LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

MATERIA: MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Prctica N 1

PRCTICA No. 1

CADA GRUPO DE TRABAJO DE LABORATORIO DEBE TRAER EL SIGUIENTE

MATERIAL

Gentamicina (en ampolla) de : 40mg, 80mg, 160mg

ES OBLIGATORIO EL USO DE MANDIL, COFIA Y MASCARILLA DE TELA

REVISAR LAS INDICACIONES DEL LABORATORIO

VENIR ESTUDIANDO LA GUA, SE LES TOMAR UNA EVALUACIN AL INICIAR LA
PRCTICA, TRAER TODO EL MATERIAL SOLICITADO

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Prctica N 1

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

AGENTES FSICOS Y QUMICOS

1. OBJETIVOS:

Simular en el laboratorio los mtodos de control del crecimiento microbiano utilizados

en la industria.
Determinar la sensibilidad bacteriana a dosis diferentes de Gentamicina y compuestos
qumicos mediante un antibiograma

2. BASES CONCEPTUALES
El crecimiento de los microorganismos est influido fuertemente por la naturaleza fsica y
qumica de su ambiente. El conocimiento de estas influencias ambientales permite el control
del crecimiento microbiano y el estudio de la distribucin ecolgica de los microorganismos
Los principales factores que influyen en la eficacia de los agentes fsicos y qumicos son los
siguientes:
- Nmero de microorganismos
- Clase de microorganismos (no todos los microorganismos son igual de sensibles a los
agentes fsico-qumicos).
- Concentracin y clase del agente qumico.
- Intensidad y naturaleza del agente fsico.
- Tiempo (necesitan un tiempo mnimo para producir el efecto que es distinto para cada
agente).
- Temperatura y pH.
- Naturaleza del material soporte de los microorganismos.

El control de microorganismos comprende todos los mtodos fsicos, mecnicos y

preferentemente qumicos, que se emplean para destruir grmenes (Tabla 1)
Los agentes fsicos y qumicos tienen una accin inespecfica y una actuacin mltiple sobre
componentes y estructuras
Agentes qumicos: Sustancias qumicas que influyen negativamente sobre las
bacterias. Sus efectos ms importantes son el impedir el crecimiento microbiano
(statico) o la destruccin de microorganismos (cida)
Agentes fsicos: condicin o propiedad fsica que causa un cambio

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Prctica N 1

Tabla 1. Principales agentes fsicos y qumicos usados para el control microbiano

Temperatura

Altas
(Calor)

AGENTES
FSICOS
Bajas
Radiaciones
Agentes mecnicos
AGENTES
QUMICOS

Llama directa:
flameado,
incineracin
Seco
aire caliente:
estufas
Autoclave
Tindalizacin
Hmedo
Ebullicin
Pasteurizacin
Congelacin
Refrigeracin

Ultravioleta
Rayos X
Ondas snicas y ultrasnicas
Filtracin

Soluciones qumicas
Gases
Antibiticos y quimioteraputicos

Constituyentes antimicrobianos y estructuras biolgicas en alimentos

Ciertos alimentos son muy estables frente al ataque microbiano, esto se debe a la presencia
de determinadas sustancias que han demostrado poseer actividades antimicrobianas. La
cubierta de algunos alimentos (membrana testcea de las semillas, la cubierta externa de los
frutos, la cscara de las nueces, entre otras) proporciona una excelente proteccin contra la
entrada y subsiguiente ataque de los microorganismos productores de alteraciones.
Actualmente se estn realizando ensayos para determinar la capacidad antimicrobiana de
ciertos compuestos que forman parte de los alimentos para usarlos con fin industrial.
CONCEPTOS GENERALES
-

Esterilizacin: destruccin de todo tipo de vida microbiana presente en elementos

inanimados.
Desinfeccin: eliminacin de la infeccin potencial de un material, no implicando
necesariamente en la destruccin de todos los organismos viables. Es un proceso
relativo del control del microbiano. Es un trmino aplicado en relacin con las
superficies inanimadas (instrumentos, muebles, utensilios, aparatos y lugares) y a las
sustancias inanimadas.
Desinfectante: agente qumico capaz de matar formas vegetativas potencialmente
patgenas. Se utiliza sobre objetos inanimados.
Antisptico: sustancia que impide el desarrollo de los microorganismos y que se
utiliza sobre piel o mucosas.
Antibitico: cualquier compuesto qumico utilizado para eliminar o inhibir el
crecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad comn a todos los antibiticos
es la toxicidad selectiva.
Asepsia: tcnicas orientadas a impedir la presencia de microorganismos patgenos en
objetos (ej. instrumental mdico) o reas determinadas.
Agentes antimicrobianos: interfieren en el crecimiento de la actividad microbiana:
o BACTERICIDA, agente que mata bacterias.
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BACTERIOSTATICO, agente que inhibe la multiplicacin de las bacterias por

detener algunos procesos fisiolgicos.

ANTIBIOGRAMA
En la actualidad estn disponibles una cantidad de agentes antibacterianos con el objeto de
controlar las enfermedades que las bacterias producen
Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por microorganismos o derivados
semisintticos de stas, mientras que los quimioterpicos son productos de sntesis qumica,
pero ambos tienen la propiedad de estar dotados de actividad antibacteriana.
Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos compuestos
antibacterianos. La evaluacin de esta sensibilidad ayuda a la seleccin del compuesto ms
adecuado para el tratamiento de una infeccin bacteriana. Las pruebas ms utilizadas para
evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano estn basadas en el
enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente.
Concentracin mnima inhibitoria (CMI) se define como la menor
concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa
bacteriana dada.
Concentracin mnima bactericida (CMB) se define como la menor
concentracin de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada.
El antibiograma por el mtodo de difusin en agar es una prueba en la que se enfrenta la
bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una solucin antibitica
absorbida en discos de papel de filtro. Este mtodo est estandarizado y los halos de
inhibicin han sido obtenidos correlacionndolos con las CMI y aparecen en unas tablas.

Hay varios factores que afectan al halo de inhibicin: la carga del antibitico en los discos, la
difusin del antibitico en el medio de cultivo, el tamao del inculo bacteriano, la composicin
y grosor del medio de cultivo, la velocidad del crecimiento bacteriano y el tiempo de
incubacin.
El inculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala de McFarland,
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aproximadamente 10 UFC/ml y ser preparado en solucin salina estril o caldo de cultivo.

Se puede trabajar en dos tipos de ensayos:
Ensayo cualitativo: un mismo cultivo se enfrenta a distintas soluciones antibiticas.
Ensayo cuantitativo: un mismo cultivo se enfrenta a un slo antibitico, preparado a distintas
concentraciones.
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3. MATERIALES
Material
- Cultivo bacteriano de 24 horas
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
- 9 tubos de ensayo con caldo nutritivo (estriles)
- 4 placas petri con Agar Mueller Hinton (estriles)
- Hisopos estriles
- Asa de inoculacin
- Pinzas

Reactivos

Agentes qumicos:
-

Cloro
Amonio cuaternario
Alcohol 70

Antibitico
-

Gentamicina

Equipos
-

micropipetas
Bao mara
Autoclave
Congelador

4. MTODO
I) AGENTES FSICOS
Inocular 100 uL de suspensin bacteriana en los tubos de ensayo que contienen 2.9 mL de
caldo nutritivo.
TUBO
No.

AGENTE FSICO

PROCESO

EBULLICION

Someter a ebullicin por 1 minuto

2
3
4

Someter a ebullicin por 10 minutos

PASTEURIZACIN

Mantener en un bao a 65C por 30 minutos,

introducir el tubo de ensayo en un bao de hielo
Mantener en un bao a 90C por 15 segundos,
introducir el tubo de ensayo en un bao de hielo

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CONGELACION

Congelar el tubo de ensayo por 24H

REFRIGERACION

Refrigerar el tubo de ensayo por 24H

CALOR
(ESTUFA)

CALOR HUMEDO Someter al tubo al proceso de esterilizacin por

(AUTOCLAVE)
autoclave (121C, 15 minutos)

CONTROL

SECO Mantener en la estufa un tubo de ensayo por 1

hora a 160C

SIN TRATAMIENTO

Una vez aplicado el tratamiento, INCUBAR LOS TUBOS y realizar las lecturas a las 24-48
horas. Reportar los resultados como crecimiento bacteriano +; -; +-

II) ANTIBIOGRAMA

1. Preparar el inculo._ Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra X

colonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del inculo
debe equivaler al estndar 0,5 de McFarland.
Los patrones de Mc Farland se utilizan como patrones de turbidez en la preparacin de suspensiones
de microorganismos. El patrn 0.5 tiene una aplicacin especial en la preparacin de inculos
bacterianos para la realizacin de pruebas de sensibilidad. La frmula aproximada de preparacin
aproximada para este patrn por cada 10ml de agua purificada es (9.95 ml de Acido sulfrico 1% +
8
0.05ml de cloruro de bario 1%) y es equivalente a una concentracin bacteriana de 1.5 x 10 UFC /ml

2. Inocular la superficie de una placa de agar con el hisopo pasndolo uniformemente por
toda la superficie en tres direcciones. Por ltimo, pasar el hisopo por el reborde de la
placa de agar. Dejar secar 5 minutos.
3. Colocar los discos impregnados del agente qumico o la concentracin de antibitico
(5l) correspondiente sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estriles y
apretndolos suavemente sobre la superficie del agar. Los discos no deben estar a
menos de 15 mm de los bordes de la placa y lo bastante separados entre ellos para
que no se superpongan sus zonas de inhibicin. Dejar las placas 15 minutos a
temperatura ambiente para que comiencen a difundir los antibiticos.
4. Incubar la placa en posicin invertida a 37C durante 18-24 horas.
5. Medir los dimetros de los halos de inhibicin con una regla.

DESINFECTANTES:

Agujero No.

SUSTANCIA

Cloro

Amonio cuaternario

Alcohol 70

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Agua
(control)

destilada

ANTIBITICO: Gentamicina a diferentes concentraciones

Agujero No.

SUSTANCIA

Gentamicina 20ppm

Gentamicina 40ppm

Gentamicina 80ppm

Agua
(control)

destilada

5. CUESTIONARIO DE INVESTIGACIN
1.

Cul es la utilidad de clasificar a los agentes qumicos en grupos de alta, media y baja
actividad?

2.

Cules son las estrategias para disminuir la aparicin de resistencias a los

antibiticos?

3.

Mencione el mecanismo de inhibicin de dos agentes qumicos sobre el crecimiento de

un microorganismo

4.

Qu otros mtodos se pueden utilizar para la valoracin y seleccin de

antimicrobianos?

6.BIBLIOGRAFA
-

Maturin, L. y Peeler, J.T. (1998) Bacteriological Analytical Manual, Edition 8, Revision

A. Chapter 3
Solano C. (2006) Microbiologa de alimentos (Guin de prcticas). Universidad
autnoma de Navarra . Disponible en
http://www.unavarra.es/genmic/micalm/manual%20practicas%20micalimentos.pdf

7. REGISTRO DE DATOS
AGENTES FSICOS
TUBO
No.
1
2
3

AGENTE FISICO

PROCESO

RESULTADO

EBULLICION

ebullicin por 1 minuto

Someter a ebullicin por 10
minutos
PASTEURIZACIN 65C 30 minutos + bao de
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Prctica N 1

hielo
90C 15 segundos, bao de
hielo
CONGELACION
Congelacin 24H
REFRIGERACION Refrigeracin 24H
CALOR
SECO 1 hora a 160C
(ESTUFA)
CALOR HUMEDO 12C, 15 minutos
(AUTOCLAVE)

AGENTES QUMICOS
DESINFECTANTES:
Agujero
No.
1
2
3
4

SUSTANCIA

Halo de
(mm)

inhibicin

Halo de
(mm)

inhibicin

ANTISEPTICOS Y ANTIBITICOS:
Agujero No.

SUSTANCIA

1
2
3
4

Gentamicina 20ppm
Gentamicina 40ppm
Gentamicina 80ppm
Control