromatina nuclear y las inclusiones
citoplsmicas de quistes de protozoarios.

Reactivo 1: Fijador de Schaudinn

Reactivo 2 : Yodo 2g, mas etanol 95% 100mL

Disolver el yodo en el etanol y se almacena en una botella ambar, y se conserva
varios meses.

Reactivo 3: solucion concentrada de alumina de fierro:

Mordente alumina
Sulfato ferrico de Amonio 4g
Agua destilada 100mL
Para usar anada 1 parte de la solucin concentrada a 10 partes de etanol 50%.
Esta solucion solo permanence estable varias semanas.

Reactivo 4: hematoxilina de Heidenhain

Haematoxilina 1g
Etanol de 70% 100g
Este reactivo mejora despus de un perodo de maduracin exponiendo el
colorante a la luz directa del sol por 4 6 semanas o aadiendo 10 mL de
peroxido de hidrogeno.

Reactivo 5
Solucion acuosa de cido pcrico o mordente almina de fierro para decolorar.

Metodo
Coloque frotes fecales recin preparados en un vaso de coplin con fijador de
Schaudinn.
a. Fijador de Schaudinn 20 minutos
b. etanol 10 minutos
c. Yodo al 95% en etanol 10 minutos
d. etanol 10 minutos
e. mordente Alumina de fierro 50% en etanol 1224 horas
f. etanol 10 minutos
g. Lave en agua de la llave 15 minutos
h. Tina en etanol-hematoxilina 12-24 hours
i. Lave con agua de la llave 15 minutos
j. Diferenciar en mordente alumina de fierrro o en solucion de acido picrico (es
un decolorante mas rapido ). Este proceso se controla bajo el microscopio,

hasta que la cromatina se vea clara y bien definida.

k. Lavar con agua de la llave 5 minutos
l. Lavar en etanol de 70% con 3 cambios de etanol 1 hora
m. etanol 5 minutos
n. Alcohol absoluto 5 minutos
o. Xileno 5 minutos
p. Montar en permount
La cromatina nuclear y el cariosoma son negros. El resto se observa con
variaciones de gris/negro.

Bibliografa
Taghi-Kilani,R. and L. Sekla. 1987. Purification of Cryptosporidium oocysts and
sporozoites by Cesium Chloride and Percoll discontinuos density gradient. J.
Tropical Med. Hyg., 36: 505.

DPDx - CDC. Laboratory Identification of Parasites of Public Health concern.

Diagnostic procedures for stool specimens. 2006.

http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/index.html