1

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR

PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINRIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS VETERINRIAS

ROBERTA NOGUEIRA CHAVES

EFEITO DA TEMPERATURA E DO TEMPO DE TRANSPORTE DE TECIDO

OVARIANO SOBRE A VIABILIDADE DE FOLCULOS PR-ANTRAIS
CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO

FORTALEZA-CEAR
Dezembro de 2007

ROBERTA NOGUEIRA CHAVES

EFEITO DA TEMPERATURA E DO TEMPO DE TRANSPORTE DE TECIDO

OVARIANO SOBRE A VIABILIDADE DE FOLCULOS PR-ANTRAIS
CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado em

Cincias

Veterinrias

do

Programa

de

Ps-

graduao em Cincias Veterinrias Faculdade de

Veterinria, da Universidade Estadual do Cear,
como requisito parcial para obteno do grau de
Mestre em Cincias Veterinrias.
rea de Concentrao: Reproduo e Sanidade
Animal
Linha de Pesquisa: Reproduo e sanidade de
pequenos ruminantes
Orientador: Prof. Dr. Jos Ricardo de Figueiredo

FORTALEZA-CEAR
Dezembro de 2007

C512e Chaves, Roberta Nogueira

Efeito da temperatura e do tempo de transporte de tecido ovariano
sobre a viabilidade de folculos pr-antrais caprinos cultivados in vitro/
Roberta Nogueira Chaves. - Fortaleza, 2007.
96 p.; il.
Orientador: Prof. Dr. Jos Ricardo de Figueiredo.
Dissertao (Mestrado em Cincias Veterinrias) Universidade
Estaual do Cear, Faculdade de Veterinria.
1. Caprino. 2. Folculos pr-antrais. 3. Conservao. 4. Ultraestrutura. I. Universidade Estadual do Cear, Faculdade de Veterinria.
CDD: 636.39

Ttulo: Efeito da temperatura e do tempo de transporte de tecido ovariano sobre a

viabilidade de folculos pr-antrais caprinos cultivados in vitro.
Autor: Roberta Nogueira Chaves

Defesa em: 20/12/2007

Conceito obtido: __________________
Nota obtida: ___________

Banca Examinadora

________________________________________________
Prof. Dr. Jos Ricardo de Figueiredo (Orientador)
Universidade Estadual do Cear

_________________________________________
Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda (Examinador)
Universidade Estadual de Londrina

_________________________________________
Prof. Dr. Claudio Cabral Campello (Examinador)
Universidade Estadual do Cear

_________________________________________
Profa. Dra. Lcia Daniel Machado da Silva (Examinadora)
Universidade Estadual do Cear

Aos meu pais, Francisco Arajo Chaves e Eurinice Nogueira Chaves

Kenio Patrcio Lima de Oliveira, meu esposo, meu amor...
Dedico.

AGRADECIMENTOS

No, no simples agradecer o que quero. Quero trazer para dentro do texto
aqueles que j o percorrem nas entrelinhas. E no s aos que me ajudaram efetivamente
na construo dessa Dissertao, mas aos amigos e colegas que partilham comigo idias
e sentimentos. queles que me ajudaram de alguma forma, no meu percurso nesses
quase dois anos e, principalmente, a seguir adiante, sem perder o que pulsa, o que vibra,
agradeo imensamente.
Em especial, a Deus, pela proteo, fora e coragem para enfrentar as
dificuldades na vida pessoal e profissional. E por me inspirar a certeza que nada nesse
mundo ocorre por acaso.
Ao meu esposo, Kenio Patrcio Lima de Oliveira, pelo inestimvel apoio
familiar que preencheu as diversas falhas que fui tendo por fora das circunstncias. E
pela pacincia e compreenso reveladas ao longo desses meses, mas principalmente
pelo amor e exemplo de companheirismo no sucesso e no fracasso, na alegria e na
tristeza, na sade e na doena, nestes anos de nossa vidas.
Aos meus pais, Francisco Arajo Chaves e Eurinice Nogueira Chaves, por terem
sido contnuo apoio em todos estes anos, ensinando-me, principalmente, a importncia
da construo e coerncia de meus prprios valores. Pelo estmulo e apoio incondicional
desde a primeira hora, pela pacincia com que sempre me ouviram, e sensatez com que
sempre me ajudaram.
Aos meus familiares, em especial, aos meus irmos (Francisco Hernandes
Nogueira Chaves e Renata Maria Nogueira Chaves) pela oportunidade de
compartilharmos experincias. E meus sogros (Jos Patrcio de Oliveira e Iza Helena
Lima de Oliveira) por me receberem na famlia e pela compreenso nos momentos
difceis.
Universidade Estadual do Cear (UECE) e Faculdade de Veterinria
(FAVET) por todos os anos de ensino e aprendizagem.
Ao Dr. Jos Ricardo de Figueiredo, professor e orientador, que devido sua
excelncia profissional conferiu prestgio e valor ao meu trabalho. Agradeo pela
abertura de esprito revelada desde a primeira aula, que logo me abriu a porta que
rapidamente me encaminharia para o tema tratado nesta dissertao. Pela
disponibilidade revelada ao longo desses meses, pelas crticas e sugestes relevantes,
pelo apoio moral e amizade.
Ao meu co-orientador, Dr. Jos Roberto Viana Silva, pelo apoio e ensinamentos
dedicados durante o desenvolvimento desse trabalho.

Ao Professor Dr. Claudio Cabral Campelo, pela ateno e orientao no

tratamento estatstico dos dados, que aliadas doura do trato confirmaram que a
simplicidade apangio dos Grandes.
Ao Prof. Dr. Marcelo Seneda e a Profa. Dra. Lcia Daniel Machado da Silva,
por terem gentilmente aceito o convite para participar da banca de defesa.
s amigas Doutoras, Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Liliam Mara Trevisan
Tavares e Maria Helena Tavares de Matos, pelo exemplo de mulheres fortes e
profissionais admirveis.
Dra. Snia Nair Bo e sua equipe do laboratrio de Cincias Biolgicas, pela
valiosa cooperao, ateno e acolhimento.
Regiane Rodrigues dos Santos, pela disponibilidade e respostas a velocidade
da luz, sempre acompanhadas de comentrios estimulantes e sensatos.
Michelle da Costa e Silva, Gerusa de Aquino Lima e Teresa Carla da
Nbrega, por terem sido e por serem, antes de tudo, amigas. Entre ns fica provado que
as grandes amizades aguentam grandes desafios.
Aos meus amigos, Claudio Afonso Pinho Lopes, Juliana Jales de Hollanda
Celestino, Mrcia Viviane Alves Saraiva, por sempre estarem presentes em todos os
momentos, pelas conversas e apoio. Para agradecer a aliana, a confiana e a amizade,
as palavras sero sempre poucas.
Ao meu grupo de trabalho do LAMOFOPA, agradeo toda a colaborao que
me prestaram, incentivo e companhia, especialmente, Fabrcio Sousa Martins, Isabel
Bezerra Lima-Verde e Valdevene Rocha Arajo. Ainda aos estudantes de iniciao
cientfica que dedicadamente participaram nos vrios momentos dos estudos expresso o
meu reconhecimento e fao votos que consigam realizar todos os seus projetos de vida.
minha amiga (para sempre estagiria) Janana da Costa Correia, pelo desafio
que aceitou de abordar, na teoria e na prtica, a temtica do desenvolvimento do
estudante do ensino superior, mas tambm pelo alegre, carinhoso, prestvel e
gratificante relacionamento que construmos. E a Anelise Maria Costa Vasconcelos
Alves que apesar do pouco tempo, tenho convico que teremos um belo caminho pela
frente.
A todos os professores de graduao e do PPGCV, pelos ensinamentos e
contribuio para minha formao.
Aos funcionrios do PPGCV, em especial a Adriana Albuquerque e Cristina
Sabia do Nascimento que colaboraram nos bastidores desta operao aproveito para
expressar o meu profundo agradecimento.
Fundao Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
FUNCAP, pelo apoio financeiro imprescindvel para viabilizar a realizao desse
trabalho.

O rio atinge o mar porque aprendeu a contornar os obstculos

Andr Luiz

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da conservao de fragmentos

ovarianos em diferentes temperaturas e tempos de conservao sobre a viabilidade e
crescimento in vitro de folculos pr-antrais caprinos aps cultivo in vitro. Os ovrios
caprinos (n=10) foram obtidos de animais de abatedouro. Cada par ovariano foi dividido
em 19 fragmentos. Um fragmento foi imediatamente fixado para histologia clssica e
microscopia eletrnica de transmisso (controle fresco dia 0). Os fragmentos restantes
foram distribudos em Meio Essencial Mnimo (MEM) e mantidos a 4, 20 ou 35C por
2 ou 4 h. Aps cada tempo de conservao, fragmentos (n=30) foram fixados (no
cultivados), enquanto fragmentos (n=60) foram cultivados in vitro por 1 ou 7 dias a
39C e 5% de CO2 em MEM suplementado. Aps cada perodo de conservao e/ou
cultivo, os fragmentos foram submetidos histologia clssica e microscopia eletrnica
de transmisso a fim de avaliar a morfologia folicular. Aps 7 dias de cultivo, somente
os fragmentos ovarianos armazenados a 4C por 4 h mantiveram o percentual de
folculos morfologicamente normais equivalentes ao controle fresco (P>0,05).
Observou-se que em todos os tratamentos ocorreu uma reduo (P>0,05) no nmero de
folculos primordiais e um concomitante aumento nos folculos em desenvolvimento,
indicando ativao. Alm disso, houve um aumento no dimetro oocitrio e folicular
aps o cultivo de crtex ovariano submetido conservao na temperatura de 4 C por 2
e 4 h. A microscopia eletrnica de transmisso confirmou a histologia clssica,
mostrando que a conservao na temperatura de 4 C por 4 h, 20 e 35 C por 2 h ajudou
a manter a integridade morfolgica dos folculos pr-antrais caprinos aps 7 dias de
cultivo. Em concluso, os fragmentos ovarianos caprinos armazenados a 4C por at 4 h
melhoram a viabilidade folicular durante transporte e aumenta o crescimento folicular
durante cultivo in vitro.

10

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of storing goat ovarian fragments in
different temperatures and storage times on viability and growth of preantral follicles
cultured in vitro. Caprine ovaries (n=10) were collected at slaughterhouse and each
ovarian pair was divided into 19 fragments. One fragment was immediately fixed for
classical histology and transmission electron microscopy (fresh control day 0).
Remaining fragments were distributed in Minimal Essential Medium (MEM) and
maintained at 4, 20 or 35 C for 2 or 4 h. After each conservation period, fragments
(n=30) were fixed (non-cultured), while fragments (n=60) were cultured in vitro for 1 or
7 days at 39 C and 5% CO2 in supplemented MEM. Follicular morphology was
evaluated at the end of both conservation and culture periods, by classical histology and
transmission electron microscopy. After 7 days of culture, only ovarian fragments
stored at 4 C for 4 h maintained the percentage of morphologically normal follicles
similar to fresh control (P>0.05). In all treatments, a significant reduction (P>0.05) in
the number of primordial follicles and a concomitant increase in the developing follicles
was observed, indicating follicular activation. Additionally, there was an increase in
oocyte and follicular diameter after culture of ovarian cortex that had been previously
chilled at 4 C for 2 or 4 h. Transmission electron microscopy confirmed that ovarian
fragments conservation at 4 C for 4 h, 20 and 35 C for 2 h helps to maintain
morphological integrity of caprine preantral follicles after 7 days of culture. In
conclusion, goat ovarian fragments stored at 4 C up to 4 h keep follicular viability
during transportation and increase follicular growth during in vitro culture.

11

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

: Antro

AMH

: Hormnio Anti-Mlleriano

APAF-1

: Fator ativador de protease apopttica

ATP

: Adenosina Trifosfato

Bcl

: gene anti-apopttico

BMP

: Protena morfogentica do osso

BSA

: Albumina srica bovina

BrdU

: Bromodesoxiuridina

Ca++

: on Clcio

CAD

: Caspase Dnase ativada

CE

: Cear

CG

: Clulas da Granulosa

CGP

: Clulas Germinativas Primordiais

CO2

: Dixodo de carbono

CT

: Clulas da Teca

DF

: Distrito Federal

DNA

: cido Desoxirribonuclico

EGF

: Fator de crescimento epidermal

FAVET

: Faculdade de Veterinria

FGF

: Fator de crescimento fibroblstico

FOPA

: Folculos Ovarianos Pr-Antrais

FSH

: Hormnio Folculo Estimulante

FUNCAP

: Fundao Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico e

Tecnolgico

GC

: Granulosa Cells (Clulas da granulosa)

GDF-9

: Fator de crescimento de diferenciao 9

GH

: Hormnio do crescimentoo

GLM

: General Linear Models

12

: Horas

HC

: Histologia Clssica

ICAD

: Inibidor de caspase ativada pelo DNA

IGF-I

: Fator de crescimento semelhante insulina I

ITS

: Insulina, Transferrina, Selnio

K+

: on Potssio

KGF

: Fator de crescimento keratincito

KL

: Kit ligand

LAMOFOPA : Laboratrio de Manipulao de Ocitos e Folculos Pr-Antrais

LH

: Hormnio Luteinizante

LIF

: Fator inibidor de leucemia

: Mitocndria

MEM

: Meio Essencial Mnimo

MEM+

: Meio Essencial Mnimo suplementado

MET

: Microscopia Eletrnica de Transmisso

mL

: Mililitro

mM

: Milimolar

mm

: Milmetro

mm3

: Milmetro Cbico

MOIFOPA

: Manipulao de Ocitos Inclusos em Folculos Ovarianos Pr-Antrais

: Nmero

Na+

: on Sdio

Nm

: Nanmetro

: Ncleo

ng

: Nanograma

NGF

: Fator de crescimento do nervo

Nu

: Nucleo do ocito

NUBIS

: Ncleo de Biotecnologia de Sobral

: Ocito

13

PAS

: cido peridico de Schiff

PBS

: Tampo fosfato salino

PCNA

: Antgeno Nuclear de Proliferao Celular

pFSH

: Hormnio folculo estimulante de origem porcina

pH

: Potencial Hidrogeninico

P<0,05

: Probabilidade de erro menor do que 5%

PPGCV

: Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias

RNAm

: cido ribonuclico mensageiro

SAS

: Statistical Analysis System

SEM

: Erro padro da mdia

ser

: smooth endoplasmic reticulum (retculo endoplasmtico liso)

SNK

: Student Newman Keuls

TCM 199

: Meio de Cultivo de Tecido 199

TEM

: Transmission Electron Microscopy (Microscopia Eletrnica de

Transmisso)

TNF

: Fator de necrose tumoral

TUNEL

: Terminal deoxynucleotidil transferase-mediate deoxyuridine

triphosphate biotin nick end-labeling

UECE

: Universidade Estadual do Cear

UnB

: Universidade de Braslia

VEGF

: Fator de crescimento do endotlio vascular

ZP

: Zona Pelcida

: Microlitro

: Micrmetro

: Micrograma

: Graus Celsius

: Porcentagem

400x

: Aumento de 400 vezes

4.000x

: Aumento de 4.000 vezes

10.000x

: Aumento de 10.000 vezes

14

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ilustrao do ovrio mamfero com suas principais estruturas

03

Figura 2. Folculos ovarianos aps colorao com cido Peridico de Schiff

(PAS)-Hematoxilina. Folculos pr-antrais: (a) primordial; (b) transio; (c)
primrio e (d) secundrio. Folculos antrais: (e) tercirio e (f) pr-ovulatrio

05

Figura 3. Esquema ilustrando o desenvolvimento e dissoluo dos cordes

ovgeros durante a vida intra-uterina

07

Figura 4. Quadro resumido do desenvolvimento folicular ovariano

09

Figura 5. Esquema de ondas foliculares em ruminantes

10

Figura 6. Desenho esquemtico ilustrando os fatores envolvidos nas diferentes

fases do desenvolvimento folicular

13

Figura 7. Ilustrao de vrios estdios de morte celular por apoptose.

Representao de mudanas esteretipas incluindo condensao, mudanas na
estrutura nuclear e fragmentao da clula em pequenos corpos apoptticos

17

Figura 8. Ilustrao de vrios estdios de morte celular por necrose.

Representao de mudanas esteretipas incluindo aumento de volume celular,
degenerao citoplasmtica, desintegrao das organelas e membrana

19

Figura 9. Modelos para cultivo in vitro de folculos pre-antrais. Folculos in situ

(fig. a, b) e isolados (fig. c, d, e, f)

23

Figure 1. Histological sections of ovarian fragments after PAS-Hematoxylin

staining, showing morphologically normal (A) and degenerated (B, C) follicles.
O: oocyte; NU: oocyte nucleus; GC: granulosa cells (x 400)

40

Figure 2. (A) Percentage (mean SEM) of primordial and (B) developing

follicle (transition, primary and secondary) in non-cultured (fresh control) and
cultured tissue for 1 or 7 days (P<0.05)

43

Figure 3. Electron micrograph of normal preantral follicle in non-cultured

ovarian tissue (control). Note the presence of numerous mitochondria in the
ooplasm. O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa cells; m: mitochondria;
ser: smooth endoplasmic reticulum (x 4000).

47

15

Figure 4. Electron micrograph of normal preantral follicle in ovarian tissue

culture for 7 days (4 C 4 h). Note the great relation between the nucleus and
the cytoplasm of granulosa cells (arrow). O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC:
granulosa cells; m: mitochondria; ser: smooth endoplasmic reticulum (x10000).

48

Figure 5. Electron micrograph of normal preantral follicle in ovarian tissue

culture for 7 days (20 C 2 h). O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa
cells; m: mitochondria (x4000).

49

Figure 6. Electron micrograph of normal preantral follicle in ovarian tissue

culture for 7 days (35 C 2 h). O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa
cells; m: mitochondria (x4000).

50

16

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Dimetro de folculos primordiais, primrios e secundrios e seus

ocitos e nmero de clulas da granulosa em seces equatoriais em caprinos

08

Table 1. Percentage (mean SEM) of morfologically normal follicles in fresh

control day 0, preserved and non-cultured tissue and preserved and cultured
tissue in MEM+ for 1 or 7 days

41

Table 2. Follicular diameter (mean SEM; m) in fresh control day 0,

preserved and non-cultured and preserved and cultured tissues for 1 or 7 days

45

Table 3. Oocyte diameter (mean SEM; m) of follicles from fresh control

day 0, preserved and non-cultured and preserved and cultured tissues for 1 or 7
days

46

17

SUMRIO

1. INTRODUO

01

2. REVISO DE LITERATURA

02

2.1 O ovrio mamfero

02

2.2 Oognese

03

2.3 Foliculognese em ruminantes

04

2.4 Importncia dos fatores de crescimento na regulao dos

estdios foliculares

11

2.5 A populao folicular ovariana

13

2.6 Atresia folicular

14

2.6.1 Apoptose

15

2.6.2 Necrose

17

2.7 Transporte e conservao de ovrio

19

2.8 Importncia da preservao de folculos pr-antrais (FOPA)

21

2.9 Cultivo in vitro de folculos

22

2.9.1 Estado atual do cultivo in vitro de folculos pr-antrais

24

2.9.2 Importncia da composio do meio sobre desenvolvimento

folicular in vitro
2.10 Mtodos de avaliao da morfologia folicular

25
26

3. JUSTIFICATIVA

28

4. HIPTESE CIENTFICA

29

5. OBJETIVOS

30

6. CAPTULO I

31

18

Influncia das condies de conservao sobre a viabilidade de folculos

pr-antrais caprinos cultivados in vitro
7. CONCLUSES

59

8. PERSPECTIVAS

60

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

61

19

1. INTRODUO

Nas ltimas dcadas, vrias pesquisas na rea da biologia ovariana em

mamferos tm sido direcionadas para o cultivo in vitro de ocitos inclusos em folculos
pr-antrais (FOPA). Considerando-se os milhares de folculos pr-antrais presentes em
um nico ovrio, a recuperao e cultivo desses ocitos poder incrementar a maturao
e fecundao in vitro para fins de utilizao em programas de transferncia embrionria,
transgenia e clonagem. Contudo, para o aproveitamento mximo deste potencial
oocitrio faz-se necessrio o desenvolvimento de protocolos de conservao que
permitam a manuteno da viabilidade folicular durante o transporte do ovrio do local
de coleta at o laboratrio, bem como durante as manipulaes que antecedem o cultivo
in vitro.
Dentre os protocolos empregados, o resfriamento do tecido ovariano vem sendo
realizado a 4 ou 20 C, por perodos que variam de 2 a 24 h, utilizando diferentes meios
como soluo salina 0,9% (SANTOS et al., 2002), Braun-Collins (CARVALHO et al.,
2001), base de gua de coco (SILVA et al., 2000), PBS (Phosphat Buffer Saline SILVA et al., 2002) e TCM 199 (FERREIRA et al., 2001). O Meio Essencial Mnimo
(MEM) tem sido largamente empregado com sucesso no cultivo in vitro de embries
(BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997), podendo ser utilizado na conservao de FOPA
caprinos. Esses meios tambm foram utilizados na preservao de folculos pr-antrais
temperatura fisiolgica (39 C) nos mesmos perodos de incubao, sendo observada a
importncia de um meio enriquecido e curto tempo (2 h) de transporte para a
manuteno da viabilidade folicular (MATOS et al., 2004).
Para um melhor entendimento da importncia deste trabalho sero abordados os
seguintes aspectos relacionados ao ovrio mamfero, oognese, foliculognese,
populao folicular ovariana, atresia folicular, mtodos de avaliao da morfologia
folicular, resfriamento e conservao de ovrios e folculos pr-antrais, regulao da
foliculognese inicial e cultivo in vitro de folculos pr-antrais, ressaltando-se a
importncia do desenvolvimento de protocolos para conservao de folculos prantrais.

20

2.

REVISO DE LITERATURA

2.1 Ovrio mamfero

O ovrio mamfero um rgo compreendido por muitos tipos de clulas
diferenciadas, ou seja, ocitos, clulas da granulosa, da teca, luteais e do estroma
ovariano. Todas estas clulas trabalham em conjunto para promover um ambiente ideal
para que o ovrio exera as suas funes excrina e endcrina (BRISTOL-GOULD &
WOODRUFF, 2006). A funo excrina consiste da liberao de ocitos maturos aptos
para fecundao. Como funo endcrina o ovrio produz hormnios esterides
responsveis pelo desenvolvimento das caractersticas sexuais secundrias femininas e
suporte da gestao (KNIGHT & GLISTER, 2006).
O ovrio constitudo por duas regies: cortical e medular. No crtex ovariano,
imediatamente abaixo do epitlio germinativo, localiza-se a tnica albugnea que rica
em fibras colgenas, desprovida de vasos sanguneos e onde se encontra a grande
maioria dos folculos primordiais. Aps o incio do crescimento, os folculos ovarianos
deslocam-se para a parte mais profunda do crtex que contm abundante irrigao
sangunea. Na regio cortical, alm dos folculos ovarianos em diferentes estdios de
desenvolvimento, podem ser encontrados corpos lteos, albicans e hemorrgicos (LIU
et al., 2006).
A regio medular localizada na poro mais interna do ovrio, com exceo
dos eqdeos. constituda por tecido conjuntivo (fibroblastos, fibronectina, colgeno e
fibras reticulares), clulas musculares lisas, nervos, vasos sanguneos e linfticos
responsveis pela nutrio e sustentao do ovrio (HAFEZ, 1996; Figura 1).
Os eventos que marcam a morfognese do ovrio fetal incluem a colonizao
por clulas geminativas primordiais (CGP), interao das clulas geminativas
primordiais com clulas somticas, formao dos cordes ovgeros e, finalmente, o
desaparecimento dos cordes ovgeros e concomitante estabelecimento de uma
populao de folculos primordiais e uma complexa rede vascular (JUENGEL et al.,
2002b). A cronologia no desenvolvimento desses eventos que culminam na formao
dos folculos primordiais parece ser semelhante em todos os mamferos (SAWYER et
al., 2002).

21

Figura 1. Ilustrao do ovrio mamfero com suas principais estruturas.

Adaptado de http://www.tarleton.edu/~anatomy/ovary.html

2.2 Oognese

A oognese em ruminantes consiste na formao e diferenciao das clulas

germinativas primordiais (CGP) at a formao do ocito haplide fecundado
(BRISTOL-GOULD & WOODRUFF, 2006). A oognese inicia-se antes do
nascimento, mas somente alguns ocitos conseguem completar este processo meses ou
anos mais tarde no animal adulto, aps a fecundao (FIGUEIREDO et al., 2003). Em
ovinos e bovinos, ainda na vida embrionria, por volta do 20 e 30 dias de gestao,
respectivamente, ocorre migrao de CGP do saco vitelneo para a regio das gnadas
primitivas. Aps um processo marcado pelo crescimento celular e pela redistribuio de
organelas citoplasmticas, as CGP dentro do ovrio multiplicam-se ativamente e
transformam-se em oognias, as quais possuem alta atividade mittica e transcricional
(EPPIG et al., 2004). Dois tipos de clulas germinativas com funes diferentes
resultam da ltima diviso mittica das CGP. Uma inicia imediatamente outra diviso

22

mittica e d origem a uma linha de clulas oogoniais, enquanto a outra permanece em

intrfase e divide-se periodicamente, originando novas CGP que se diferenciaro
posteriormente em oognias. Em ovinos e bovinos, a diferenciao das CGP em
oognias ocorre no 31 e 42 dia de gestao, respectivamente (RSSE, 1983). A fase
que antecede este processo meitico marcada pela replicao do DNA (GORDON,
1994). Nesta fase, as oognias se diferenciam e passam ento a ser denominadas de
ocitos (FAIR, 2003). Estes, ento formados, comeam a primeira diviso meitica,
passando pelos estdios da prfase I (leptteno, zigteno, paquteno e diplteno) da
primeira diviso meitica (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). No estdio de diplteno
ou vescula germinativa da prfase I, ocorre a primeira interrupo da diviso meitica e
formao dos ocitos primrios, que permanecem neste estdio at a puberdade (SUH et
al., 2002). Na puberdade, imediatamente antes da ovulao, com o pico dos hormnios
folculo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), os ocitos que terminaram seu
crescimento retomam a meiose e o ncleo passa do estdio de vescula germinativa para
diacinese (CECCONI et al., 2004b). Em seguida, ocorre o rompimento da vescula
germinativa, progresso para metfase I, anfase I e telfase I, expulso do primeiro
corpsculo polar e formao do ocito secundrio (BETTERIDGE et al., 1989). Iniciase a seguir a segunda diviso meitica, em que o ncleo do ocito evolui at o estdio
de metfase II, quando ocorre a segunda interrupo da meiose (GORDON, 1994). O
ocito permanece neste estdio at ser fecundado pelo espermatozide, quando ento
completa a meiose e expulsa o segundo corpsculo polar, formando o ocito haplide
fecundado (MOORE & PERSAUD, 1994).

2.3 Foliculognese em ruminantes

O folculo considerado a unidade morfolgica e funcional do ovrio mamfero,
cuja funo proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturao do ocito
(CORTVRINDT & SMITZ, 2001). A foliculognese, evento iniciado na vida pr-natal
na maioria das espcies, pode ser definida como o processo de formao, crescimento e
maturao folicular, iniciando-se com a formao do folculo primordial e culminando
com o estdio de folculo de pr-ovulatrio (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005).
Ocorre simultaneamente oognese quando o ocito est entre as fases de prfase I e
metfase II, na maioria das espcies. Em outras palavras, a foliculognese inicia aps e

23

termina antes da oognese (FIGUEIREDO et al., 2003). Em ruminantes, a

foliculognese tem sido bastante estudada em ovinos e bovinos, mas poucas
informaes so disponveis em caprinos.
O folculo ovariano formado por vrios tipos celulares, sendo composto por
um ocito circundado por clulas somticas (granulosa e tecais) (MAGOFFIN, 2005).
Esses dois tipos celulares so responsveis pela sntese de numerosos hormnios que
promovem a complexa regulao do desenvolvimento folicular (SKINNER, 2005).
Durante a foliculognese, a morfologia folicular alterada uma vez que o ocito cresce
e as clulas circundantes se diferenciam (BRISTOL-GOULD & WOODRUFF, 2006).
De acordo com o grau de evoluo, os folculos podem ser classificados em pr-antrais
ou no cavitrios (primordiais, transio, primrios e secundrios) e antrais ou
cavitrios (tercirios e pr-ovulatrios) (Figura 2) (FIGUEIREDO et al., 2003).

c
CG

CG

N
CG

CT

f
CT

ZP
A
O

CG O

CG

Figura 2. Folculos ovarianos aps colorao com cido Peridico de Schiff (PAS)Hematoxilina. Folculos pr-antrais: (a) primordial; (b) transio; (c) primrio e (d)
secundrio. Folculo antrais: (e) tercirio e (f) pr-ovulatrio. N: ncleo do ocito; O:
ocito; CG: clulas da granulosa; ZP: zona pelcida; A: antro; CT: clulas da teca.

Durante a vida fetal, a formao dos folculos primordiais em ovrios de

caprinos, ovinos e bovinos observada aos 62, 75 e 120 dias, respectivamente
(BEZERRA et al., 1998; McNATTY et al., 1999; RSSE, 1983). Clulas germinativas

24

primordiais surgem aproximadamente trs semanas aps a fertilizao e migram atravs

de movimentos amebides do epitlio do saco vitelnico para a gnoda em formao.
Durante essa migrao, as CGP se multiplicam rapidamente por mitose e com sete
semanas de gestao originam grupos de oognias, conectados entre si por interaes
citoplasmticas denominados cordes primitivos (Figura 3) (SMITZ & CORTVRINDT,
2002).
Aps a colonizao dos ovrios pelas clulas germinativas primordiais e
posterior diferenciao em oognias e ocitos, uma camada de clulas somticas planas,
conhecidas tambm como clulas da pr-granulosa, circundam os ocitos formando
assim os folculos primordiais (JUENGEL et al., 2002b). A maioria das clulas da prgranulosa so recrutadas das clulas mesoteliais oriundas do epitlio da superfcie
ovariana que tem alta atividade proliferativa. Aps circundarem os ocitos, as clulas da
pr-granulosa param de se multiplicar e entram em um perodo de quiescncia
(SAWYER et al., 2002). A zona pelcida nesse estdio no observada, verificando-se
apenas uma justaposio do ocito e clulas da granulosa, sem nenhuma juno
especfica. O ncleo do ocito relativamente grande e ocupa uma posio central e as
organelas so uniformemente distribudas no citoplasma ou as vezes mais prximas ao
ncleo (LUCCI et al., 2001). Uma vez formados, os folculos primordiais representam o
pool de clulas germinativas disponveis durante toda a vida reprodutiva (EPIFANO &
DEAN, 2002), embora estudos recentes tenham sugerido que a oognese ps-natal
tambm pode ocorrer em fmeas mamferas (JOHNSON et al., 2004). importante
ressaltar que os folculos primordiais correspondem a um total de 90% de todos os
folculos presentes no ovrio (SMITZ & CORTVRINDT, 2002). A proliferao celular
retomada somente quando um folculo primordial quiescente comea a crescer, dias,
meses ou anos aps a sua formao (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). Os
mecanismos seletivos pelos quais alguns folculos crescem e outros permanecem
quiescentes ainda no so completamente elucidados (EPIFANO & DEAN, 2002).
Sabe-se que o desenvolvimento folicular inicial, incluindo a transio de folculo
primordial para primrio (ativao folicular) pouco dependente de gonadotrofinas e
que regulado, principalmente, por fatores intra-ovarianos (VAN DEN HURK &
ZHAO, 2005).
As caractersticas morfolgicas que marcam o incio do crescimento de folculos
primordiais so: aumento do dimetro oocitrio, proliferao das clulas da granulosa e

25

transformao do formato destas clulas de pavimentoso para cbico. Durante esta fase,
os folculos que apresentam clulas da granulosa com ambos os formatos pavimentoso e
cbico so denominados intermedirios ou de transio (BARNETT et al., 2006).

Clulas epiteliais da
superfcie ovariana

Folculo primordial
Clulas
i ti

Figura 3. Esquema ilustrando o desenvolvimento e dissoluo dos cordes ovgeros

durante a vida intra-uterina. Adaptado de JUENGEL et al., 2002b.

Quando o ocito circundado por uma camada completa de clulas da granulosa

de formato cbico, os folculos so classificados como primrios (FORTUNE, 2003).
Em caprinos, ovinos e bovinos, o aparecimento de folculos primrios, em fetos, ocorre
aos 71, 100 e 140 dias de gestao, respectivamente (BEZERRA et al., 1998;
McNATTY et al., 1999; RSSE, 1983). Os folculos primrios so o primeiro estdio
de crescimento saindo do pool de reserva. medida que os folculos iniciam o
crescimento, as protenas que iro formar a zona pelcida comeam a ser sintetizadas
(LEE et al., 2000). A zona pelcida uma matriz extracelular glicoprotica localizada
entre o ocito e as clulas da granulosa e consiste de trs glicoprotenas sintetisadas pelo
ocito, denominadas ZP1, ZP2 e ZP3 (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). As clulas
da teca so recrutadas do estroma e podem ser organizadas ao redor da membrana basal
(SKINNER, 2005). Os folculos secundrios so caracterizados pelo aumento do ocito,
a presena de duas ou mais camadas de clulas da granulosa e as primeiras clulas da

26

teca (SILVA et al., 2004b). Neste estdio, a zona pelcida claramente identificada ao
redor do ocito (PARROT & SKINNER, 2000). Alm disso, as clulas da granulosa
apresentam uma extensiva rede de junes do tipo gap, que so canais membranrios
que permitem a passagem de nutrientes, ons inorgnicos, mensageiros e pequenos
metablitos entre as clulas (KIDDER & MHAWI, 2002). O ncleo do ocito assume
uma posio exctrica e as organelas comeam a mover-se para a periferia (LUCCI et
al., 2001). Os folculos secundrios so observados em ovrios de fetos caprinos, ovinos
e bovinos aos 80, 120 e 210 dias de gestao, respectivamente (BEZERRA et al., 1998;
McNATTY et al., 1999; RSSE, 1983). Apesar de serem responsivos s
gonadotrofinas, os folculos secundrios podem desenvolver-se at o estdio antral com
uma quantidade mnima de FSH circulante (McGEE & HSUEH, 2000). Os dimetros
das categorias foliculares mencionadas anteriormente so mostrados na Tabela 1.
Tabela 1. Dimetro de folculos primordiais, primrios e secundrios e seus ocitos e
nmero de clulas da granulosa em seces histolgicas em caprinos.
Classe folicular

Dimetro (m)

N de CG

Folculo

Ocito

Primordial

20,0

15,9

1-14

Primrio

24,4

17,4

5-26

Secundrio

44,2

24,5

13-114

Adaptado de LUCCI et al., 2001.

Com a intensa proliferao das clulas da granulosa, uma rea preenchida por
fluido folicular identificada na camada granulosa e, a partir de ento, os folculos
passam a ser classificados como antrais. O fluido antral pode servir como uma
importante fonte de substncias reguladoras ou moduladoras derivados do sangue ou
secrees de clulas foliculares como gonadotrofinas, esterides, fatores de
crescimento, enzimas, proteoglicanos e lipoproteas. Durante o desenvolvimento
folicular, a produo de fluido antral intensificada pelo aumento da vascularizao
folicular e permeabilidade dos vasos sanguneos, os quais esto fortemente relacionados
com o aumento do folculo antral (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). A formao dos

27

folculos antrais em caprinos, ovinos e bovinos observada aos 110, 135 e 230 dias,
respectivamente (BEZERRA et al., 1998; McNATTY et al., 1999; RSSE, 1983). A
partir deste estdio, o dimetro folicular aumenta acentuadamente devido ao
crescimento do ocito, multiplicao das clulas da granulosa, da teca e aumento da
cavidade antral.
O desenvolvimento dos folculos antrais caracterizado por uma fase de
crescimento, recrutamento, seleo e dominncia, sendo a formao de folculos provulatrios (ltimo estdio de desenvolvimento folicular) um pr-requisito para a
ovulao e formao do corpo lteo, bem como manuteno da fertilidade (Figura 4)
(DRUMMOND, 2006). O folculo pr-ovulatrio caracterizado por um ocito
circundado por clulas da granulosa especializadas que so denominadas de clulas do
cumulus. As clulas da granulosa de folculos pr-ovulatrios param de se multiplicar
em resposta ao hormnio luteinizante (LH) e iniciam o processo final de diferenciao.
A ovulao ocorre em resposta ao pico de LH. Em todas as espcies, a formao de
folculos pr-ovulatrios ocorre geralmente durante a puberdade (DRIANCOURT,
2001).

Figura 4. Quadro resumido do desenvolvimento folicular ovariano.

28

Adaptado de BARNETT et al., 2006.

Os folculos antrais iniciais possuem RNAm para receptores de FSH nas clulas
da granulosa, mas so relativamente independentes de gonadotrofinas durante seu
perodo de crescimento inicial, uma vez que eles aumentam em tamanho na presena ou
ausncia de baixas concentraes de FSH e LH (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005).
Estudos ultra-sonogrficos indicam que o ciclo estral de cabras caracterizado por um
padro de ondas de desenvolvimento folicular nos ovrios (ROCHE, 1996). Uma onda
folicular envolve um crescimento de um grupo de folculos antrais dos quais geralmente
um ou dois folculos so selecionados para crescer at mais de 5 mm. O nmero de
ondas foliculares por ciclo varia entre duas a cinco, entretanto, o padro predominante
em cabras com ciclo estral de comprimento normal (19-22 dias) de quatro ondas
(Figura 5) (CASTRO et al., 1999).
O aumento das concentraes plasmticas de FSH constitui um dos estmulos
necessrios para o recrutamento e emergncia da onda folicular (ADAMS et al., 1992).
O folculo selecionado conhecido como folculo dominante e suprime ativamente o
crescimento dos demais folculos pela secreo de estradiol e inibina provocando a
regresso ou atresia dos mesmos (FORTUNE et al., 2001).

Dimetro folicular (m)

Lutelise
Recrutamento
Seleo
Dominncia
Atresia

Pool folicular sensvel

gonadotrofinas

Dias do ciclo estral

Figura 5. Esquema de ondas foliculares em ruminantes.

Adaptado de http://www.beef.unl.edu/learning/estrous.shtml

29

O controle do desenvolvimento ovariano, regulao do crescimento e seleo

folicular so eventos importantes, mas ainda no completamente elucidados. Ao longo
do ciclo reprodutivo, folculos ovarianos em todas as fases de desenvolvimento esto
presentes e geralmente podem ser classificados em trs estdios, ou seja, folculos
quiescentes, em crescimento ou atrsicos. Os sinais que interrompem a latncia do
folculo primoridal quiescente e induzem incio de seu crescimento em direo
ovulao ou atresia ainda no so completamente conhecidos (BRISTOL-GOULD &
WOODRUFF, 2006).

2.4 Importncia dos fatores de crescimento na regulao dos estdios foliculares

A foliculognese ovariana um processo complexo envolvendo padres de

secreo endcrina, parcrina e autcrina (SCOTT et al., 2004). Como descrito
anteriormente, o desenvolvimento folicular at o estdio antral inicial pode ocorrer na
ausncia de gonadotrofinas (FSH e LH), mostrando que os fatores de crescimento locais
desempenham um papel crucial nesta etapa (EPPIG, 2001).
Provavelmente, a ativao de folculos primordiais regulada pelo balano entre
fatores estimulatrios e um fator inibitrio presente no prprio ovrio. Dentre os fatores
estimulatrios para ativao folicular, destacam-se: Kit Ligand (KL PARROTT &
SKINNER, 1999), fator de crescimento de diferenciao-9 (GDF-9 VITT et al.,
2000), fator de crescimento fibroblstico-2 (FGF-2 NILSSON et al., 2001), fator
inibidor de leucemia (LIF NILSSON et al., 2002), fator de crescimento queratincito
(KGF NILSSON & SKINNER, 2003) e protena morfogentica do osso 4 (BMP-4
KEZELE et al., 2002) e 7 (BMP-7 LEE et al., 2001). O fator de crescimento do nervo
(NGF) considerado importante, mas no essencial na ativao de folculos primordiais
(DISSEN et al., 2001). Por outro lado, alguns estudos tm demonstrado que o hormnio
Anti-Mlleriano (AMH) inibe o recrutamento de folculos primordiais para o pool de
folculos em crescimento (CARLSSON et al., 2006).
A transio folicular do estdio primrio para secundrio regulado por
membros da famlia do fator de crescimento transformante (TGF-), GDF-9, protena

30

morfogentica do osso 15 (BMP-15) (CECCONI et al., 2004b). Alm destes, tambm

atuam a Ativina A (ZHAO et al., 2001b), fator de crescimento epidermal (EGF
GUTIERREZ et al., 2000), fator de crescimento do endotlio vascular (VEGF YANG
& FORTUNE, 2007) e testosterona (YANG & FORTUNE, 2006).
Nos folculos secundrios ou multilaminares, as junes gap facilitam a
comunicao bi-direcional e permitem a transferncia de nutrientes, metablitos (como
aminocidos e nucleotdeos), outras molculas (hormnios, neurotrofinas e fatores de
crescimento) e sinais meiticos estimulatrios e inibitrio entre ocito e clulas da
granulosa. Nessa classe folicular sugerido que o desenvolvimento esteja
principalmente associado com fatores locais (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005), tais
como: Ativina A (THOMAS et al., 2003), KGF (McGEE et al., 1999), TGF- (LIU et
al., 1999), EGF (GUTIERREZ et al., 2000), GDF-9 (HAYASHI et al., 1999) e BMP-15
(JUENGEL et al., 2002a). Alm desses, podemos citar o hormnio do crescimento (GH
LIU et al., 1998) e fator de crescimento semelhante insulina I (IGF-I ZHAO,
2001a). Embora folculos secundrios sejam responsivos s gonadotrofinas, como
hormnio folculo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), eles podem desenvolver para
estdio antral com uma circulao mnima dos mesmos (VAN DEN HURK & ZHAO,
2005).
Os sinais para formao do antro no so bem conhecidos. Estudos in vitro com
folculos de roedores mostraram que FSH (MAO et al., 2002), LH (CORTVRINDT et
al., 1998), ativina (ZHAO et al., 2001b), IGF-I (DRIANCOURT, 2001), fator de
crescimento fibroblstico 8 (FGF-8 BURATINI et al., 2005) e KL (DRIANCOURT et
al., 2000) so possveis candidatos nesse respeito. Estudos in vitro com folculos
secundrios em bovinos mostraram um efeito estimulatrio do EGF na formao do
antro (Figura 6) (GUTIERREZ et al., 2000).

31

Figura 6. Desenho esquemtico ilustrando os fatores envolvidos nas diferentes fases do

desenvolvimento folicular. Adaptado de BRISTOL-GOULD & WOODRUFF, 2006.

2.5 Populao folicular ovariana

O estoque finito e no renovvel de clulas germinativas considerado como
uma premissa bsica da fisiologia da reproduo. O declnio progressivo do nmero de
ocitos ao longo da vida ps-natal ocorre principalmente por mecanismos apoptticos, e
na senilidade, a ausncia de clulas germinativas nos ovrios apresenta-se como
fenmeno amplamente aceito (SENEDA & BORDIGNON, 2007).
Em muitos mamferos, a populao folicular ovariana estabelecida ainda na
vida intra-uterina (primatas e ruminantes KNIGHT & GLISTER, 2006) ou em um
curto perodo de tempo aps o nascimento (roedores OJEDA et al., 2000). Por outro
lado, recentemente trabalhos tm demonstrado mecanismos envolvidos na formao de
novas clulas germinativas e folculos na mulher (BUKOVSKY et al., 2005) e
camundonga adulta (JOHNSON et al., 2004). Esses autores demonstraram indcios da
continuidade da oognese e foliculognese no perodo ps-natal, pela atuao de
clulas-tronco. Foi evidenciada a presena de protenas especficas do incio da meiose
em ovrios de camundongas adultas. De acordo como o conceito atual, a expresso
dessas protenas deveria ocorrer apenas durante a vida intra-uterina (SENEDA &
BORDIGNON, 2007). Em trabalho subseqente (JOHNSON et al., 2005), um grupo de
camundongas foi submetido esterilizao qumica, sendo descrita ausncia de

32

folculos aps tratamento. Em seguida, os animais receberam transfuso de medula

ssea e sangue perifrico e, uma semana aps, folculos viveis em crescimento foram
identificados nos ovrios. Para BUKOVSKY et al. (2005), a renovao folicular psnatal ocorre regularmente em mulheres, mas a origem das clulas-tronco para tal no
seria a medula ssea, e sim clulas germinativas presentes na superfcie do epitlio
ovariano.
Independente disso, a populao folicular difere entre as espcies, alm de ser
observada uma forte variao individual (KATSKA-KSIAZKIEWICZ, 2006), sendo de
aproximadamente 1.500 na camundonga (SHAW et al., 2000); 160.000 na ovelha
(AMORIM et al., 2000); 35.000 na cabra (LUCCI et al., 1999) e aproximadamente
2.000.000 na mulher (ERICKSON, 1986). Ao longo da vida do animal, ocorre uma
reduo ordenada, geralmente exponencial, no nmero de folculos pr-antrais (SHAW
et al., 2000). Essa reduo devida a dois fenmenos que ocorrem naturalmente no
ovrio: (i) a ovulao e (ii) a atresia ou morte folicular. Somente uma pequena parte
(0,1%) dos folculos primordiais chega ao estdio de ovulao (NUTTINCK et al.,
1993), pois a maioria (99,9%) torna-se atrsica durante as fases de crescimento e
maturao (OTALA et al. 2002).

2.6 Atresia folicular

Os folculos pr-antrais representam 90% da populao folicular e so
responsveis pela renovao contnua de folculos antrais no ovrio. Entretanto, a
maioria, ou seja, 99,9% dos folculos pr-antrais no chega at a ovulao, mas sofre
um processo conhecido por atresia folicular (KATSKA-KSIAZKIEWICK, 2006). A
atresia, apesar de causar a perda de vrios folculos ovarianos, um evento crucial para
manuteno da homeostase ovariana em mamferos, assegurando a ciclicidade dos
animais e prevenindo o desenvolvimento de mltiplos embries durante a gestao
(AMSTERDAM et al., 2003). A atresia um fenmeno natural que comum a todos as
espcies domsticas, podendo ocorrer em qualquer estdio do desenvolvimento
folicular, sendo mais comum nos estdios antrais mais avanados (GLAMOCLIJA et
al., 2005). Ela pode ocorrer por via apopttica ou degenerativa, fazendo com que o
ovrio seja um rgo de baixssima produtividade (MARKSTROM et al., 2002).

33

O processo de atresia usualmente difere entre folculos pr-antrais (primordiais,

primrios e secundrios) e antrais. Em folculos pr-antrais, as primeiras alteraes
indicativas de atresia ocorrem no ocito, como por exemplo, retrao da cromatina
nuclear e fragmentao oocitria, o que desencadeia o processo de eliminao
irreversvel dos folculos ovarianos neste estdio de desenvolvimento (MORITA &
TILLY, 1999). importante ressaltar que aps a formao da cavidade antral, ocorre
uma alterao na sensibilidade do ocito e das clulas da granulosa. A partir deste
estdio, o ocito torna-se altamente resistente e as primeiras alteraes indicativas de
atresia so observadas nas clulas da granulosa (JORIO et al., 1991). A seguir, sero
descritos os mecanismos de atresia de folculos ovarianos atravs da apoptose e da
necrose.

2.6.1 Apoptose
A apoptose, tambm conhecida como morte celular programada, um evento
geneticamente determinado, ou seja, depende do balano de genes pr e antiapoptticos, e observada nos folculos ovarianos durante toda a vida, incluindo a fase
pr-natal (HUSSEIN, 2005). A apoptose geralmente mediada por mecanismos
intrnsecos, podendo tambm ser influenciada por fatores extrnsecos (JOHSTONE et
al., 2002).

Dentre os fatores que podem levar a apoptose destaca-se o estresse

oxidativo, irradiao, ativao de genes promotores de apoptose, bem como danos no

DNA, citocinas, protenas virais e a deficincia de fatores de sobrevivncia da clula
(JOHNSON, 2003).
O incio, execuo e regulao da apoptose envolvem vrios fatores bioqumicos
e as caspases possuem um papel central como sinalizador da apoptose. Elas so
membros da famlia de proteinases cistenicas com especificidade para ligaes
peptdicas envolvendo o aspartato. So expressas como pr-enzimas e so
proteoliticamente processadas para a sua forma ativa aps estmulo apopttico
(STRASSER et al., 2000). Existem 14 tipos de caspases, sendo estas identificadas como
caspase-1 at caspase-14 (TIBBETS et al., 2003). Funcionalmente, a famlia das
caspases pode ser dividida em duas subfamlias. As caspases-1, -4, e -5 esto envolvidas
com o processamento de citocinas pr-inflamatrias como as pr-interleucina-1 e printerleucina-18, e tm funes pr-inflamatrias. Os outros membros da famlia

34

funcionam especificamente para a morte celular por apoptose, e so subdivididas em

iniciadoras (caspases-2, -8, -9 e -10) e executoras ou efetoras (caspase-3, -6 e -7)
(STRASSER et al., 2000). As caspases iniciadoras so clivadas em resposta a um
estmulo apopttico e ativam as caspases efetoras (GREEN, 2003). Durante a apoptose,
as caspases efetoras clivam numerosas protenas localizadas na membrana celular,
ncleo e citoplasma. A ativao da CAD (caspase DNase ativada) para facilitar a
degradao do DNA uma das funes importantes das caspases no processo
apopttico (NAGASE et al., 2003).
Dois diferentes padres moleculares sinalizadores podem levar a ativao das
caspases e a escolha da via utilizada pela clula profundamente influenciada pelo
estmulo apopttico inicial. A primeira via atravs de receptores de superfcie celular
(receptores de morte), constituindo a via extrnseca, exemplificada pela ligao do fator
de necrose tumoral (TNF) e do antgeno Fas (polipeptdeo associado membrana,
membro da superfamlia de receptores TNF) aos seus respectivos receptores. A segunda
via, conhecida como intrnseca, mediada pelas mitocndrias, ocorre principalmente por
meio de sinalizadores de estresse intrnseco, seguida de instrues para o
desenvolvimento

da

apoptose

(HENGARTNER,

2000;

KAUFMANN

&

HENGARTNER, 2001). A integridade mitocondrial e a liberao do citocromo c dentro

do citosol so primariamente controlados pelos membros da famlia Bcl-2 (Gene antiapopttico; DESAGHER & MARTINOU, 2000). O mecanismo preciso pelo qual os
membros da famlia Bcl-2 modulam a apoptose no esto completamente elucidados,
especialmente as funes relacionadas com a liberao do citocromo-c do
compartimento intermedirio mitocondrial no citosol (SUZUKI et al., 2000).
Existem trs hipteses para esse fato: 1) Protenas Bcl-2 podem se inserir dentro
da membrana mitocondrial, formando em seguida canais que permitem a passagem de
molculas (REED & KROEMER, 2000); 2) Membros da famlia Bcl-2 podem interagir
com outras protenas na membrana mitocondrial formando grandes poros na membrana
da mitocndria (REED & KROEMER, 2000); e 3) Membros da famlia Bcl-2 podem
alterar a permeabilidade da membrana, causando turgidez mitocondrial e eventual
ruptura da membrana mitocondrial externa, com a liberao de protenas
intermembranrias no citosol (HENGARTNER, 2000). O citocromo-c citoslico
dispara a formao do apoptossoma mitocondrial, que indicativo de apoptose e
consiste do citocromo c, Apaf-1 (Fator ativador de protease apopttica) e caspase-9

35

(JOZA et al., 2002). A ligao do citocromo c protena adaptadora Apaf-1 recruta a

pr-caspase-9. Essa pr-caspase clivada, e a sua forma ativa, ou seja, caspase-9,
promove uma ativao proteoltica da caspase-3. Tal caspase leva informao da
apoptose ao ncleo e ela prpria, cliva a protena ICAD (inibidor de caspase ativada
pelo DNA) que est normalmente ligada a uma endonuclease (CAD) que reside no
ncleo. Aps essa clivagem, a endonuclease liberada e faz a quebra do DNA a cada
180-200 pares de bases ou mltiplos (HUSSEIN, 2005).
As caractersticas morfolgicas da apoptose so condensao perifrica da
cromatina nuclear seguida pelo rompimento do citoesqueleto (BLONDIN et al., 1996),
compactao da clula e fragmentao citoplasmtica e nuclear, resultando na formao
de mltiplos corpos apoptticos (RACHID et al., 2000). Em seguida, os corpos
apotticos so fagocitados pelas clulas vizinhas, sem ocorrer processo inflamatrio.
Durante todo o processo, a permeabilidade celular permanece inalterada, e as organelas
mantm sua integridade morfofuncional (Figura 7).

Normal

Condensao

Fragmentao

Corpos apoptticos

Figura 7. Ilustrao de vrios estdios de morte celular por apoptose. Representao de

mudanas esteretipas incluindo condensao, mudanas na estrutura nuclear e
fragmentao da clula em pequenos corpos apoptticos. Adaptado de PADANILAM,
2003.

36

2.6.2 Necrose
A necrose, diferentemente da apoptose, considerada uma forma no
programada de morte celular e iniciada devido a algum estmulo circunstancial
resultando na rpida quebra da homeostasia celular (BRAS et al., 2005).
A necrose comumente ocorre devido a estmulos txicos, isqumicos,
degenerativos e imunolgicos, podendo tais fatores tambm induzir a apoptose. Alm
disso, alguns estmulos que levam a ocorrncia de apoptose podem em certas
circunstncias (como depleo de energia ou reduo da ativao das caspases) induzir
o fenmeno da necrose (ZEISS, 2003). Geralmente, a necrose iniciada por
mecanismos no celulares como isquemia, deficincia de nveis de ATP (BHATIA,
2004), trauma, levando a danos irreversveis na clula (McCULLY et al., 2004).
Recentes trabalhos tm sugerido que alm dessas causas, mecanismos ativos como
uma sobrecarga de Na+, acmulo de Ca2+ e mudanas na permeabilidade da mitocndria
podem tambm participar e levar ao processo necrtico (PADANILAM, 2003).
O padro bioqumico que leva a morte celular necrtica pouco conhecido. Em
injrias isqumicas ou hipxicas, a depleo de energia ocorre devido a uma deficiente
produo de ATP associada a um rpido consumo de ATP pelas bombas e devido
hidrlise e perda de ATP. O aumento do volume celular associado com a morte celular
necrtica iniciado devido ao influxo de Na+ e liberao de ATP devido ruptura da
membrana (PADANILAM, 2003). O aumento dos nveis de Na+ no citosol ativa a
bomba Na+-K+-Atpase, resultando na dissipao de ATP. Nos estdios iniciais da
injria, um simultneo efluxo de K+ mantm a homeostase inica. Severas deplees de
ATP levam a falhas no mecanismo de balano da bomba de ons, levando a um influxo
de Na+ e gu,a o qual resulta em inchao e ruptura da clula. Esse acmulo de Na+
concomitante com uma severa deficincia de ATP o maior responsvel pela necrose
(CARINI et al., 1995). O aumento dos nveis de Ca2+ ativa endonucleases para degradar
DNA, bem como proteases celulares ativas para degradar diversas estruturas e protenas
sinalizadoras (WANG, 2000).
A participao da mitocndria na necrose a na apoptose pode ocorrer pela
abertura de poros durante a permeabilidade mitocondrial transitria. Alguns segundos
mensageiros e protenas pr-apoptticas, incluindo membros da famlia Bcl-2, podem
induzir a abertura de poros na mitocndria (KROEMER & REED, 2000).

37

Em condies in vitro, especialmente durante a conservao, ocorre alterao no

fornecimento de oxignio e nutrientes para o ovrio. Nesta situao, a isquemia pode ser
uma das principais causas do desencadeamento da morte folicular por degenerao
(FARBER, 1982), resultando em alteraes na permeabilidade da membrana celular.
Essas alteraes podem levar ao aumento de gua intracelular e do volume celular,
vacuolizao citoplasmtica e, conseqentemente, degenerao (BARROS et al., 2001).
A morfologia de uma clula que sofreu necrose bem distinta de uma clula que
sofreu apoptose, com mudanas ultra-estruturais ocorrendo tanto no citoplasma quanto
no ncleo (SCAFFIDI et al., 2002). As principais caractersticas so: floculao da
cromatina, turgidez e completa degenerao do citoplasma e da matriz mitocondrial,
rompimento da membrana plasmtica, e eventual extravasamento do contedo
citoplasmtico dentro do espao extracelular (NEWTON & ILLINGWORTH, 2001)
(Figura 8). Diferentemente da apoptose, a cromatina no empacotada em discretas
partculas ligadas a membrana.

Normal

Inchao reversvel

Inchao irreversvel

Desintegrao

Figura 8. Ilustrao de vrios estdios de morte celular por necrose. Representao de

mudanas

esteretipas

incluindo

aumento

de

volume

celular,

degenerao

citoplasmtica, desintegrao das organelas e membrana. Adaptado de SLOT, 2004.

2.7 Transporte e preservao de ovrios

Visando evitar a enorme perda folicular que ocorre naturalmente in vivo, vem
sendo desenvolvida a biotcnica de manipulao de ocitos inclusos em folculos prantrais (MOIFOPA), que consiste no isolamento, conservao e cultivo folicular in
vitro. O resfriamento, que uma etapa importante desta biotcnica, tem sido utilizado

38

para preservao de folculos pr-antrais (SANTOS et al., 2003), visando melhorar as

condies de transporte mantendo a viabilidade folicular at sua manipulao
(SANTOS et al., 2004). Sendo assim, o objetivo da preservao consiste em garantir
que as clulas permaneam com uma baixa taxa metablica durante o perodo de
estocagem, a fim de que possam ser resgatadas para continuar o seu desenvolvimento in
vitro. Entretanto, para que isso seja possvel, mesmo aps longos perodos de
preservao, alguns fatores essenciais para a sobrevivncia das clulas devem ser
levados em considerao, tais como: escolha do meio utilizado durante o processo de
resfriamento, temperatura e tempo de preservao (SANTOS et al., 2004).
Diferentes solues e meios tm sido utilizados para a preservao de FOPA,
podendo ser citados como exemplos: TCM 199 (COSTA et al., 2005), soluo salina
0,9% (MATOS et al., 2004), PBS (SANTOS et al., 2002), soluo Braun-Collins
(CARVALHO et al., 2001) e soluo base de gua de coco (LUCCI et al., 2004).
Dentre os meios de conservao empregados, o MEM (Meio Essencial Mnimo) tem
sido utilizado no cultivo in vitro de folculos pr-antrais em diferentes espcies
mantendo a viabilidade folicular (JEWGENOW et al., 1998) e ativao de folculos
primordiais (MARTINS et al., 2005).
Tcnicas para armazenamento de ovrios a curto perodo j foram desenvolvidas
para caprinos (SILVA et al., 2000), ovinos (ANDRADE et al., 2002) e bovinos (LUCCI
et al., 2004). Nesses estudos, as temperaturas de 4, 20 e 39 C foram testadas para
preservao de folculos pr-antrais. Em geral, a temperatura mais satisfatria a de 4
C, permitindo uma boa preservao de folculos pr-antrais em sunos por perodos de
at 18 ou 24 h, enquanto 20 C preserva os folculos por apenas 4 ou 6 h, no afetando a
habilidade para posterior desenvolvimento in vitro (LUCCI et al., 2007).
Em caprinos, a preservao de fragmentos ovarianos in vitro com valores
semelhantes aos encontrados in vivo foram obtidos a 4 C em soluo salina e BraunCollins por 12 h (CARVALHO et al., 2001; SILVA et al., 2000) e em gua de coco,
TCM 199 e PBS por 24 h (FERREIRA et al., 2001; SILVA et al., 2000; SANTOS et
al., 2002), e a 20 C em meio gua de coco, soluo salina e TCM 199, Braun-Collins e
PBS por 4 h (CARVALHO et al., 2001; SILVA et al., 2000; SANTOS et al., 2002;
FERREIRA et al., 2001). No entanto, nenhum desses trabalhos mostraram resultados
satisfatrios quando os fragmentos ovarianos foram transportados a 39 C nem mesmo
por 4 h (FERREIRA et al., 2001; SILVA et al., 2000; SANTOS et al., 2003).
Durante o transporte dos ovrios para o laboratrio, a ausncia de aporte

39

vascular impede o suprimento de oxignio e energia para os ovrios. A privao de

oxignio do tecido resulta em uma mudana do metabolismo aerbico para anaerbico,
sendo o acido lctico o produto principal, acumulado dentro da clula causando reduo
do pH (WONGSRIKEAO et al., 2005).
Com a inteno de reduzir esses efeitos, a hipotermia provocada por baixas
temperaturas (4 e 20 C), provoca uma reduo no metabolismo celular, minimizando
as necessidades metablicas e aumentando a resistncia de folculos reduo de
nutrientes e oxignio durante a preservao in vitro (SILVA et al., 2003). O
metabolismo fisiolgico (39 C) associado a baixa tenso de oxignio em estudos in
vitro leva a degenerao folicular (CELESTINO et al., 2007). No entanto, ovrios
bovinos tm sido transportados em temperaturas de 35 C sem problemas para um
subsequente cultivo in vitro (39 C) (SAHA et al., 2000).
Neste sentido, o transporte e perodo de armazenamento dos ovrios, e em
particular, temperatura do meio usado durante transporte esto entre os fatores que
afetam a maturao completa do ocito (TAS et al., 2006).

2.8 Importncia da preservao de folculos pr-antrais de animais domsticos

Tendo em vista a grande perda de folculos pr-antrais, que ocorre naturalmente
in vivo, e a ausncia de mtodos eficientes de cultivo desses folculos in vitro, a
conservao do tecido ovariano ou dos folculos pr-antrais tem sido uma alternativa
para preservar os gametas femininos da espcie humana (PICTON & GOSDEN, 2000),
bem como de vrias espcies mamferas domsticas bovinos (LUCCI et al., 2004),
ovinos (CASPACCHIETTI et al., 2004), caprinos (RODRIGUES et al., 2004), felinos
( JEWGENOW et al., 1998).
Especificamente com relao aos animais de produo, as pesquisas tm como
objetivo preservar e contribuir para a multiplicao de animais de alto valor gentico.
Alm disso, animais como os ovinos e caprinos podero servir de modelo experimental
para aplicao na espcie humana, haja vista a similaridade da gnada feminina entre
essas espcies (SALLE et al., 2002). Alm de sua importncia para a formao de
bancos de germoplasma animal, os milhares de folculos pr-antrais de um mesmo
animal, preservados podem ser destinados para pesquisas que visem o crescimento,

40

maturao e fecundao in vitro, clonagem, transgenia, congelao e vitrificao

(PICTON, 2001).

2.9 Cultivo in vitro de folculos ovarianos

O objetivo principal do cultivo in vitro de FOPA permitir o desenvolvimento
folicular assegurando o crescimento e maturao dos ocitos, bem como a multiplicao
e posterior diferenciao das clulas da granulosa inclusas nesses folculos
(FIGUEIREDO et al., 2003). O cultivo de ovrios tem sido usado para avaliar a
importncia da vascularizao (FORTUNE et al., 2000), apoptose (FLAWS et al.,
2001) e fatores de crescimento (ERICKSON, 2001) para desenvolvimento de folculos
primordiais (O`BRIEN et al., 2003).
Em roedores, a pequena dimenso dos ovrios possibilita o cultivo do rgo
inteiro, o que tem sido bastante til para o estudo da foliculognese inicial em pequenos
mamferos (FORTUNE, 2003). Por outro lado, em animais domsticos de mdio e
grande porte, devido s grandes dimenses dos ovrios, no possvel utilizar este
modelo. Para estes animais, o cultivo de pequenos fragmentos de crtex ovariano, rico
em folculos primordiais, tem sido realizado para o estudo da ativao e crescimento de
folculos primordiais caprinos (SILVA et al., 2004a), bovinos (BRAW-TAL &
YOSSEFI, 1997) e humanos (SCOTT et al., 2004 e ZHANG et al., 2004). Folculos
humanos permaneceram viveis por quatro semanas quando cultivados em sistema in
situ (HOVATTA et al., 1997). O cultivo de pequenos fragmentos de crtex ovariano
tem a vantagem de manter a integridade estrutural folicular e as interaes entre as
clulas foliculares e clulas do estroma, facilitando a perfuso do meio para o tecido
ovariano (TELFER, 1996).
J o segundo sistema de cultivo folicular envolve o isolamento, mecnico ou
enzimtico dos folculos ovarianos pr-antrais (ABIR et al., 2001b). As tcnicas de
isolamento desenvolvidas possibilitam a recuperao de milhares de folculos prantrais a partir de um nico ovrio (FIGUEIREDO et al., 2003). Alm disso, o cultivo
de folculos isolados permite o monitoramento dirio do crescimento folicular in vitro e
o efeito in vitro de hormnios e fatores de crescimento sobre cada classe folicular
(ABIR et al., 2001a).

41

Os folculos primrios e secundrios podem ser isolados e cultivados

individualmente. Desta forma, mtodos mecnicos tm sido desenvolvidos para isolar
um grande nmero de folculos intactos de ovrios de cabras (LUCCI et al., 1999),
ovelhas (CECCONI et al., 1999), vacas (FIGUEIREDO et al., 1999), ratas (ZHAO et
al., 2000) e camundongas (LENIE et al., 2004). Uma vez isolados, os folculos podem
ser cultivados na sua forma intacta, para o estudo dos efeitos in vitro de hormnios e
fatores de crescimento nos folculos primrios ou secundrios (SILVA, 2005). Os
principais sistemas realizam o cultivo dos folculos diretamente sobre o suporte de
plstico, sobre uma matriz de colgeno ou inclusos em gotas de colgeno
(DEMEESTERE et al., 2005) (Figura 9).

In situ (ovrio inteiro)

d

In situ (fragmentos)
e

Isolado em suspenso

isolado sobre placa

f

isolado sobre matriz

isolado incluso em matriz

Figura 9. Modelos para cultivo in vitro de folculos pre-antrais. Folculos in situ (Fig. a,
b) e isolados (Fig. c, d, e, f). Adaptado de HARTSHORNE, 1997.

2.9.1 Estado atual do cultivo in vitro de folculos pr-antrais

Vrios autores tm utilizado sistemas de cultivo in situ e isolado para estudar o
desenvolvimento de folculos pr-antrais em roedores e ruminantes (VAN DEN HURK
& ZHAO, 2005). Em gatas (JEWGENOW & STOLTE, 1996), gambs (BUTCHER &
ULLMAN, 1996) e macacas (FORTUNE et al., 1998) j foi observado o crescimento

42

de folculos pr-antrais aps cultivo in vitro, porm sem a formao de antro. Nas
espcies bovinas (ITOH et al., 2002), ovinas (CECCONI et al., 1999), caprinas
(HUAMIN & YONG, 2000) e humana (ROY & TREACY, 1993), folculos pr-antrais
isolados foram cultivados in vitro e se desenvolveram at o estdio antral. Em sunos,
folculos secundrios crescidos in vitro chegaram at a ovulao, tiveram seus ocitos
fecundados in vitro, com desenvolvimento at estdio de blastocisto (WU et al., 2001).
Os maiores avanos do cultivo folicular foram obtidos em roedores, tendo sido
obtido o nascimento de crias viveis a partir do cultivo de ocitos provenientes de
folculos pr-antrais de camundongas, em que o ocito adquiriu competncia para
maturao, fertilizao e desenvolvimento embrionrio (O BRIEN et al., 2003). Tal
crescimento foi obtido atravs de dois sistemas de cultivo. O primeiro consistiu no
cultivo de ovrios inteiros para obteno da transio de primordial para primrio. O
segundo consistiu no isolamento e cultivo de folculos primrios e secundrios.
Provavelmente essa estratgia necessria para promover o crescimento de folculos
primordiais de espcies domsticas e primatas (SILVA et al., 2006). Embora a
utilizao de fragmentos ovarianos no cultivo permita a ativao folicular (HOVATTA
et al., 1999), a variedade de clulas presentes no cultivo in situ torna o sistema pouco
definido e impede estudos mais detalhados sobre a biologia dos ocitos e da
foliculognese nos estdios iniciais de desenvolvimento (MURUVI et al., 2005). O
presente desafio determinar condies de cultivo apropriadas para dar suporte
transio de folculos primrios para secundrios in vitro. Esta fase apresenta alta
sensibilidade degenerao em virtude da alta atividade biossinttica e consumo de
nutrientes, sendo a composio do meio um importante fator para a obteno de sucesso
durante o cultivo de folculos pr-antrais in vitro (WANDJI et al., 1997).

2.9.2 Importncia da composio do meio sobre desenvolvimento folicular in vitro

O desenvolvimento de um sistema de cultivo de base que garanta a ativao e
crescimento folicular para um estdio em que os ocitos podem ser maturados e
fertilizados in vitro importante para estudar os fatores que controlam o crescimento
oocitrio e multiplicao das clulas da granulosa (ANDRADE et al., 2005).
A composio do meio de cultivo um importante fator para obteno de
sucesso durante o cultivo in vitro de folculos ovarianos. FIGUEIREDO et al. (1994)

43

descreveram que a sobrevivncia dos folculos pr-antrais bovinos in vitro foi reduzida
na ausncia de hipoxantina e substratos energticos, tais como piruvato e glutamina. Foi
demonstrado tambm que uma mistura de piruvato (0,23 mM), glutamina (2 mM) e
hipoxantina ao meio de cultivo de base (MEM), suplementado com ITS (insulina 6,25
g/ml, transferrina - 6,25 g/ml e selnio - 6,25 g/ml) aumentou significativamente a
porcentagem de folculos morfologicamente normais durante o cultivo. JEWGENOW et
al. (1998) mostraram tambm que a adio de piruvato, glutamina e hipoxantina ao
meio de cultivo (MEM) so essenciais para o crescimento de folculos pr-antrais
felinos in vitro.
Insulina normalmente adicionada ao meio de cultivo como fator de
sobrevivncia, permitindo um melhor aproveitamento das fontes de energia do meio e
aumentando os precussores metablicos como aminocidos e glicose (LIU et al., 2002).
Os antioxidantes (selnio e transferrina) so relatados como importantes
substncias a serem adicionadas ao meio. Alguns autores sugerem que o processo de
maturao folicular est relacionado aos altos nveis de transferrina e seus receptores na
clula e que selnio pode ser adicionado ao meio de cultivo para ativar enzimas
envolvidas na detoxificao e eliminao de radicais livres (DEMEESTERE et al.,
2005). SILVA et al. (2004b) demonstraram a importncia da adio de tais substncias
ao MEM durante o cultivo de folculos pr-antrais caprinos inclusos no tecido ovariano.
O FSH usualmente adicionado ao meio de cultivo de folculos pr-antrais em
camundongas e grandes mamferos (MAO et al., 2002). Em caprinos, a adio de 50
ng/mL de FSH ao meio de cultivo de folculos pr-antrais inclusos em tecido ovariano
foi responsvel pela preservao da viabilidade folicular, aumento dos dimetros
folicular e oocitrio bem como pela manuteno da integridade ultra-estrutural dos
folculos (MATOS et al., 2007). MITCHELL et al. (2002) revelaram que na ausncia de
FSH somente 10% dos folculos sobreviveram durante crescimento in vitro.

2.10 Mtodos de avaliao da viabilidade folicular

Existem vrias tcnicas disponveis para avaliar a morfologia, ultraestrutura e
viabilidade dos folculos ovarianos pr-antrais. Com o auxlio destas tcnicas, pode-se

44

analisar a ativao, o crescimento e a viabilidade folicular ao longo do perodo de

cultivo in vitro (MATOS, 2007).
A histologia clssica (HC) permite verificar a mudana na morfologia das
clulas da granulosa de pavimentosas para cbicas, no momento da ativao folicular,
alm de analisar a integridade morfolgica do ocito e das clulas da granulosa. A
vantagem desta tcnica a possibilidade de avaliar um grande nmero de folculos,
importante para uma anlise quantitativa (MATOS et al., 2004). Alguns autores
mostraram que na anlise histolgica, as alteraes indicativas de atresia em folculos
pr-antrais ocorrem primariamente no ocito, sendo a picnose nuclear o primeiro sinal
de atresia (HUSSEIN, 2005). Apesar de tais informaes, no possvel avaliar a
integridade das organelas citoplasmticas atravs de HC (GOSDEN, 2000). Para tal
anlise, a microscopia eletrnica de transmisso (MET) consiste em uma ferramenta
indicada por mostrar as mudanas ultraestruturais (SALEHNIA et al., 2002) ocorridas
durante a atresia folicular, sendo destacada sua importncia aps conservao in vitro de
folculos pr-antrais caprinos e ovinos, mostrando que folculos considerados normais
aps avaliao histolgica poderiam apresentar alteraes degenerativas na sua
ultraestrutura (MATOS et al., 2004; SANTOS et al., 2006).
Alm das tcnicas j mencionadas, existe ainda a utilizao de corantes vitais
como o azul de trypan, empregado para estimar a viabilidade da populao de folculos
isolados aps cultivo in vitro atravs da penetrao do corante em membranas
danificadas. Esta tcnica equivalente histologia clssica, mostrando resultados
similares quanto viabilidade (AMORIM et al., 2003 a, b). O corante Hoescht tem sido
largamente empregado em citologia com a finalidade de corar cromossomos. Este
corante penetra em clulas vivas , no submetidas ao processamento histolgico(SAHA
et al., 2000). A tcnica de TUNEL (terminal deoxynucleotidil transferase-mediate
deoxyuridine triphosphate biotin nick end-labeling) avalia a fragmentao do DNA em
seces histolgicas, determinando o grau de apoptose (LINDE et al., 2000). O brometo
de etdio comumente utilizado como um corante de cidos nuclicos (MAO et al.,
2002). A deteco do incio de crescimento de folculos primordiais depende da
disponibilidade de marcadores sensveis (WANDJI et al., 1996). Dentre os marcadores
proloferativos mais utilizados pode-se citar: bromo-deoxiuridina (BrdU), antgeno
nuclear de proliferao celular (PCNA) e timidina- H3 que se incorporam ao material
nuclear durante a transcrio. O crescimento e a diferenciao folicular durante o
cultivo in vitro podem ser refletidos pela secreo de esterides (LIU et al., 2001). Para

45

detectar esses produtos de secreo folicular, podem ser utilizadas anlises de alta
sensibilidade, entretanto, anlises das concentraes de RNAm indicando a expresso
gnica ou imunohistoqumica utilizando anticorpos para protenas especficas so as
tcnicas mais indicadas (HARTSHORNE, 1997). Estes so alguns exemplos das
diferentes tcnicas que podem ser utilizadas para avaliar a qualidade do folculo aps o
cultivo in vitro (MATOS, 2007). Contudo, a melhor anlise da capacidade de preservar
folculos pr-antrais apropriadamente, consiste na obteno da sua ativao (i.e.,
transio de folculos primordiais para primrios) e crescimento in vitro (SANTOS et
al., 2006). Sendo assim, CECCONI et al. (2004a) confirmam a importncia do cultivo
in vitro como uma ferramenta de avaliao de folculos pr-antrais ovinos preservados a
baixas temperaturas.

46

3. JUSTIFICATIVA

A criao de caprinos no Brasil tem crescido bastante nos ltimos anos como um
ramo econmico rentvel. Dentre vrios aspectos, a explorao de caprinos no nordeste
brasileiro destaca-se pelo seu efetivo, uma vez que mais de 90% do rebanho nacional
explorado nessa regio e por apresentar material gentico de excelente qualidade para
produo de pele, carne e adequada produo de leite.
Desta forma, essencial o desenvolvimento de tcnicas que aumentem o
potencial reprodutivo de animais de alta produtividade. O desenvolvimento de um
sistema de cultivo eficiente poder fornecer subsdios para uma melhor compreenso
acerca dos fatores que regulam a foliculognese na fase pr-antral, fatores esses
necessrios para a sobrevivncia, a ativao e o incio do crescimento folicular. O
melhor conhecimento da foliculognese caprina uma condio necessria para
aumentar os ndices reprodutivos destes animais.
Mesmo com a possibilidade de recuperar milhares de folculos pr-antrais a
partir de um nico ovrio, um fator limitante da MOIFOPA consiste na manuteno da
qualidade folicular aps remoo e transporte dos ovrios, uma vez que na maioria das
vezes esses animais encontram-se distantes dos laboratrios de reproduo. Por esta
razo, torna-se fundamental a utilizao de protocolos eficientes de preservao.
Embora j tenha sido mostrado que possvel preservar ocitos imaturos inclusos em
folculos pr-antrais, ainda no conhecido se as condies de transporte (tempo e
temperatura) dos ovrios afetam a eficincia do cultivo in vitro. Apesar de vrios meios
para o transporte j terem sido testados, ainda no foi avaliada a eficincia do MEM. O
crescimento in vitro de folculos preservados in vitro poder viabilizar o aproveitamento
dos milhares de ocitos presentes em ovrios mamferos, revolucionando a produo in
vitro de embries.

47

4. HIPTESE CIENTFICA

Diante do exposto, formulou-se a seguinte hiptese cientfica: A temperatura e o

tempo de transporte influenciam a morfologia, ativao e o crescimento in vitro de
folculos pr-antrais caprinos.

48

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo Geral

- Resfriar e cultivar in vitro folculos pr-antrais caprinos inclusos no tecido

ovariano.

5.2 Objetivo Especfico

- Avaliar o efeito de trs temperaturas de transporte (4, 20 e 35 C) e dois

tempos de transporte (2 e 4 horas) sobre a morfologia (histologia clssica e microscopia
eletrnica de transmisso) e viabilidade de folculos pr-antrais caprinos resfriados e
cultivados por 7 dias.

49

6. CAPTULO I
Resfriamento de fragmentos ovarianos durante o transporte melhoram
a viabilidade e crescimento de folculos pr-antrais caprinos cultivados
in vitro
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da conservao de fragmentos
ovarianos em diferentes temperaturas e tempos de conservao sobre a viabilidade e
crescimento in vitro de folculos pr-antrais caprinos aps cultivo in vitro. Os ovrios
caprinos (n=10) foram obtidos de animais de abatedouro. Cada par ovariano foi dividido
em 19 fragmentos. Um fragmento foi imediatamente fixado para histologia clssica e
microscopia eletrnica de transmisso (controle fresco dia 0). Os fragmentos restantes
foram distribudos em Meio Essencial Mnimo (MEM) e mantidos a 4, 20 ou 35C por
2 ou 4 h. Aps cada tempo de conservao, fragmentos (n=30) foram fixados (no
cultivados), enquanto fragmentos (n=60) foram cultivados in vitro por 1 ou 7 dias a
39C e 5% de CO2 em MEM suplementado. Aps cada perodo de conservao e/ou
cultivo, os fragmentos foram submetidos histologia clssica e microscopia eletrnica
de transmisso a fim de avaliar a morfologia folicular. Aps 7 dias de cultivo, somente
os fragmentos ovarianos armazenados a 4C por 4 h mantiveram o percentual de
folculos morfologicamente normais equivalentes ao controle fresco (P>0,05).
Observou-se que em todos os tratamentos ocorreu uma reduo (P>0,05) no nmero de
folculos primordiais e um concomitante aumento nos folculos em desenvolvimento,
indicando ativao. Alm disso, houve um aumento no dimetro oocitrio e folicular
aps o cultivo de crtex ovariano submetido conservao na temperatura de 4 C por 2
e 4 h. A microscopia eletrnica de transmisso confirmou a histologia clssica,
mostrando que a conservao na temperatura de 4 C por 4 h, 20 e 35 C por 2 h ajudou
a manter a integridade morfolgica dos folculos pr-antrais caprinos aps 7 dias de
cultivo. Em concluso, os fragmentos ovarainos caprinos armazenados a 4C por at 4 h
melhoram a viabilidade folicular durante transporte e aumenta o crescimento folicular
durante cultivo in vitro.
Palavras-chave: caprino, conservao, cultivo in vitro, folculo pr-antral.

50

CAPTULO I
Ovarian fragments chilling during transportation improves viability and growth of
goat preantral follicles cultured in vitro

R.N. Chavesa, F.S. Martinsa, M.V.A. Saraivaa, J.J.H. Celestinoa, C.A.P. Lopesa, J.C.
Correiaa, I.B. Lima Verdea, M.H.T. Matosa, S.N. Bob, K.P.O. Nameb, C.C. Campelloa,
J.R.V. Silvac, J.R. Figueiredoa

Faculty of Veterinary Medicine, LAMOFOPA, PPGCV, State University of Ceara,

Fortaleza, CE, Brazil, b Laboratory of Electron Microscopy, Department of Cell

Biology, University of Brasilia, Brasilia, DF, Brazil, c Biotechnology Nucleus of Sobral

(NUBIS) Federal University of Ceara, Sobral, CE, Brasil.

Reproduction, Fertility and Development

(Austrlia)
(Submetido para publicao)

51

Abstract

The aim of this study was to evaluate the effect of storing goat ovarian fragments in
different temperatures and storage times on viability and growth of preantral follicles
cultured in vitro. Caprine ovaries (n=10) were collected at slaughterhouse and each
ovarian pair was divided into 19 fragments. One fragment was immediately fixed for
classical histology and transmission electron microscopy (fresh control day 0).
Remaining fragments were distributed in Minimal Essential Medium (MEM) and
maintained at 4, 20 or 35 C for 2 or 4 h. After each conservation period, fragments
(n=30) were fixed (non-cultured), while fragments (n=60) were cultured in vitro for 1 or
7 days at 39 C and 5% CO2 in supplemented MEM. Follicular morphology was
evaluated at the end of both conservation and culture periods, by classical histology and
transmission electron microscopy. After 7 days of culture, only ovarian fragments
stored at 4 C for 4 h maintained the percentage of morphologically normal follicles
similar to fresh control (P>0.05). In all treatments, a significant reduction (P>0.05) in
the number of primordial follicles and a concomitant increase in the developing follicles
was observed, indicating follicular activation. Additionally, there was an increase in
oocyte and follicular diameter after culture of ovarian cortex that had been previously
chilled at 4 C for 2 or 4 h. Transmission electron microscopy confirmed that ovarian
fragments conservation at 4 C for 4 h, 20 and 35 C for 2 h helps to maintain
morphological integrity of caprine preantral follicles after 7 days of culture. In
conclusion, goat ovarian fragments stored at 4 C up to 4 h keep follicular viability
during transportation and increase follicular growth during in vitro culture.

Keywords: caprine, conservation, in vitro culture, preantral follicle.

52

Introduction

The majority of the techniques for in vitro embryo production depends on

oocytes obtained from antral follicles, which are present in low numbers in the
mammalian ovary. On the other hand, thousands of oocytes enclosed in preantral
follicles are present in the ovaries and could potentially be matured in vitro and used for
embryo production, optimizing the utilization of oocyte potential from valuable
animals. In vivo, during female reproductive life, only a low percentage of follicles,
approximately 0.1%, reach the pre-ovulatory stage (CLARK et al., 2004), while the
remaining is lost by atresia (MCGEE and HSUEH, 2000).
Several studies have demonstrated that the quality of oocytes enclosed in
preantral follicles depends of the preservation media, temperature and time of storage
during transportation of ovaries from the slaughterhouse to reproduction laboratories,
being this a limiting step in the maintenance of follicular quality (MATOS et al., 2004).
In this way, there is a lack of information about preservation methods to be used for
ovaries transportation that are to be cryopreserved or to donate preantral follicles for in
vitro culture (LUCCI et al., 2004) or oocytes for in vitro fertilization (FIGUEIREDO et
al., 2007).
The preservation solution had a fundamental role in minimizing the depletory
effects caused by isquemy during storage (BIGAM and GRANT, 1999). Minimal
Essential Medium (MEM) has been used in the in vitro culture of preantral follicles in
different species, allowing maintenance of follicular viability (JEWGENOW et al.,
1998; GAO et al., 2007) and primordial follicles activation (MARTINS et al., 2005).
Different methods for ovary preservation, using temperatures of 4, 20 or 39 C for a
short period were successfully developed for many species (caprine: SILVA et al.,

53

2000; ovine: ANDRADE et al., 2002; bovine: LUCCI et al., 2004; swine:
WONGSRIKEAO et al., 2005; equine: PEDERSEN et al., 2004; canine: TAS et al.,
2006), but none of them evaluated the ability of chilled preantral follicles to develop in
vitro. Since follicular quality is essential for the success of follicle growth and oocyte
maturation, it is very important to evaluate if transportation conditions (time and
temperature) of caprine ovaries affect follicular viability during in vitro culture.
The present study aimed to evaluate the effect of the preservation of caprine
ovarian tissue in different temperatures and incubation times on the viability and growth
of preantral follicles cultured in vitro.

Material and Methods

Source, collection and transport of ovarian tissue

Ovaries (n=10) from five adult non-pregnant mixed breed goats were collected
at a local slaughterhouse. Immediately after collection, ovaries were stripped of
surrounding fat tissue and ligaments, washed one time in 70% alcohol and twice in
MEM. Still in the slaughterhouse, the ovarian pair from each animal was divided into
19 fragments of approximately 3 x 3 mm (1 mm thick) consisting of the ovarian cortex
of the two ovaries. An ovarian fragment was randomly taken and immediately fixed in
Carnoy and 2% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate
buffer for histology and Transmission Electronic Microscopy (TEM), respectively
(fresh control day 0). The other 18 fragments were distributed into tubes containing 5
ml of MEM supplemented with 100 g/ml penicillin and 100 g/ml streptomycin and

54

stored at 4, 20 or 35 C for 2 or 4 h. At laboratory, the 18 fragments were kept in thermo

flasks filled with water at the temperatures and conservation periods cited before.

In vitro culture of goat preantral follicles

After conservation period, the half of the ovarian fragments (n=30) were fixed
for histological and ultrastructural studies (non-cultured fragments). Other fragments
(n=60) were individually cultured in 24-well culture dishes (Corning Inc., Corning, NY)
containing 1 mL of culture medium at 39 C, in presence of 5% CO2 in air for 1 or 7
days. Fragments were cultured using a modification of the method described by
FIGUEIREDO et al. (1994) for bovine preantral follicles. The culture medium consisted
of MEM+, consisting of MEM with antibiotics (100 g/mL of penicillin, 100 g/mL of
streptomycin), 0.25 g/mL amphotericin B, 1.25 mg/mL BSA, ITS (insulin 6.25 g/mL,
transferrin 6.25 g/mL and selenium 6.25 ng/mL), 0.23 mM pyruvate, 2 mM glutamine,
2 mM hypoxanthine and pFSH (50 ng/mL - provided by Dr J.F. Beckers, Lige,
Belgium). Unless otherwise indicated, reagents were obtained from Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO). Fresh medium was prepared immediately before use. Every two
days, the total culture medium was replaced by fresh medium. Each treatment was
repeated 5 times.

Morphological analysis of goat preantral follicles

All ovarian fragments were individually fixed in Carnoy for 12 h. Subsequently,

the fragments were dehydrated in a graded series of ethanol, clarified with xylene and
embedded in paraffin. The tissue was sectioned serially at a thickness of 7 m and

55

section were stained using standard protocols with Periodic Acid Schiff and
hematoxilyn (PAS staining system, Sigma, Inc., St. Louis, MO, USA). Sections were
examined by light microscopy (Zeiss, Germany) at 400X magnification.
Preantral follicles were counted and evaluated only when oocyte nuclei were
visible. According to the developmental stage, preantral follicles were classified as
primordial (oocyte surrounded by one layer of flattened pre-granulosa cells) or
developing, which ones were divided into intermediate (oocyte surrounded by one layer
of flattened pre-granulosa and cuboidal granulosa cells), primary (oocyte surrounded by
one layer of cuboidal granulosa cells) or secondary (oocyte surrounded by two or more
layers of cuboidal granulosa cells) (Silva et al., 2000).
Each follicle was evaluated according to oocyte and granulosa cells integrity,
presence or absence of pyknotic bodies, ooplasmic retraction and organization of
granulosa cells. Acoording to those parameters, preantral follicles were classified as
normal, when a morphologically normal oocyte with a non-pyknotic nucleus was
surrounded by granulosa cells organized in discrete layers. Degenerated follicles
presented retracted oocyte with pyknotic nuclei, and/or surrounded by disorganized
granulosa cells detached from the basement membrane. From each treatment, 150
follicles were randomly evaluated.

Activation and growth of primordial follicle

To evaluate activation and growth of primordial follicle, only intact follicles

with a visible oocyte nuclei were recorded. The proportion of primordial and developing
follicles were calculated for fresh control, preserved and non-cultured fragments and
preserved fragments cultured for 1 or 7 days. In addition, for each follicle category,

56

oocyte and follicle diameters were measured with the aid of an ocular micrometer and
the averages of minor and major axes were reported as oocyte and follicle diameters,
respectively.

Ultrastructural analysis of preantral follicles

For a better evaluation of follicular morphology, ultrastructural studies were

carried out on fragments of fresh control and cultured samples that maintained follicular
morphology during the histological analysis. Ovarian tissues (1 mm3) were fixed in 2%
paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)
for 3 h at room temperature. After fixation specimens were post-fixed in 1% osmium
tetroxide, 0.8% potassium ferricyanide and 5 mM calcium chloride in 0.1 M sodium
cacodylate buffer for 1 h. Subsequently, samples were dehydrated through a gradient of
acetone solutions (30100%) and tissues were embedded in Spurr. Semi-thin sections (3
m) were cut at the ultramicrotome (Reichert Supernova, Heidelberg, German) for light
microscopy studies and stained with toluidine blue. Ultra-thin sections (6070 nm) were
contrasted with uranyl acetate and lead citrate, and examined under a Jeol 1011 (Jeol,
Tokyo, Japan) transmission electron microscope. Parameters such as density and
integrity of ooplasmic and granulosa cell organelles, vacuolization and basement
membrane integrity were evaluated.

Statistical analysis

Data were analyzed statistically as follows. Kolmogorov-Smirnov and Bartletts

tests were applied to confirm normal distribution and homogeneity of variance,

57

respectively. Analysis of variance was made using GLM procedure of SAS (1999) and
Dunnetts test was applied for comparison of control groups against each treatment
tested (STEEL et al., 1997) regarding to follicle and oocyte diameters before and after
culture. Student Newman Keuls (SNK) test was used to compare mean diameters
among days of culture and percentages of morphologically normal follicles in noncultured tissue or after 1 or 7 days culture. In order to avoid type II error because of the
higher coefficient of variation, Duncans test was applied to compare the percentage of
primordial or developing follicles obtained after 1 or 7 days among the various
treatments and Students t-test was used to compare means between days of culture.
Differences among groups were considered significant when p<0.05 and results were
expressed as means standard error of means (SEM).

Results

Effect of the storage conditions on the follicular morphology before and after in vitro
culture

A total of 2,850 preantral follicles were analyzed, being 1,532 primordial, 977 in
transition, 316 primary and 25 secondary follicles. Histological analysis showed that
normal (Figure 1A) and degenerated follicles (Figures 1B e C) were found in fragments
of ovarian cortex before and after in vitro culture. The main characteristics in
degenerated follicles were retracted oocyte, pyknotic nucleus and disorganized
granulosa cells, with low cellular density.

58

GC
Nu

O
O
GC
Nu

GC
O
Nu

Figure 1. Histological sections of ovarian fragments after PAS-Hematoxylin staining,

showing morphologically normal (A - x 400) and degenerated (B,C x 1000) follicles.
O: oocyte; NU: oocyte nucleus; GC: granulosa cells

Table 1 shows the effect of temperature and time of storage of ovarian fragments
on the percentage of normal preantral follicles before and after 1 or 7 days of culture.
Before culture, the percentage of morphologically normal follicles kept in MEM at 4, 20
or 35 C for 2 or 4 h were similar to the fresh control - day 0 (P<0.05). In contrast, after
the first day of culture, ovarian tissue stored at 35C for 4 h had a significant reduction
(P<0.05) in the percentage of normal follicles when compared to the fresh control - day
0. However, there was no significant difference in the percentage of normal follicles in
non-cultured tissues after preservation or in tissues cultured for 1 day.
After 7 days culture of fragments stored at 4 C for 2 and 4 h, 74.6% and 71.9%
of follicles were morphologically normal, respectively. Interestingly, this percentage did
not differ from those found in fresh control day 0. On the other hand, a significant
reduction (P<0.05) in the percentage of normal follicles after both storage at 20 C or 35
C and cultured for 7 days was observed when compared to fresh control (P<0.05).

59

However, after 7 days of culture, there was no difference in the percentage of normal
follicles among treatments, except when fragments were stored at 35 C for 4 h, which
showed significant reduction in the percentage of normal follicles when compared to
storage at 4 C for 2 h.
After preservation, a significant reduction in follicular viability at day 1 of
culture was observed in fragments previously preserved at 20 C for 2 or 4 h when
compared to non-cultured fragments. Acoording to the progression of culture period
from 1 to 7 days, no reduction (P>0.05) in follicular viability was observed.

Table 1. Percentage (mean SEM) of morfologically normal follicles in fresh control

day 0, preserved and non-cultured tissue and preserved and cultured tissue in MEM+ for
1 or 7 days.
Fresh control
day 0

81.3 1.99
Cultured fragments

Treatments

Non- cultured
fragments

Day 1

4 C 2h

80.6 1.57 Aa

77.3 1.90 Aa

4 C 4h

77.9 0.33 Aa

73.9 1.31

Aa

71.9 1.33 ABa

20 C 2h

82.6 0.99 Aa

69.3 1.31

Ab

69.3 0.51 *ABb

20 C 4h

83.9 0.79 Aa

69.9 1.17 Ab

64.6 0.53 *ABb

35 C 2h

78.6 1.95 Aa

69.9 0.75 Aab

65.3 1.19 *ABb

35 C 4h

74.6 1.95 Aa

64.6 1.39 *Aa

61.3 1.02 *Ba

Day 7
74.6 0.33 Aa

* Differs significantly from fresh control day 0 (P<0,05).

A, B

Different letters in the same column denote significant differences among treatments in the
same period (P<0,05).
a, b

Different letters in the same row denote significant differences between culture periods within
the same treatment (P<0,05).

60

Activation and growth of caprine primordial follicles during in vitro culture

The percentages of primordial and developing follicles in fresh ovarian cortex

were 70.4% and 29.6%, respectively (Figure 2). Growth was evaluated only in follicles
considered morphologically normal during in vitro culture. After 1 day of culture, the
proportion of primordial follicles did not differ significantly among treatments or when
compared to the fresh control. On the other hand, after 7 days of culture, a significant
reduction in the percentage of primordial follicles and a concomitant increase of
developing follicles was observed in all treatments when compared to be fresh control
(P<0.05). However, neither preservation conditions or culture periods affected the
proportion of primordial or developing follicles in cultured tissues.

61

Figure 2. (A) Percentage (mean SEM) of primordial and (B) developing follicle
(transition, primary and secondary) in non-cultured (fresh control) and cultured tissue
for 1 or 7 days (P<0.05).
* Differs significantly from fresh control day 0 (P<0,05).

A, B

differences among treatments in the same culture periods (P<0,05).

Different letters denote significant

a, b

Different letters denote significant

differences between temperatures within the same storage time (P<0,05).

62

Evaluation of follicle and oocyte diameter in non-cultured and cultured tissue

Follicular and oocyte diameters from fresh control - day 0 were 52.07 1.81 m
and 40.94 1.70 m, respectively (Tables 2 and 3). After 2 or 4 h of incubation,
preantral follicles enclosed in ovarian fragments stored at 4, 20 or 35 C did not show
changes in follicular and oocyte diameters when compared to the fresh control day 0.
As early as after 1 day of culture, in all treatments, except for ovarian fragments
stored at 35 C for 4 h, a significant increase in follicular diameter in monolaminar
follicles (primordial, transition and primary) was observed when compared to fresh
control day 0 (P<0.05). However, the oocyte diameter did not change in any of the
treatments. After 1 day of culture, only the tissues kept at 35 C for 2 h showed a
significant improviment on follicular diameter when compared to both preserved noncultured and cultured fragments. The culture of ovarian fragments for 7 days promoted a
significant increase in follicular diameter in all treatments when compared to both fresh
control and non-cultured fragments. Interestingly, only oocyte from follicles stored at 4
C had a significant increase in diameter when compared to non-cultured fragments.
With the progression of the culture period from 1 to 7 days, an increase in follicular
diameter was verified in all treatments (P<0.05). However, a significant increase in
oocyte diameter only occurred in follicles conserved at 4 C for 2 or 4 h.

63

Table 2. Follicular diameter (mean SEM; m) in fresh control day 0, preserved and
non-cultured and preserved and cultured tissues for 1 or 7 days.
Follicular diameter (mean SEM) m
Fresh control
day 0

52.07 0.40
Cultured fragments

Treatments

Non-cultured
fragments

Day 1

Day 7

4 C 2h

54.69 0.64 a

56.55 0.51 *a

66.43 1.02 * b

4 C 4h

54.23 0.35 a

56.39 0.95

*a

64.73 1.20* b

20 C 2h

54.38 0.76 a

55.77 0.94

*a

60.72 0.82 * b

20 C 4h

53.92 0.96 a

56.55 1.12 *a

60.56 1.01 *b

35 C 2h

52.68 0.65 a

55.31 0.89 * b

59.02 0.95 *c

35 C 4h

52.22 1.10 a

53.61 0.98 a

56.24 0.48 * b

* Differs significantly from fresh control - day 0(P<0,05).

a, b, c

Different letters in the same row denote significant differences between culture periods within
the same treatment (P<0,05).

64

Table 3. Oocyte diameter (mean SEM; m) of follicles from fresh control day 0,
preserved and non-cultured and preserved and cultured tissues for 1 or 7 days.
Oocyte diameter (mean SEM) m
Fresh control
day 0

40.94 0.38
Cultured fragments

Treatments

Non-cultured
fragments

Day 1

Day 7

4 C 2h

42.02 0.41 a

42.33 0.51 a

44.96 0.65 * b

4 C 4h

41.25 0.34 a

42.02 0.57

ab

43.41 0.85* b

20 C 2h

41.72 0.53 a

41.87 0.42

42.95 0.54 a

20 C 4h

40.79 0.48 a

41.56 0.42 a

42.18 0.56 a

35 C 2h

41.87 0.42 a

40.79 0.42 a

41.87 0.72 a

35 C 4h

40.63 0.46 a

39.71 0.51 a

41.10 0.32 a

* Differs significantly from fresh control day 0(P<0,05).

a, b

Different letters in the same row denote significant differences between culture periods within
the same treatment (P<0,05).

Ultrastructural analysis of cultured preantral follicles

To better evaluate follicular quality, ultrastructural analysis was performed using

morphologically normal preantral follicles (classified in semi-thin sections after toluidin
blue staining) from non-cultured control as well as from treatments that did not differ
from control after 7 days of culture, i.e., ovarian fragments maintained at 4 C for up to
4 h. Follicles from control (Figure 3), as well as those preserved at 4 C for up to 4 h
and cultured for 7 days (Figure 4) showed an intact nuclear membrane, with a great
oocyte nucleus in a central position and discondensed nuclear chromatin, besides
organelles uniformly distributed in the cytoplasm. These follicles exhibited few
vesicles, circular and elongated mitochondria, a well-developed Golgi complex and both

65

smooth and rough endoplasmic reticulum. Circular mitochondria were the most
prevalent organelles, followed by smooth endoplasmic reticulum. Flattened granulosa
cells were well-organized around oocyte and showed a distinct elongated nucleus with
irregular membrane and high proportion nucleus-cytoplasm. Ultrastructural analysis
showed that fragments cultured for 7 days after conservation at 4 C for 4 h (Figure 4),
20 (Figure 5) and 35 C (Figure 6) for 2 h, preantral follicles were well-preserved and
similar to fresh control.

Nu
GC
m
O

ser

Figure 3. Electron micrograph of normal preantral follicle in non-cultured ovarian tissue

- control. Note the presence of numerous mitochondria in the ooplasm. O: oocyte; Nu:
oocyte nucleus; GC: granulosa cells; m: mitochondria; ser: smooth endoplasmic
reticulum (x 4000).

66

GC

Nu

ser

Figure 4. Electron micrograph of normal preantral follicle in ovarian tissue culture for 7
days (4 C 4 h). Note the great relation between the nucleus and the cytoplasm of
granulosa cells (arrow). O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa cells; m:
mitochondria; ser: smooth endoplasmic reticulum (x10000).

67

Nu
O

Figure 5. Electron micrograph of normal preantral follicle in ovarian tissue culture for 7
days (20 C 2 h). Note the presence of numerous elongated mitochondria in the
ooplasm. O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa cells; m: mitochondria (x4000).

68

Nu

Figure 6. Electron micrograph of normal preantral follicle in ovarian tissue culture for 7
days (35 C 2 h). O: oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa cells; m: mitochondria
(x4000).

69

Discussion
This study shows that goat preantral follicles can be successfully stored in
ovarian pieces at low temperatures maintaining the ability for in vitrodevelopment.
Ovaries collected in slaughterhouse are generally used as source of oocytes for
in vitro culture studies. The storage of ovaries without blood supply may affect oocyte
quality, influencing the extracellular environment around the oocyte (WONGSRIKEAO
et al., 2005). In general, hypothermia is globally applied to preserve organs to minimize
the rates of energy consuming processes and to minimize the rates of tissue autolysis.
Isquemy is present during long periods of storage causing rapid depletion of energetic
cellular stocks resulting in acidification of the medium (SALEHI et al., 2004).
After 2 or 4 h of incubation, caprine preantral follicle viability did not differ
either among temperatures nor in relation to fresh control day 0. Similar results were
observed after storage of ovarian fragments at 4 C for up to 24 (COSTA et al., 2002) or
12 h (CARVALHO et al., 2001), at 20 C for 4 h (SANTOS et al., 2002) and at 39 C
for 2 h (MATOS et al., 2004). All these works related the maintenance of the
percentage of morphologically normal preantral follicles similar to control.
It is well-known that there are a variable number of degenerated follicles during
in vitro culture (TELFER et al., 2000). In the present study, after 1 or 7 days of culture,
the percentage of morphologically normal preantral follicles was kept similar to fresh
control only in fragments maintained at 4 oC for 2 or 4 h. These results may be due to
hypothermia caused by low temperatures, which reduces the cellular metabolism and
increases follicle resistance to reduction of nutrients and oxygen during in vitro
preservation (SANTOS et al., 2002). However, with the increase of the temperature, the
medium composition becomes an important factor to maintain follicular viability. MEM

70

is a medium rich in nutrients and widely used for in vitro culture of bovine (SAHA et
al., 2000), ovine (CECCONI et al., 1999) and caprine (MARTINS et al., 2005)
preantral follicles. LUCCI et al. (2007) observed that after storing at 4 C for 18 h or at
20 C for 6 h, developing swine follicles were able to continue growth in a 3-day culture
system, showing a pattern similar to the observed in fresh follicles.
Preservation at 35 C for 4 h significantly reduced the percentages of normal
preantral follicles in comparison to controls in 1 and 7 days of culture. With similar
results, others authors showed a reduction in preantral follicle viability from caprine
ovaries kept at 32 C and further in vitro cultured for 5 days (SILVA et al., 2004;
MARTINS et al., 2005). In our study, at 20 C for 2 or 4 h, this reduction was only
observed after 7 days of culture. These results showed that storage of ovarian fragments
in association of low oxygen tension with temperatures close to the physiological limit
(35 C) or subnormal (20 C) may result in great rates of follicular degeneration
(SANTOS et al., 2002). A long term in vitro culture (7 days) caused probably a
reduction in the percentage of follicular viability mainteine at higher temperatures, since
the metabolism was accelerated and more nutrients are required (TAS et al., 2006).
After 1 day of culture, the percentages of primordial and developing follicles
were similar to control values. However, after 7 days of culture, high percentages of
primordial follicle activation were observed in ovarian cortex that had been preserved in
all temperatures and times of storage. Similar results were reported during short-term
culture of bovine ovarian tissue (BRAW-TAL and YOSSEFI, 1997), where activation
occurred from the second day of culture onward. Furthermore, Matos et al. (2007)
demonstrated that FSH, at 50 ng/mL, promoted caprine primordial follicle activation
and survival.

71

All cultured follicles had a bigger diameter than those from fresh control, except
from fragments preserved at 35 C for 4 h in the first day of culture. Nevertheless,
oocyte diameter, after 7 days of culture, was only significantly higher than control when
ovarian fragments were previously stored at the temperature of 4 C for 2 or 4 h,
suggesting that granulosa cells in cultured tissue were stimulated to proliferate quickly
and that, probably high temperatures during the transportation of ovaries are not benefic
to a further oocyte maturation. MIYANO and MANABE (2007) affirmed that oocytes
from primordial follicles when enter the growth phase take a long period to reach their
final size. Our results were similar to those found by SILVA et al. (2004) and MATOS
et al (2007), in which the use of FSH after culture for 5 or 7 days promoted an increase
in follicular diameter by the increase in oocyte diameter and proliferation of goat
granulosa cells.
Histological analysis of follicles both preserved at 4 C for up to 4 h and
cultured in vitro revealed their morphological integrity , and this result was confirmed
by ultrastructural analysis. MATOS et al. (2007) obtained satisfactory results in
ultrastructural studies of caprine preantral follicles cultured for 7 days after
transportation to the laboratory in saline solution at 32 oC.
In conclusion, our study showed that the storage of ovarian tissue at 4 C for up
to 4 h before culture was the best condition to the transportation of caprine preantral
follicles without affecting their morphology and the ability for in vitro development.
Preservation of ovarian fragments during the transportation in these conditions will be
useful in the future to optimize the use of oocytes enclosed in preantral follicles for the
reproductive prupose.

72

Acknowledgements

This work was supported by Fundao Cearense de Apoio ao Desenvolvimento

Cientfico e Tecnolgico (FUNCAP).

References

ANDRADE ER, AMORIM CA, MATOS MHT, RODRIGUES APR, SILVA JRV,
DODE MAN, FIGUEIREDO JR. (2002). Evaluation of saline and coconut water
solutions in the preservation of sheep preantral follicles in situ. Small Rumin Res. 43,
235-43.
BIGAM, D.L., and GRANT, D.R. (1999). Small bower transplantation. In: Oxford
Textbook of Surgery. (Eds P.J., MORRIS, and W.C., WOOD).
BRAW-TAL, R., and YOSSEFI, S. (1997). Studies in vivo and in vitro on the initiation
of follicle growth in the bovine ovary. J. Reprod. Fert. 109, 165-171.
CARVALHO, F.C.A., LUCCI, C.M., SILVA, J.R.V., ANDRADE, E.R., BO, S.N.,
and FIGUEIREDO, J.R. (2001). Effect of Braun-Collins and saline solutions at different
temperatures and incubation times on the quality of goat preantral follicles preserved in
situ. Anim. Reprod. Sci. 66, 195-208.
CECCONI, S., BARBONI, B., COCCIA, M., and MATTIOLI, M. (1999). In vitro
development of sheep preantral follicles. Biol. Reprod. 60, 594-601.

73

CLARK, L.J., IRVING-RODGERS, H.F., DHARMARAJAN, A.M., and RODGERS,

R.J. (2004). Theca Interne: The Other Side of Bovine Follicular Atresia. Biol Reprod.
71, 1071-1078.
COSTA,

S.H.F.,

SANTOS,

R.R.,

FERREIRA,

M.A.L.,

MACHADO,

V.P.,

RODRIGUES, A.P.R., OHASHI, O.M., and FIGUEIREDO, J.R. (2002). Preservation

of goat preantral follicles in saline or coconut water solution. Braz. J. Vet. Res.Anim.
Sci. 39, 324-330.
FIGUEIREDO, J.R., HULSHOF, S.C.J., VAN DEN HURK, R., NUSGENS, B.,
BEVERS, M.M., ECTORS, F.J., BECKERS, J.F.(1994). Preservation of oocyte and
granulosa cell morphology in bovine preantral follicles cultured in vitro.
Theriogenology. 41, 1333-1346.
FIGUEIREDO, J.R., CELESTINO, J.J.H., RODRIGUES, A.P.R., and SILVA, J.R.V.
(2007). Importncia da biotcnica de MOIFOPA para o estudo da foliculognese e
produo in vitro de embries em larga escala. Ver. Bras. Reprod. Anim. 31, 143-152.
GAO, M., WANG, Y., and WU, X. (2007). In vitro maturation of immature oocytes
from preantral follicles in prepuberal mice. J Reprod Contracept. 18, 25-32.
JEWGENOW, K., WOOD, T.C., and WILDT, D.E. (1998). DNA degradation in mural
granulose cells of non-and slightly atresico follicles of fresh and cold-stored domestic
cat ovaries. Mol. Reprod Dev. 48, 350-355.
LUCCI, C.M., KACINSKIS, M.A., RUMPF, R., and BO, S.N. (2004). Effects of
lowered temperatures and media on short-term preservation of zebu (Bos indicus)
preantral ovarian follicles. Theriogenology. 61, 461-472.

74

LUCCI, C.M., SCHREIER, L.L., MACHADO, G.M., AMORIM, C.A., BO, S.N., and
DOBRINSKY, J.R. (2007). Effects of storing pig ovaries at 4 or 20 C for different
periods of time on the morphology and viability of preantral follicles. Reprod. Dom.
Anim. 42, 76-82.
MARTINS, F.S., VAN DEN HURK, R., SANTOS, R.R., SILVA, J.R.V., MATOS,
M.H.T., CELESTINO, J.J.H., RODRIGUES, A.P.R., PESSOA, C., FERREIRA,
F.V.A., and FIGUEIREDO, J.R. (2005). Development of goat primordial follicles after
in vitro culture of ovarian tissue in Minimal Essential Medium supplemented with
coconut water. Anim. Reprod. 2, 106-113.
MATOS, M H. T., ANDRADE, E. R., LUCCI, C. M., BO, S. N., SILVA, J. R. V.,
SANTOS, R. R., FERREIRA, M. A. L., COSTA, S. H .F, CELESTINO, J. J. H., and
FIGUEIREDO, J. R. (2004). Morphological and ultrastructural analysis of sheep
primordial follicles preserved in 0.9% saline solution and TCM 199. Theriogenology.
62, 65-80.
MATOS, M.H.T., LIMA-VERDE, I.B., LUQUE, M.C.A., MAIA Jr, J.E., SILVA, J.R.,
CELESTINO, J.J.H., MARTINS, F.S., BO, S.N., LUCCI, A.M., and FIGUEIREDO,
J.R. (2007). Essential role of follicle stimulating hormone in the maintenance of caprine
preantral follicle viability in vitro. Zygote. 15, 173-182.
MCGEE, E.A., and HSUEH, A.J. (2000). Initial and cyclic recruitment of ovarian
follicles. Endocr. Rev. 21, 200214.
MIYANO, T., and MANABE, N. (2007). Oocyte growth and acquisition of meiotic
competence. Soc Reprod. Fertil. Suppl. 63, 531-8.

75

PEDERSEN, H.G., WATSON, E.D., and TELFER, EE. (2004). Effects of ovary
holding temperature and time on equine granulose cell apoptosis, oocyte chromatin
configuration and cumulus morphology. Theriogenology. 62, 468-480.
SAHA, S., SHIMIZU, M., GESHI, M., and IZAIKE, Y. (2000). In vitro culture of
bovine preantral follicles. Anim. Reprod. Sci. 63, 27-39.
SALEHI, P., SPRATLIN, J., CHONG, T.F., and CHUCHILL, T.A. (2004). Beneficial
effects of supplemental buffer and substrate on energy metabolism during small bowel
storage. Cryobiology. 48, 245-253.
SANTOS, R.R., SILVA, J.R.V., COSTA, S.H.F., RODRIGUES, A.P.R., LBO,
R.N.B., and FIGUEIREDO, J.R. (2002). Effect of 0,9% Saline Solution and Phosphate
Buffer Saline at different temperatures and incubation times on the morphology of goat
preantral follicles. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. 39, 254-259.
SILVA, J.R.V., LUCCI, C.M., CARVALHO, F.C.A., BAO, S.N., COSTA, S.H.F.,
SANTOS R.R., and FIGUEIREDO, J.R. (2000). Effect of coconut water and brauncollins solutions at different temperatures and incubation times on the morphology of
goat preantral follicles preserved in vitro. Theriogenology. 54, 809-822.
SILVA, J. R.V., VAN DEN HURK, R., MATOS, M. H. T., SANTOS, R. R., PESSOA,
C., MORAED, M. O., and FIGUEIREDO, J. R. (2004). Influences of FSH and EGF on
primordial follicles during in vitro culture of caprine ovarian cortical tissue.
Theriogenology. 61,1691-1704.
STEEL, R. G. D., TORRIE, J. H., and DICKEY, D. A. (1997). Principles and
procedures of statistics: a biometrical approach. (Ed. McGraw-Hill), New York, NY,
pp. 666.

76

TAS, M., EVECEN, M., OZDAS, O.B., CIRIT, U., DEMIR, K., BIRLER, S., and
PABUCCUOGLU, S. (2006). Effect of transport and storage temperature of ovaries on
in vitro maturation of bitch oocytes. Anim Reprod Sci. 96, 30-34.
TELFER, E.E., BINNIE, J.P., McCAFFERY, F.H., and CAMPBELL, B.K. (2000). In
vitro development of oocytes from porcine and bovine primary follicles. Mol Cell
Endocrinol. 163, 117-123.
WONGSRIKEAO, P., OTOI, T., KARJA, N.W.K., AGUNG, B., NII, M., and NAGAI,
T. (2005). Effects of ovary time and temperature on DNA fragmentation and
development of porcine oocytes. J Reprod Develop. 51,87-97.

77

7. CONCLUSO

O armazenamento de fragmentos ovarianos a 4 C por at 4 h antes do cultivo

foi a melhor condio para o transporte de folculos pr-antrais caprinos, preservando
sua morfologia e a habilidade para crescimento in vitro por at 7 dias.
O cultivo in vitro mostrou ser uma ferramenta eficaz para valiao da eficincia
de protocolos de preservao empregando baixas temperaturas.

78

8. PERSPECTIVAS

A utilizao de protocolos de preservao do tecido ovariano poder facilitar o

transporte de folculos pr-antrais caprinos a laboratrios especializados em
biotcnicas de reproduo animal, garantindo a manuteno da morfologia folicular, e
obteno de milhares de ocitos viveis a serem utilizados em programas de
criopreservao, cultivo e fecundao in vitro, melhorando a produtividade de animais
de alto valor zootcnico ou em via de extino.
Apesar do sucesso dos protocolos de conservao, estudos relacionados ao
cultivo in vitro de folculos pr-antrais, in situ ou isolados, por longos perodos (>7
dias) precisam ser realizados para que os folculos possam ter um desenvolvimento at
estdios mais avanados, com uma alta taxa de viabilidade e conseqente aplicao
prtica.

79

REFERNCIAS GERAIS

ABIR, R.; FISCH, B.; NAHUN, R.; ORVIETO, E.; NITKE, S.; OKON, E.; BENRAFAEL,Z. Turner`s syndrome and fertility: Current status and possible future
prospects. Hum Reprod, v. 7, p. 603-610, 2001a.
ABIR, R.; FISCH, B.; NITKE, S.; OKON, E.; RAZ, A.H.; BEN-RAFAEL, Z.
Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertil Steril,
v. 75, p. 141-146, 2001b.
ADAMS, G.P., MATTERI, R.L., KASTELIC, J.P., KO, J.C.H., GLNTHER, O.J.
Association between surges of follicle stimulating hormone and the emergence of
follicular waves in heifers. J Reprod Fertil, v. 94, p. 177-188, 1992.
ANDRADE ER, AMORIM CA, MATOS MHT, RODRIGUES APR, SILVA JRV,
DODE MAN, FIGUEIREDO JR. Evaluation of saline and coconut water solutions in
the preservation of sheep preantral follicles in situ. Small Rumin Res, v. 43, p. 235-43,
2002.
ANDRADE, E.R.; SENEDA, M.M.; ALFIERE, A.A.; OLIVEIRA, J.A.; RODRIGUES,
A.P.F.; BRACARENSE, L; FIGUEIREDO, J.R.; TONIOLLI, R. Interactions of indole
acetic acid with EGF and FSH in the culture of ovine preantral follicles.
Theriogenology, v. 64, p. 11041113, 2005.
AMORIM, C.A., RODRIGUES, A.P.R., LUCCI, C.M., FIGUEIREDO, J.R.,
GONALVES, P.B.D. Effect of sectioning on the number of isolated ovine preantral
follicles. J Small Rum Res, v. 37, p. 269-277, 2000.
AMORIM, C.A., RODRIGUES, A.P.R., RONDINA, D., GONALVES, P.B.D.,
FIGUEIREDO, J.R., GIORGETTI, A. Cryopreservation of ovine primordial follicles
using dimethyl sulfoxide. Fertil Steril, v. 79, p. 682-686, 2003a
AMORIM,

C.A.,

RONDINA,

D.,

RODRIGUES,

A.P.R.,

COSTA,

S.H.F.,

GONALVES, P.B.D., FIGUEIREDO, J.R., GIORGETTI, A. Isolated ovine

primordial follicles cryopreserved in different concentration cryopreserved in different
concentrations of ethylene glycol. Theriogenology, v. 60, p. 735-742, 2003b.

80

AMSTERDAM, A., SASSON,R., KEREN-TAL, I., AHARONI, D., DANTES, A.,

RIMON, E., LAND, A., COHEN, T., DOR, Y., HIRSH, L. Alternative pathways of
ovarian apoptosis: death for life. Biochem Pharm, v. 66, p. 1355-1362, 2003.
BARNETT, K.R., SCHILLING, C., GREENFELD, C.R., TOMIC, D., FLAWS, J.A.
Ovarian follicle development and transgenic mouse models. Hum Reprod Update, v.
12, p. 537-355, 2006.
BARROS, L.F.; HERMOSILLA, T.; CASTRO, J. Necrotic volume increase and the
early physiology of necrosis. Comp Biochem Physiol, v. 130, p. 401-409, 2001.
BETTERIDGE, K.J.; SMITH, C.; STUBBINGS, R.B.; XU, K.P.; KING, W.A.
Potential genetic improvement of cattle by fertilization of fetal oocytes in vitro. J
Reprod Fert, v. 38, p. 87-98, 1989.
BEZERRA, M.B.; RONDINA, D.; OLIVEIRA, L.C.; LIMA, A.K.F.; CECCHI, R.;
LUCCI, C.M.; GIORGETTI, A.; FIGUEIREDO, J.R. Aspectos quantitativos da
foliculognese na fase pr-natal na espcie caprina. Cincia Animal, v.8, p.30-41,
1998.
BHATIA, M. Apoptosis versus necrosis. Am J Physiol - Renal Physiology, v. 284, p.
608627, 2004.
BIGAM, D.L. & GRANT, D.R. Small bower transplantation, in: MORRIS, PJ &
WOOD, WC (Eds), Oxford Textbook of Surgery, second ed., 1999.
BLONDIN, P., DUFOUR, M., SIRARD, M.A. Analysis of atresia in bovine follicles
using different methods: flow citometry, enzyme-linked immunosorbent assay, and
classic histology. Biol Reprod, v. 54, p. 631-637, 1996.
BRAS, M., QUEENAN, B., SUSIN, S.A. Programmed cell death via mitochondria:
Different modes of dying. Biochemistry, v. 70, p. 231-239, 2005.
BRAW-TAL, R., YOSSEFI, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle
growth in the bovine ovary. J Reprod Fertil, v. 109, p. 165171, 1997
BRISTOL-GOULD, S. & WOODRUFF, T.K. Folliculogenesis in the domestic cat
(Felis catus). Theriogenology, v. 66, p. 5-13, 2006.

81

BUKOVSKI, A., CAUDLE, M.R., SVETLIKOVA, M., UPADHYAYA, N.B. Origin of

germ cells and formation of new primary follicles in adult human ovaries. Reprod Biol
Endocrin, v. 4, p. 2-20, 2005.
BURATINI, J.Jr., TEIXEIRA, A.B., COSTA, I.B., GLAPINSKI, V.F., PINTO, M.G.L.,
GIOMETTI, I.C., BARROS, C.M., CAO, M., NICOLA, E.S., PRICE, C.A. Expression
of fibroblast growth factor-8 and regulation of cognate receptors, fibroblastic growth
factor receptor-3c and -4, in bovine antral follicles. Reproduction, v. 130, p. 343-360,
2005.
BUTCHER, L. & ULLMANN, S.L. Culture of preantral ovarian follicles in the grey,
short-tailed opossum, monodelphis domestic. Reprod Fert Develop, v. 8, p. 535-539,
1996.
CARINI, R., AUTELLI, R., BELLOMO, G., DIANZANI, M.U., ALBANO, E. Sodium
mediated cell swelling is associated with irreversible damage in isolated hepatocytes
exposed to hypoxia or mitochondrial toxins. Biochem Biophysic Res Commun, v. 206,
p. 180185, 1995.
CARLSSON, I.B., SCOTT, J.E., VISSER, J.A., RITVOS, O., THEMMEN, A.P.N.,
HOVATTA, O. Anti-Mullerian hormone inhibits initiation of growth of human
primordial ovarian follicles in vitro. Hum Reprod, v. 21, p. 2223-2227, 2006.
CARVALHO, F.C.A., LUCCI, C.M., SILVA, J.R.V., ANDRADE, E.R., BO, S.N.,
FIGUEIREDO, J.R. Effect of Braun-Collins and saline solutions at different
temperatures and incubation times on the quality of goat preantral follicles preserved in
situ. Anim Reprod Sci, v. 66, p. 195-208, 2001.
CASPACCHIETTI, G., CECCONI, S., TURRIANI, M. Effect of cryoprotectant agents
on the potential development of sheep preantral follicles. Vet Res Commun, v. 28, p.
173-176, 2004.
CASTRO, T., RUBIANES, E., MENCHACA, A., RIVERO, A., Ovarian dynamics,
serum estradiol and progesterone concentrations during the interovulatory interval in
goats. Theriogenology, v. 52, p. 399-411, 1999.
CECCONI, S., BARBONI, B., COCCIA, M., MATTIOLI, M. In vitro development of
sheep preantral follicles. Biol Reprod, v. 60, p. 594-601, 1999.

82

CECCONI, S., CAPACCHIETTI, G., RUSSO, V., BERARDINELLI, P., MATTIOLI,

M. In vitro growth of preantral follicles isolated from cryopreserved ovine ovarian
tissue. Biol Reprod, v. 70, p. 12-17, 2004a.
CECCONI, S., CICCARELLI, C., BARBERI, M., MACCHIARELLI, G., CANIPARI,
R. Granulosa cell-oocyte interactions. Eur J Obstet Gyn R B, v.115, p. 19-22, 2004b.
CELESTINO,

J.J.H.,

SANTOS,

R.R.,

MARTINS,

F.S.,

MATOS,

M.H.T.,

FIGUEIREDO, J.R., COSTA, S.H.F., SILVA, J.R.V., RODRIGUES, A.P.R.

Conservao de folculos pr-antrais bovinos em soluo salina 0,9% ou TCM 199.
Arq Bras Med Vet Zootec, v. 59, p. 591-599, 2007.
CLARK, L.J.; IRVING-RODGERS, H.F.; DHARMARAJAN, A.M.; RODGERS, R.J.
Theca Interne: The Other Side of Bovine Follicular Atresia. Biology of Reproduction,
v. 71, p. 1071-1078, 2004.
CORTVRINDT, R., HU, Y., SMITZ, J. Recombinant luteinizing hormone as a survival
and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle
stimulating hormone supplemented mouse preantral follicle culture. Hum Reprod, v.
13, p. 1292-1302, 1998.
CORTVRINDT, R., & SMITZ, J.E.J. In vitro follicle growth: Achievements in
mammalian species. Reprod Dom Anim, v. 36, p. 3-9, 2001.
COSTA,

S.H.F.,

SANTOS,

R.R.,

FERREIRA,

M.A.L.,

MACHADO,

V.P.,

RODRIGUES, A.P.R., OHASHI, O.M., FIGUEIREDO, J.R. Preservation of goat

preantral follicles in saline or coconut water solution. Braz J vet Res anim Sci., So
Paulo, v. 39, p. 324-330, 2002.
COSTA, S.H.F., ANDRADE, E.R., SILVA, J.R.V., RODRIGUES, A.P.R., AMORIM,
C.A., LOBO, R.N.B., OHASHI, O.M., FIGUEIREDO, J.R. Preservation of goat
preantral follicles enclosed in ovarian tissue in saline or TCM 199 solutions. Small
Ruminant Res, v. 58, p. 189-193, 2005.
DEMEESTERE, I., CENTNER, J., GERVY, C., ENGLERT, Y., DELBAERE, A.
Impact of various endocrine and paracrine factors on in vitro culture of preantral
follicles in rodents. Reproduction, v. 130, p. 147-157, 2005.

83

DESAGHER, S. & MARTINOU, J.C. Mitochondria as the central control point of

apoptosis. Trends Cell Biology, v. 10, p. 369-377, 2000.
DISSEN, G.A., ROMERO, C., HIRSHFIELD, A.N., OJETA, S.R. Nerve growth factor
is required for early follicular development in the mammalian ovary. Endocrinology, v.
142, p. 2078-2086, 2001.
DRIANCOURT, M.A., REYNAUD, K., CORTVRINDT, R., SMITZ, J. Roles of Kit
and Kit Ligand in ovarian function. Reviews of Reproduction, v. 5, p. 143-152, 2000.
DRIANCOURT, M.A. regulation of ovarian follicular dynamics in farm animals.
implications for manipulation of reproduction. Theriogenology, v. 55, p. 1211-1230,
2001.
DRUMMOND, A.E. The role of steroids in follicular growth. Reprod Biol
Endocrinol, v. 4, p. 1-11, 2006.
EPPIG, J.J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals.
Reproduction, v. 122, p. 829-838, 2001.
EPPIG, J.J., VIVEIROS, M.M., BIVENS, C.M., DE LA FUENTE, R. Regulation of
mammalian oocyte maturation. In: LEUNG, P.C., ADASHI, E.Y. (Eds.), The ovary,
2004.
EPIFANO, O. & DEAN, J. Genetic control of early folliculogenesis in mice. Trends
Endocrinol Metab, v. 13, p. 169-173, 2002.
ERICKSON, G.F. Na analysis of follicles development and ovum maturation. In:
Seminars in Reproductive Endocrinology, san Diego-California, p.233-254, 1986.
ERICKSON, G.F. Role of growth factors in ovary organogenesis. J Soc Gynecol
Investig, v. 8, p. 13-16, 2001.
FAIR, T. Follicular oocyte growth and acquisition of developmental competence. Anim
Reprod Sci, v. 78, p. 203-216, 2003.
FARBER, J.L. Membrane injury and calcium homeostasis in the pathogenesis of
coagulative necrosis. Lab Invest, v. 47, p. 114-123, 1982.

84

FERREIRA MAL, BRASIL AF, SILVA JRV, ANDRADE ER, RODRIGUES APR,
FIGUEIREDO JR. Effects of storage time and temperature on atresia of goat ovarian
preantral follicles held in M199 with or without indole-3-acetic acid supplementation.
Theriogenology, v. 55, p. 1607-17, 2001.
FIGUEIREDO, J.R., HULSHOF, S.C.J., VAN DEN HURK, R., NUSGENS, B.,
BEVERS, M.M., ECTORS, F.J., BECKERS, J.F. Preservation of oocyte and granulosa
cell morphology in bovine preantral follicles cultured in vitro. Theriogenology, v. 41,
p. 1333-1346, 1994.
FIGUEIREDO, J.R., SILVA, J.R.V., RODRIGUES, A.P.R. Estado atual da biotcnica
de manipulao de ocitos inclusos em folculos ovarianos pr-antrais (MOIFOPA).
Cincia Animal, v. 9, p. 11-25, 1999.
FIGUEIREDO, J.R., RODRIGUES, A.P.R., AMORIM, C.A. Manipulao de ocitos
inclusos em folculos ovarianos pr-antrais. In: Biotcnicas aplicadas reproduo
animal. 1 ed. So Paulo: Livraria Varela, p. 227-260, 2003.
FIGUEIREDO, J.R., CELESTINO, J.J.H, RODRIGUES, A.P.R., SILVA, J.R.V.
Importncia da biotcnica de MOIFOPA para o estudo da foliculognese e produo in
vitro de embries em larga escala. Rev Bras Reprod Anim, v.31, p.143-152, 2007.
FLAWS, J.A., HIRSFIELD, A.N., HEWITT, J.A., BABUS, J.K., FURTH, P.A. Effects
of bcl-2 on the primordial follicle endowment in the mouse ovary. Biol Reprod, v. 64,
p. 1153-1159, 2001.
FORTUNE, J.E., KITO, S., WANDJI, S.A., SRSEN, V. Activation of bovine and
baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology, v. 49, p. 441-449, 1998.
FORTUNE, J.E., CUSHMAN, R.A., WAHL, C.M., KITO, S. The primordial to
primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol, v. 163, p. 53-60, 2000.
FORTUNE, J.E., RIVERA, G.M., EVANS, A.C.O., TURZILLO, A.M. Differentiation
of dominant vesus subordinate follicles in cattle. Biol Reprod, v. 65, p. 648-654, 2001.
FORTUNE, J.E. The early stages of follicular development: activation of primordial
follicles and growth of preantral follicles. Anim Reprod Sci, v.78, p. 135-163, 2003.

85

GAO, M.; WANG, Y.; WU, X. In vitro maturation of immature oocytes from preantral
follicles in prepuberal mice. J Reprod Contracep, v. 18, p. 25-32, 2007.
GLAMOCLIJA, V., VILOVIC, K., SARAGA-BABIC, M., BARANOVIC, A.,
SAPUNAR, D. Apoptosis and active caspase-3 expression in human granulosa cells.
Fertil Steril, v. 83, p. 426-431, 2005.
GORDON, I. Prenatal development of the bovine ovary. In: Gordon, I. Laboratory
production of cattle embryos. Cambridge: CAB International: Raven Press, p. 4349,
1994.
GOSDEN, R.G. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Mol
Cell Endocrinol, v.163, p.125-129, 2000.
GREEN, D.R. Overview: apoptotic signaling pathways in the immune system.
Immunology Review, v. 193, p. 59, 2003.
GUTIERREZ, C.G., RALPH, J.H., TELFER, E.E., WILMUT, I., WEBB, R. Growth
and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro. Biol
Reprod, v. 62, p. 1322-1328, 2000.
HAFEZ, E.S.E. Anatomy of Female Reproduction. In: HAFEZ, E.S.E. Reproduction
in Farm Animals, 6th edition, Williams & Wilkins, USA, p. 20-58, 1996.
HARTSHORNE, G. In vitro culture of ovarian follicles. Reviews of Reproduction, v.
2, p. 94-104, 1997.
HAYASHI, M., McGEE, E.A., MIN, G., KLEIN, C., ROSE, U.M., VAN DUIN, M.,
HSUEH, A.J.W. Recombinant growth differentiation factor-9 (GDF-9) enhances
growth and differentiation of cultured early follicles. Endocrinology, v. 140, p. 12361244, 1999.
HENGARTNER, M.O. The biochemistry of apoptosis. Nature, v. 407, p. 770776,
2000.
HOVATTA, O.; SILY, R; ABIR, R.; KRAUSZ, T.; WINSTON, R.M.L. Extra cellular
matrix improves the survival of human primordial and primary fresh and frozen-thawed
ovarian follicles in long-term culture. Hum Reprod, v.12, p. 1032-1036, 1997.

86

HOVATTA, O.; WRIGHT C, KRAUZ T, HARDY K, WINSTIN RM. Human

primordial, primary and secondary ovarian follicles in long-term culture: effect of
partial isolation. Hum Reprod, v. 14, p. 2519-2524, 1999.
HUANMIN, Z., & YONG, Z. In vitro development of caprine ovarian preantral
follicles. Theriogenology , v. 54, p. 641-650, 2000.
HUSSEIN, M.R. Apoptosis in the ovary: molecular mechanisms. Hum Reprod
Update, v.11, p. 162-178, 2005.
ITOH, T., KACCHI, M., ABE, H., SENDAI, Y., HOSHI, H. Growth, antrum
formation, and estradiol production of bovine preantral follicles cultured in a serum-free
medium. Biol Reprod, v. 67, p. 1099-1105, 2002.
JEWGENOW, K.N. & STOLTE, M. Isolation of preantral follicles from nondomestic
cats viability and ultrastructural investigations. Anim Reprod Sci, v. 44, p. 183-193,
1996.
JEWGENOW, K., PENFOLD, L.M., MEYER, H.H.D. et al. Viability of small
preantral ovarian follicles from domestic cats after cryoprotectant exposure and
cryopreservation. J Reprod Fertil, v. 112, p. 39-47, 1998.
JOHNSON, J., CANNING, J., KANEKO, T., TILLY, J.L. Germ line stem cells and
follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature, v. 428, p. 145-150,
2004.
JOHNSON, J., BAGLEY, J., SKAZNIK-WIKIEL, M., LEE, H.J., ADAMS, G.B.,
NIIKURA, Y., TSCHUDY, K.S., TILLY, J.C., CORTES, M.L., FORKERT, R.,
SPITZER, T., IACOMINI, J., SCADDEN, D.T., TILLY, J.L. Oocyte generation in
adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral
blood. Cell, v. 122, p. 303-315, 2005.
JORIO, A., MARIANA, J.C., LAHLOU-KASSI, A. Development of the population
of ovarian follicles during the prepubertal period in D`man and Timahdite sheep.
Anim Reprod Sci, v. 26, p. 239-250, 1991.
JOHNSON, A.L. Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian follicles.
Anim Reprod Sci, v. 78, p. 185-201, 2003.

87

JOHNSTONE, R.J., RUEFFI, A.A., LOWE, S.W. Apoptosis: a link between cancer
genetics and chemotherapy. Cell, v. 108, p. 153-164, 2002.
JOZA, N., KROEMER, G., PENNINGER, J.M. Genetic analysis of the mammalian cell
death machinery. Trends Genetic, v. 18, p. 142149, 2002.
JUENGEL, J.L.; HUDSON, N.L.; HEATH, D.A.; SMITH, P.; READER, K,L.;
LAWRENCE, S.B.; OCONNELL, A.R.; LAITINEN, M.P.E.; CRANFIELD, M.;
GROOME, O.R.; McNATTY, K.P. Growth differentiation factor 9 and bone
morphogenetic protein 15 are essential for ovarian follicular development in sheep. Biol
Reprod, v. 67, p. 1777-1789, 2002a.
JUENGEL, J.L., SAWYER, H.R., SMITH, P.R., QUIRKE, L.D., HEATH, D.A., LUN,
S., WAKEFIELD, J., McNATTY, K.P. Origins of follicular cells and ontogeny of
steroidogenesis in ovine fetal ovaries. Mol Cell Endoc, v. 191, p. 1-10, 2002b.
KATSKA-KSIAZKIEWICZ, L. Recent achievements in in vitro culture and
preservation of ovarian follicles in mammals. Reprod Biol, v. 6, p. 3-16, 2006.
KAUFMANN, S.H. & HENGARTNER, M.O. Programmed cell death: alive and well in
the new millennium. Trends Cell Biology, v. 11, p. 526534, 2001.
KEZELE, P.R., NILSSON, E.E., SKINNER, M.K. Insulin but not insulin-like growth
factor promotes the primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinology,
v. 192, p. 37-43, 2002.
KIDDER, G.M. & MHAWI, A.A. Gap junctions and ovarian folliculogenesis.
Reproduction,v. 123, p. 613, 2002.
KNIGHT, P.G. & GLISTER, C. TGF- super family members and ovarian follicle
development. Reproduction, v. 132, p. 191-206, 2006.
KROEMER, G. & REED, J.C. Mitochondrial control of cell death. Nature Medicals, v.
6, p. 513519, 2000.
LEE, C.J.; PARK, H.H.; DO, B.R.; YOON, Y.D.; KIM, J.K. Natural and radiationinduced degeneration of primordial and primary follicles in mouse ovary. Anim
Reprod Sci, v. 59, p. 109-117, 2000.

88

LEE, W.S., OTSUKA, F., MOORE, R.K., SHIMASAKI, S. Effect of bone

morphogenetic protein-7 on folliculogenesis and ovulation in the rat. Biol Reprod, v.
65, p. 994-999, 2001.
LENIE, S., CORTVRINDT, R., ADRIAENSSENS, T., SMITZ, J. A reproducible twostep culture system for isolated primordial mouse ovarian follicles as single functional
units. Biol Reprod, v. 71, p. 1730-1738, 2004.
LINDE, V.; FLODGAARD, H.; KASTRUP, J.S.; BJORN, S. Measurement of
apoptosis by the TUNEL method using scintillating microplates. Anal Biochemistry, v.
280, p. 186-188, 2000.
LIU, X., ANDOH, K., YOKOTA, H., KOBAYASHI, J., ABE, Y., YAMADA, K.,
MIZUNUMA, H., IBUKI, Y. Effects of growth hormone, activin, and follistatin on the
development of preantral follicle from immature female mice. Endocrinology, v. 139,
p. 2342-2347, 1998.
LIU, X., ANDOH, K., ABE, Y., KOBAYASHI, J., YAMADA, K., MIZUNUMA, H.,
IBUKI, Y. A comparative study on transforming growth factor and activin A for
preantral follicles from adult, immature, and diethylsbestrol-primed immature mice.
Endocrinology, v. 140, p. 2480-2485, 1999.
LIU, J.; VAN DER ELST, J.; VAN DEN BROECKE, R. DHONT, M. Live offspring
by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after
sequential in vivo transplantation and in vitro maturation. Biol Reprod, v. 64, p. 171178, 2001.
LIU, H.C., HE, Z., ROSENWAKS, Z. In vitro culture and in vitro maturation of mouse
preantral follicles with recombinant gonadotropins. Fertil Steril, v. 77, p. 373-383,
2002.
LIU, K., RAJAREDDY, S., LIU, L., JAGARLAMUDI, K., BOMAN, K., SELSTAM,
G., REDDY, P. Control of mammalian oocyte growth and early follicular development
by the oocyte PI3 kinase pathway: new roles for an old timer. Dev Biol, v. 299, p. 1-11,
2006.
LUCCI, C.M., AMORIM, C.A., BO, S.N., FIGUEIREDO, J.R., RODRIGUES,
A.P.R., SILVA, J.R., GONALVES, P.B.D. Effect of the interval of serial sections of

89

ovarian in the tissue chopper on the number of isolated caprine preantral follicles. Anim
Reprod Sci, v. 56, p. 39-49, 1999.
LUCCI, C.M., SILVA, R.V., CARVALHO, C.A., FIGUEIREDO, R., BO, S.N. Light
microscopical and ultrastructural characterization of goat preantral follicles. Small
Ruminant Res, v. 41, p. 61-69, 2001.
LUCCI CM, KACINSKIS MA, RUMPF R, BO SN. Effects of lowered temperatures
and media on short-term preservation of zebu (Bos indicus) preantral ovarian follicles.
Theriogenology, v. 61, p. 461-472, 2004.
LUCCI, C.M.; SCHREIER, L.L.; MACHADO, G.M.; AMORIM, C.A.; BO, S.N.;
DOBRINSKY, J.R. Effects of storing pig ovaries at 4 or 20 C for different periods of
time on the morphology and viability of preantral follicles. Reprod Dom Anim, v. 42,
p. 76-82, 2007.
MAGOFFIN, D.A. Ovarian theca cell. Int J Biochem Cell Biol, v. 37, p. 1344-1349,
2005.
MAO, J., WU, G., SMITH, M.F., McCAULEY, T.C., CANTLEY, T.C., PRATHER,
R.S., DIDION, B.A., DAY, B.N. Effects of culture medium, serum type, and various
concentrations of follicle-stimulating hormone on porcine preantral follicular
development and antrum formation in vitro. Biol Reprod, v. 67, p. 1197-1203, 2002.
MARKSTROM, E.; SVENSSON, E.C.; SHAO, R., SVANBERG, B.; BILLIG, H.
Survival factors regulating ovarian apoptosis dependence on follicle differentiation.
Reproduction, v. 123, p. 23-30, 2002.
MARTINS, F.S.; VAN DEN HURK, R.; SANTOS, R.R.; SILVA, J.R.V.; MATOS,
M.H.T..; CELESTINO, J.J.H.; RODRIGUES, A.P.R.; PESSOA, C.; FERREIRA,
F.V.A.; FIGUEIREDO, J.R. Development of goat primordial follicles after in vitro
culture of ovarian tissue in Minimal Essential Medium supplemented with coconut
water. Anim Reprod, v. 2, n.2, p. 106-113, 2005.
MATOS, M.H.T., ANDRADE, E.R., LUCCI, C.M., BAO, S.N., SILVA, J.R.V.,
SANTOS, R.R., FERREIRA, M.A.L., FIGUEIREDO, J.R. Morphological and
ultrastructural analysis of sheep primordial follicles preserved in 0.9% saline solution
and TCM 199. Theriogenology, v. 62, p. 6580, 2004.

90

MATOS, M.H.T. Cultivo in vitro de folculos pr-antrais caprinos utilizando cido 3indol-actico (IAA), fator de crescimento fibroblstico-2 (FGF-2) e hormnio folculo
estimulante (FSH). Tese, Universidade Estadual do Cear, Faculdade de Veterinria, p.
22-46, 2007.
MATOS, M.H.T.; LIMA-VERDE, I.B.; LUQUE, M.C.A.; MAIA Jr, J.E.; SILVA, J.R.;
CELESTINO, J.J.H.; MARTINS, F.S.; BO, S.N.; LUCCI, A.M.; FIGUEIREDO, J.R.
Essential role of follicle stimulating hormone in the maintenance of caprine preantral
follicle viability in vitro. Zygote., v. 15: 173-182, 2007.
McCULLY, J.D., WAKIYAMA, H., HSIEH, Y-J., JONES, M., LEVITSKY, S.
Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion
injury. American Journal of Physiology - Heart Circulation Physiology, v. 286, p.
1923-1935, 2004.
McGEE, E.A., CHUN, S.Y., LAI,S., HE, Y., HSUEH, A.J. Keratinocyte growth factor
promotes the survival, growth, and differentiation of preantral ovarian follicles. Fertil
Steril, v. 71, p. 732-738, 1999.
McGEE, E.A. & HSUEH. A.J. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles.
Endocrine Review. v. 21, p. 200-214, 2000.
McNATTY, K.P.; HEATH, P.A.; LUNDY TIFIDLER, A.E.; QUIRKE, L.;
OCONNELL, A.; SMITH, P.; GOOME, N.; TISDALL, D.J. J Reprod Fertil, v. 54, p.
3-16, 1999.
MITCHELL, L.M., KENNEDY, C.R., HARTSHORNE, G.M. Effects of varying
gonadotrophin dose and timing on antrum formation and ovulation efficiency of mouse
follicles in vitro. Hum Reprod, v. 17, p. 1181-1188, 2002.
MIYANO, T. & MANABE, N. Oocyte growth and acquisition of meiotic competence.
Soc Reprod Fertil Suppl., v. 63, p. 531-8, 2007.

MOORE, K.L., & PERSAUD, T.V. Incio do desenvolvimento humano. In Moore, K.L.
e Persaud, T.V.N. Emb Cln. Guanabara Koogan, 5a ed., p. 13-38, 1994.
MORITA, Y. & TILLY, J.L. Oocyte apoptosis: Like sand through and hourglass.
Developmental Biology, v. 213, p. 1-17, 1999.

91

MURUVI, W.; PINCTON, H.M.; RODWAY, R.G.; JOYCE, I.M. In vitro growth of
oocytes from primordial follicles isolated from frozen-thawed lamb ovaries.
Theriogenology. v. 64, p. 1357-1370, 2005.
NAGASE, H., FUKUYAMA, H., TANAKA, M., KAWANE, K., NAGATA, S.
Mutually regulated expression of caspase-activated DNase and its inhibitor for
apoptotic DNA fragmentation. Cell Death and Differentiation, v. 10, p. 142143,
2003.
NEWTON, H., & ILLINGWORTH, P. In vitro growth of murine preantral follicles
after isolation from cryopreserved ovarian tissue. Hum Reprod, v. 16, p. 423-429,
2001.
NILSSON, E.E., PARROTT, J.A., SKINNER, M.K. Basic fibroblast growth factor
induces primordial follicle development and initiates folliculogenesis. Mol Cell
Endocrinology, v. 175, p. 123-130, 2001.
NILSSON, E.E., KEZELE, P., SKINNER, M.K. Leukemia inhibitory factor (LIF)
promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell
Endocrinology, v. 188, p. 65-73, 2002.
NILSSON, E.E. & SKINNER, M.K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian
follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod, v.
69, p. 1265-1272, 2003.
NUTTINCK, F., MERMILLOD, P.M., DESSY, F. Characterization of in vitro growth
of bovine preantral ovarian follicles: a preliminary study. Theriogenology, v. 39, p.
811-821, 1993.
O`BRIEN, M.J., PENDOLA, J.K., EPPIG, J.J. A revised protocol for in vitro
development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their
developmental competence. Biol Reprod, v. 68, p. 1682-1686, 2003.
OJETA, S.R., ROMERO, C., TAPIA, V., DISSEN, G.A. Neurotrophic and cell-cell
dependent control of early follicular development. Mol Cell Endocrinol, v. 163, p. 6771, 2000.

92

OTALA, M., ERKKIL, K., TUURI, T., SJBERG, J., SOUMALAINEN, L.,
SUIKKARI, A-M., PENTIKINEN, V., DUNKEL L. Cell death and its suppression in
human ovarian tissue culture. Mol Hum Reprod, v. 8, p. 228-236, 2002.
PADANILAM, B.J. Cell death induced by acute renal injury: a perspective on the
contributions of apoptosis and necrosis. American Journal of Physiology - Renal
Physiology, v. 284, p. 608627, 2003.
PARROT, J.A. & SKINNER, M.K. Kit ligand/stem cell factor induces primordial
follicle development and initiates folliculogenesis. Endocrinology, v. 140, p. 262-271,
1999.
PARROT, J.A. & SKINNER, M.K. Kit ligand on ovarian stromal cells: effects on theca
cell recruitment and steroid production. Mol Reprod Dev, v. 55, p. 55-64, 2000.
PEDERSEN, H.G.; WATSON, E.D.; TELFER, EE. Effects of ovary holding
temperature and time on equine granulose cell apoptosis, oocyte chromatin
configuration and cumulus morphology. Theriogenology, v. 62, p. 468-480, 2004.
PICTON, H.M., & GOSDEN, R.G. In vitro growth of human primordial follicles from
frozen-banked ovarian tissue. Mol Cell Endocrin, v. 166, p. 27-35, 2000.
PICTON, H.M. Activation of follicle development: The primordial follicle.
Theriogenology, v. 55, p. 1193-1210, 2001.
RACHID, M.A.; VASCONCELOS, A.C.; NUNES, V.A. Apoptosis in the lymphoid
depletion induced by T-2 toxin in broiler chicks. Histopmorphometry of the bursa of
Fabricius. Arq Bras Med Vet Zootec, v.52, n.6, 2000.
REED,

J.C.

&

KROEMER,

G.

Mechanisms

of

mitochondrial

membrane

permeabilization. Cell Death and Differentiation, v. 7, p. 1145, 2000.

ROCHE, J.F. Control and regulation of folliculogenesis A symposium in perspective.
Reproduction, v. 1, p. 19-27, 1996.
RODRIGUES, A.P.R., AMORIM, C.A., COSTA, S.H.F., MATOS, M.H.T., SANTOS,
R.R., LUCCI, C.M., BAO, S.N., FIGUEIREDO, J.R. Cryopreservation of caprine
ovarian tissue using glycerol and ethylene glycol. Theriogenology, v. 61, p. 1009
1024, 2004.

93

ROY, S.K. & TREACY, B.J. isolation and long-term culture of human preantral
follicles. Fertil Steril, v. 59, p. 783-790, 1993.
RSSE, I. Oogenesis in cattle and sheep. Bibl Anat, v. 24, p. 77-92, 1983.
SALLE, B.; LORNAGE, J.; DEMIRCI, B.; VAUDOYER, F.; POIREL, M. et al.
Restoration of progesterone secretion and histological assessment after freezing,
thawing and autograft of hemi-ovary in sheep. Fertil Steril, v. 77, p. 403-408, 2002.
SALEHNIA, M., MOGHADAM, E.A.; VELOJERDI, M.R. Ultrastructure of follicles
after vitrification of mouse ovarian tissue. Fertil Steril, v.78, p. 644-645, 2002.
SAHA, S.; SHIMIZU, M.; GESHI, M.; IZAIKE, Y. In vitro culture of bovine preantral
follicles. Anim Reprod Sci, v. 63, p. 27-39, 2000.
SALEHI, P.; SPRATLIN, J.; CHONG, T.F.; CHUCHILL, T.A. Beneficial effects of
supplemental buffer and substrate on energy metabolism during small bowel storage.
Cryobiology, v. 48, p. 245-253, 2004.
SANTOS RR, SILVA JRV, COSTA SHF, RODRIGUES APR, LBO RNB,
FIGUEIREDO JR. Effect of 0,9% Saline Solution and Phosphate Buffer Saline at
different temperatures and incubation times on the morphology of goat preantral
follicles. Braz J vet Res Anim Sci, So Paulo, v.39, p. 254-259, 2002.
SANTOS, R.R.; RODRIGUES, A.P.R.; FERREIRA, M.A.L.; LOBO,R.N.B.,
FIGUEIREDO, J.R. Conservao de folculos pr-antrais ovinos. Revista Brasileira de
Reproduo Animal. v. 27, 2003.
SANTOS, R.R.; RODRIGUES, A.P.R.; MARTINS, F.S.; MATOS, M.H.T.;
CELESTINO, J.J.H.; FIGUEIREDO, J.R. Preservao de folculos pr-antrais de
pequenos ruminantes. Cincia Animal, v.14, n.1, 2004.
SANTOS, R.R., RODRIGUES, A.P.R., COSTA, S.H.F., SILVA, J.R.V., MATOS,
M.H.T., LUCCI, C.M., BO, S.N., VAN DEN HURK, R., FIGUEIREDO, J.R.,.
Histological and ultrastructural analysis of cryopreserved sheep preantral follicles.
Anim. Reprod. Sci. v. 91, p. 249-263, 2006.

94

SAWYER, H.R., SMITH, P., HEATH, D.A., JUENGEL, L., WAKEFIELD, J.

Formation of ovarian follicles during fetal development in sheep. Bio Reprod, v. 66, p.
1134-1150, 2002.
SCAFFIDI, P., MISTELI, T., BIANCHI, M.E. Release of chromatin protein HMGB1
by necrotic cells triggers inflammation. Nature, v. 418, p. 191195, 2002.
SCOTT, J.E.; CARLISSON, I.B.; BAVISTER, B.D.; HOVATTA, O. Human ovarian
tissue cultures: Extra cellular matrix composition coating density and tissue dimensions.
Reproduction Biomedicine On Line. v. 9, p. 287-293, 2004.
SENEDA, M.M. & BORDIGNON, V. Novos conceitos em foliculognese. Acta
Scientiae Veterinariae, v. 35, p. 857-868, 2007.
SHAW, J.M., ORANRATNACHAI, A.,TROUNSON, A.O. Fundamental cryobiology
of mammalian oocytes and ovarian tissue. Theriogenology, v. 53, p. 5972, 2000
SILVA, J.R.V., LUCCI, C.M., CARVALHO, F.C.A., BAO, S.N., COSTA, S.H.F.,
SANTOS

R.R.,

FIGUEIREDO, J.R. Effect of coconut water and braun-collins

solutions at different temperatures and incubation times on the morphology of goat

preantral follicles preserved in vitro. Theriogenology, v.54, p. 809-822, 2000.
SILVA, J.R.V.; FERREIRA, M.A.L.; COSTA, S.H.F.; SANTOS, R,R,; CARVALHO,
F.C.A.; RODRIGUES, A.P.R.; LUCCI, C.M.; BAO, S.M.; FIGUEIREDO, J.R.
Degeneration rate of preantral follicles in the ovaries of goat. Small Ruminant Res,
v.43, p.203-209, 2002.
SILVA, J.R.V.; BRASIL, A.F.; SANTOS, R.R.; COSTA, S.H.F.; RODRIGUES,
A.P.R.; FERREIRA, M.A.L.; MACHADO, V.P.; FIGUEIREDO, J.R. Degeneration
rate of goat primordial follicles maintained in TCM 199 or PBS at different
temperatures and incubation times. Cincia Rural, v.33, p. 913-919, 2003.
SILVA, J.R.V.; VAN DEN HURK; MATOS, M.H.T., SANTOS, R.R.; PESSOA, C.,
MORAES, M.O., FIGUEIREDO, J.R. Influences of FSH and EGF on primordial
follicles during in vitro culture of caprine ovarian cortical tissue. Theriogenology, v.
61, p. 1691-1704, 2004a.

95

SILVA, J.R.V.; VAN DEN HURK; COSTA, S.H.F; ANDRADE, E.R.; NUNES,
A.P.A.; FERREIRA, F.V.A.; LBO, R.N.B.; FIGUEIREDO, J.R. Survival and growth
of goat primordial follicles after in vitro culture of ovarian cortical slices in media
containing coconut water. Anim Reprod Sci, v. 81, p. 273286, 2004b.
SILVA, J.R.V. Growth factors in goat ovaries and the role of activin-A in the
development of early-staged follicles. PhD Thesis, Utrecht University, Faculty of
Veterinary Medicine, p. 142, 2005.
SILVA, J.R.; VAN DEN HURK, R.; FIGUEIREDO, J.R. Expression of mRNA and
protein localization of epidermal growth factor and its receptor in goat ovaries. Zygote,
v. 14, p. 107-117, 2006.
SKINNER, M.K. Regulation of primordial follicle assembly and development. Hum
Reprod Update, v. 5, p. 461-471, 2005.
SLOT, K.A. Hormonal regulation of apoptosis in the ovary under normal physiological
and pathological conditions. Utrecht University, The Netherlands, Thesis PhD, 159p,
2004.
SMITZ, J.E.J. & CORTVRINDT, R.G. The earliest stages of folliculogenesis in vitro.
Reproduction, v. 123, p. 185-202, 2002
STEEL, R.G.D.; TORRIE, J.H.; DICKEY, D.A. Principles and procedures of
statistics: a biometrical approach. 3rd Ed. McGraw-Hill, New York, NY, 666p., 1997.
STRASSER, A., OCONNOR, L., DIXIT, V.M. Apoptosis signaling. Annuary of
Review in Biochemistry, v. 69, p. 217-245, 2000.
SUH, C.S., SONNTAG, B., ERICKSON, G.F. The ovarian life cycle: a contemporany
view. Rev. Endocr. Metab. Disord., v. 3, p. 5-12, 2002.
SUZUKI, M., YOULE, R.J., TJANDRA, N. Structure of Bax: coregulation of dimer
formation and intracellular localization. Cell, v. 103, p. 645654, 2000.
TAS, M.; EVECEN, M.; OZDAS, O.B.; CIRIT, U.; DEMIR, K.; BIRLER, S.;
PABUCCUOGLU, S. Effect of transport and storage temperature of ovaries on in vitro
maturation of bitch oocytes. Anim Reprod Sci, v. 96, p. 30-34, 2006.

96

TELFER, E.E. The development of methods for isolation and culture of preantral
follicles from bovine and porcine ovaries. Theriogenology, v.45, p. 101-110, 1996.
TELFER, E.E.; BINNIE, J.P.; McCAFFERY, F.H.; CAMPBELL, B.K. In vitro
development of oocytes from porcine and bovine primary follicles. Mol Cell
Endocrinol, v. 163, p. 117-123, 2000.
THOMAS, F.H., ARMSTRONG, D.G., TELFER, E.E. Activin promotes oocyte
development in ovine preantral follicles in vitro. Reprod Biol Endocrinology, v. 1, p.
76, 2003.
TIBBETTS, M.D., ZHENG, L., LENARDO, M.J. The death effector domain protein
family: regulators of cellular homeostasis. Nature Immunology, v. 4, p. 404409,
2003.
VAN DEN HURK, R & ZHAO, J. Formation of mammalian oocytes and their growth,
differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology, v.63, p. 17171751, 2005.
VITT, U.A., McGEE, E.A., HAYASHI, M., HSUCH, A.J. In vitro treatment with
GDF9 stimulates primordial and primary follicle progression and theca cell marker
CYP17 in ovaries of immature rats. Endocrinology, v. 141, p. 3814-3820, 2000.
WANDJI, S. A.; SRSEN, V.; VOSS, A. K.; EPPIG, E. E.; FORTUNE, J. E. Initiation in
vitro of growth of bovine primordial follicles. Biol. Reprod., v. 55, p. 942-948, 1996.
WANDJI, S.A.; SRSEN, V.; NATHANIELSZ, P.W.; EPPIG, J.J.; FORTUNE, J.E. Initiation
of growth of baboon primordial follicles in vitro. Hum. Reprod., v.12, p.1993-2001,
1997.
WANG, K.K. Calpain and caspase: can you tell the difference? Trends
Neuroscience, v. 23, p. 2026, 2000.

WONGSRIKEAO, P.; OTOI, T.; KARJA, N.W.K.; AGUNG, B.; NII, M.; NAGAI, T.
Effects of ovary time and temperature on DNA fragmentation and development of
porcine oocytes. J Reprod Develop, v. 51, p. 87-97, 2005.

97

WU, J., BENJAMIN, R.E., CARRELL, D.T. In vitro growth, maturation, fertilization,
and embryonic development of oocytes from porcine preantral follicles. Biol Reprod,
v. 64, p. 375-381, 2001.
YANG, M.Y. & FORTUNE, J.E. Testosterone stimulates the primary to secondary
follicle transition in bovine follicle in vitro. Biol Reprod, v. 75, p. 924-932, 2006.
YANG, M.Y. & FORTUNE, J.E. Vascular endothelial growth factor stimulates the
primary to secondary follicle transition in bovine follicle in vitro. Mol Reprod Dev, v.
8, in press, 2007.
ZHANG, P.; LOUHIO, H.; TUURI, T.; SJOBERG, J.; HEINSSON, J.; TELFER, E.E.;
HOVATTA, O. In vitro effect of cyclic adenosine 3`,5`-Monophosphate (cAMP) on
early human ovarian follicles. Journal Assisted Reproduction Genetic. v. 21, p. 301306, 2004.
ZHAO, J., DORLAND, M., TAVERNE, M.A.M., VAN DER WEIJDEN, G.C.,
BEVERS, M.M., VAN DEN HURK, R. In vitro culture of rat preantral follicle with
emphasis on follicular interactions. Mol Reprod Dev, v. 55, p. 65-74, 2000.
ZHAO, J., TAVERNE, M.A.M., VAN DER WEIJDEN, G.C., BEVERS, M.M, VAN
DEN HURK, R. Insulin-like growth factor-I (IGF-I) stimulates the development of
cultured rat preantral follicles. Mol Reprod Dev, v. 58, p. 287-296, 2001a.
ZHAO, J., TAVERNE, M.A.M., VAN DER WEIJDEN, G.C., BEVERS, M.M, VAN
DEN HURK, R. Effect of activin A on in vitro development of rat preantral follicles
and localization of activin A and activin receptor II. Biol Reprod, v. 65, p. 967-977,
2001b.
ZEISS, C.J. The apoptosis-necrosis continuum: insights from genetically altered mice.
Veterinary Pathology, v. 40, p. 481-495, 2003.