Monografias

FFI 339 - Introduo Espectroscopia

Cincias Fsicas e Biomoleculares

Introduo......................................................................................................................03
Princpios Bsicos da Ressonncia Magntica Nuclear.............................................04
Francesco Brugnera Teixeira
Espectroscopia de RMN................................................................................................10
Marcela Nunes
Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)......................................17
Renato Dantonia Pacincia
Ressonncia Magntica Nuclear...................................................................................22
Csar Moschio Fioravanti
Ressonncia Magntica Nuclear por Tensor de Difuso...........................................26
Rafael Tuma Guariento
Espectroscopia Raman..................................................................................................30
Carolina de Paula Campos
Espectroscopia Raman..................................................................................................36
Eduardo Cocca Padovani
Espectroscopia Raman..................................................................................................41
Gilson Campani Junior
Espectroscopia Raman A Voz do Silncio................................................................45
Letcia Fais
Efeito Raman..................................................................................................................57
Ricardo Simionato Boffa
Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier e seu Uso na
Anlise de Vinho............................................................................................................60
Vanessa Kiraly Thomaz Rodrigues
Espectroscopia Vibracional: Infravermelho...............................................................67
Andra Rodrigues Cardoso

Espectroscopia Visvel e Ultravioleta...........................................................................73

Andr de Campos Rauber
Espectroscopia de Fluorescncia..................................................................................78
Pedro Michelo Neuber
Espectroscopia: Histria Geral, a Espectroscopia de Fluorescncia e uma Possvel
Aplicao na Terapia Fotodinmica............................................................................83
Ana Paula Pereira Guimares
Espectroscopia por Fluorescncia...............................................................................91
Jssica Baleiro Okado
Espectro de Fluorescncia.............................................................................................97
Priscilla Jukeram Bergo
Fundamentos e Aplicaes de Espectroscopia Ultrarpida de Bombeio-e-Prova
(Pump-Probe Spectroscopy).......................................................................................104
Caio Vaz Rmoli
Estudo de Protena por Dicrosmo Circular.............................................................111
Letcia Marchese
Princpio Bsico sobre XPS........................................................................................117
Evandro Jos Molinari
Ressonncia Paramagntica Eletrnica....................................................................123
Lus Felipe Santos Mendes
Espectroscopia por Raios-X........................................................................................130
Andr Monteiro Pascoal
SAXS Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo..................................................135
Bruno Luan Soares Paulo de Mello
Espectroscopia de Fotoeltron....................................................................................144
Jaqueline Yu Ting Wang

Dezembro de 2011

Introduo

Este o primeiro compndio das monografias elaboradas pelos alunos do curso

de Cincias Fsicas e Biomoleculares de 2011 do curso de Introduo Espectroscopia
do IFSC. Essas monografias so de autoria dos alunos e foram eleaboradas com o
intuito de estabelecer os conceitos bsicos das vrias tcnicas de espectroscopia que
existm. Algumas monografias enfocam mais os conceitos tericos e outras os
conceitos experimentais. Como o tema e o formato das monografias foram livres, h
uma grande disperso entre elas.
As monografias sofreram algumas modificaes por conta de eventuais
correes e tentativa de padronizao de formato. Algumas figuras e equaes sofreram
perda de resoluo devido reduo do tamanho e converso para o pdf. Alm disso, as
algumas equaes ficaram prejudicadas devido converso para figura. Devido ao
grande nmero de equaes e notaes cientcas, no foi possvel fazer todas as
correes necessrias, portanto pode haver eventuais erros e falhas de tipografia.
Acredito que esse compndio possa ser uma tima referncia para todos os
alunos quando se fizer necessrio o estudo de umas das espectroscpicas aqui listadas.
Portanto, use esse material da melhor forma possvel, e aprecie os trabalhos dos seus
colegas.

So Carlos, 5 de dezembro de 2011.

Prof. Dr. Lino Misoguti

Princpios Bsicos da Ressonncia Magntica Nuclear

Francesco Brugnera Teixeira
INTRODUO
Neste trabalho apresentarei os princpios bsicos da
ressonncia magntica nuclear (RMN) e tambm os
principais fenmenos fsicos que a tornam uma tcnica
espectroscpica.

espectroscopia por RMN so 1H, 13C, 15N, 19F e 31P com

I = e 2H (deutrio) com I = 1.
A projeo no eixo z do momento de spin Iz tambm
no assume quaisquer valores:
(2)
E o nmero quntico magntico m pode assumir os
valores:

Para cada valor de I podemos ter 2I + 1 valores de Iz, ou

seja, 2I + 1 estados, Na ausncia de campos externos
todos esses estados so degenerados e no h nenhuma
direo preferencial para I. Para I = , apenas dois
estados de Iz so possveis: com m = + e m = - .
Interao do spin com o campo magntico externo
Ncleos com momento de spin I diferente de zero
possuem tambm momento magntico que colinear
com I :

Figura 1: Espectro 1H do glicerol

PRINCPIOS BSICOS
(3)

Spin nuclear
O spin nuclear, assim como spins de qualquer outra
origem, um fenmeno puramente quntico. Ele
representa um momento angular intrnsico do ncleo e
no possui anlogo clssico. simbolizado pelo vetor I.
Por restries da mecnica quntica no podemos
determinar o vetor I por completo, apenas seu mdulo e
uma de suas componentes, convencionada como direo
z. O spin nuclear quantizado, ou seja, no pode
assimir qualquer valor, os valores possveis do mdulo
de I so:
2

I = I .I = hI ( I + 1)

Ncleos com nmero de massa mpar possuem

I semi-inteiros;
Ncleos com nmero de massa par e nmero
atmico par possuem I nulo;
Ncleos com nmero de massa par e nmero
atmico impar possuem I inteiro.

(ii)
(iii)

Ncleos do tipo (ii) no so ativos para as tcnicas de

RMN. Ncleos com I maior que possuem momento
quadrupolar magntico devido a sua distribuio no
esfrica de cargas. Os ncleos mais utilizados na

Ao aplicarmos um campo magntico externo B0, o

momento magntico do ncleo interage com B0 e a
energia de interao dada por:
(4)
Aplicando um campo uniforme na direo z, (B0 = B0
z):

(1)

I chamado nmero quntico de spin e caracterstico

de cada ncleo. Na tcnica de RMN, I dado para cada
tipo de ncleo:
(i)

chamado razo magnetogrica, pode ser maior ou

menor que zero dependendo do ncleo e indica o quo
receptvel o ncleo para a espectroscopia de RMN.

(5)
Para I=1/2, as energias dos dois estados possveis ( e
) e diferena entre elas so:
,
e
(6)
Para ncleos com I , as transies entre nveis
sucessivos (m = 1) tambm possuem E= B0. De
fato, apenas esse tipo transio (m = 1) permitido
pela regra de seleo. A condio de Bohr nos diz que a

frequncia de radiao eletromagntica capaz de

estimular a transio entre nveis respeita a condio:

(7)
Como em outras formas de espectroscopia, a condio
de Bohr apenas uma condio necessria para se
observar transies entre estados de energia diferentes.
Na
espectroscopia
por
RMN,
a
radiao
eletromagntica de frequncia apropriada induz
transies descendentes (emisso) e ascendentes
(absoro) com idntica probabilidade. Porm poder
haver um efeito que favorea absoro ou emisso de
energia se, numa amostra macroscpica, a populao
dos dois estados no for a mesma, como o caso da
aplicao de B0, vejamos.
Num ensemble de ncleos magnticos idnticos de I =
, a razo das populaes dos estados em equilbrio
dada pela distribuio de Boltzmann:

Figura 2: Momentos angulares I e Iz (eixo vertical) para os

casos de (a) I = e (b) I = 1. As componentes Ix e Iy no
podem ser determinadas pela incerteza natural da mecnica
quntica e esto distribudas num cone.

Assumir que Ix e Iy, e consequentemente x e y, no

podem ser determinados o mesmo que dizer, num
ponto de vista clssico, que essas componentes no so
constantes de movimento, ou seja, x e y executam um
movimento de precesso em torno de B0.
A precesso tende alinhar a B0, porm sem alterar a
componente Iz (no havendo mudana energia). A
equao de movimento nos diz:

(8)
A aproximao em srie de Taylor pode ser feita j que
E tem um valor muito menor comparado com kT. n
o nmero total de ncleos (n = n + n). Mesmo com
campos magnticos B0 da ordem de 14T, a 300K,
aproximadamente 5 ncleos de 1H em 100.000 estaro
em excesso no estado de menor energia, justificando a
baixa sensibilidade da tcnica.
Mas afinal, como podemos manipular os estados de spin
nucleares atravs dum campo magntico para medirmos
algum tipo de espectro? Para isso devemos saber como
ocorre a interao radiao-spin e a precesso nuclear.
Ao aplicarmos o campo B0 = B0 z, sabemos que o
momento magntico nuclear no se alinha na direo
de B0, seno poderamos determinar todas as
componentes de ( = z z , x = y = 0), o que no
possvel pela natureza da mecnica quntica. Como
relaciona-se com I de forma colinear, e o mdulo de I
sempre maior que o mdulo da componente Iz (relaes
1 e 2) razovel supor que as componentes Ix e Iy esto
distribudos num cone, conforme a figura abaixo:

Essa expresso identifica-se com a que descreve a

precesso:

Desde que
. A frequncia de precesso,
chamada frequncia de Larmor, portanto:
(9)
Agora compare as equaes (7) e (9). Podemos ver que
a frequncia de precesso do spin em torno de B0
(Larmor) tem o mesmo valor da frequncia da radiao
eletromagntica que satisfaz a condio de Bohr!
Podemos dizer que a radiao eletromagntica e os
spins nucleares esto em ressonncia. Esse mecanismo
nos proporciona uma forma de interagir com o sistema.
Aplicando radiao eletromagntica num ensemble de
spins sujeitos ao campo B0, a interao com o sistema
ocorrer atravs da componente magntica B1 oscilante
de frequncia adequada levando excitao da amostra
e consequente deteco.
Natureza do sinal RMN
Numa amostra composta de muito ncleos de I =
sujeitos ao campo B0 = B0 z, a pequena diferena de

populao entre os estados e gerar uma

magnetizao total M0 = alinhada na direo z pelo
fato das direes dos momentos magnticos nucleares
estarem distribudos aleatoriamente em torno da direo
z.
Ao aplicarmos um campo oscilatrio B1 de frequncia
adequada fL e perpendicular a B0, o binrio x B1 tanto
produzir transies e como tende a
agrupar os vetores , deixando-os em fase com a
oscilao de B1. Devido a diferena de populao entre
os estados e , como discutido anteriormente, as
transies so favorecidas at que as populaes
se igualem.

A intensidade do sinal eltrico gerado gerado por My

ser proporcional a sua variao temporal dMy/dt.
Enquanto a potncia da radiao absorvida
proporcional a B12, o sinal eltrico proporcional a B1.
Podemos dizer agora quais fatores aumentam a
intensidade do sinal gerado:
(i)

(ii)
(iii)
(iv)
(v)

Maior relao magnetogrica , pois aumenta

E, h maior probabilidade de transio de
estado e aumenta a magnetizao da amostra
M;
Maior intensidade de B0, leva a maior E e
maior M ;
Maior nmero de ncleos n, pois aumenta n n e M ;
Maior intensidade de B1 acarreta em maiores
probabilidades de transio;
Menor temperatura T aumenta n - n e
consequentemente M.

Relaxao de spins nucleares e as equaes de Bloch

A dinmica dos spins devido aos campos magnticos e
podem ser descritos a partir da equao anloga a uma
j estudada:
onde

Figura 3: Magnetizao M0 gerada a partir da aplicao do

campo B0.

A magnetizao resultante M, portanto, alm da

diminuio de sua grandeza devido diminuio do
excesso de ncleos n n, se desloca de um ngulo
do eixo z e passa a precessionar em torno do eixo z com
velocidade angular correspondente a frequncia de
oscilao de B1 (0 = 2 fL z). Em geral, as variaes
da componente My induzem corrente eltrica numa
bobina alinhada no eixo y. Temos assim um sinal
eltrico quando a condio de ressnancia atingida.

Sendo B1 um campo polarizado circularmente no plano

xy temos:
,
,

Nos levando a:

(10)
Podemos ver que Mz varia apenas devido atuao de
B1, que responsvel pela transio de estado.
Figura 4: Magnetizao total M gerada a partir da aplicao
de B1 varivel de frequncia fL = 0 /2. M desloca-se do eixo
z devido ao agrupamento dos momentos magnticos e
precessiona em torno do eixo z com velocidade angular 0.

Mas a variao de M no se d somente pela presena

de B1. Com os spins em contato trmico, na ausncia de
B1, o sistema tende a voltar ao equilbrio trmico, ou
seja, tornar M = M0, esse processo denominado
relaxao. As componentes de M tendem a voltar ao

equilbrio de forma exponencial, isso se traduz nas

equaes:

(11)
Mx e My voltam aos seus de equilbrio (Mx = My = 0)
com o tempo caracterstico T2, que chamado tempo de
relaxao transversal ou tempo de relaxao spin-spin.
Deve-se ao fato de os spins voltarem a se distribuir
aleatoriamente no cone de precesso e no envolve
necessariamente transferncia de energia. O nome spinspin vem de estudo de amostras slidas, onde a perda de
coerncia resulta da interao direta entre os spins de
diferentes ncleos.
T1 designado tempo de relaxao longitudinal ou
tempo de relaxao spin-rede. Novamente o segundo
nome derivado de estudos em amostras slidas. Esse
tipo de relaxao deve-se recuperao de Mz para M0,
ocorre com a relaxao dos ncleos excitados por B1 e
envolve a transferncia de energia dos ncleos
excitados para outros graus de liberdade (energia
cintica). A relaxao no um fenmeno de emisso
expontnea, mas o resultado de campos magnticos
flutuantes de apropriada frequncia com origem nos
movimentos moleculares da amostra. Os tempos de
relaxao seguem a relao T1T2, devido a natureza
das relaxaes.
Finalmente, combinando os dois efeitos descritos pelos
conjuntos de equaes (10) e (11), a variao de
magnetizao total descrita pelas chamadas equaes
de Bloch:

Figura 5: Sinal obtido pela bobina no eixo y (a esquerda) e o

sinal de forma Lorentziana no domnio das frequncias (a
direita) aps a transformada de Fourier.

A largura a meia-altura da banda obtida descrita pela

relao
, mas, de fato, h uma
contribuio ao alargamento de banda devido
inomogeneidade de B0:

. Por

analogia define-se um tempo de relaxao efetivo

ea

meia altura da banda passa a ser

. A

inomogeneidade do campo pode ser modelado por

funes gaussianas e leva-nos a obter sinais de forma
lorentziana + gaussiana.

ESPECTROSCOPIA POR RMN

At agora, os princpios fsicos que explicam a
ressonncia magntica nuclear foram apresentados,
porm, se pararmos para pensar, ao medirmos um
espectro de 1H de certo componente simples como o
etanol ou qualquer outro composto, no haveria
espectro algum! S veramos uma grande banda em
certa frequncia j que todos os prtons possuem
mesma razo magnetogrica e sentem o mesmo campo
magntico B0. Na realidade, essa ltima informao
falsa.

Equaes de Bloch

(12)
J que o sinal captado na bobina depende de My, as
equaes de Bloch preveem uma banda de forma
Lorentziana no domnio das frequncias como mostra a
figura abaixo:

Figura 6: Primeiro espectro do etanol obtido por

Arnold et al. na Universidade de Stanford em 1951.
As correntes induzidas produzidas pelos eltrons
prximos a certo ncleo tendem a diminuir o campo
magntico local (lei de Lenz) em amostras
diamagnticas
(que
no
possuem
eltrons
desemparelhados). Isso acarreta na mudana da
frequncia de ressonncia fL para ncleos idnticos mas
pertencentes a ambientes qumicos diferentes, nos
permitindo observar um espectro de frequncias de
ressonncia. A esse efeito damos o nome de desvio

qumico ou chemical shift que nos revela a estrutura fina

do espectro.

aumento da constante de blindagem da esquerda para a

direita.

Muitos outros efeitos causam o desdobramento ou

deslocamento desses sinais, entre eles esto:

Uma forma de padronizar todos os espectros foi a

introduo do desvio qumico ij definido por:

(i)
(ii)
(iii)
(iv)

Acoplamento dipolar ou dipolo-dipolo;

Acoplamento escalar ou spin-spin indireto;
Interao ncleo-eltron;
Momento quadrupolar, em ncleos com I1/2 .

Os fenmenos citados acima revelam a estrutura

hiperfina dos espectros. Irei agora descrever brevemente
o que so e o que acarretam os trs principais efeitos de
desdobramento dos espectros: desvio qumico,
acoplamento dipolar e acoplamento escalar. No estou
dizendo que os outros efeitos no tm importncia, a
espectroscopia por RMN possui diversas aplicaes e,
certamente, os no citados aqui so importantes para
algumas dessas aplicaes.
Desvio qumico
A origem do desvio qumico j foi citado acima: as
correntes induzidas dos eltrons que blindam o ncleo
de forma que ele sinta um campo magntico
adicional ao campo B0. De fato, no
necessariamente
est na mesma direo de B0,
portanto a constante de proteo magntica ou
constante de blindagem uma grandeza tensorial.
Porm, no estudo de lquidos e gases, apenas o valor
determinado devido ao rpidos
mdio de
movimentos das molculas e apenas o valor mdio de
importante. Para prtons, a constante de blindagem
da ordem de 10-5 e, para ncleos de alta massa, da
ordem de 10-2. O campo magntico sentido pelo spin :
(13)
Dois ncleos iguais, porm em ambientes qumicos
diferentes, absorvem radiao de frequncias
ligeiramente diferentes. Com isso j podemos esplicar,
pelo menos em parte, o espectro de 1H do etanol
CH3CH2OH na figura 6. O pico de absoro a esquerda
(maior frequncia) representa o prton ligado ao
oxignio, que, por ser mais eletronegativo, diminui a
blindagem do prton, aumentando o campo local e
consequentemente a sua frequncia de ressonncia. O
pico do meio representa os dois prtons ligados ao
carbono central, pois sua intensidade est a dois teros
da altura do pico a direita, que por sua vez representa os
trs hidrognios ligados ao terceiro carbono. Simples,
no ? Sim, simples demais. No foram levadas em
conta as ligaes de hidrognio nem outras
contribuies das correntes de induo de tomos
vizinhos. Se medirmos o espectro do etanol num
solvente inerte como o CCl4, mostra-se que a banda do
OH est a a direita (menor frequncia) da banda do
CH2.
Por razes histricas, nos espectros de RMN a
frequncia de ressonncia ou o desvio qumico crescem
da direita para a esquerda, pois isso representa um

ij =

( fi f j )
fj

(14)

onde fj a frequncia de ressonncia dum padro que

segue vrias caractersticas bem definas (comumente
usa-se os compostos TMS ou DSS) e fi a frequncia do
ncleo em questo. Pode-se observar facilmente que o
desvio qumico ij no depende de B0, tornando a
escala independente do espectrmetro utilizado. O
desvio qumico d-se na ordem de 10-6, por isso a escala
chamada geralmente de ppm, ou partes por milho.
O desvio qumico transforma a espectroscopia de RMN
numa ferramenta poderosa na identificao da estrutura
de substncias qumicas. Cada grupamento qumico ter
seus desvios qumicos caracterstico. Na espectroscopia
de 1H particularmente, os desvios qumicos so muito
sensveis natureza do solvente e presena de
espcies paramagnticas.
Acoplamento dipolar
O acoplamento dipolar advm da interao direta entre
spin de ncleos diferentes e um dos agentes que causa
desdobramento nos sinais de RMN. O spin sente seu
vizinho atravs de um campo magntico local
, onde r a distncia entre os spins e
o ngulo entre seus momentos de dipolo. No ngulo
de 55o, a contribuio da mdia temporal de Bloc nula,
esse ngulo denominado ngulo mgico em RMN de
slidos.
Em amostras lquidas ou gasosas, os rpidos
movimentos moleculares causam rpida reorientao
das molculas em relao ao campo magntico,
tornando a contribuio do acoplamento dipolar nula e
no leva ao desdobramento de espectro. Para molculas
muito grandes onde o movimento trmico reduzido, a
mdia temporal de Bloc no anula-se completamente,
contribuindo com o alargamento de banda.
Acoplamento escalar
Atravs de mecanismos indiretos, os eltrons de ligao
fazem com que o valor mdio do campo magntico
sentido por um ncleo dependa da orientao dos spins
de ncleos vizinhos. Esse acoplamento indireto leva a
um desdobramento do espectro de RMN normalmente.
Se tivermos 2 ncleos, A e X no equivalentes mas
ambos de spin I = , como o HF, o sinal de A
depender da orientao do spin de X. Os spins de X
podem ser +1/2 e -1/2, levando ao desdobramento do
sinal de A em dois (dubleto). Igualmente o sinal de X
ser um dubleto pois A pode assumir dois estados de
spin (+1/2 e -1/2).

Muitos efeitos, naturais e provocados podem levar ao

desacoplamento entre ncleos. Dentre eles rpidas
trocas, como a do prton de um grupo OH, fazem com
que os spins vizinhos enxergem apenas um campo
magntico mdio gerado por ele e no observa-se
acoplamento com este. Elevados momentos de
quadrupolo eltrico tambm geram desacoplamento
pois as rpidas oscilaes do campo eltrico promovem
rpidas transies no estado de spin. O efeito de
Overhauser nuclear (NOE) tambm um causador de
desacoplamento. Certas tcnicas, por fim, geram
desacoplamento
intencional
aplicando
campo
magntico oscilatrio intenso de frequncia igual a
frequcia de ressonncia do ncleo.
Figura 7: Desdobramento do espectro de RMN de dois
ncleos A e X de spin I = acoplados. Em cima a diferena
entre os nveis de energia e em baixo o espectro
correspondente se ( esquerda) os ncleos no estivessem
acoplados (J=0) e ( direita) se os ncleos esto acoplados
(J>0).

A separao (em Hz) entre os picos denominada

constante de acoplamento e representada pela letra J.
A constante de acoplamento no depende da
intensidade de B0.
Em geral, um ncleo acoplado a outro de spin I e
quimicamente no equivalente ao primeiro ter um
multipleto de 2I+1 componentes. Como o caso do
espectro 1H do on 14NH4+ (I = 1 para 14N) que ser um
tripleto pois os prtons encontam-se acoplados ao
nitrognio e nesse caso 2I+1 = 3. Nessa situao, JNH
ser a separao entre picos consecutivos.
Se um ncleo estiver acoplado com o mesmo J a n
ncleos equivalentes, haver 2nI+1 picos em seu
espectro e se o ncleo estiver acoplado a ncleos de
diferentes JJ pode acontecer desdobramentos
consecutivos, como tripeto de dubletos na pirimidina.
No necessariamente os ncleos precisam estar
diretamente ligados (distncia de uma ligao) a outro
ncleo para estarem acoplados e os picos no precisam
ter a mesma intensidade j que alguns estados
acoplados so mais provveis que outros.

CONCLUSO
Foram apresentados aqui apenas uma breve introduo
do fenmeno de RMN e os princpios mais
fundamentais da espectroscopia por RMN, porm para
entendermos a fundo toda a teoria dos diversos tipos de
experimentos realizados por RMN, necessrio um boa
dose de mecnica quntica e lgebra matricial.
No falei muito das aplicaes da tcnica, mas h
muitas e muitas delas em diferentes reas. Na qumica e
na biologia estrutural, muitos experimentos podem ser
realizados; desde simples fingerprints de pequenas
substncias at a elucidao de estruturas proteicas,
dinmica molecular, interao com ligantes e outros
monmeros
da mesma protena. Cada tipo de
experimento utilizado explora certos fenmenos fsicos,
por exemplo, o acoplamento dipolar que fundamental
na RMN de slidos e tem seu efeito anulado ou
reduzido em lquidos e slidos, da a importncia de
conhecer o background terico de cada experimento a
ser realizado.

BIBLIOGRAFIA

Figura 8: Espectro do etanol com resoluo suficiente

para se ver o quarteto do grupo metileno e o tripleto do
grupo metil.

Ressonncia magntica nuclear: fundamentos,

mtodos e aplicaes (captulos 1 e 2); Victor M.
S. Gil e Carlos F. G. C. Geraldes; Fundao
Calouste Gulbenkian, Lisboa; 1987.
Protein NMR Spectroscopy: Principles and
Practice, Second Edition (Captulo 1); John
Cavanagh, Wayne J. Fairbrother, Arthur G.
Palmer III, Mark Rance e Nicholas J. Skelton;
Elsevier Academic Press; 2007.
Aula sobre RMN no Estudo de Biomolculas
da profa. Claudia Elizabeth Munte, IFSC-USP.

Espectroscopia de RMN
Marcela Nunes
INTRODUO
A Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) ,
atualmente, uma das tcnicas mais versteis para o
estudo a nvel atmico a estrutura e a dinmica de
macromolculas como protenas e cidos nuclicos, e
tambm caracterizao das interaes e reconhecimento
molecular, nomeadamente interaes protena-protena,
protena-ligante ou protena-cidos nuclicos, sendo
uma tcnica no destrutiva.
Esta tcnica tem como base o fenmeno de ressonncia
para o estudo das propriedades fsicas e qumicas da
matria, explorando as propriedades magnticas de
ncleos atmicos. Em qumica, frequentemente
utilizada para o estudo da estrutura dos compostos
usando tcnicas uni ou bidimensionais simples
substituindo as tcnicas de cristalografia de raios-X.
Espectroscopia de RMN depende das variaes de
energia quantificveis que podem ser induzidas em
pequenas molculas quando estas so submetidas
radiao eletromagntica. Este se relaciona com as
transies induzidas pelas radiofrequncias entre
estados quantificados de energia dos ncleos orientados
num campo magntico.
O ncleo de certos elementos e istopos comporta-se
como se um fosse m girando em torno de um eixo,
quando se coloca um composto contendo tomos de 1H
ou de 13C em um campo magntico muito forte e
simultaneamente se irradia o composto com energia
eletromagntica, os ncleos podem absorver energia
num processo denominado ressonncia magntica. A
absoro desta radiao pelos ncleos desses elementos
quantificada e da origem a um espectro caracterstico.

PRINCPIOS BSICOS

Os ncleos apresentam momentos magnticos e

angulares paralelos entre si, respeitando a
expresso
, onde o fator giromagntico. O
momento angular
definido, quanticamente, por
, onde denominado de momento angular ou
spin, cujos valores podem ser somente nmeros inteiros
ou semi-inteiros positivos. Na RMN possvel
controlar a radiao eletromagntica e descrever a
interao da radiao com os spins nucleares.

PROPRIEDADES MAGNTICAS DOS NCLEOS

Quando a massa atmica (A) par, porque Z e N so
pares, o numero quntico = 0, e o ncleo no possui
sinal de RMN, mas quando
, o ncleo pode ser
considerado como uma partcula carregada girando em
torno do seu prprio eixo com um momento magntico
r
nuclear ao longo deste eixo.

Figura 1: Movimento de rotao da carga do hidrognio gera

um campo magntico

A rotao de partculas carregadas gera um movimento

magntico orientado segundo o eixo de spin,
significando que estes ncleos funcionam como barras
magnticas.

RMN trata da interao da radiao eletromagntica

com a matria. Entretanto, esta se diferencia da
espectroscopia ptica em vrios aspectos, como:
- A separao dos nveis de energia

resultado da interao do momento magntico de

um ncleo atmico com o campo magntico
aplicado;
- A interao com a componente magntica da
radiao eletromagntica ao invs da componente
eltrica. Sendo que, o efeito de ressonncia ocorre para
r
ncleos que possuem momentos magnticos ( )e
angulares ( ).

Figura 2: Rotao do ncleo em um campo magntico externo

Quando os ncleos so submetidos a um campo

magntico forte e uniforme, , sofrem uma toro e
tendem a tomar uma orientao permitida, em relao
ao campo externo. Este alinha os ncleos que giram
opondo-se tendncia desordenada dos processos
trmicos. Porm, os ncleos no se alinham em posio
perfeitamente paralela (ou antiparalela), em relao ao
campo. O que ocorre que os eixos dos respectivos
spins ficam oblquos em relao ao campo, e tal como a
parte superior de um giroscpio, sofre um movimento
de precesso, em que cada plo do eixo nuclear
descreve uma trajetria circular no plano do campo.

Um dos desenvolvimentos mais importantes para a

espectroscopia foi o desenho de novos magnetos
baseados em materiais supercondutores. Este novo tipo
possibilitou o alcance de campos magnticos maiores e
mais estveis levando obteno de espectros mais
sensveis e de melhor resoluo, podendo-se estudar
sistemas mais complexos. Entretanto, o grande
desenvolvimento surgiu com o sistema de FT*- RMN
bidimensional (2D), baseado nas tcnicas de pulsao.

SOBRE O SINAL
sinal da espectroscopia de RMN resultante da
diferena entre a energia absorvida pelos spins que
efetuam uma transio do estado de menor energia para
o estado de maior energia e a energia emitida pelos
mesmos que simultaneamente efetuam uma transio do
nvel de energia superior para o de energia inferior. O
sinal ento proporcional diferena populacional
entre os estados considerados.

FT Transformadas de Fourrier.

Em RMN -1D, os spins so expostos a um pulso que

detecta um sinal no receptor em funo do tempo t. J
em RMN-2D, os spins so sujeitos a dois ou mais
pulsos, com um intervalo de tempo t1. Aps o segundo
pulso, o sinal obtido da mesma forma que para RMN1D, embora a varivel de tempo passe a ser denominada
de t2. Depois desta etapa, o espectrofotmetro repete o
procedimento, mas com valor diferente de t1. Essa
variao de t1 modifica o sinal medido durante t2, que
origina ento, uma tabela bidimensional contndo a
intensidade do sinal como funo da t1 e t2. Aps estas
variveis serem submetidas s transformadas de
Fourrier, obtm-se um espectro de frequncia
bidimensional na forma de um mapa, que demonstra a
dependncia da intensidade do sinal em duas variveis
de frequncia, denominadas F1 e F2.

Figura 3: Formato das curvas dos dois sinais RMN

observveis.

A espectroscopia de RMN um mtodo sensvel porque

a capacidade de detectar estas pequenas diferenas
populacionais de certa forma acentuada. O sinal RMN
formado por duas componentes defasadas em 90.
Estas, quando so detectveis, so compostas por uma
componente de absoro e uma componente de
disperso, Figura 3, que podem ser observadas com a
utilizao de um detector de fase sensvel. Porm, os
espectros de RMN so habitualmente observados no
modo de absoro, enquanto o de disperso utilizado
para controle da frequncia de campo.

RMN BIDIMENSIONAL 2D

APLICAES NA SADE E NA PESQUISA

BIOLGICA
Atualmente, a espectroscopia de ressonncia magntica
nuclear utilizada em todos os ramos da qumica, tanto
nas universidades como nos laboratrios industriais.
Uma investigao tpica em RMN, combina vrios tipos
de espectros 1D, 2D e por vezes at 3D ou 4D, e com a
acumulao das informaes pode ser fornecida uma

figura detalhada da estrutura molecular. Por exemplo, a

estrutura tridimensional completa de vrias protenas e
outras macromolculas biolgicas determinada com
freqncia por este meio.
RMN tambm tem sido usada para o estudo das
interaes entre diferentes espcies moleculares (ex.
Enzimas - substrato), dos seus movimentos em lquidos
e polmeros, bem como para obteno de informaes
acerca das velocidades de certas reaes. Ocupa um
lugar elevado no campo da anlise qualitativa e
quantitativa, desde componentes em produtos
alimentares, a fluidos biolgicos e metabolitos em
tecidos e rgos de seres vivos intactos, de um modo
no invasivo e no destrutivo.
A classe de possveis aplicaes da RMN demasiado
grande para se efetuar uma lista exaustiva, porm
algumas destas aplicaes incluem:
- Verificao do grau de pureza das matrias primas;
- Anlise de drogas e frmacos;
- Controle e qualidade de produtos qumicos;
- Investigao de reaes qumicas;

Figura 6: Exemplo de imagem obtida atravs da ressonncia

magntica

O procedimento para anlise clinica simples, com o

paciente deitado na maca, esta ir suavemente deslocarse para dentro do magneto onde o scaner ser realizado.
Por vezes ocorre a introduo, via venosa de
medicamento (agente de contraste) de forma a facilitar a
visualizao ou melhora das imagens. Sendo que este
exame um procedimento totalmente
indolor,
virtualmente sem efeitos colaterais.

- Investigao de substncias desconhecidas, bem como

anlise de polmeros.
Por outro lado, a caracterizao espacial do sinal de
RMN da gua (junto com o avano da computao)
permitiu, tambm, o desenvolvimento do domnio de
imagem por ressonncia magntica, hoje uma das
tcnicas fundamentais da medicina.

EXAME MDICO
O exame por RMN permite aos mdicos analisarem as
estruturas internas do corpo sem ter de recorrer ao uso
de raios-x. Esta tecnologia possibilita a deteco de
doenas em desenvolvimento ou anormalidades com
maior antecedncia. Basicamente, a RMN utiliza um
poderoso campo magntico e ondas de radiofrequncia
que combinados produz imagens muita. A unidade de
RMN parece um tnel aberto no meio de uma grande
caixa, podendo possuir certas variaes (vista frontal
simplificada na figura 7).

DETECO DIRECTA DE HETERONCLEOS

A elevada razo giromagntica, , dos prtons, a qual
responsvel pela alta sensibilidade deste tambm causa
grandes interaes dipolo-dipolo que levam a uma
rpida relaxao dos ncleos. Este efeito provoca o
alargamento das ressonncias (podendo ate mesmo
desaparecer) na vizinhana de um centro paramagntico
ou em protenas de elevada massa molecular. Este efeito
de alargamento pode ser diminudo atravs de
sequncias de pulsos como TROSY (espectroscopia de
relaxao transversa optimizada, transverse relaxationoptimized spectroscopy) , CRIPT (transferncia de
polarizao induzida por relaxao-cruzada, crossrelaxation-induced polarization transfer) ou CRINEPT
(transferncia de polarizao correlacionada por
aumento da relaxao, crosscorrelated relaxationenhanced polarization transfer), ou atravs de esquemas
mais elaborados de marcao isotpica, como a
marcao isotpica de aminocidos especficos, ou dos
seus metilos, em que os prtons restantes da protena se
apresentam deuterados. Uma outra forma de diminuir
este efeito, o recurso deteco direta de spins
nucleares com uma razo giromagntica pequena, como

 o caso do 13C. Esta metodologia foi desenvolvida

atravs de sequncias de pulsos com deteco direta de
13
C para a identificao completa de heteroncleos da
cadeia carbonada, que podem fornecer informao
sobre a estrutura e dinmica das protenas.
A deteco direta de spins nucleares de 13C tem sido
utilizada no s em protenas de elevada massa
molecular, como o caso, por exemplo, da ferritina (um
dodecahedro de 22 kDa por monmero), mas tambm
na identificao de resduos na vizinhana de um centro
paramagntico.
Este fato deve-se deteco direta de 13C no ser to
afetada pelo centro paramagntico como o 1H, devido
pequena razo giromagntica do 13C gerar uma
diminuio nas contribuies paramagnticas dipolares
para a sua relaxao por um factor de (C /H)2. Uma
outra aplicao deste mtodo o estudo de protenas
intrinsecamente no estruturadas, uma vez que, ao
contrrio do prton, o 13C apresenta uma maior
disperso de desvios qumicos, o que acaba por
solucionar o problema da grande sobreposio de sinais
que se observa na frequncia do 1H dos espectros destas
protenas. Nesta metodologia, o espectro que
correlaciona o 15N do grupo amida com a carbonila da
ligao peptdica, CON, o espectro equivalente ao
espectro 1H -15N HSQC (correlao hetero-nuclear de
quantum-simples), como sendo o espectro base para a
identificao de todos os sistemas de spin
(nomenclatura equivalente ao resduo) da protena e
posterior identificao sequencial desses mesmos
sistemas de spin.

SONDAS PARAMAGNTICAS
A presena de um on paramagntico nas amostras de
RMN era vista como desvantagem e muitas vezes
tentavam-se substituir este on por outro diamagntico,
de forma a evitar os efeitos de alargamento de linha nas
ressonncias de ncleos na sua vizinhana. No entanto,
nos ltimos anos, o uso de sondas contendo metais
paramagnticos tem ganho interesse, uma vez que estas
podem ser usadas como uma ferramenta para a
obteno de informao estrutural em protenas, e de
orientao e dinmica de complexos protena-protena e
protena-ligante. O uso destas sondas permite a
obteno de restries a longa-distncia, atravs da
determinao do aumento da relaxao paramagntica,
de desvios de pseudo-contacto e de acoplamentos
dipolares residuais (RDCs).
O tipo de efeito que se observa depende do on
paramagntico utilizado, sendo que os desvios de
pseudo-contato e os acoplamentos dipolares residuais
so observados quando o on paramagntico (a maioria
dos lantandeos, Dy3+) apresenta uma distribuio
anisotrpica do spin eletrnico. Os RDCs so
provocados
pelo
alinhamento
induzido
pelo
paramagnetismo no campo magntico, estendendo-se a
toda molcula, podendo ser utilizados na definio das

orientaes relativas de domnios em uma protena ou

de protenas em complexos transientes, enquanto os
desvios de pseudo-contato, provocados pela interao
atravs do espao com o eltron desemparelhado,
podem ser observados at uma distncia de 40 do on
paramagntico, sendo proporcionais a 1/d3 (onde d a
distncia entre o spin nuclear e o on paramagntico).
No caso dos ons paramagnticos que apresentam uma
distribuio isotrpica de spin eletrnico (ex., radicais
nitrxido, e on Mn2+ ou Gd3+), observa-se somente o
aumento da relaxao paramagntica, que se deve
grande interao magntica dipolar que existe entre o
eltron desemparelhado num centro paramagntico e
um ncleo (observvel em RMN) na sua vizinhana, o
que provoca um aumento da taxa de relaxao desse
mesmo ncleo. Este efeito depende da distncia, d,
entre o ncleo e o eltron, e a sua magnitude
diretamente proporcional a 1/d6, podendo ser observado
at 20-35 .
A utilizao destas tcnicas possvel quando as
metalo-protenas em estudo apresentam locais de
ligao de metais que podem ser substitudos por
lantandeos (ex., Ca2+, Mg2+ e Mn2+). No entanto, vrios
tipos de sondas com poder de ligao a locais
especficos de cadeias polipeptdicas tm sido
desenvolvidos:
- Atravs da ligao a um grupo tiol de um resduo de
cistena (natural ou introduzido por mutao dirigida)
que se encontre exposto superfcie da protena, como
o caso das sondas de lantandeos;
- Ou atravs da fuso, ao N- ou C-terminal da protena,
de pequenos peptdeos com afinidade para metais
paramagnticos.
- Outros tipos de sondas paramagnticas onde no
ocorre a necessidade de ligao covalente protenasonda.

UTILIZAO DE RMN NOS PROJETOS DE

GENMICA ESTRUTURAL
Muitos so os fatores que contriburam para o avano
atual em pesquisa. Dentre estes, a melhora significativa
da instrumentao, como o aumento da sensibilidade
das crio-sondas em 13C, o desenvolvimento de micro
crio-sondas e pr-amplificadores, o aumento da
sensibilidade em RMN atravs da utilizao de campos
magnticos mais elevados, e a melhoria da eletrnica
digital da ltima gerao dos espectrmetros.
O surgimento de micro crio-sondas permite a reduo
na quantidade de amostra a serem utilizadas na
aquisio de espectros para a determinao da estrutura
de protenas. Estas sondas so usadas nas linhas de
seleo de protenas alvo para a determinao das
melhores condies de estabilidade da amostra
(temperatura, solues tampo, pH, fora inica,
detergentes ou outros aditivos), identificao de

domnios de uma protena mais complexa, para

posteriores estudos estruturais por RMN ou
cristalografia de raios-X. Neste campo, rotina
determinar o tempo de correlao da protena na
tentativa de determinar o seu estado de oligomerizao
em soluo, nas condies (concentrao de protena,
pH, fora inica) em que os estudos estruturais iro se
realizar.
A otimizao das condies de amostragem essencial
em sistemas como:
- protenas de maior massa molecular;
- protenas com vrios domnios;
- protenas membranares;
Esta otimizao feita atravs da anlise da disperso e
distribuio dos desvios qumicos das ressonncias no
espectro 1H-15N HSQC da protena alvo. A anlise do
1
H-15N HSQC permite ainda avaliar o estado de pureza
da protena, a sua estabilidade em diferentes solues
tampo, temperaturas, contendo informao sobre a
dinmica da protena.

METODOLOGIA
SIMPLES
PARA
CARACTERIZAO
DE
COMPLEXOS
PROTENA-PROTENA.
Dado o crescente numero de projetos de genmica
estrutural, o numero de estruturas proticas conhecidas
vem crescendo exponencialmente. A contribuio da
metodologia de ressonncia magntica para os dados
armazenados ainda relativamente pequena se
comparado com os obtidos por cristalografia de raios-X.
No entanto, a RMN tem um papel extremamente
importante
na
caracterizao
de
interaes
biomoleculares, por se tratar da nica tcnica que
permite obter informao, em condies prximas das
condies fisiolgicas, sobre a estrutura, a dinmica
molecular das biomolculas, e a termodinmica e
cintica de interaes biomoleculares.
Uma das metodologias mais utilizadas na caracterizao
de interaes protena-protena por RMN a
perturbao dos desvios qumicos, que permite o
mapeamento da interface do complexo, informao esta
que pode ser integrada em programas computacionais
de forma a obter-se um modelo da estrutura do
complexo. Esse procedimento tem sido muito utilizado
na caracterizao de complexos transientes e de baixa
afinidade, como complexos de transferncia eletrnica.
Outro mtodo a experincia de transferncia de
saturao, em que uma protena A deuterada e
marcada com 15N, enquanto que a outra protena B
(doadora) no marcada. Neste caso, a saturao das
ressonncias da protena B, no marcada, leva
atenuao de sinal por mecanismos de saturao
cruzada, que so observados no espectro de 1H -15N
HSQC da protena A.

Podem-se usar tambm acoplamentos dipolares

residuais e o aumento da relaxao paramagntica na
caracterizao de complexos transientes. Neste caso,
foi exemplificado a aplicao da primeira metodologia
ao complexo entre o citocromo c3, uma protena
contendo quatro grupos hmicos (Fe-hmico
hexacoordenado octadrico, 4 azotos da porfirina e
dois ligandos axiais, Fe3+ S=1/2 e Fe2+ S=0), e a
rubredoxina, que contm um on ferro coordenado por
quatro resduos de cistena (arranjo tetradrico, Fe3+
S=5/2 e Fe2+ S=2).
O complexo citocromo c3 rubredoxina foi
caracterizado de duas formas. Na impossibilidade de
marcao isotpica do citocromo c3, a identificao do
hemo que fica na interface do complexo, foi feita
atravs de uma titulao monitorizada por espectros 1H.
O espectro 1H do citocromo apresenta 16 ressonncias
de grupos metilo dos quatro hemos, deslocadas para
campo baixo devido ao efeito paramagntico do ferro
(III). No estado oxidado, a adio de rubredoxina ao
citocromo c3, provoca a relaxao seletiva de dois dos
grupos metilo de um dos hemos (Hemo-IV). Por outro
lado, como a rubredoxina pode ser marcada
isotopicamante com 15N, podemos identificar os
resduos da rubredoxina que esto na interface do
complexo, atravs de uma titulao monitorizada por
espectros de 1H - 15N HSQC.
A informao obtida atravs destas duas experincias
foi posteriormente usada num programa de acoplamento
molecular, obtendo-se um modelo da estrutura do
complexo (Figura 8).

CONCLUSO
A espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear
tornou-se o mtodo mais importante para a investigao
a nvel molecular, permitindo obter informaes tanto
da estrutura protica quanto da dinmica desta, uma vez
que existem relaes muito prximas entre os dados
obtidos por 1H-RMN e o arranjo dos prtons na
molcula em investigao. So vrias as informaes
que podemos obter num espectro, tais como:

Informao contida no espectro

Arranjo dos prtons

- Nmero de linhas de ressonncia

- Nmero de grupos de prtons equivalentes

- Posio dos sinais de ressonncia

- Tipo de grupos de prtons

- Intensidade relativa dos sinais de

- Nmero de prtons que provocam o sinal

ressonncia

- Posio dos grupos de prtons relativamente a

cada um deles

- Estrutura fina dos sinais de ressonncia

Em muitos casos este conhecimento permite-nos:

- Protenas contendo centros paramagnticos,

- Predizer espectros de molculas baseando-se somente

na frmula estereoqumica;

- Protenas desnaturadas,

- Propor estrutura para uma molcula desconhecida

baseando-se apenas no seu espectro;
- Decidir entre vrias estruturas possveis para uma
molcula baseando-se no espectro obtido, ou pelo
menos um limite de vrias possibilidades;
A aplicao da espectroscopia de RMN fundamenta-se
essencialmente na correlao emprica entre as
estruturas com deslocamentos qumicos observados e
constantes de acoplamento.
Em termos de investigao clnica e desenvolvimento
de imagem, a RMN direciona-se para determinados
objetivos nomeadamente:
- Comparar a RMN com outras modalidades;
- Aproveitar as caractersticas nicas da imagem RMN;
- Determinar as tcnicas mais teis para cada local ou
doena;
- Determinar a utilidade de medidas diretas de tecidos
normais e de leses benignas e malignas;
- Atuar com a cirurgia e radioterapia na preparao,
planejamento e estudo da resposta ao tratamento de
cancros e linfomas;
- Avaliar o problema da segurana;
- Desenvolver tcnicas de aumento de contraste;
Apesar das notadas vantagens da RMN, este recurso
tambm traz inconvenientes que se referem
impossibilidade
da
analise
de
misturas
multicomponentes, ao elevado custo dos aparelhos e sua
manuteno e a baixa sensibilidade em certos casos,
devido s transies magnticas nucleares serem pouco
intensas. No entanto, nos ltimos anos tm-se verificado
diversos avanos na tcnica que permitem contornar
este problema, permitindo a expanso da aplicao da
RMN a tpicos, tais como:
- Protenas com mais de 25 kDa,
- Protenas membranares,

- RMN de protenas em clulas in vivo.

A aplicao da RMN a estes tpicos de interesse
biolgico foi possvel devido a avanos significativos
no s ao nvel da instrumentao de RMN (campos
magnticos mais elevados e crio-sondas de maior
sensibilidade), como tambm no desenvolvimento de
novas sequncias de pulsos, novos esquemas de
aquisio de espectros multidimensionais, a deteco
direta de 13C, e tambm a marcao seletiva de
aminocidos, assim como a possibilidade de introduzir
sondas paramagnticas em protenas.
Para alm destas inovaes na RMN de protenas no
estado lquido, tem-se ocorrido nos ltimos anos o
desenvolvimento da RMN de slidos aplicada a
protenas membranares, a protenas contendo regies
desordenadas ou homomultmeros de elevada massa
molecular.
Os ncleos que so frequentemente observados por
RMN biomolecular tm abundncia natural (1H e 31P)
ou podem ser enriquecidos atravs da expresso
heterloga, usando fontes de carbono e azoto
enriquecidos nestes istopos (13C e 15N).
Uma vez que cada um destes ncleos d origem a um
sinal num espectro RMN, de esperar que haja um
grande nmero de sinais que se encontrem sobrepostos,
e que tm de ser identificados de forma a se extrair toda
a informao estrutural que contm. Uma das formas de
solucionar o problema da sobreposio de sinais nos
espectros de RMN foi a introduo de espectros
multidimensionais,
RMN-nD.
Estes
espectros
correlacionam a frequncia de um sinal numa dimenso
com outras frequncias noutras dimenses, permitindo a
identificao de sinais sobrepostos observados nos
espectros unidimensionais.
Um dos espectros mais utilizados na RMN
biomolecular, e que pode ser considerado como o
espectro base, o 1H -15N HSQC, em que cada sinal
observado corresponde a um prton ligado a um ncleo
15
N.

Uma vez que, numa protena, cada resduo, exceo

da prolina e do resduo N-terminal, tem um prton
ligado a um azoto na ligao peptdica, o nmero de
sinais observados num 1H-15N HSQC de uma protena
deve corresponder ao nmero de resduos da sua cadeia
polipeptdica (as cadeias laterais dos resduos de
asparagina e glutamina contribuem com dois sinais
cada). Por este motivo, este espectro considerado
como sendo a impresso digital de uma protena, e a
disperso dos sinais observados indica que a protena se
encontra estruturada.

BIBLIOGRAFIA

RMN Biomolecular desenvolvimentos recentes

e aplicaes modernas da RMN biologia, Sofia
R. Oauleta e Jos J.G. Moura
Fsico-qumica - Peter Atkins, Julio de Paula, 8
edio
Quantum chemistry & spectroscopy - Thomas
Engel 2 edio
Spectroscopy - Gary M. Lampman ; Donald L.
Pavia George S. Kriz

Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)

Renato Dantonio Paciencia
INTRODUO
A ressonncia magntica nuclear (RMN) um
fenmeno que ocorre quando o ncleo de certos tomos
so postos em um campo magntico esttico. Nem
todos os ncleos possuem esse fenmeno j que ele
dependente de uma propriedade chamada spin. O RMN
pode ser usado em espectroscopia para estudar as
propriedades fsicas, qumicas e biolgicas da matria.
J a espectroscopia pode ser definida como o estudo da
interao de radiao eletromagntica com a matria. A
espectroscopia de RMN possui aplicaes em vrias
reas da cincia, sendo a mais importante o estudo da
estrutura de compostos naturais usando tcnicas de uma
dimenso e de duas dimenses (para os compostos mais
complicados). O princpio da espectroscopia de RMN
a medida da intensidade de absoro ou emisso das
radiaes eletromagnticas em cada freqncia atravs
uma faixa especfica de freqncias. A freqncia de
ressonncia de um tipo em particular de ncleo ser
diferente quando este estiver em um ambiente qumico
diferente. Mudando a freqncia da radiofreqncia que
excita e medindo a intensidade de absoro em cada
freqncia, possvel detectar um ncleo e em cada
caso o seu ambiente qumico. Ao passo que a
espectroscopia RMN de estado slido empregada na
determinao da estrutura de compostos slidos, a
espectroscopia RMN de domnio de tempo usada para
determinar a dinmica molecular em solues..
Mtodos recentemente desenvolvidos de RMN so
capazes de analisar os coeficientes de difuso de um
composto. O RMN um campo que vem rapidamente
crescendo e j se tornou to vasto que levaria uma vida
inteira para dominar todas as tcnicas.
Quando os ncleos so colocados num potente campo
magntico uniforme, estes sofrem uma toro e tendem
a tomar uma orientao permitida, em relao ao
campo externo. Este ltimo alinha os ncleos que giram
opondo-se tendncia desordenada dos processos
trmicos. Porm, os ncleos no se alinham em posio
perfeitamente paralela (ou antiparalela), em relao ao
campo. Na realidade, os eixos dos respectivos spins
ficam oblquos em relao ao campo, e tal como a parte
superior de um giroscpio, sofre um movimento de
precesso
Por volta de 1950, descobriu-se que as freqncias de
ressonncia nuclear no dependem apenas da natureza
dos ncleos atmicos, mas tambm do ambiente
qumico. A utilidade desta tcnica tornou-se ento
muito bvia, na medida em que poderia ser utilizada
para determinar o nmero e o tipo de grupos qumicos

num composto. Porm, quando associada a outros

mtodos espectroscpicos, a tcnica de espectroscopia
de ressonncia magntica nuclear, RMN, revolucionou
a metodologia deidentificao e caracterizao das
molculas fornecendo
um grande volume de
informaes, fruto dos efeitos das aes inter e
intramolculares sobre os valores da ora do campo
magntico ao nvel dos ncleos das molculas.

ORIGEM DO SINAL:
Como os eltrons possuem o nmero quntico de spin
(S), os ncleos de 1H e de alguns istopos tambm
possuem spin. O ncleo do hidrognio comporta-se
como um eltron em que o seu spin 1/2 e pode
assumir dois estados: +1/2 e -1/2, o que pressupe a
existncia de dois momentos magnticos.
Observaremos absoro de energia correspondente a
transio entre os nveis de spin e - quando se
satisfaz a condio de ressonncia:

Figura 1: Momento angular e estados de spin nuclear

Consideremos um spin nuclear I = . Neste caso, m =

+ e -. A separao entre estes dois nveis

E = hH 0

(1)

Se a amostra exposta a radiao de frequncia de

forma que:

h0 = hH 0

(2)

Observaremos a absoro de energia correspondente a

transio entre os nveis de spin e - quando se
satisfaz a condio de ressonncia:

0 = H 0

(3)

Esta a frequncia de precesso dos spins no campo, ou

Freq. de Larmor (equao 3)

Dois outros parmetros por vezes referidos so os

tempos de relaxao spin-rede e spin-spin dos ncleos.
A rotao interna, as trocas qumicas e outros processos
podem afetar os tempos de relaxao, de modo a
originar efeitos termos-dependentes sobre os
espectros. Nos slidos predominam as interaes diretas
dipolo-dipolo magnticos, os tempos de relaxao so
prolongados e o espectro de RMN constitudo por
riscas muito largas. Nos lquidos e gases, as interaes
diretas dipolo-dipolo anulam se, em geral, pelos
rpidos movimentos intra e intermoleculares, os
tempos de relaxao so muito menores e observam-se
espectros de RMN de riscas finas.

DESLOCAMENTO QUMICO

Figura 2: Ao do pulso de RF e o aparecimento do sinal de

RMN

ESPECTROFOTMETRO
CONTNUA)

DE

RMN

(ONDA

O espectrofotmetro de ressonncia magntica nuclear

constitudo por seiscomponentes fundamentais: um
magnete, que separa os estados energticos do spin
nuclear; um transmissor, que fornece a energia RF; o
suporte da amostra, provido de bobinas eltricas para a
ligao desta ao gerador RF; um detector que processa
os sinais RMN; um registrador que fornece o espectro;
finalmente, um gerador para o varrimento do campo
magntico da regio de ressonncia, para produzir
o espectro.

Se os prtons de uma molcula qualquer perdessem

todos os seus eltrons e fossem isolados dos outros
ncleos, todos estes absorveriam energia num campo
magntico de intensidade bem determinada e para uma
dada freqncia de radiao eletromagntica. No
entanto, esta situao no corresponde realidade.
Numa molcula, alguns ncleos de hidrognio esto em
regies de densidade eletrnica maior do que em outros,
pelo que teremos ento prtons que absorvem energia
em campos magnticos de intensidades ligeiramente
diferentes. Como resultado teremos sinais no espectro
de RMN que aparecem em diferentes posies. Desta
forma, estamos perante prtons que apresentam um
deslocamento qumico diferente.
Assim como o nmero de sinais num espectro de RMN
diz-nos quantas espcies de protes existem numa
molcula, a posio dos sinais ajuda-nos a determinar
que espcie de prtons se trata: aromticos ou alifticos;
primrios, secundrios, ou tercirios; benzlicos,
vinlicos ou acetilnicos; adjacentes a tomos de
halognio ou a qualquer outro grupo de tomos.
A circulao dos eltrons de uma ligao sob a
influncia de um campo magntico externo gera campo
magntico de baixa intensidade (campo induzido) que
protege o prton em relao ao campo externo. Isto
quer dizer que o campo magntico real que atua sobre o
prton menor do que o campo externo.

NMERO DE SINAIS E IDENTIFICAO DOS

TIPOS DE PRTONS

ESTRUTURA

Numa dada molcula prtons com o mesmo ambiente

absorvem mesma induo magntica aplicada e so
designados por prtons equivalentes. O nmero de
sinais no espectro de RMN diz-nos, ento, quantos
conjuntos de prtons equivalentes, ou quantas
espcies de prtons, existem na molcula.

Para a maior parte dos fins, os espectros RMN de

alta resoluo podem descrever-se em termos de
deslocamentos qumicos e constantes de acoplamento.

De forma a compreender o estabelecimento da

equivalncia entre os prtons de uma molcula, sero
abordados alguns exemplos dados pelas seguintes frm
ulas de estrutura.

Figura 3: Aspecto esquemtico dos componentes de um

espectrofotmetro de RMN.

ESPECTROS
MOLECULAR

RMN

Tendo em conta que, para serem quimicamente

equivalentes, os prtons tm de ser tambm
estereoquimicamente equivalentes, dai que para
as seguintes estruturas temos a seguinte anlise.
Os efeitos do acoplamento spin-spin so transferidos
principalmente pelos electresde ligao e no so
usualmente observados se os protes acoplados
estiverem separados por mais de trs ligaes sigma.

Assim temos que para uma mesma molcula podem

existir vrios tomos dehidrognio equivalentes, isto ,
com o mesmo deslocamento qumico. Portanto, o sinal
destes prtons cai na mesma posio do espectro de
RMN. Dizemos ento que estamos perante prtons
homotpicos.
Se a substituio de cada um dos tomos de hidrognio
pelo mesmo grupo leva formao de compostos que
so enantimericos, ento, os dois prtons considerados
so enantiotpicos. Neste caso, os ambientes destes dois
prtons so imagens um do outro num espelho plano e
num meio aquiral comportam-se como se fossem
equivalentes dando apenas um sinal no espectro.
Por outro lado, se a substituio de cada um dos tomos
de hidrognio pelo mesmo grupo leva formao de
compostos que so diasteroismericos, os dois prtons
considerados so diasterotpicos.

ACOPLAMENTO SPINSPIN
Desdobramento do sinal o fenmeno que ocorre
devido s influncias magnticas dos tomos
de hidrognio adjacentes aos tomos responsveis
pelo sinal. Este efeito conhecido como acoplamento
spin-spin. Este acoplamento spin-spin de prtons
em carbonos adjacentes, tambm responsvel por cada
um dos picos observados, tambm muito importante
para a determinao da estrutura de compostos. Porm
para o entender, h que ter em conta que os prtons no
so somente afetados pelo campo magntico externo,
mas tambm pelos campos magnticos de todos os
prtons dos carbonos adjacentes.
Quando estamos perante o acoplamento de um prtons
com outro forma-se um pico duplo (dupleto), entre trs
prtons forma-se um pico triplo (tripleto) e assim por
diante.Os sinais com mltiplos picos (mais de 7 ou
8) podem ser chamados multipletos.

Porm, se os prtons que permitem o acoplamento, tm

desvios qumicos suficientemente distintos, o nmero
de picos em 1H-NMR N+1, onde N o nmero total
de prtons quimicamente equivalentes em tomos de
carbono adjacentes. Esta deduo uma regra
designada por regra do N+1.
A tabela seguinte ilustra o nmero de picos num
multipleto, resultantes da regra N+1, e as intensidades
ideais esperadas para cada pico.

Assim temos que N Prtons iro desdobrar os protes

adjacentes em (N+1) picos. As intensidades destes picos
so simplesmente o resultado das possveis orientaes
de spin, portanto, os prtons de um grupo CH 2 podem
ter os seguintes spins.
O par intermdio degenerado, portanto um prton
adjacente ao grupo CH2 ser dividido em trs picos
distintos na razo 1:2:1.
A separao entre estes picos referida como sendo a
constante de acoplamento, J,que medida em Hz.
Os efeitos do desdobramento so vulgarmente descritos
recorrendo a um esquema designado por rvore de
desdobramento splitting tree que mostra a
absorbncia inicial a ser dividida, por uma constante de
acoplamento J, em (N+1) picos.
Um esquema deste tipo muito til para a
compreenso de modelos dedesdobramento mais
complexos, como os que ocorrem no Br-CH2-CH2 CH2
-OD, como se pode ver na seguinte figura:

origina ento, uma tabela bidimensional que contm a

intensidade do sinal como funo da t1 e t2.
RESSONNCIA
APLICAES

MAGNTICA

NUCLEAR

A espectroscopia de ressonncia magntica nuclear

hoje em dia usada praticamente em todos os ramos da
qumica, quer nas universidades como tambm nos
laboratrios industriais.

RESUMO
Um fenmeno muito importante que explica o
aparecimento de sinais no espectro de RMN e que
resulta da presena de prtons vizinhos e da
sua influncia o acoplamento spin-spin.
O acoplamento spin-spin ocorre entre 2 ou mais
grupos de prtons, se estes so:
-no equivalentes
-suficientemente prximos (a menos de 3 ligaes )
A intensidade de um sinal determinada como sendo
a rea abaixo da curva do espectro de RMN
A intensidade do sinal proporcional ao nmero de
prtons equivalentes que lhe da origem.

RESSONNCIA
MAGNTICA
BIDIMENSIONAL 2D

NUCLEAR

Um dos desenvolvimentos mais importantes para

a espectroscopia durante os anos de1960 1970 foi
o desenho de novos magnetes, baseados em
materiais supercondutores. Este novo tipo de magnetes
possibilitou a obteno de campos magnticos maiores
e mais estveis levando obteno de espectros com
muito melhor sensibilidade e resoluo.
A partir deste momento podia-seestudar sistemas mais
complexos. Porm, o grande desenvolvimento surgiu
com Ernst que desenvolveu em 1975 um sistema de FTRMN bidimensional (2D), baseado nas tcnicas de
pulsao. O diagrama ilustra o desenvolvimento
do tempo do mtodo FT-RMN unidimensional (1D) e
FT-RMN (2D).
Em RMN (1D), os spins nucleares so expostos a um
pulso aps o qual, detectado um sinal no receptor em
funo do tempo t. Em RMN(2D), os spins nucleares
so sujeitos a dois ou mais pulsos, com um intervalo de
tempo t1.
Aps o segundo pulso, o sinal obtido da mesma forma
que para RMN (1D), embora aqui se designe a varivel
de tempo por t2. Depois desta etapa, o
espectrofotmetro retomo o mesmo procedimento mas
repetindo-o com outros valores de t1. A variao de t1
modifica o sinal medido durante t2. Esta situao

Uma investigao tpica em RMN, combina vrios tipos

de espectros 1D, 2D e por vezes at 3D ou 4D. a
acumulao desta informao que fornece vulgarmente
uma figura detalhada da estrutura da molcula. Por
exemplo, a estrutura tridimensional completa de muitas
protenas e outras macromolculas biolgicas tem sido
determinada por este meio.
A espectroscopia de RMN tambm tem sido usada para
estudar no s a estrutura das molculas, mas tambm a
interao entre diferentes espcies moleculares (ex.
Enzimas- substrato), para estudar os seus movimentos
em lquidos e polmeros, bem como para obter
informao acerca das velocidades de certas reaes.
Ocupa, igualmente, um lugar saliente no campo da
anlise qualitativa e quantitativa, desde componentes
em produtos alimentares, a fluidos biolgicos e
metabolitos em tecidos e rgos de seres vivos intactos,
de um modo no invasivo e no destrutivo.
A classe de possveis aplicaes da RMN demasiado
grande para se efetuar uma lista exaustiva, porm
algumas destas aplicaes incluem: Verificao do grau
de pureza das matrias primas; Anlise de drogas e
frmacos; controlo e qualidade de produtos qumicos;
investigao de reaes qumicas; investigao de
substncias desconhecidas bem como anlise de
polmeros.
Por outro lado, a caracterizao espacial do sinal de
RMN da gua (juntamente com o desenvolvimento
acelerado
das
capacidades
de
computao)
permitiu, tambm, odesenvolvimento do domnio de
imagem por ressonncia magntica, hoje uma das
tcnicas imageolgicas fundamentais em medicina
e noutras reas.
A tcnica adaptada aos objetivos do utilizador constitui
um excelente mtodo de estudo do crebro, medula
espinhal, ossos esponjosos, pelve masculina ou
feminina e grandes articulaes. Para tal utilizado e
cada vez com mais regularidade nos hospitais, um
aparelho de ressonncia magntica de imagem, RMI,
que no mais do que um aparelho de
RMN especializado.

EXAME MDICO RMN

Ressonncia Magntica Nuclear (RMN), ou RMI como
conhecida no meio, um exame que permite aos
mdicos analisarem as estruturas internas do corpo sem

o recurso aos raios-x. Esta tecnologia possibilita aos

mdicos detectar doenas em desenvolvimento, ou
anormalidades mais precocemente. Basicamente a
RMN utiliza um poderoso campo magntico e ondas de
radio freqncia e a combinao do campomagntico e
radiofreqncia produz imagens muita claras de
estruturas do corpo humano como o crebro, espinha,
articulaes, corao e outros rgos vitais.
O exame realizado numa sala contendo grande
mquina de RMN designada pelos mdicos por
"Magnete". A unidade de RMN parece um tnel aberto
no meio de uma grande caixa, podendo ser de diferentes
tipos, mas com um funcionamento semelhante.

So vrias as informaes que podemos obter num

espectro tais como:

Em muitos casos este conhecimento permite-nos

-Predizer espectros de molculas baseando-se apenas
na formula estereoqumica.
-Propor uma estrutura para uma molcula desconhecida
baseando-se apenas no seu espectro.
-Decidir entre
vrias estruturas possveis para uma molcula baseando
-se no espectro obtido, ou pelo menos um limite de
vrias possibilidades.
A aplicao da espectroscopia de RMN baseia-se, deste
modo,
essencialmente
nacorrelao emprica das estruturas com deslocamento
s qumicos observados e constantes de acoplamento.
Em termos de investigao clnica e desenvolvimento
de imagem, a RMN direciona-se para determinados
objetivos nomeadamente:
-Comparar a RMN com outras modalidades.

O procedimento para a anlise clinica o seguinte. O

paciente deita-se numa confortvel maca que ir
suavemente deslocar-se para dentro do magnete onde o
scan (exame) ser realizado.

-Aproveitar as caractersticas nicas da imagem RMN.

Por vezes a "bobina", que apenas um rdioreceptor

especial, colocada em torno da rea do corpo a ser
estudado, cabea, joelho, fgado. etc. em outras
situaes, o tcnico injeta um medicamento (agente
contraste) atravs de uma injeo de forma a facilitar a
interpretao das imagens do corpo do paciente. Os
dados obtidos pelo scan so processados por um
poderoso computador que os transforma em imagens
muito ntidas que o mdico especialista ir interpretar.

-Determinar a utilidade de medidas directas de T1 de

tecidos normais e de leses benignas e malignas.

A RMN por si prpria um procedimento totalmente

indolor, virtualmente sem efeitos colaterais. Atualmente
milhes de pacientes tem feito esse tipo de exame
comprovando ser extremamente seguro at porque a
tcnica utiliza apenas ondas de rdio e magnetizao
com as quais convivemos no dia a dia.

CONCLUSO
A espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear
tornou-se num mtodo standart em muitos laboratrios
de qumica. Esta tcnica reconhecidamente a mais
importante para a investigao a nvel molecular,
permitindo obter informao estrutural e dinmica para
qualquer estado da matria, uma vez que existem
relaes muito prximas entre os dados obtidos por 1HRMN e o arranjo dos prtons na molcula em
investigao.

-Determinar as tcnicas mais teis para cada local ou

doena.

-Interaccionar com a cirurgia e radioterapia na

preparao, planeamento e estudo da resposta ao
tratamento de cancros e linfomas.
-Avaliar o problema da segurana.
-Desenvolver tcnicas de aumento de contraste.
A espectroscopia de ressonncia magntica nuclear, e
uma tcnica que vem sendo muito usada fruto das
enormes vantagens que possui, nomeadamente a
possibilidade de estudar um elevado nmero de ncleos
e em todas as fases (gs, liquido e slido),elevadas
intervalos de temperaturas, tcnica no destrutiva e
segura. Porm o recurso a esta tcnica tambm traz
alguns inconvenientes que se referem insensibilidade
do mtodo, bem como a impossibilidade de analisar
misturas multicomponentes e ao elevado custo dos
aparelhos e sua manuteno.

BIBLIOGRAFIA

http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc16/v16_A04.
pdf

http://www.ifsc.usp.br/~donoso/espectroscopia/
RMN.pdf

Ressonncia Magntica Nuclear

Csar Maschio Fioravanti
Espectroscopia o estudo da interao da radiao
eletromagntica com a matria. Essa radiao pode ser
vista como uma onda com duas componentes, uma
eltrica
e
outra
magntica,
que
oscilam
perpendicularmente entre si, sendo ambas tambm
perpendiculares direo de propagao da luz (Figura
1). A interao entre a radiao eletromagntica e a
matria pode ocorrer de duas formas: pela sua
componente eltrica ou pela sua componente
magntica.
Uma das diferenas fundamentais entre a ressonncia
magntica nuclear (RMN) e as outras formas de
espectroscopia no fato de que essa interao se d
com o campo magntico e no com o campo eltrico,
como o caso, por exemplo, do infravermelho ou do
ultravioleta.

O momento magntico m gerado pode ser descrito em

termos do nmero de spin I, cujos valores, calculados
pela mecnica quntica podem ser 0, 1/2, 1, 3/2 etc.
Ncleos que apresentam tanto massas atmicas quanto
nmeros atmicos pares no possuem spin, sendo,
conseqentemente, o nmero de spin igual a zero. o
caso do carbono 12, oxignio 16, enxofre 32, entre
outros .Esses ncleos no tm momento angular
associado e, portanto, no exibem propriedades
magnticas, o que implica a ausncia de sinais
detectveis por RMN. Caso se deseje detectar algum
desses tomos deve-se utilizar istopos, com spin no
nulo.

Para cada tipo de espectroscopia exigido um tipo de

excitao e, para cada uma delas, existe uma quantidade
definida de energia. Isso quer dizer que uma radiao de
freqncia determinada e caracterstica absorvida para
uma determinada transio.
A RMN encontra-se na regio das ondas de rdio. Em
um campo magntico, sob determinadas condies, uma
amostra pode absorver na regio da radiofreqncia,
absoro essa dependente de caractersticas da amostra
e funo de determinados ncleos presentes na
molcula, que so sensveis radiao aplicada.

Figura 4: Ilustrao
eletromagnticas

da

propagao

de

Na ausncia de um campo magntico, os spins

nucleares esto orientados randomicamente, no
apresentando nenhuma orientao definida. Entretanto,
quando uma amostra submetida a um campo
magntico externo B0, de alta intensidade e homogneo,
os spins nucleares tendem a assumir determinadas
orientaes. Segundo a mecnica quntica, o nmero de
conformaes possveis do ncleo quando submetido a
um campo magntico vale 2S+1.

ondas

A grandeza fsica envolvida em RMN o spin nuclear.

O conceito de spin nuclear provm da Mecnica
Quntica. Esse conceito fundamental para a
compreenso do fenmeno e pode ser compreendido
como uma propriedade que determinados ncleos
apresentam. Tais ncleos, devido sua configurao
nuclear, assumem um comportamento caracterstico de
momento angular, capaz de gerar um momento
magntico (Figura 2), pois uma carga em movimento
gera um campo magntico.

Figura 5: Momento magntico gerado pelo momento angular

Figura 6: Ilustrao do alinhamento do momento magntico

ao campo B0

No caso de um ncleo com nmero de spin I = ,

apenas duas orientaes so possveis, quando h
aplicao de um campo magntico: uma parcialmente
alinhada ao campo magntico aplicado e outra
parcialmente contra. O ngulo que define a orientao

do vetor com relao a B0 tambm determinado pela

mecnica quntica (seus valores aproximados so 55 e
125).
As duas orientaes representam diferentes estados
energticos. Isso acontece porque um ncleo com spin
cria seu prprio campo magntico. Quanto mais
paralelos forem esses dois campos (o do ncleo e o
campo magntico externo), menor ser a energia desse
estado. Assim, o estado de menor energia aquele que
se encontra parcialmente alinhado com o campo e
denominado estado a (ou +), e o estado de maior
energia, o parcialmente contra, denominado estado b
(ou - ). As energias desses nveis podem ser descritas
como Ea = - B0 e Eb = B0, o que equivale a dizer que
a diferena de energia entre os dois nveis pode ser
expressa por: E = (Eb - Ea) = 2 B0. A diferena de
energia E que surge entre os dois nveis est
relacionada com vrios fatores, dentre eles, a
intensidade do campo magntico B0 aplicado: quanto
maior for o campo magntico aplicado, maior ser a
diferena de energia entre os dois nveis e maior a
diferena de populao associada a esses nveis. Isso
significa que, para uma melhor resoluo de spins
nucleares em ambientes qumicos semelhantes, so
desejveis espectrmetros com campos cada vez mais
intensos.

B0
2

que a equao fundamental utilizada em RMN e que

define a condio de ressonncia de um ncleo.
Classicamente a interao entre um ncleo com um
momento magntico m e o campo B0 faz com que o
momento magntico precesse em torno daquele eixo. A
freqncia desse movimento chamada freqncia de
Larmor, e seu valor dada pela expresso anterior. Os
dois estados energticos correspondem precesso de
m em torno do eixo, alinhado. Considerando que o
campo B0 esteja aplicado na direo z, no equilbrio, os
vetores dos momentos magnticos estaro distribudos
em dois cones, em torno dos eixos +z e.-z.

O fenmeno da RMN ocorre na regio das

radiofreqncias (MHz) e a interao da radiao
eletromagntica com a matria ocorre com a sua
componente magntica. Portanto, para se proceder a
RMN, deve ser aplicado um segundo campo magntico
(chamado de B1), proveniente de uma fonte de
radiofreqncia aplicada perpendicularmente ao campo
B0. esse segundo campo magntico que permite a
observao de absores em RMN.
Portanto, a absoro em RMN uma conseqncia das
transies entre o nvel de menor energia e o de maior
energia, possveis pela aplicao de um segundo campo
magntico na regio da radiofreqncia. O momento
angular L e o momento magntico m podem ser
representados por vetores e a proporcionalidade entre
eles chamada de constante giromagntica. Essa
constante, que determina a freqncia de ressonncia do
ncleo, constitui um parmetro muito importante em
RMN e representada por , apresentando um valor
prprio para cada ncleo, podendo ser expressa pela
relao:

= 2 / hI
onde h a constante de Plank e I o nmero quntico
de spin nuclear. Se a constante giromagntica for
positiva, como o caso dos ncleos de 1H e 13C, o
estado + representa um nvel de menor energia. Caso
a constante giromagntica seja negativa, como, por
exemplo, para o 15N, ocorre o oposto. Substituindo-se
as equaes anteriores (E=hn e =2/hI) , pode se
chegar a:

Figura 7: Cone de precesso nuclear e decaimento do sinal

de RMN aps aplicao do campo B1

Os ncleos so excitados em uma regio de freqncias

por um ou mais pulsos. Na ressonncia, o campo B1,
aplicado na forma de um pulso, faz com que alguns
ncleos absorvam energia e seus momentos magnticos
nucleares passem a precessar no plano xy. Ou seja, o
campo B1 altera a direo de precesso da
magnetizao, resultando em uma perturbao do
sistema.
A nova componente gerada no plano xy pode ser
observada com auxlio de um detector no mesmo plano
de precesso. Para isso, a fonte de radiofreqncia. deve
ser desligada. Quando isto ocorre, o sistema tende a
retornar situao original de equilbrio. Este retorno
conhecido por processo de relaxao, que faz com que
os ncleos percam o excesso de energia e retornem s
suas posies originais de equilbrio. O decaimento da
magnetizao xy para retornar sua posio de
equilbrio exponencial e d origem ao chamado sinal
FID (Free Induction Decay). Sinais da FID (Figura 4)
so detectados como uma funo do tempo,
encontrando- se a todas as informaes sobre

acoplamento e deslocamento qumico contidos em um

espectro de RMN.

metila e seu sinal ser um quarteto (3 + 1 = 4), cuja

absoro observada em torno de 3,5 ppm.

Como existem vrios ncleos em uma amostra, tambm

so originados vrios sinais de FID que se superpem,
de forma que se torna muito difcil a extrao das
informaes desejadas (Figura 14). Para que as
informaes se tornem acessveis ao usurio, ou seja,
para que a interpretao do espectro seja facilitada, os
sinais da FID so convertidos para um domnio de
freqncias de ressonncia, caractersticas de cada
ncleo, atravs de uma operao matemtica chamada
transformada de Fourier. A transformada de Fourier dos
diferentes sinais de FID d origem ao espectro de RMN
comumente analisado. Em outras palavras, um espectro
de RMN consiste de uma srie de ressonncias em
diferentes freqncias, denominadas deslocamentos
qumicos.

Nas ltimas quatro dcadas, a realizao de

experimentos de RMN em vrias dimenses elevou
bastante a capacidade de resoluo dessa tcnica,
ampliando seus horizontes de aplicao. A RMN em
duas dimenses (RMN-2D) foi proposta em 1971 e hoje
representa uma poderosa tcnica para a elucidao
estrutural de molculas orgnicas, inorgnicas e
principalmente de biomolculas. Essas molculas
apresentavam espectros de difcil interpretao
devido,principalmente, superposio de sinais ao
longo de toda a faixa espectral em uma dada regio de
freqncia. A RMN-2D possibilitou a interpretao dos
espectros dessas molculas, antes dificilmente
identificadas pelos mtodos em uma dimenso.

Os valores de deslocamento qumico em unidades de

freqncia so valores muito prximos. Por isso,
muito usual a chamada escala delta (), dada pela
relao:
=amostra 106/espectrometro

OH

CH2

CH3

Para entender as razes disso e o que um espectro de

RMN em duas dimenses, assim como o seu
processamento, necessrio compreender conceitos
como tempo de preparao, tempo de evoluo e tempo
de deteco. Tempo de preparao o perodo durante
o qual um sistema de spins preparado para atingir o
equilbrio trmico. Esse tempo pode incluir a aplicao
de um ou mais pulsos ou, simplesmente, ser um perodo
t diferente de zero; pode at mesmo nem existir,
dependendo do experimento que est sendo realizado. O
importante que o sistema de spins se encontre em
equilbrio antes que o experimento seja iniciado. O
tempo de evoluo (chamado t1) constitui o
experimento de RMN propriamente dito, durante o qual
o sistema de spins evolui fora da situao de equilbrio
pela aplicao de um ou mais pulsos, dependendo da
informao que se deseja obter. O tempo de deteco
(ou tempo de aquisio, chamadot2) o perodo durante
o qual se adquire o sinal do FID.

Figura 8: Espectro de RMN de etanol

Por meio da Mecnica Quntica, sabe-se que o

desdobramento de um sinal, por exemplo de singleto
para dupleto, (chamado de multiplicidade) pode ser
dado pela relao 2nI+1, onde n o nmero de ncleos
vizinhos em diferentes ambientes qumicos e I o
nmero de spin do ncleo que est sendo analisado.
Para ncleos com spin I = , a multiplicidade ser
dada simplesmente por (n+1).
Assim, no espectro de hidrognio do etanol (Figura 5), ,
sero observados dois sinais devidos a acoplamento
homonuclear: um relativo aos hidrognios da metila e
outro aos hidrognios do grupo CH2, uma vez que se
encontram em diferentes ambientes eletrnicos e que,
portanto, apresentaro diferentes deslocamentos
qumicos. Como a multiplicidade dada por (n+1) os
trs hidrognios da metila tm dois vizinhos (os dois
hidrognios do grupo CH2) logo, o seu sinal aparecer
no espectro como um tripleto (2 + 1 = 3), observado em
torno de 1 ppm. Analogamente, os dois hidrognios do
grupo .CH2 tm como vizinhos os trs hidrognios da

Figura 9: Espectro de RMN 2D de uma protena

Um experimento unidimensional pode apresentar esses

trs tempos. O tempo de evoluo (t1) fixo e o sinal
recebido apenas funo do tempo de deteco (t2),
que varivel. Em um experimento convencional em
uma dimenso, o tempo de evoluo t1 zero e a
deteco realizada imediatamente aps o pulso de
radiofreqncia. Os spins sofrem ao do campo B1 e o
resultado , ento, detectado. O sinal detectado no
domnio temporal (FID) transformado para o domnio
das freqncias mediante a transformada de Fourier e o
espectro resultante um grfico da amplitude pela

freqncia, chamado unidimensional porque apenas um

dos eixos corresponde a freqncias de absoro.
Em um experimento bidimensional, vlido o mesmo
raciocnio temporal. A principal diferena que existem
obrigatoriamente dois perodos variveis: o tempo de
evoluo (t1, que em um experimento 1D pode ser zero)
e o tempo de aquisio (t2). Fazendo-se uma srie de
experimentos nos quais variem progressivamente os
valores do tempo de evoluo, desde zero at t1, tem-se
duas variaes no domnio temporal: uma devida a t1 e
outra devida a t2. Se uma srie de FIDs for detectada a
partir desses experimentos nos quais se variam os
valores de t1, a transformada de Fourier ao longo de t2
dessas diferentes FIDs fornecer uma srie de espectros
1D. Se outra transformada de Fourier for realizada ao
longo de t1, ento poderemos obter um espectro
bidimensional, com sinais observados ao longo de duas
dimenses.

Figura 10: Exemplo de estruturas proticas calculadas por

RMN

Dessa forma, informaes complexas, que antes

apareciam em apenas uma dimenso (por exemplo,
hidrognios em ambientes qumicos semelhantes que
apresentam deslocamentos qumicos muito prximos),
aparecem agora em duas dimenses, facilitando a
interpretao do espectro para determinao da
estrutura molecular.

REFERNCIAS:

Harris, R.K. Nuclear Magnetic Resonance . A

Physicochemical View Longman Scientific &
Technical, England,1986.

Concepts in Magnetic Resonance,1989, 1, 7-13 ,

Daniel D.

http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/inside.htm

http://www.uff.br/fisicoquimica/docentes/
katialeal /didatico/Capitulo8.pdf

Ressonncia Magntica Nuclear por Tensor de Difuso

Rafael Tuma Guariento

INTRODUO
Desde sua criao em 1938, a Ressonncia Magntica
Nuclear tem revolucionado diversas reas da cincia,
indo desde a determinao da estrutura e o estudo da
dinmica de molculas pequenas (Frtig et. al., 2003)
at a criao e novos conceitos em neurocincias
(Logothetis et. al., 2001), sem contar, claro, a ampla
gama de aplicaes clnicas em medicina.
De maneira geral, a tcnica consiste em provocar
transies entre diferentes estados nucleares, tirando o
sistema do equilbrio, e ento medir seu decaimento
para o estado estacionrio, se assemelhando, grosso
modo, s tcnicas espectroscpicas que utilizam o
conceito de transio eletrnica.
Com uma grande quantidade de tipos e escaneamento,
h diversas implementaes instrumentais dessa
tcnica, que apesar de compartilharem o mesmo
princpio fsico, so especficas para cada aplicao.
Devido a este fato, neste trabalho optamos por tratar
somente o mecanismo fsico bsico e nos
aprofundarmos somente na tcnica de Ressonncia
Magntica Nuclear por Tensor de Difuso.

PRINCPIOS
FSICOS
BSICOS
RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR

DA

Para que seja possvel aplicar a tcnica de Ressonncia

Magntica Nuclear, necessrio que no sistema exista
um tomo com spin nuclear total no nulo. Por razes
de quantidade e de intensidade do sinal, em geral se
utiliza o tomo de hidrognio. Esta escolha adequada
para muitas aplicaes mdicas, dado que os sistemas
biolgicos so ricos em gua, e sua medida pode
fornecer informaes valiosas sobre o funcionamento
do organismo.
O ncleo atmico, por ser um corpo muito massivo
(~1836 vezes mais massivo que o eltron) necessita de
energias muito elevadas para que seja possvel observar
sua resposta a campos externos aplicados. Logo, como a
inteno medir os spins destas partculas, necessrio
criar campos magnticos muito intensos para conseguir
um nmero razovel de spins alinhados. Idealmente,
espera-se criar um campo tal que todos os spins estejam
alinhados com o campo. Para isso necessrio termos a
seguinte relao:

Este mtodo pode ser dividido em duas subcategorias

de imageamento:
Imagem ponderada de difuso;
Sendo o magneton de Bohr normalizado para a massa
do prton. A verificao desta propriedade pode ser
vista da Demonstrao 1.

Imagem de tensor de difuso.

O primeiro, mais simples, cria uma imagem
tridimensional em que cada voxel(pixel tridimensional)
tem uma intensidade proporcional difuso da gua
naquele local, considerando que esta se difunde de
maneira isotrpica pelo meio. O segundo leva em
considerao anisotropias inerentes ao meio, e fornece
alm do coeficiente de difuso no local, a direo
preferencial em que a gua se difunde, permitindo assim
a visualizao de interfaces entre estruturas no corpo.
Este mtodo permitiu a realizao de um procedimento
conhecido como tractografia in vivo, possibilitando o
diagnstico
de
leses
cerebrais,
alm
do
desenvolvimento de importantes estudos em
neurocincia cognitiva (Filler, 2010).

gradiente espacial na intensidade do campo aplicado

(Figura 1). Feito isso, sabemos que, em mdia, metade
dos spins dos ncleos dos tomos de hidrognio esto
alinhados paralelamente ao campo. Ento, emitido um
pulso de radiofrequncia sintonizado justamente na
diferena entre os nveis em uma dada fatia do
paciente. Isso faz com que alguns poucos spins
invertam o sinal do seu spin de paralelo para
antiparalelo, e eventualmente criando uma componente
do spin no plano X-Y (este fato no foi includo no
modelo da demonstrao), tirando assim o sistema do
seu estado estacionrio.

Demonstrao 1: Com um campo magntico

suficientemente intenso, possvel ter todas as
partculas alinhadas com o campo.
Calculando o valor do campo magntico aplicado para
termos tal situao, temos:

Como alcanar tal valor tarefa impraticvel,

calculamos o percentual de molculas que estaro
alinhadas com o campo na situao de um campo da
ordem de 1T:
Que um nmero razovel de tomos, garantindo um
bom alinhamento.
Ao alinhar os tomos com o campo magntico externo,
so criados dois estados qunticos, um paralelo e um
antiparalelo, com uma diferena energtica de 2B. Esta
diferena energtica, em unidades de frequncia, dada
por:

Figura 1: Um campo magntico aplicado linearmente sobre

o paciente, de tal maneira que cada seco transversal deste
possui uma frequncia de Larmor caracterstica, permitindo
sintonizar a ressonncia das molculas com a onda
eletromagntica aplicada.

Por estar fora do seu estado de equilbrio

termodinmico, o sistema passa a apresentar uma
dinmica de decaimento exponencial para retornar ao
mesmo, com uma constante de relaxao T1 para os
spins no estado antiparalelo, e T2 para as componentes
de spin no plano X-Y (Figura 2). Esta dinmica foi
modelada por Felix Bloch em 1946, cujas equaes
esto apresentadas na Figura 3 para o caso de um
campo magntico alinhado com o eixo , possuem um
papel fundamental para o imageamento por tensor de
difuso.

Que uma frequncia passvel de ser alcanada por

equipamentos emissores de radiofrequncia!
Tendo em mos estas informaes, estamos preparados
para explicar o funcionamento bsico do mtodo de
Ressonncia Magntica Nuclear.
Inicialmente o paciente colocado no interior de um
solenoide supercondutor que gera um campo magntico
da ordem de 1 T. Um outro circuito a parte gera um
outro campo magntico de menor intensidade (~ alguns
mT), que cresce linearmente pelo paciente, criando um

Figura 2: Perfil energtico dos spins nucleares dos tomos de

hidrognio antes e depois da aplicao do campo magntico
externo. T1 e T2 so os tempos de decaimento dos estados
nucleares aps a excitao com ondas de rdio.

ao invs de chamar 'D' de coeficiente de difuso, o

chamamos de Coeficiente de Difuso Aparente(ADC
do ingls Apparent Diffusion Coefficient). Esta
medida a base do prximo mtodo que ser discutido.

IMAGEM POR TENSOR DE DIFUSO

Figura 3: Equaes de Bloch a razo giromagntica do
tomo em questo (no caso do hidrognio)

RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR POR

TENSOR DE DIFUSO

IMAGEM PONDERADA POR DIFUSO

Em 1956, H.C. Torrey modificou a equao de Bloch da
magnetizao transversal para incluir termos que
levassem em conta a difuso das molculas que contm
os tomos de hidrognio. A nova verso da equao,
desconsiderando o termo de relaxao ficou com a
seguinte forma:

Sendo G o gradiente do campo magntico aplicado e D

o tensor de difuso da molcula no meio. No caso de
uma difuso isotrpica no meio, a equao pode ser
solucionada, permitindo isolar o coeficiente de difuso
do meio, caso a magnetizao seja conhecida. Para tal
feito, emitido um pulso eletromagntico cuja
frequncia varia linearmente com a posio, fazendo
com que os ncleos se alinhem, porm tenham
frequncias de precesso distintas, levando a uma
disperso do sinal. Aps um determinado intervalo de
tempo, emitido outro pulso, porm com sentido
oposto ao original, fazendo com que os tomos se
realinhem, porm no sentido oposto. No entanto, esta
refocalizao no ser perfeita, visto que os tomos se
moveram devido difuso das molculas. Utilizando a
soluo da equao de Bloch-Torrey, a perda na
intensidade do sinal entre o primeiro e o segundo pulso
fica dada por:

Sendo assim, possvel encontrar o valor do coeficiente

de difuso em cada caixinha do espao
tridimensional. Cada uma destas caixinhas chamada
de voxel.
No caso da difuso no meio em questo no ser
isotrpica, isto ocorre, por exemplo, prximo a
membranas celulares ou na interface de vasos
sanguneos e rgos, medido, na verdade, uma
projeo da difuso em uma dada direo. Neste caso,

Em 1990, Michael Moseley observou que a difuso da

gua na substncia branca cerebral era anisotrpica,
indicando que esta deveria ser modelada por um
Tensor de Difuso. Logo aps esta descoberta, em
1991, Aaron Filler e colegas conseguiram criar a
primeira imagem dos tratos neurais utilizando a
anisotropia da difuso da gua, cuja patente foi
publicada em 1992.
A tcnica consiste em uma simples ampliao do
mtodo de imageamento ponderado por difuso, em que
se repete o exame ao menos 6 vezes em ngulos
distintos, e pelas medidas do Coeficiente de Difuso
Aparente, tenta-se reconstruir o tensor de difuso em
cada voxel espacial. A partir destes dados, possvel, a
partir dos autovetores da representao matricial do
tensor de difuso, mensurar a direo preferencial de
descolamento das molculas de gua. Assim, para gerar
a imagem tridimensional que ser analisada pelo
mdico, associada a cada direo de deslocamento
uma determinada cor (Veja tabela 1). importante notar
que apenas a direo pode ser determinada, o mtodo
no fornece nenhum tipo de informao sobre o sentido
de difuso.
Tabela 1
Cor

Direo

Vermelho

Esquerda/Direita

Verde

Anterior/Posterior

Azul

Base/Topo

Um resultado de um exame realizado por esta tcnica

pode ser visto na figura 4.

Figura 4: Resultados de um exame de Ressonncia Magntica

Nuclear por Tensor de Difuso. esquerda: Crebro inteiro
visualizado colorido com o cdigo de pseudo-cores citado. No
centro: Um subconjunto do trato neuronal da substncia
branca do crebro. direita: Voxels pseuso-coloridos.
Retirado de Brun, A. et al., 2004

importante notar que devido ao grande nmero de

vezes em que deve ser repetida a medida do Coeficiente
de Difuso Aparente no h resoluo temporal neste
exame, e so obtidos somente dados mdios sobre a
difuso do fluido intraneuronal.

CONCLUSO

2.

As tcnicas descritas neste trabalho so capazes de

fornecer informaes importantes a respeito do
funcionamento de rgo e deteco de diversos tipos de
patologias e leses. Em particular, o Imageamento
Ponderado por Difuso tem sido um forte candidato
para substituir o exame de Tomografia por Emisso e
Psitrons (PET Scan) no diagnstico de certos tipos de
cncer. Alm disso, o Imageamento por Tensor de
Difuso fornece informaes de como as diferentes
regies do crtex cerebral se interconectam, dado que
pode trazer uma contribuio importante para a
neurocincia cognitiva, dado que agora h um mapa de
conexes das reas de processamento do crtex do
Sistema Nervoso Central. Alm disso, este tipo de
imageamento tem sido utilizado para o diagnstico de
leses no trato nervoso devido a doenas como
epilepsia (ver MacDonald et. al., 2011 e Ropper. et. al.,
2011).

3.

REFERNCIAS
1.

Brun, A., Knutsson, H., Park, H.-J., Shenton,

M.E. & Westin, C.-F. Clustering Fiber Traces
Using Normalized Cuts. Lecture Notes in
Computer Science 3216/2004, 368-375 (2004).

2.

Filler, Aaron (2010). "The History, Development

and Impact of Computed Imaging in
Neurological Diagnosis and Neurosurgery: CT,
MRI, and DTI". Internet Journal of
Neurosurgery 7 (1).

3.

Frtig, B., Richter, C., Whnert, J. and

Schwalbe, H. (2003), NMR Spectroscopy of
RNA.
ChemBioChem,
4: 936962.
doi: 10.1002/cbic.200300700

4.

Logothetis NK, Pauls J, Augath M, Trinath T,

Oeltermann A. (July 2001). "Neurophysiological
investigation of the basis of the fMRI signal".
Nature
412
(6843):
1507.
doi:10.1038/35084005. PMID 11449264.

5.

MacDonald CL, Johnson AM, Cooper, D, et al

(2011). "Detection of blast-related traumatic
brain injury in U.S. military personnel". New
England Journal of Medicine 364: 20912100.

6.

Ropper A (2011). "Editorial: Brain injuries from

blasts". New England Journal of Medicine 364:
21562157.

BIBLIOGRAFIA AUXILIAR
1.

http://en.wikipedia.org/

http://www.howstuffworks.com/
ANDRADE, Katia Cristine. Dinmica da
alterao perfusional induzida por estado de
apnia utilizando fMRI [en lnea]. Ribeiro Preto
: Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras de
Ribeiro Preto, Universidad de So Paulo, 2006.
Disertacin de Maestra en Fsica Aplicada
Medicina e Biologia. [citado 2011-11-25].
Disponible
en
Internet:
<http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59
135/tde-20042010-100103/>.

Espectroscopia Raman
Carolina de Paula Campos
INTRODUO

EFEITO RAMAN

Quando uma molcula irradiada, a energia dos ftons

da fonte pode ser transmitida, absorvida, ou espalhada.
A espectroscopia Raman baseada na deteco da luz
espalhada, geralmente tendo por fonte de radiao o
laser. O espalhamento de radiao eletromagntica
ocorre, porque o campo eltrico oscilante da radiao
induz oscilao de eltrons na molcula, que por sua
vez emite radiao eletromagntica. O espalhamento
pode ser elstico, ou seja, os eltrons espalhados tm a
mesma energia (freqncia) e, portanto, mesmo
comprimento de onda, que o feixe de ftons incidente.
Este processo chamado de espalhamento Rayleigh. No
entanto, uma pequena frao da luz espalhada
inelasticamente, ou seja, em freqncias diferentes, os
ftons podem ganhar ou perder parte de sua energia
durante o processo de espalhamento. Essa diferena de
energia igual energia de uma transio que a
molcula sofre em resposta, podendo ser uma transio
eletrnica, rotacional ou vibracional. Este processo
denominado o efeito Raman.

Na mecnica quntica o espalhamento descrito

como uma excitao para um estado virtual com energia
mais baixa do que uma verdadeira transio eletrnica,
com retorno ao estado no excitado e com uma
mudana na energia vibracional (figura1).

A espectroscopia Raman uma tcnica espectroscpica

baseada nesse efeito e pode ser utilizada para estudar
amostras slidas, lquidas e gasosas.

HISTRIA
Embora o espalhamento inelstico de luz tenha sido
predito por Adolf Smekal em 1921, somente em 1928
que foi observado na prtica. O efeito Raman foi
nomeado aps um de seus descobridores, o cientista
indiano Sir Chandrasekhara Venkata Raman observou o
efeito por meio da luz do sol (1928, juntamente com K.
S. Krishnan e independentemente por Grigory
Landsberg e Leonid Mandelstam). Raman ganhou o
Prmio Nobel em Fsica em 1930 por esta descoberta
realizada utilizando luz solar, um filtro de banda estreita
fotogrficas para criar luz monocromtica, e um "filtro
cruzado" para bloquear esta luz monocromtica. Ele
descobriu que uma pequena quantidade de luz tinha
mudado de freqncia e passou atravs do filtro
"cruzado". A teoria sistemtica do efeito Raman foi
desenvolvida pelo fsico da Checoslovquia George
Placzek entre 1930 e 1934. O arco de mercrio tornouse a fonte de luz principal, primeiro com a deteco de
fotografia
e,
em
seguida,
com
deteco
espectrofotomtrica. No presente momento, lasers so
usados como fontes de luz.

O espalhamento Raman (ou efeito Raman) baseado

em deformaes no campo eltrico e determinado pela
polarizabilidade molecular . O feixe de laser pode ser
considerado como uma onda eletromagntica oscilante
com campo eltrico igual a E0. Aps a interao com a
amostra, um momento de dipolo eltrico P = E0
induzido, deformando as molculas e as transformando
em dipolos oscilantes. O dipolo oscilante afeta a
amplitude da onda de luz incidente fazendo com que
essa amplitude flutue com a freqncia da vibrao. O
campo eltrico da onda espalhada descrito na Equao
1 a seguir:

(1)
Onde:
E0 = feixe de radiao incidente
= polarizabilidade da partcula (facilidade de
distoro da densidade eletrnica)
= comprimento de onda da radiao incidente
= angulo entre o raio incidente e espalhado
Observa-se que h mais espalhamento
comprimentos de onda mais baixos

em

Assim, a luz espalhada pode ter trs diferentes tipos de

energia, o que significa trs diferentes frequncias que
so descritas a seguir:

Mesma frequncia: Quando uma molcula

irradiada com ftons de freqncia 0 (energia h0), ela
excitada e retorna para o mesmo estado vibracional
base emitindo luz de mesma freqncia 0 (energia h0)
que a fonte de excitao. Este tipo de interao
chamado de espalhamento Rayleigh (elstico) (figura
1).

Menor frequncia: Quando uma molcula que

est no estado vibracional base irradiada com ftons
de freqncia 0, parte da energia (hi) do fton
transferida para transio vibracional e a freqncia
resultante da luz espalhada reduzida a 0 - i. Esta
freqncia chamada Raman Stokes, ou apenas
"Stokes" (inelstico) (figura 2).


Maior frequncia: Quando uma molcula j
est no estado vibracional excitado e irradiada com
ftons de frequncia 0, a energia do estado vibracional
excitado liberada, a molcula retorna ao estado
vibracional base e a frequncia resultante da luz
espalhada 0 +i. Esta freqncia chamada Raman
Anti-Stokes,
ou
simplesmente
"Anti-Stokes"
(inelstico) (figura 3).

Figura 2: Esquema do espectro Raman

Figura 1: Tipos de energias emitidas aps espalhamento.

ESPECTRO RAMAN
A maioria dos ftons incidentes que so espalhados pela
amostra no apresenta nenhuma alterao na frequncia.
Apenas uma pequena parte, aproximadamente 1 em
107 ftons tem sua frequncia modificada. No espectro
Raman, que mostra o deslocamento Raman pela
Intensidade Raman, tem-se simetricamente em relao
linha Rayleigh (em escala de cm-1) uma banda do lado
de freqncias mais baixas, a Stokes, e uma do lado de
freqncias mais altas, a anti-Stokes (figura 2).
Numericamente, o deslocamento Raman em nmeros de
onda (cm-1), calculado atravs da Equao 2:

Onde o comprimento de onda (em cm) dos ftons

incidentes e espalhados.
Uma vez que as molculas existem em diferentes
estados rotacionais e vibracionais (dependendo da
temperatura), muitos valores diferentes de i so
possveis. Conseqentemente, o espectro Raman ser
composto por um grande nmero de linhas espalhadas.
Para melhorar a observao da radiao em 0 i, a
radiao espalhada observada perpendicular ao feixe
incidente. Para fornecer alta intensidade da radiao
incidente e permitir a observao de linhas onde i
pequena (como quando devido a mudanas de rotao),
a fonte em um espectrmetro Raman geralmente um
laser monocromtico na regio do visvel.

INSTRUMENTAO
Um sistema de espectroscopia Raman normalmente
consiste em quatro componentes principais:
1. Fonte de excitao (laser).
2. Sistema de iluminao da amostra e coleta ptica de
luz.
3. Seletor de comprimento de onda (filtro ou
espectrofotmetro).
4. Detector (Fotodiodo Array, CCD ou PMT).
A amostra normalmente iluminada com um feixe de
laser no ultravioleta (UV), visvel (Vis) ou faixa do
infravermelho prximo (NIR). A luz dispersada
coletada com uma lente e enviada atravs do filtro de
interferncia ou espectrofotmetro para obter o espectro
Raman de uma amostra. Do fato de o espalhamento
Raman espontneo ser muito fraco, a principal
dificuldade da espectroscopia Raman separar este do
espalhamento Rayleigh intenso. Mais precisamente, o
grande problema que o espalhamento Rayleigh pode
exceder muito a intensidade do sinal Raman til nas
proximidades do comprimento de onda do laser. Em
muitos casos o problema resolvido simplesmente
eliminando uma faixa espectral prxima linha do
laser, onde a luz difusa tem o efeito mais proeminente.
Existem filtros que eliminam faixa espectral de 80120 cm-1 a partir da linha laser. Este mtodo eficiente
na eliminao de luz difusa, mas no permite a deteco
de modos Raman de baixa freqncia na faixa abaixo de
100 cm-1. Luz difusa gerada no espectrmetro
principalmente pela disperso da luz em grades e
depende
fortemente
da
qualidade
destas.
Espectrmetros Raman tipicamente usam grades
hologrficas que normalmente tm muito menos
defeitos de fabricao em sua estrutura. Luz difusa
produzida por grades hologrficas de cerca de uma

ordem de magnitude menos intensa que grades de linha

de mesma densidade de sulco.
Usar mltiplos estgios de disperso outra forma de
reduo de luz difusa. Espectrmetros de estgios
duplos e triplos permitem a obteno espectros Raman
sem o uso de filtros. Em tais espectrmetros, modos
com freqncias to baixas quanto 3-5 cm-1 podem ser
eficientemente detectados.
Antigamente usavam-se principalmente detectores de
nico ponto, tais como Tubos Fotomultiplicadores
(PMT) de contagem de ftons. No entanto, um espectro
Raman obtido com um detector PMT no modo de
varredura nmero de ondas, levava um perodo de
tempo substancial, retardando pesquisas ou atividades
industriais baseadas na tcnica analtica de Raman.
Atualmente, mais e mais vezes pesquisadores usam
detectores multi-canal, como Fotodiodo Arrays (PDA)
ou, mais comumente, um Charge Coupled Devices
(CCD) para detectar a luz do espalhamento Raman.

RAMAN X INFRAVERMELHO (IR)

A observao do espectro vibracional Raman de uma
molcula depende de uma mudana na polarizabilidade
molculas (capacidade de ser distorcido por um campo
eltrico) ao invs de seu momento de dipolo durante a
vibrao dos tomos, como na espectroscopia IR. Como
resultado, espectros de infravermelho e Raman
fornecem informaes complementares (figura 3), e
com as duas tcnicas, todas as transies vibracionais
podem ser observadas. Esta combinao de tcnicas
essencial para a medio de todas as freqncias de
vibrao das molculas de alta simetria que no tm
momentos de dipolo permanente.

sinal uma comparao entre a intensidade antes e

depois da amostra. A espectroscopia Raman, porm,
no tem medida de comparao: a intensidade do sinal
Raman pode ser melhorada atravs de radiao mais
intensa. Em espectroscopia Raman a radiao utilizada
no precisa ser igual a uma energia de uma transio
permitida, uma vez que praticamente toda a radiao
capaz de ser dispersa. Enquanto em espectroscopia IR
se usa uma fonte policromtica, em espectroscopia
Raman se usa uma fonte monocromtica para evitar a
sobreposio de linhas provenientes do espalhamento
com as linhas da fonte, porque a freqncia da fonte
dispersa e, portanto, detectada tambm.
Algumas das aplicaes para as quais a espectroscopia
Raman prefervel a espectroscopia IR so:

Investigao de linhas em nmeros de onda

baixos (400-100 cm-1) que muito mais simples com
Raman do que com IR. Estas linhas so de importncia
no estudo de complexos e de ligaes de hidrognio.

Estudos em soluo aquosa, visto que a gua

pouco Raman ativa, ou seja, pouco espalhadora.
Especialmente para molculas carregadas e complexas,
isso valioso, uma vez que nenhum bom espectro IR
pode ser obtido para estas substncias em soluo.

Vibraes totalmente simtricas como as de

molculas diatmicas homo nucleares so Raman
ativas, mas IR inativas. Outro exemplo de vibraes
simtricas so as ligaes metal-metal em complexos
multi nucleares, mas vibraes de ligaes duplas e
triplas de carbono-carbono so tambm altamente
simtricas e com espectroscopia Raman pode-se obter
muito mais informaes sobre eles (por exemplo,
densidade de eltrons no sistema ) do que com a
espectroscopia IR.
Algumas vantagens e desvantagens da espectroscopia
Raman em relao a IR so mostradas na tabela 1:
Tabela 1: Vantagens e desvantagens da espectroscopia
Raman.

Figura 3: Espectro IR e Raman para 2,5-Dicloroacetofenona.

As principais diferenas entre IR e

espectroscopia Raman entre absoro e espalhamento.
Na espectroscopia de IR s a radiao com o nmero de
onda adequado absorvida, isso significa que somente
ftons com uma energia E= h que corresponde a uma
transio permitida pode causar um sinal. Alm disso, o

Vantagens

Desvantagens

pticasimples

Instrumentos
relativamentecaros

Quasenenhumalimitao
natemperatura

Resoluoespectral
baixa(UVeVis)

Designverstilde
clulas(quartzoevidro
permitido)

Difcilquantificao
(limitadaacatlise
heterognea)

Quantidademuito
pequena(picograma)de
amostrapossvel

Estruturadoanalito
afetadapelaalta
energiadolaser(p.e.
UVRaman)

guanointerfere

Fluorescncia

Sensveismicrocristais
(<4nm)

realmente necessrio. Um filtro de interferncia de

banda larga e um detector atrs do filtro poderiam fazer
o trabalho.

Resoluoespacial(1m)

Fibraptica

Em maiores detalhes, na tcnica CARS dois feixes de

laser com frequncias 1 e 2 (1>2) interagem de
forma coerente, e por causa da onda de mistura,
produzem uma forte luz espalhada de freqncia 21-2.
Se a diferena de freqncia entre dois lasers 1-2
igual frequncia um de um modo Raman ativo
rotacional, vibracional ou qualquer outra modalidade,
em seguida, uma luz forte de frequncia 1+i emitida.

TCNICAS QUE UTILIZAM O EFEITO RAMAN

Sinal Raman normalmente muito fraco e melhorias
nas tcnicas de espectroscopia Raman so feitas
constantemente. Muitos jeitos diferentes de preparao
de amostras, de iluminao da amostra e de deteco de
luz dispersa foram inventados para aumentar a
intensidade do sinal Raman. Algumas tcnicas que
utilizam o efeito Raman com modificaes so:
Raman estimulado
Verificou-se que se a amostra for irradiada com um
pulso de laser muito forte, novos fenmenos "nolinear" so observados no sinal Raman. Em comparao
com lasers de onda contnua com campo eltrico de
cerca de apenas 104 Vcm -1, lasers pulsados com
campo eltrico de cerca de 109 Vcm-1 transformam
uma parcela muito maior da luz incidente em
espalhamento Raman til e melhoram substancialmente
o sinal-rudo.
Espalhamento Raman estimulado um exemplo de
espectroscopia Raman "no-linear". Um pulso de laser
muito forte com campo eltrico >109 Vcm-1 transforma
at 50% de toda a energia de pulso do laser em feixe
coerente de frequncia Stokes 0-i.
O feixe de Stokes unidirecional com o feixe de laser
incidente. S o modo i que o mais forte do Espectro
Raman normal muito amplificado. Todos os outros
modos Raman ativos mais fracos no esto presentes. A
freqncia de Stokes to forte que age como uma
fonte de excitao secundria e gera a segunda linha
Stokes com freqncia 0-2i. A segunda linha Stokes
gera a terceira com a freqncia 0-3i, e assim por
diante. A tcnica Raman estimulado gera 4-5 ordens de
aprimoramento de magnitude do sinal Raman em
comparao com o espalhamento Raman espontneo.
CARS
Coerente Anti-Stokes Raman, do ingls Coherent AntiStokes Raman, CARS, outro tipo de espectroscopia
Raman "no-linear". Em vez de o tradicional laser
nico, dois lasers colineares muito fortes irradiam uma
amostra. A freqncia do primeiro laser geralmente
constante, enquanto a freqncia do segundo pode ser
ajustada de forma que a diferena de freqncia entre os
dois lasers equivale exatamente a frequncia de algum
modo Raman ativo de interesse. Este modo particular
ser o nico modo extremamente forte no sinal Raman.
Com CARS, pode-se obter apenas um forte pico Raman
de interesse. Neste caso, um monocromador no

Em outras palavras, para obter sinal Raman forte a

frequncia do segundo laser deve ser ajustada de forma
a 2 = 1 - i. Ento a frequncia da luz forte espalhada
ser 21 - 2 = 21 (1 - i) = + 1 i, que maior que a
frequncia de excitao 1 e, portanto, considerada
freqncia Anti-Stokes. O nome Espectroscopia
Coerente Anti-Stokes Raman deriva do fato de que ela
usa dois feixes de laser coerentes e o sinal resultante
tem freqncia Anti-Stokes.
Ressonncia Raman (RR)
Muitas substncias, especialmente as coloridas, podem
absorver energia do feixe de laser e gerar forte
fluorescncia que contamina espectro Raman. Este um
dos problemas centrais em espectroscopia Raman
especialmente quando lasers UV so usados.
No entanto, verificou-se que sob certas condies,
alguns tipos de molculas coloridas podem produzir
forte espalhamento Raman em vez de fluorescncia.
Este efeito foi chamado de ressonncia Raman.
O efeito de ressonncia Raman ocorre quando a
freqncia do laser de excitao escolhida de
forma que atravessa freqncias de estados eletrnicos
excitados e ressoa com eles. A intensidade das bandas
Raman que se originam a partir de transies
eletrnicas entre os estados so reforadas de 3 a
5 ordens de magnitude. Nem todas as bandas do
espectro Raman espontneo so reforadas. O grupo
chamado cromforo, que responsvel pela colorao
da molcula, experimenta o mais alto nvel de reforo.
A razo que normalmente o grupo cromforo tem o
maior nvel de absoro da luz.
A maior intensidade de sinal de ressonncia Raman
obtido quando a freqncia do laser igual ao primeiro
ou segundo o estado eletrnico excitado. Portanto,
lasers sintonizveis so a escolha mais apropriada para
a tcnica de RR. Mesmo quando a freqncia do laser
no corresponde exatamente aos estados eletrnicos
excitados desejados, uma melhoria impressionante do
sinal Raman ocorre.
SERS e SERRS
Espectroscopia Raman Superfcie-Aprimorada, do
ingls Surface Enhanced Raman Spectroscopy, SERS,
utiliza o seguinte efeito. Sinal Raman de molculas

adsorvidas em certas superfcies metlicas pode ser de 5

a 6 ordens de magnitude mais forte que o sinal Raman
das mesmas molculas no volume de massa.
A razo exata para a melhoria drstica ainda est em
discusso. No entanto, uma vez que a intensidade do
sinal Raman proporcional ao quadrado do momento
de dipolo eltrico P = E, h duas possveis razes - o
reforo da polarizabilidade , e a valorizao do campo
eltrico E.
A primeira melhoria da polarizabilidade pode ocorrer
devido a um efeito de transferncia de carga qumica ou
formao de vnculo entre a superfcie do metal e das
molculas sob observao. Este o chamado
aprimoramento qumico.
O segundo leva em conta a interao do feixe de laser
com irregularidades na superfcie do metal, tais como
micro-partculas de metal ou perfil de rugosidade.
Acredita-se que a luz do laser excita eltrons de
conduo na superfcie de metal levando a uma
ressonncia de plasma de superfcie, valorizando
fortemente o campo eltrico E. tambm chamado de
aprimoramento eletromagntico. Em todos os casos a
escolha adequada do substrato de superfcie muito
importante. Os substratos universais mais populares e
usados para SERS so eletrodos de prata
eletroquimicamente gravados, assim como colides de
prata e ouro, com tamanho mdio de partcula abaixo de
20 nm.
Uma desvantagem do SERS a dificuldade de
interpretao de espectros. O reforo do sinal to
drstico que as bandas Raman que so muito fracas e
imperceptveis nos espectros Raman espontneos
podem aparecer em SERS. Alguns contaminantes
podem tambm contribuir com picos adicionais. Por
outro lado, por causa de interaes qumicas com a
superfcie do metal, certos picos que so fortes no
Raman convencional podem no estar presentes em
SERS. O carter no-linear de intensidade de sinal em
funo da concentrao complica ainda mais as coisas.
Uma considerao muito cuidadosa de todos os fatores
fsicos e qumicos deve ser feita ao interpretar espectros
SERS, o que o torna extremamente difcil para uso
prtico.
A tcnica SERRS, Espectroscopia de Ressonncia
Superfcie-Aprimorada, do ingls Surface Enhanced
Resonance Raman Spectroscopy, foi desenvolvida por
causa de tais complicaes. Ela utiliza tanto o efeito de
superfcie aprimorada quanto o efeito de ressonncia
Raman para a valorizao resultante da intensidade do
sinal Raman ser to alta quanto 1014. A principal
vantagem do SERRS que seus espectros se
assemelham muito com os espectros regulares de
Ressonncia Raman, o que os torna muito mais fceis
de interpretar.

CARACTERSTICAS GERAIS

A espectroscopia Raman uma tcnica

complementar ao infravermelho.

Assim como o infravermelho, o espectro

Raman pode ser utilizado para identificao
(fingerprint).

Fornece informaes sobre vibraes homo

nucleares sintticas como os estiramentos C=C e S=S
que so fracas ou inativas no infravermelho.

Os anis aromticos possuem bandas fortes.

As amostras precisam de pouca ou nenhuma

preparao.

uma tcnica no destrutiva, anlise in

situ.

O vidro um bom material para ser usado em

medidas por Raman.

No requer acessrios especiais.

No h interferncia de umidade.

APLICAES
Embora, com uma profundidade de amostragem de 1
mm ou mais, a espectroscopia Raman no
intrinsecamente uma tcnica de superfcie, ela oferece
vrias vantagens. Uma vez que a anlise no precisa
ser realizada no vcuo, existem anlises que so
possveis com essa tcnica que no seriam possveis
com outras tcnicas de superfcie, todas as
quais requerem que a amostra esteja em vcuo. A
espectroscopia
Raman tambm
diferencia entre a
mesma molcula em diferentes formas cristalinas, pois
o ambiente de trelias em um cristal pode ter energias
vibracionais nicas.
A sensibilidade da espectroscopia Raman muito
varivel, e sua utilidade altamente diversificada.
Alguns compostos so dispersores Raman muito fortes
e podem ser identificados em camadas superficiais
muito finas ou em partculas muito pequenas, enquanto
outros so to fracos a ponto de serem indetectveis.
A espectroscopia Raman vem sendo aplicada com xito
na anlise de uma ampla gama de materiais e sistemas.
Algumas das reas de aplicao esto descritas a seguir:

Indstria Farmacutica

o
Fases do produto farmacutico, design e
processo de produo;
o
Fiscalizao e controle de processos de
fabricao.

Carbono e Diamante

o
Controle de qualidade de Carbono diamante
revestimentos;
o
Caracterizao da estrutura;
o
Quiralidade dos nanotubos de carbono.

Material Cientfico

o
Combinao de microscopia eletrnica de
varredura e microRaman.

Gemologia, Geologia e Mineralogia

o
Utilizados para identificar se diamantes foram
tratados artificialmente a alta temperatura e presso.

Cincia Forense

Identificao de substncias desconhecidas.

Nanotecnologia

o
Classificar o dimetro dos nanotubos de
carbono

Arte e Patrimnio

o
Compreende os materiais originais (tintas,
pigmentos, lacas, etc) do objeto a ser restaurado.

Biolgicas e Biomdicas

o
Distinguir entre clulas cancerosas e prcancerosas e tecidos normais.
o
Estudos de molculas orgnicas cclicas, j que
a espectroscopia Raman capaz de produzir
informaes sobre o tamanho do anel.
o
Estudos de molculas biolgicas sob condies
fisiologicamente significantes, por exemplo, o estado de
oxidao e de spin dos tomos de ferro na hemoglobina
e no citocromo-c podem ser determinados.

REFERNCIAS

http://www.vanbokhoven.ethz.ch/education/D.F
3
http://www.renishaw.co.pt/pt/aplicacoes-daespectroscopia-raman--6259
http://www.metalmat.ufrj.br/seminarios/PErkinE
lmer_Raman_AGO2008.PDF
http://www.qmc.ufsc.br/~lab313/qmc_5131/aula
ramancurta.pdf
http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Im
ages/44-74565MAN_Raman20Questions.pdf
http://content.piacton.com/Uploads/Princeton/Do
cuments/Library/UpdatedLibrary/Raman_Spectr
oscopy_Basics.pdf
http://www.britannica.com/EBchecked/topic/145
4108/surface-analysis/277285/Ramanspectroscopy?anchor=ref996942
http://www.britannica.com/EBchecked/topic/558
901/spectroscopy/80630/Ramanspectroscopy?anchor=ref620367
http://www.seara.ufc.br/especiais/fisica/raman/ra
man3.htm
http://en.wikipedia.org/wiki/Raman_spectroscop
y
http://instructor.physics.lsa.umich.edu/advlabs/Raman_Spectroscopy/Raman_spect.pdf

Espectroscopia Raman
Eduardo Cocca Padovani
INTRODUO
A espectroscopia Raman uma tcnica baseada no
espalhamento inelstico de ftons, que permite em
poucos segundos obter informao qumica estrutural
de quase qualquer material, seja ele orgnico ou
inorgnico, permitindo assim sua identificao.
A tcnica consiste na anlise da luz dispersa por um
material quando incidimos sobre ele um feixe
monocromtico. Uma pequena parte da luz dispersada
inelasticamente sofrendo pequenas mudanas na
frequncia que so caractersticas do material analisado
e independem da frequncia da luz incidente. Esta
uma tcnica de anlise que feita diretamente sobre o
material, sem precisar de nenhum tipo de preparao
especial, tambm no danifica a amostra, ou seja, uma
tcnica no destrutiva.

possuem mesma frequncia e comprimento de onda que

os ftons incidentes, ou inelstico (Raman),quando
ento acontece transferncia de energia entre o fton e o
sistema.
Este
ltimo
espalhamento
ocorre
aproximadamente na proporo de um a cada 10
milhes de ftons incidentes.
Existem dois tipos de espalhamento Raman:
espalhamento Stokes quando o fton espalhado possui
energia menor que o incidente gerando um espectro
corresponde a comprimentos de onda maiores (linhas
Stokes) ou espalhamento anti-stokes em que a molcula
perde energia e o fton espalhado, mais energtico, sai
com comprimentos de onda menores (linhas antiStokes).

O EFEITO RAMAN
O fenmeno conhecido como efeito Raman foi
teoricamente previsto por Smeakel em 1923 e foi
verificado experimentalmente pelo fsico indiano
Chandrasekhara Venkata Raman no ano de 1928, tal
feito lhe rendeu o nome do fenmeno inelstico de
disperso da luz e o prmio Nobel de fsica em 1932.

Figura 2.

Figura 1: C. V. Raman.

O espectro Raman devido ao espalhamento inelstico

de uma radiao monocromtica que incide sobre uma
molcula. A atividade est ligada ao momento de dipolo
induzido na molcula pelo campo eltrico da radiao.
Embora como resultado a molcula possa passar de um
estado para outro um fenmeno fsico diferente do
processo de absoro que mais comumente observado,
e onde ocorre a variao do momento dipolar intrnseco
com a vibrao.
O espalhamento se d quando uma molcula do sistema
sofre uma coliso com um fton, que no chega a ser
absorvido e sim espalhado. Este espalhamento pode ser
elstico (Rayleigh) quando os ftons espalhados

Figura 3.

Na temperatura ambiente segundo a distribuio de

Maxwell-Boltzman, 99% das molculas se encontram
no estado vibracional de menor energia, portanto a
probabilidade de ocorrer transferncia de energia
resultando no espalhamento Raman-Stokes muito
maior que a ocorrncia do espalhamento Raman antiStokes. Isto pode ser observado nos espectros em que a
intensidade das linhas Raman Stokes 100 vezes

superior intensidade das linhas Raman anti-Stokes.

Ver figura (4)
(4)
Onde 0 a amplitude de ind. , para este caso a
radiao emitida tem a mesma frequncia que a
radiao incidente. A ela d-se o nome de espalhamento
elstico ou espalhamento de Rayleigh .

Figura 4

Estas diferenas de energia so obtidas subtraindo-se a

energia dos ftons espalhados da energia da luz
monocromtica incidente.
Regras de seleo: A transio Raman s pode ser
ativada opticamente quando a derivada da
polarizabilidade eletrnica com respeito a uma
coordenada normal (vibrao ou rotao) diferente de
zero.
(1)
No efeito Raman tanto molculas diatmicas hetero
nucleares como homo nucleares apresentam atividade,
pois em ambos os casos ocorre variao da
polarizabilidade com a vibrao.

O espalhamento inelstico ou Raman pode ser

entendido classicamente como tendo origem na
modulao da distribuio eletrnica e da
polarizabilidade molecular devida s vibraes dos
ncleos. Por exemplo, para uma molcula diatmica
pode ser representado adequadamente pelos dois
primeiros termos de uma srie de potncias na
coordenada vibracional Q:

(5)
Aqui o subndice zero indica que os parmetros 0 e
(d/dQ)0 so avaliados na posio de equilbrio.
No modelo do oscilador harmnico, Q oscila na
frequncia vibracional de acordo com a relao:
(6)
Onde A a amplitude de vibrao.
Substituindo as equaes (3), (5), (6) em (2), chegamos
na dependncia temporal de ind.

A FSICA POR TRS DO EFEITO RAMAN

Um campo eltrico esttico ou oscilante a baixas
frequncias capaz de induzir um momento de dipolo
na molcula devido ao movimento dos eltrons e
ncleos na presena do campo. A altas frequncias,
como o caso da luz (~1014 Hz), os ncleos no
conseguem se mover to rapidamente quanto o campo
eltrico oscilante, somente os eltrons conseguem. Para
uma molcula isolada, um campo eltrico de
intensidade E ir induzir um momento de dipolo de
magnitude:
(2)
Onde a polarizabilidade molecular. O campo
eltrico E oscila na frequncia 0 da luz.
(3)
Ento o dipolo induzido tambm ir oscilar nesta
frequncia. De acordo com a teoria eletromagntica
clssica, um dipolo oscilante ir irradiar energia, ento
luz de frequncia 0 ser emitida em todas as direes
(exceto a paralela ao dipolo), a teoria clssica nos traz a
mdia da intensidade total da radiao com sendo:

(7)
O primeiro termo responsvel pelo espalhamento de
Rayleigh em 0, enquanto que o segundo e o terceiro
termos produzem o espalhamento Raman mudados por
uma frequncia de vibrao , para frequncias
maiores
(anti-Stokes)
ou
menores
(Stokes)
respectivamente em relao frequncia da luz
incidente. A frequncia 0 usualmente corresponde, a
luz na regio visvel, que a frequncia de oscilao da
radiao do laser de excitao.
Esta abordagem clssica consegue descrever
superficialmente o fenmeno. Para extrarem-se
informaes que levem em conta a simetria, a
polarizao dos estados Raman, as intensidades das
linhas e regras de seleo deve-se fazer o uso de
Mecnica Quntica.

A TCNICA ESPECTROSCPICA

Uma anlise de espectroscopia Raman se baseia em

incidir um feixe de luz monocromtica com uma
frequncia 0 sobre uma amostra (cujas caractersticas
moleculares se deseja determinar), e examinar a luz
espalhada por ela.
A maior parte da luz espalhada apresenta a mesma
frequncia 0 que a luz incidente, este fenmeno
conhecido como espalhamento de Rayleigh no traz
nenhuma informao sobre a amostra analisada.

Vale ressaltar que o espectro Raman independe da

frequncia da radiao incidente. Ver figura (6)
No eixo das abcissas aparecer uma diferena entre a
frequncia Raman e de excitao do laser normalizada
pela velocidade da luz.

J luz espalhada que apresenta frequncias diferentes da

radiao incidente a que proporciona informao
sobre a composio da amostra, gerando um espectro
Raman com novas frequncias que trazem
caractersticas da composio qumica e estado fsico.
As variaes de frequncias observadas no fenmeno de
espalhamento Raman so equivalentes a variaes de
energia. Os tomos e ons so ligados quimicamente
para formar molculas e redes cristalinas, estando
submetidos a movimentos vibracionais e rotacionais
que se do em frequncias bem determinadas
dependendo dos tomos e da forma de ligao. Cada um
destes movimentos interfere nas propriedades
eletrnicas permitindo interao com a radiao
eletromagntica e consequentemente a construo de
um espectro Raman.

Fig.(6)

A figura (7) traz um exemplo de um espectro Raman

real.

Cada composto ter um espectro (conjunto de valores

Vr) caracterstico devido a sua estrutura poliatmica e
natureza das ligaes qumicas presentes.
O espectro Raman representa a intensidade ptica
dispersada em funo do nmero de onda normalizado
que se produz.

Fig.(7) Espectro Raman do tolueno-cromo-carbonila

(8)
O nmero de onda normalizado tem uma magnitude que
proporcional frequncia e inversamente
proporcional ao comprimento de onda.
(9)
Pode-se observar na figura (5) que o espectro Raman
formado por uma banda principal (espalhamento de
Rayleigh) e duas outras bandas Raman-Stokes e antiStokes localizadas simetricamente a ambos os lados da
banda de Rayleigh.

Fig(8)Tolueno-cromo-carbonila

APLICAES DA ESPECTROSCOPIA RAMAN

A espectroscopia Raman uma tcnica que se realiza
diretamente sobre o material que se quer analisar, sem
requerer nenhum tipo de preparao.
Pode-se analisar compostos orgnicos e inorgnicos em
qualquer estadofsico, slido, lquido e gasoso. Tambm
uma tcnica que no degrada a amostra, mantendo as
caractersticas dos analitos.
Por ser muito verstil e possuir alta resoluo utilizada
em diversas reas:
Na qumica bsica: comumente utilizada, j que traz
informao
sobre
propriedades
vibracionais,
propriedades das ligaes qumicas e simetrias das
molculas.

Figura 5:

Na indstria petroqumica: tem sido utilizada no

processo de controle de qualidade, e para resolver

problemas como a desativao de catalisadores e sua

contaminao.
Em biomedicina: utilizada na deteco de colesterol,
lipdeos, imunoglobulina, oligossacardeos e outras
molculas biologicamente ativas.
Em biologia estrutural: utilizada para a predio de
fnons de baixa frequncia em protenas e DNA e
tambm no estudo de protenas e estruturas
polipeptdicas em seu estado natural.
Indstria alimentcia: tem sido utilizada para verificar
a presena de macro componentes como protenas
lipdeos, carboidratos e gua.
Meio Ambiente: para analisar compostos orgnicos e
inorgnicos presentes no solo e na gua, determinando
sua contaminao por fenis, complexos metlicos,
cidos poli-orgnicos, hidrocarbonetos, etc.
Na indstria farmacutica: no controle de pureza e
qualidade do produto, ao longo das reaes de sntese
orgnica para verificar a presena dos compostos
desejados.
Na fsica do estado slido: utilizada na caracterizao
de materiais fornecendo informao sobre a orientao
de um cristal anisotrpico, estrutura cristalina e grupos
de simetria. Em semicondutores pode ser utilizada para
verificar a presena de fnons, plasmons e gaps de
conduo.

RUDOS PRESENTES NA ESPECTROSCOPIA

RAMAN
Um dos problemas na aquisio de qualquer sinal
espectroscpico o rudo presente na medida. No caso
da espectroscopia Raman estes rudos podem ter
diversas origens, as principais esto listadas abaixo:

desde uma suave curvatura na linha de base, at um

sinal to intenso capaz de mascarar por completo as
linhas Raman.
Como rudos gerados pela amostra tambm temos
aqueles devido heterogeneidade de concentraes e
temperatura, que podem levar a mudanas na
intensidade Raman.
Rudo computacional: rudo introduzido no processo
de digitalizao do sinal de sada do detector.
Rudo gerado por fontes externas: este tipo de rudo
gerado externamente ao equipamento utilizado ou a
amostra. Geralmente causado por uma fonte de luz
externa que contamina o sinal em algum ponto do
equipamento de medida. Muitas vezes o compartimento
que recebe as amostras cuidadosamente projetado para
evitar este tipo de problema.
Uma fonte de rudos externa de origem no ptica so
os raios csmicos, partculas de alta energia que chegam
ao detector do equipamento. Estes raios liberam um
grande nmero de eltrons que so indistinguveis dos
fotoeltrons. O rudo gerado pelos raios csmicos
geralmente se concentra em um ou no mximo dois
elementos do detector e como resultado temos um pico
estreito de grande intensidade no espectro de
espalhamento Raman. Estes picos so relativamente
raros e ocorrem em tempos e posies aleatrias do
espectro.
Devido a todos estes rudos muitas vezes se faz
necessrio o uso de tcnicas de processamento de sinal
para que a anlise do espectro no seja comprometida.
Ver figura (9) de um espectro Raman com rudos.

Rudo shot: este tipo de rudo resultado da natureza

aleatria da luz. Sua intensidade proporcional raiz
quadrada do nmero de ftons detectados. Esta uma
fonte de rudos inevitvel na medida de espectros
Raman.
Rudos gerados pela instrumentao: depende do
desenho especfico da instrumentao empregada na
anlise. Este tipo de rudo inclui rudos introduzidos
pelo detector como rudo de leitura, rudo trmico, e a
dependncia da eficincia quntica do detector com o
comprimento de onda.
Rudo gerado pela amostra: os rudos gerados pela
amostra incluem emisses pticas no desejadas
geradas pela prpria amostra como, por exemplo, a
fluorescncia que ocorre com a incidncia de um fton
sobre uma molcula, que ao ser absorvido a excita para
um estado eletrnico mais energtico e ao passar para
outro estado de menor energia libera um fton com
frequncia mais baixa que o incidente. Nos espectros
Raman a fluorescncia pode apresentar-se de vrias
maneiras e com diferentes intensidades, podendo ir

Figura 9: Rudos espectro Raman

INSTRUMENTAO
Um espectrmetro Raman deve conter os seguintes
elementos:

Uma fonte de luz monocromtica (normalmente uma

fonte de luz Laser), um sistema ptico para a
iluminao da amostra e coleta da luz espalhada, um
elemento dispersivo para separar a luz em diversos
comprimentos de onda, um detector de luz, e um
computador para processamento do sinal e anlise dos
dados.
Ver figura (10),um esquema de um equipamento para
inferir o espectro Raman.

de onda. Podem ser utilizados prismas ou grades de

difrao, as ltimas tem como caracterstica fornecer
um grande poder de separao (bem superior ao
prisma).
DETECTOR
Dispositivo capaz de captar a luz e transform-la em um
sinal eltrico. Normalmente utiliza-se um CCD( charge
coupled device ), um CCD um arranjo (array) de
condensadores MOS(metal-oxido-Si) desenhados para
converter ftons em um sinal digital. Ele converte os
ftons em carga eltrica, que armazenada
temporariamente e finalmente lida e convertida em
pulsos eltricos que so amplificados, processados e
codificados digitalmente pela eletrnica da unidade de
interface do detector. Ento envia-se o sinal para o
sistema computacional.

SISTEMA COMPUTACIONAL
Figura 10: Esquema equipamento

FONTES DE LUZ
Para a obteno de um espectro Raman necessria
uma fonte de luz monocromtica. Pode-se utilizar uma
fonte que no tenha esta caracterstica e passar o feixe
por um monocromador .
No entanto os lasers so fontes de luz com as
caractersticas mais adequadas para a espectroscopia
Raman, so monocromticos e possuem potencia
suficiente para realizarmos as medidas.

Figura 11: Laser He-Ne

MEIOS PARA CAPTAO E PROPAGAO DA

LUZ
Utiliza-se fibras ticas para captar a luz da fonte,
conduzi-la at a amostra e lev-la para o detector com
perdas mnimas de intensidade.
Cabea tica: tem como funo focalizar na amostra a
luz de excitao e maximizar a captao da luz
espalhada pela amostra.
Graas presena da fibra tica o compartimento de
coleta pode estar independente do resto do
equipamento.
Elemento dispersivo: Dependendo do tipo de detector
deve se utilizar um elemento dispersivo para separar a
luz espalhada pela amostra em diferentes comprimentos

O sistema computacional tem como misso controlar a

aquisio do sinal Raman e sua posterior anlise,
tratamento grfico, matemtico, etc. Do computador
tambm pode se realizar o controle dos parmetros do
CCD, do alinhamento dos lasers e do elemento
dispersivo, monocromador caso estes sejam utilizados.

CONCLUSES
Buscou-se neste trabalho apresentar os conceitos da
tcnica de espectroscopia Raman, e suas aplicaes.
Foi explicado o fenmeno do espalhamento Raman, as
principais caractersticas da tcnica de espectroscopia,
mostrando que com ela pode-se rapidamente obter
informao acerca de compostos sejam eles
orgnicos/inorgnicos e estando em qualquer forma
fsica. Apresentei tambm as principais caractersticas
de um espectro Raman e dei alguns exemplos de
aplicao da tcnica em vrias reas distintas. Por fim
relatei os principais tipos de rudos presentes nas
medidas e falei um pouco sobre a instrumentao
necessria para se fazer a espectroscopia.

REFERNCIAS

Characterizing molecular vibrations using raman

spectroscopy-s. Garoff, B. Liokkala 1-26-2011
Carnegie Mellon University 33.340 Modern
Physics Laboratory

Molecular
Spectroscopy -Ira N. Levine
Brooklyn College City University of New York
.Editora Jhon Wiley & Sons.

http://en.wikipedia.org/wiki/Raman_spectroscop
y

http://en.wikipedia.org/wiki/Raman_scattering

Espectroscopia Raman
Gilson Campani Junior
HISTRIA E TEORIA
Em 1928, ao estudarem o espalhamento de luz por
molculas, os fsicos indianos C. V. Raman e K. S.
Krishnan
descobriram,
experimentalmente,
um
interessante efeito conhecido hoje como efeito Raman,
em homenagem ao primeiro pesquisador. Deve-se
destacar que, em 1923, esse efeito j havia sido predito
teoricamente por Smekal1. Tambm, ao mesmo tempo
da descoberta feita por Raman, outros dois
pesquisadores, Landsberg e Mandelstam2, observaram
esse mesmo efeito em quartzo. Porm, o artigo
publicado por Raman3 foi o que apresentou um estudo
mais minucioso e uma teoria detalhada sobre o efeito.
Isso, junto aos demais estudos seus sobre o
espalhamento de luz, lhe rendeu o prmio Nobel de
Fsica em 1930.
A espectroscopia Raman consiste em uma tcnica em
que um feixe monocromtico de ftons incide na
amostra (slido, lquido ou gs), interage e espalhado
com uma energia diferente da incidente num processo
inelstico. A radiao espalhada ento separada por
um monocromador e sua intensidade medida por um
detector, resultando em um espectro que relaciona
frequncia do fton espalhado com nmero de eventos
em cada frequncia (intensidade).
Basicamente, existem duas classes distintas de nveis de
energia que podem ser acessadas no efeito Raman: a
vibracional e a rotacional. O efeito Raman rotacional,
embora sempre esteja presente nos espectros
vibracionais obtidos, passvel de anlise apenas nos
espectros de alta resoluo. Um exemplo ilustrativo
desse fenmeno ocorre nos espectros de alta resoluo
de molculas diatmicas, onde cada linha constituda
por um grande nmero de componentes, cuja separao
da ordem de 10 cm-1. Essa estrutura devida a
transies rotacionais que acompanham a transio
vibracional. Em uma transio +1, as observaes
caem em trs grupos denominados ramo P (J=-1),
ramo Q ((J=0) e ramo R ((J=1).
No caso do efeito Raman vibracional, que ser
abordado nesse trabalho e o mais descrito na
literatura, a diferena de energia observada entre a onda
incidente e a espalhada est relacionada com alguma
frequncia de vibrao da molcula que interagiu com o
fton incidente, conforme a Eq. 1.
(1)
Ei = E f h molec
onde Ei a energia do fton incidente, Ef a energia do
fton espalhado, h a constante de Planck e molec a
frequncia de vibrao da molcula.

A grande maioria dos ftons sofre espalhamento

elstico com as molculas da amostra, conhecido como
espalhamento Rayleigh, de tal forma que a energia dos
ftons capturados no detector a mesma que a dos
incidentes (Ei =Ef). Por outro lado, os demais ftons,
que sofrem espalhamento inelstico, podem sair com
energia maior do que aquela incidente, ganhando
energia da molcula, no efeito conhecido como Raman
anti-Stokes, ou sarem menos energticos, no efeito
Raman Stokes. Um esquema sobre cada um desses
fenmenos comparados com demais tcnicas
espectroscpicas apresentado na Fig. 1.

Figura 1: Esquema ilustrativo das tcnicas de espectroscopia

eletrnica (absoro), de fluorescncia (absoro e emisso),
infravermelho (absoro) e Raman, com seus vrios efeitos
possveis. A largura de cada seta representa de forma
aproximada a seo de choque de cada fenmeno.

Usualmente, comparam-se as espectroscopias Raman e

no infravermelho, de modo que essencial entender em
que essas tcnicas se aproximam e se diferenciam.
A espectroscopia no infravermelho (IR) uma tcnica
de absoro em que a onda eletromagntica
transmitida atravs da amostra e analisada aps sua
passagem. Ftons capazes de excitar um modo
vibracional da molcula, levando-a a um estado
vibracional de maior energia, tero maior probabilidade
de serem absorvidos, enquanto que aqueles que no
interagiram atravessam a amostra livremente. A Fig. 1
mostra que o infravermelho apenas excita a molcula a
um estado vibracional mais elevado, sem transio
eletrnica.
Por outro lado, a espectroscopia Raman se baseia no
espalhamento da onda eletromagntica, onde a radiao
simultaneamente absorvida e reemitida, de modo que
se mede a re-emisso (~ 0,1% da intensidade incidente)
e no a transmisso. O fton absorvido e leva a
molcula a um estado eletrnico virtual (noestacionrio), decaindo para um estado eletrnico
fundamental, porm em um nvel vibracional excitado
(Raman Stokes) ou abaixo do nvel vibracional

originrio da molcula (Raman anti-Stokes). Como

resultado final, ambas as tcnicas fornecem informaes
sobre nveis vibracionais das molculas, porm de
maneiras distintas, estando sujeitas a diferentes regras
de seleo.
Para molculas cuja geometria apresenta centro de
inverso, necessariamente no haver coincidncia
entre os modos ativos no Raman e no IR. Portanto,
bandas que so ativas no IR so inativas no Raman e
vice-versa. Para as demais molculas, poder ou no
haver coincidncia entre as bandas. Dessa forma, essas
tcnicas
geralmente
fornecem
informaes
complementares, sendo, por isso, comumente utilizadas
em conjunto.
Abaixo, na Fig. 2, esto esquematizados os modos de
vibrao moleculares (e suas abreviaes) que podem
ser observados no espectro Raman e IR de algumas
molculas.

Para o efeito Raman Stokes, numa geometria em que a

radiao espalhada coletada a 90 em relao
incidente, a intensidade Raman dada pela Eq. 3
abaixo.
(3)
Ou seja, a intensidade proporcional, a menos de
algumas constantes, diferena entre as frequncias da
radiao incidente e da espalhada elevada ao cubo,
intensidade da radiao incidente e somatria da
contribuio de cada estado virtual, assumindo-se que
h infinitas possibilidades de estados, cada um com um
peso estatstico diferente.
Cada termo [] , por sua vez, escrito conforme a Eq.
4, em que r um fator de amortecimento inversamente
a
proporcional ao tempo de vida do estado excitado,
frequncia de transio para o estado intermedirio e
a frequncia da radiao incidente. Dessa forma, a
participao de cada estado na somatria depender
desses valores e, assim, pode-se determinar a
intensidade Raman para um determinado modo de
vibrao de uma molcula.

(4)
Os componentes do vetor momento de dipolo induzido
(P), no Raman, se relacionam com os componentes do
vetor eltrico (E) pelo tensor de polarizabilidade,
conforme mostra a Eq. 5.
Figura 2: Modos de vibrao molecular e as suas respectivas
abreviaes.

O infravermelho sensvel variao do momento de

dipolo da molcula, enquanto o Raman sensvel
variao da polarizabilidade (tensor ) da molcula
induzida pela radiao incidente. Dessa forma, qualquer
modo vibracional em que a variao do momento de
dipolo eltrico seja nula, como o estiramento em
molculas diatmicas homonucleares (e.g. N2 e O2) ou
estiramento simtrico de molculas lineares (e.g.
O=C=O), no aparecem no espectro IR. Analogamente,
qualquer modo vibracional em que no haja alterao
na polarizabilidade da molcula ser inativo no Raman.
Um esquema que facilita a interpretao do que foi dito
acima apresentado na Fig. 3.

Figura 3: Regras de seleo para as atividades Raman e

infravermelha.

(5)
APLICAES
Anlises de propriedades moleculares e suas
interaes
O espectroscopista, ao analisar um espectro Raman de
uma espcie qumica, capaz de avaliar os momentos
de dipolo da molcula e suas intensidades vibracionais.
Com isso, obtm informaes importantes sobre os
modos vibracionais da molcula em questo, o que
bastante til para caracterizar as interaes molculasolvente e/ou molcula-molcula.
Em sistemas com mais de uma espcie qumica, a
presena de novas espcies moleculares pode ser
detectada pela apario de novas linhas no espectro. O
mtodo Raman praticamente no perturba o equilbrio
qumico e, portanto, tambm pode fornecer informaes
sobre espcies instveis que, provavelmente, no
apareceriam em outros mtodos analticos. Acima de

tudo, por fornecer individualmente informaes

distintas sobre as espcies presentes em um sistema, o
mtodo Raman muitas vezes mais til que os demais
mtodos coligativos, que medem apenas algumas
propriedades do sistema como um todo. Portanto, esse
mtodo um dos mais indicados quando se deseja
estudar espcies inicas e seu equilbrio em solues
aquosas concentradas.

controlados por microcomputador, o que facilita e

agiliza muito a coleta de dados pela sistematizao e
preciso experimental. Abaixo, na Fig. 4, est
esquematizado um modelo comercialmente disponvel.

Identificao de compostos
Outra aplicao muito comum se refere identificao
de espcies qumicas. Como cada molcula fornece um
espectro Raman caracterstico, o mesmo se torna uma
impresso digital da molcula, o que possibilita a sua
identificao em um sistema desconhecido. Em geral, o
espectro pouco afetado pela mistura com outros
compostos e, diferentemente do IR, a espectroscopia
Raman aplicvel sem maiores dificuldades com
solues aquosas.

(a)

Quantificao de compostos
Finalmente, outra aplicao que se destaca para o
mtodo Raman a quantificao de espcies qumicas
em amostras. Isso possvel se considerarmos, numa
razovel aproximao, que as intensidades das linhas no
espectro so proporcionais concentrao volumtrica
da espcie qumica em questo. Portanto, atravs de
uma curva padro de intensidades, pode-se determinar a
concentrao de determinada espcie qumica em uma
amostra.
INSTRUMENTAO
Em 1928, quando S. C. Raman descobriu o efeito que
recebeu seu nome, a instrumentao utilizada por ele
era extremamente rudimentar. Raman usou a luz solar
como fonte, um telescpio como coletor e seus olhos
como detector.
Gradualmente,
houve
diversos
avanos
na
instrumentao original utilizada por Raman, em
especial no desenvolvimento de melhores fontes de
radiao. Pesquisadores desenvolveram lmpadas de
cdmio, hlio, tlio, bismuto, chumbo, zinco e
mercrio. Finalmente, no incio da dcada de 60,
surgiram as primeiras fontes de laser para uso em
espectrmetros Raman, possibilitando um enorme
ganho de intensidade do feixe luminoso. Vale ressaltar
que, em paralelo, muitos avanos foram obtidos pelos
pesquisadores
em
filtros
responsveis
pela
monocromatizao das fontes.
Atualmente, os espectrmetros Raman disponveis
comercialmente possuem lasers com alta potncia e alta
monocromaticidade, alm de cmaras CCD bastante
sensveis. Outro avano dos atuais espectrmetros se
refere automao do aparato instrumental, com
espelhos, lentes, polarizador e detector conectados e

(b)
Figura 4: (a) Esquema de um espectrmetro Raman e (b) a
sua imagem.

Esse espectrmetro est equipado com um micro laser

diodo pulsado (500 ps) Nd:LSB com potncia mdia de
40 mW (8 kW de pico), emisso de radiao com
comprimento de onda de 531 nm, cmara CCD,
polarizador (POL/USM SMD) e espelhos (M1 e M2)
motorizados, lentes focais (L1 e L2), porta amostras
mvel (S@H), condensador, filtro (FN) e medidor de
intensidade do feixe proveniente do laser.

LIMITAES E DESENVOLVIMENTOS
Sabe-se que uma grande dificuldade no fenmeno
Raman a baixssima intensidade do sinal. Para
amostras lquidas e uma fonte de luz na regio do
visvel, a intensidade total da luz espalhada pelas
molculas pode ser at 105 vezes menor que a incidente.
Nos gases, onde a densidade molecular menor, a
intensidade correspondente ainda mais fraca de modo
que, em geral, volumes grandes de amostra so
necessrios nesses casos.
Estudos focados no desenvolvimento de fontes mais
potentes e monocromticas de laser em espectroscopia
Raman sero, provavelmente, realidade ainda
futuramente. Os lasers a serem desenvolvidos devero

ser pulsados continuamente e emitir feixes mais

potentes. Alm disso, eles devero ser capazes de emitir
radiao na regio do espectro eletromagntica que se
escolha.
Com essas novas fontes de radiao a serem
desenvolvidas, o espectro Raman de slidos poderia ser
obtido mais facilmente. Materiais coloridos e pequenas
amostras poderiam tambm ser analisados com menor
dificuldade. Alm disso, seria possvel obter espectros
Raman de gases, lquidos, slidos e de amostras
coloridas ou no em um nico espectrmetro sem
maiores modificaes no equipamento. Linhas
espectrais referentes s transies de energia rotacionais
em um espectro vibracional poderiam ser obtidas com
maior preciso e qualidade. Por fim, com todo o
desenvolvimento
tecnolgico
associado
aos
espectrmetros Raman, esses equipamentos se
tornariam mais acessveis economicamente, acarretando
numa maior competitividade em relao aos
espectrmetros de infravermelho de alta resoluo
disponveis atualmente.

REFERNCIAS

SMEKAL, A. Naturwissenschaften 11 : 873

(1923).

LANDSBERG, G.; MANDELSTAM, L.

Naturwissenschaften 16 : 557 and 772 (1928).

RAMAN, C. V.; KRISHNAN. Nature 121 : 501

(1928).

Catlogo da empresa Standa Ltd. Equipamentos

pticos Mecnicos disponvel pelo site
<http://www.standa.lt/products/catalog/spectrosc
opic_instruments?item=267>.
Acesso
em
23/09/2011.

SZYMANSKI, H. A. Raman Espectroscopy:

Theory and Practice. 1.ed., New York, Plenum
Press (1967).

RODRIGUES, F. Espectroscopia Raman de

lquidos inicos imidazlicos: interaes
interinias, organizao estrutural e efeitos de
micro-ambiente. Tese de Doutorado, Instituto
de Qumica, USP, So Paulo, SP, Brasil (2011)

DONOSO, J. P. Espectroscopia infravermelha:

molculas. Slides de aula disponvel em
<http://www.ifsc.usp.br/~donoso/espectroscopia/
Infravermelho.pdf>. Acesso em 22/09/2011.

Espectroscopia Raman A Voz do Silncio

Leticia Fais
INTRODUO
H centenas de milhares de anos, a luz instiga o
raciocnio humano a buscar novas respostas e
perguntas. O nascer do sol estimula o despertar, o arco
ris encanta o imaginrio tal qual fosse a descoberta de
um segredo velado. Como o mundo? Como somos? O
que calor? O que energia?
Desde a descoberta do fogo, o ser humano aprimora
suas tcnicas de sobrevivncia e qualidade de vida, bem
como a seu entendimento da natureza. Luz, calor e
matria
sempre
se
mostraram
elementos
interconectados, cujas interaes ativamente edificam a
cincia e passivamente confere ao homem a capacidade
de desenvolver tecnologia.
Tato, olfato, paladar, viso e audio so as primeiras
ferramentas utilizadas para se experimentar o mundo.
Isaac Newton descobriu a decomposio da luz ao
pass-la por um prisma. Em diferentes ngulos de
difrao, pde notar as diferentes cores constituintes. O
experimento mostrou algo que os olhos no eram
capazes de enxergar. Herschell, em 1773, tambm quis
potencializar seus sentidos. Com ajuda de sua irm,
construiu telescpios que o permitiram relacionar
temperatura e faixas espectrais da luz vinda do espao.
Pelo calor detectado nas frequncias mais baixas que o
vermelho, descobriu que ondas eletromagnticas no se
restringem luz visvel. A regio do infravermelho
estava descoberta.
O efeito Raman, assim contemplado nominalmente por
um de seus descobridores, foi observado em 1928.
Premiado pela Fundao Nobel, Sir C. V. Raman, com
apoio de K. S. Krishnan, desenvolveu um aparato de
criao de luz monocromtica passando a luz do sol por
um filtro fotogrfico de abertura estreita. Adicionando
um filtro cruzado, surpreendeu-se com pequenas
intensidades de frequncias modificadas que haviam
sido desviadas. Independentemente, Grigory Landsberg
e Leonid Mandelstam tambm identificaram o efeito.
Todos estavam mais uma vez em face de
conhecimentos que a luz fornece, mas que esto alm

da viso. Neste caso, as energias envolvidas no

espalhamento so dos modos vibracionais moleculares.
A quantizao dessas energias dada em fnons. Desde
a descoberta do espalhamento Raman, os fnons
contribuem cincia dos materiais dizendo como so as
estruturas a nvel microscpico.
Disse Sir Isaac Newton no sculo XVIII, o Sculo das
Luzes: No great discovery was ever been made
without a bold guess. A histria da espectroscopia
mostra essa cincia como fomentadora do imaginrio e
da criatividade humana, o que caro aos bons palpites
alm de exigir lgica e razo para sistematizar o
conhecimento. O ser humano assim, potencializando
seus sentidos espectroscopicamente, por sua qualidade
intelectual evolui em sua cincia iluminada.

ESPECTROSCOPIA RAMAN
A espectroscopia investiga a natureza da matria
valendo-se da anlise de efeitos fisicamente detectveis
provocados
por
sua
interao
com
ondas
eletromagnticas, calor ou eltrons bombardeados. O
termo espectrometria compreende a investigao de
dados plotados de intensidade de radiao em funo de
comprimentos de onda ou frequncias. Esses dados so
obtidos em experimentos espectroscpicos nos quais a
energia incidida sobre o material de prova absorvida,
promove alteraes nos nveis energticos eletrnicos e,
por fim, devolvida em forma de luz ou calor, e em
seguida, detectada. A magnitude das implicaes dos
estudos espectroscpicos deve-se ao fato de que os
tomos e compostos distintos tm diferentes
distribuies eletrnicas, cada qual interagindo com a
energia aplicada, de acordo com as prprias
caractersticas qunticas, e transmitindo informaes
estruturais de ordens de grandeza (10-9m [nm], 1010
m[]) inacessveis ao olho nu.
A Tabela a seguir relata tipos de espectroscopia, ranges
de comprimento de onda e a natureza da energia
envolvida nas transies energticas.

Tipodeespectroscopia

Faixa decomprimento
deonda

Tipodetransioenergtica

EmissodeRaios

0,0051,4

Nuclear

Absoro,emissofluorescnciae
difraodeRaiosX

0,0110

Eletrnicainterna

AbsoronoUltraVioleta

10nm180nm

Eletrnicadevalncia

Absoro,emissoefluorescnciano
UVVis

180nm780nm

Eletrnicadevalncia

AbsoronoInfraVermelhoe
espalhamentoRaman

0,78m300m

Rotacionalevibracionalmolecular

Absorodemicroondas

0,75mm3,75mm

Ressonnciadespineletrnico

3cm

Ressonnciamagnticanuclear

0,6m10m

A maioria das transies puramente rotacionais ocorre

pela absoro ou emisso de micro-ondas. As
vibracionais ocorrem pela absoro ou emisso da
radiao infravermelha. Transies eletrnicas ocorrem
na presena de luz visvel ou ultravioleta. H excees:
transies de eltrons entre orbitais f (isto , em tomos
de terras raras) podem ocorrer na regio infravermelha,
e transies rotacionais podem ser sobrepostas num
espectro vibracional, tambm na regio infravermelha.
Mas, ainda assim, conveniente se referir a um tipo de
espectroscopia pela regio do espectro eletromagntico
que est sendo explorada.
A Espectroscopia Raman explora os modos rotacionais,
vibracionais e outros modos de baixa frequncia de um
sistema. A amostra em estudo irradiada por um
comprimento de onda especfico. Esta luz
monocromtica escolhida de forma a no ser

Tabela 2: As subdivises do espectro infravermelho

RotacionalMolecular
Eletrnicasedespinemcampomagntico
Despinemcampomagntico

absorvida pela molcula, ou seja, no deve possuir

energia E tal que a molcula seja levada a um estado
eletrnico excitado. Como a energia dada por
E = hc
Em que h a constante de Planck, c a velocidade da luz
e o comprimento de onda, energias baixas requerem
altos comprimentos de onda. Esta a razo pela qual o
espalhamento Raman detectado para frequncias na
regio espectral do infravermelho.

Figura 1: As divises do espectro eletromagntico


ROTAO, VIBRAO, TRANSLAO E A
APROXIMAO DE BORN-OPPENHEIMER
O movimento de translao, por definio, ocorre
homogeneamente na molcula, ou seja, no modifica as
posies relativas das partculas que a constituem. Pode
ser descrito como o deslocamento do centro de massa.
Se os ncleos formassem uma estrutura rgida, tal
estrutura poderia girar, o que se caracterizaria por
rotao
molecular.
Entretanto,
as
distncias
internucleares e os ngulos entre as ligaes variam sem
deslocar o centro de massa, i. e., vibram. O movimento
resultante da superposio desses graus de liberdade
denomina-se roto-vibrao molecular. As velocidades
tpicas associadas roto-vibrao so inferiores do
som (340 m s-1). Os eltrons de valncia apresentam
velocidades da ordem de 106 m.s-1 e os eltrons
internos, velocidades maiores, podendo at se
aproximar da velocidade da luz (c = 3x108 m.s-1).
O movimento relativo eltrons-ncleos reflete o fato de
ambos se moverem em relao a algum referencial fixo.
Entretanto, como as velocidades eletrnicas so pelo
menos mil vezes maiores do que as nucleares, uma
aproximao razovel desprezar a roto-vibrao ao se
considerar o movimento dos eltrons em relao aos
ncleos (ou dos ncleos em relao aos eltrons). Em
outras palavras, uma aproximao admissvel
considerar que, a cada momento ao longo do
movimento roto-vibracional, a distribuio eletrnica
espacial instantaneamente ajustada s correspondentes
posies nucleares, de modo a manter sempre mnima a
energia molecular. Essa a aproximao de BornOppenheimer, que permite resolver a equao de
Schrdinger, para o movimento eletrnico em relao
aos ncleos de uma molcula, considerando estes
ltimos fixos. Este artifcio permite que a equao de
Schrdinger para o movimento nuclear seja resolvida
examinando a influncia eletrnica como um potencial
dependente das posies nucleares. Essa aproximao
produz uma imensa simplificao matemtica no estudo
mecnico-quntico das molculas, com o nus de
introduzir nos resultados um erro. Porm, o erro
insignificante quando comparado com outros, criados
por outras aproximaes frequentemente utilizadas.

A QUANTIZAO DA ENERGIA
A energia interna de um sistema distribui-se entre as
partculas constituintes em seus graus de liberdade
internos rotacionais, vibracionais e translacionais. As
rotacionais referem-se mudana de posio com
respeito a eixos definidos. As vibracionais so dadas
pela mudana na distncia entre as ligaes qumicas ou
ngulos, sem que haja deslocamento do centro de
massa. As translacionais, diferentemente das outras, no
so quantizadas e podem assumir qualquer valor, uma
vez deslocado o centro de massa. Para uma estrutura
com N tomos, o nmero mximo de graus de liberdade
igual a 3N. Dependendo das ligaes qumicas entre
estes tomos, ocorrem acoplamentos de movimentos
que impossibilitam alguns microestados. Por tal motivo
3N um nmero mximo de formas de distribuir a
energia interna, no uma regra fixa vlida para qualquer
molcula. Trs destes graus de liberdade correspondem
s trs dimenses permitidas ao deslocamento espacial
do centro de massa. Outros trs, aos possveis eixos de
rotao. Os outros (3N 6) so modos de vibrao da
molcula.
Considerando a aproximao de Born-Oppenheimer e
excluindo a energia translacional, o nmero de onda
correspondente energia total de uma molcula
diatmica pode ser escrito:

Nessa equao fundamental:

, sendo J a unidade de energia
de Etot J.cm a do produto hc (a constante de Planck h
= 6,626x10-34 J.s e a velocidade da luz c = 3,0x1010
cm.s-1,

logo

em

cm-1.

mdulo

numa
transio
radioativa (radioativa significa que absorve ou emite
radiao eletromagntica), o nmero de onda
absorvido (quando
onda emitido (quando

) ou o nmero de
).

 o nmero de onda
correspondente a Eel, sendo esta ltima a energia do
mnimo da curva considerada para descrever a energia
potencial eletrnica em funo da distncia internuclear,
o nmero de onda correspondente a
assim como
Etot. Nota-se que, por causa do princpio de incerteza de
Heisenberg (E.t 2), a energia da roto-vibrao
molecular no pode ser nula, logo a energia total
mnima obrigatoriamente superior a Eel, ou seja,
. conveniente definir o inteiro no
negativo adimensional n = 0,1,2,... , que numera as
curvas de energia potencial eletrnica na ordem
crescente dos valores de

um nmero um adimensional, no
negativo, denominado constante de anarmonicidade,
responsvel pela principal correo ao modelo do

Figura 2: Diagrama de energias rotacionais e nveis

vibracionais associados para uma molcula diatmica em
determinado estado eletrnico

fornece a
oscilador harmnico. O termo
energia correspondente a esse modelo dividida por hc,
corrige tal
enquanto a subtrao do termo
valor (correes de menor valor existem, mas foram
desprezadas na equao anterior). Nota-se tambm que,
, o valor de
depende de qual o
assim como
valor de n, sendo nico para cada um desses valores. Se
o zero de energia vibracional for Eel, a energia
vibracional da molcula ser, portanto, dada
por
a constante rotacional em
cm-1, convencionando-se que =m1m2(m1+m2) a
massa reduzida da molcula diatmica cujas massas
atmicas so m1 e m2 e Re a distncia internuclear de
equilbrio para o nvel vibrnico considerado, logo Re2
o momento de inrcia da molcula. O valor de
depende, atravs de Re, de qual o nvel vibrnico da
molcula diatmica, sendo nico em cada um destes
nveis. Essa dependncia geralmente expressa por
, em que
e
so grandezas no
negativas que dependem apenas do valor de n, sendo
nicas para cada um desses valores. Portanto, se a
constante de interao vibrao-rotao

for nula,

=
e Re= Re, ou seja, dependero apenas de n.
Essa constante ser nula quando cada ramo da curva de
energia potencial eletrnica for a imagem especular do
outro, como acontece no caso da parbola que
representa o potencial do oscilador harmnico, porque
teremos ento Re=Re, ou seja, a distncia internuclear
de equilbrio ser igual para todos os nveis vibrnicos
de uma mesma curva. Para o oscilador anarmnico,
entretanto, a forma dos dois ramos diferir cada vez
mais, medida que aumentar.

Figura 3: Diagrama de energia da molcula de O2 mostrando

os estados vibracionais associados a vrios estados
eletrnicos

J = 0,1,2,... um inteiro no negativo

adimensional chamado nmero quntico rotacional que,
junto com n e v, indica qual o nvel roto-vibrnico em
que o sistema se encontra. A energia de uma rotao
depende da sua velocidade angular e do seu momento
de inrcia mas, como j afirmado, o segundo no se
altera quando n e v no mudam. Por isso, fixando-se um
nvel vibracional de uma curva de energia potencial
eletrnica, a energia rotacional variar apenas com a
velocidade angular, ambas quantizadas por J (destaca-se
que a energia e a velocidade angular mnimas so iguais
a zero). Quando somente uma curva de energia
potencial eletrnica estiver sendo considerada
(geralmente a fundamental), o nvel roto-vibrnico da
molcula ser denominado apenas roto-vibracional.

 uma constante no negativa denominada

distoro centrfuga, expressa em cm-1, responsvel pela
principal correo ao modelo do rotor rgido. Sua
aumenta com J,

existncia provm do fato de que

e
porque a ligao no rgida, ou seja,
dependem do nvel roto-vibrnico e no apenas do nvel
fornece a
vibrnico. Nota-se que o termo
energia do rotor rgido dividida por hc, enquanto a

considerar a interao vibrao-rotao. Quanto mais

significativos forem os valores das correes, menos as
regras de seleo apresentadas sero rigidamente
obedecidas.
As
figuras
abaixo
mostram,
respectivamente, correes aos nveis energticos do
rotor rgido e do oscilador harmnico. A tabela abaixo
mostra a existncia, no espectro real do HCl , de
pequenos picos devidos aos sobretons, absolutamente
proibidos pela regra de seleo do oscilador harmnico.

corrige tal valor, ou

subtrao do termo

e
dependam apenas do nvel
seja, permite que
vibrnico, como convencionalmente considerado
(correes de menor ordem foram desprezadas na
depende somente do valor de n,
equao anterior).
sendo nico para cada um desses valores.
AS REGRAS DE TRANSIO
Algumas transies radioativas so proibidas, por
razes explicadas pela mecnica quntica. Por exemplo,
dentro do modelo do rotor rgido apenas transies com
J = 1, em molculas com momento de dipolo
permanente, absorvem ou emitem radiao. A essa
limitao costuma-se chamar regra de seleo do rotor
rgido. Analogamente, a regra de seleo do oscilador
harmnico consiste em apenas ocorrerem transies
radioativas em molculas cujo momento de dipolo varia
durante a vibrao, sendo v = 1. Se os modelos do
oscilador harmnico e do rotor rgido, simultaneamente
admitidos, representassem alguma molcula diatmica
real, seus nveis de energia seriam aqueles
representados nas figuras em (1.2). Para tal molcula, as
regras de seleo antes mencionadas seriam rigidamente
obedecidas. Fazendo, ento,

constante e

Figura 4: Nveis rotacionais de um rotor rgido (a) e no

rgido (b)

= 0 na equao fundamental , para J = 1 e v =

1 obtemos
, sendo J = 1,2,3,... .
Portanto, o espectro roto-vibracional de absoro dessa
molcula
especial
apresentaria
picos
em
, ou seja, picos igualmente espaados em 2
menos os dois centrais, espaados em 4

cm-1,

cm-1.

Os espectros roto-vibracionais de absoro de

molculas diatmicas reais em fase gasosa lembram o
que foi acima descrito para Oscilador Harmnico e
Rotor Rgido, mas diferem porque, para que o modelo
matemtico se aproxime do espectro real, no se pode
=
=
= 0, ou seja, deve-se corrigir os
impor
modelos do oscilador harmnico e do rotor rgido e

Figura 5: Estados vibracionais da molcula de H35Cl

calculadas com: (a) aproximao do oscilador harmnico e
(b) com a correo da anarmonicidade

O EFEITO RAMAN
Quando feita a incidncia do feixe de luz sobre a
amostra, a energia absorvida. O campo eltrico
oscilante da luz interage com os eltrons dos tomos. A
matria pode reemitir essa energia espontaneamente
(emisso de fton no retorno ao estado fundamental), de
forma estimulada (como nos lasers, um tomo j em
estado excitado devolve o fton absorvido com mesma
energia, polarizao, direo e fase) ou ainda apresentar
espalhamento (elstico ou inelstico).
O espalhamento da luz pode ser pensado como
redirecionamento dela quando a onda eletromagntica
(EM) incidente encontra um obstculo ou uma no
homogeneidade (no caso espectroscpico o material
analisado). Conforme a onda EM interage com o
material, seus orbitais eletrnicos so perturbados de
forma peridica, com a mesma frequencia (o) que o
campo eltrico da onda incidente. A oscilao, ou
perturbao da nuvem eletrnica, resulta em separao
peridica de cargas na molcula, o que se denomina
momento de dipolo induzido, e se manifesta como fonte
de radiao EM. Este fenmeno o espalhamento, que
pode ser elstico ou inelstico.
Em colises elsticas, tanto partculas incidentes quanto
o alvo mantm-se intactas. No h perda de energia e
ocorre conservao da energia cintica e do momento.
Se o alvo pontual, o processo elstico a nica
possibilidade.
No espalhamento inelstico parte da energia cintica da
partcula (no caso o fton) perdida no alvo em
processos internos. Este o caso do espalhamento
Raman, no qual a onda EM incidente perde parte de sua
energia na interao com a estrutura atmica/molecular
do material.

Em que a polarizabilidade e E a fora do campo

eltrico da onda EM incidente.
A polarizabilidade propriedade intrnseca matria,
subordinada estrutura molecular e natureza das
ligaes.
Para a onda incidente, o campo eltrico pode ser
expresso por:
E

Eo cos2

ot

(2)

Em que o a frequncia (Hz) da luz (o = c/. Por (2) e

(1) obtm-se o momento dipolo em funo do tempo.
P

Eo cos2

ot (3)

Dado que a capacidade local de perturbao da nuvem

eletrnica de uma estrutura molecular depende da
localizao dos tomos individuais, a polarizabilidade
funo da posio instantnea dos tomos constituintes.
Para qualquer ligao molecular, os tomos individuais
esto confinados em modos vibracionais especficos, de
energias vibracionais quantizadas. Essa energia dada
por:
(4)
Em que j o nmero quntico vibracional (j = 0,1,2),
vib a frequncia do modo vibracional, e h a
constante de Planck. O deslocamento fsico dos tomos
com respeito posio de equilbrio devido ao modo
vibracional particular ser dado por:
dQ

Qocos2 vibt

(5)

em que Qo o mximo afastamento da posio de

equilbrio. Para uma molcula diatmica tpica, N2, por
exemplo, o deslocamento mximo em torno de 10%
do comprimento de ligao. Para deslocamentos to
pequenos, a polarizabilidade pode ser aproximada por
expanso de srie de Taylor

(6)
Figura 6: Espalhamento da luz por momento de dipolo
induzido devido a uma onda EM incidente

Como discutido acima, a onda incidente induz o

momento dipolo magntico na interao com o
material. A fora do momento dipolo induzido, P,
dado por
P

(1)

Em que o a polarizabilidade do modo molecular na

posio de equilbrio.
Dado o deslocamento vibracional descrito na equao
(5), a polarizabilidade pode ser expressa por:

(7)

Substituindo (7) em (3):

Dada a identidade trigonomtrica, a relao acima pode
ser reescrita:

muito perturbados. Logo, a polarizabilidade reduzida

se a distncia de ligao tambm . Por outro lado, dada
a elongao mxima da ligao, os eltrons so mais
deslocados por campo eltrico externo aplicado. Assim,
a polarizabilidade aumenta no distanciamento mximo.
Ao plotar a dependncia da polarizabilidade com a
distncia entre ncleos, obtm-se o grfico a seguir:

(9)
Analisando as equaes acima, nota-se que os
momentos dipolo-induzido so criados em trs distintas
frequncias: o, (o - vib), e (o + vib). Isso resulta no
espalhamento da radiao nos comprimentos de onda
correspondentes. A primeira frequncia corresponde
incidente (espalhamento elstico, como de Mie ou
Rayleigh, por exemplo), enquanto as outras so os shifts
para frequncias mais baixas (espalhamento Stokes) ou
mais altas (anti-Stokes). A condio necessria ao
espalhamento Raman que o termo
Q no seja
nulo. Fisicamente, pode-se interpretar tal fato como o
deslocamento vibracional dos tomos correspondendo a
um modo vibracional particular resultar em mudana de
polarizabilidade.

Figura 9: Polarizabilidade de A-B em funo da distncia ao

ponto de equilbrio

Do grfico infere-se que o valor

Q na posio de
equilbrio (dQ = 0) diferente de zero. Assim, o modo
vibracional fundamental de uma molcula diatmica
seria Raman ativo e geraria choques inelsticos para as
duas frequncias (o - vib) e (o + vib). A condio
necessria mudana de polarizabilidade deve mudar
com o deslocamento vibracional (i.e.
Q no nula
no equilbrio) e pode ser vista como a regra de seleo
Raman.
Pode-se descrever o espalhamento Raman em termos
das energias. Considera-se um poo de energia
vibracional, no qual estados vibracionais discretos
correspondem a nmeros qunticos, como mostrado
pela equao (4). Nveis de energia adjacentes que
diferem por um nico nmero quntico determinam:
Evib = hvib.

Figura 7: Absoro no infravermelho e diferentes formas de

espalhamento

Considerando uma molcula diatmica A-B com

espaamento vibracional mximo Qo, como na figura
abaixo:

Figura 10: Poo de energia vibracional

Para uma populao de molculas, uma dada frao

povoa cada estado vibracional, como determinado pela
funo distribuio de Boltzmann, com o estado
vibracional (j=0) altamente favorecido em baixas e
moderadas temperaturas.
Figura 8: Deslocamento vibracional de A-B com respeito
posio de equilbrio

Quando A-B est em mnima elongao, os eltrons de

um tomo sentem os efeitos do outro ncleo e no so

Por Boltzmann:

Como o sistema molecular tem probabilidade muito

maior de ser encontrado no estado vibracional
fundamental, o deslocamento Stokes o processo de
espalhamento Raman mais comum. Para o caso antiStokes, a molcula precisa estar em estado vibracional
excitado (j=1, por exemplo). Durante a interao com o
fton incidente, a molcula passa por relaxao do
estado vibracional de energia e o fnon adicionado ao
fton resultando no aumento da frequncia original, ou
seja, o fton passa a ter energia igual a h( o + vib).
Para um grande sistema de molculas, tanto
deslocamentos Stokes quanto anti-Stokes ocorrero
simultaneamente no espalhamento Raman, com a
intensidade do deslocamento Stokes, por via de regra,
muito mais alta.

Na qual N0 o nmero de tomos no estado vibracional

inferior; N1: nmero de tomos no estado vibracional
mais alto; g0: degenerescncia do estado vibracional
mais baixo (numero de orbitais com mesma energia);
g1: degenerescncia do estado vibracionalde mais alta
energia; Ev: variao de energia entre os dois estados
vibracionais; k: constant de Boltzmann T: temperatura
absoluta.
Molculas em estados qunticos vibracionais mais altos
(j=1, por exemplo) ainda vibram com a frequncia
fundamental vib, apesar da probabilidade de encontrar
os tomos afastados da posio de equilbrio. Como
exemplo, as curvas do grfico acima de cada nvel
quntico vibracional podem ser interpretadas como
funo probabilidade de deslocamento instantneo
(dQ). O deslocamento Raman pode tambm ser
compreendido como um shift no estado energtico
vibracional devido interao com um fton incidente.
Como j discutido, a onda EM incidente induz o
momento dipolo oscilante e leva o sistema a um estado
virtual de energia. Esse nvel de energia , no geral,
muito maior que os quanta vibracionais (tambm
chamados de fnons), mas no necessariamente
(muito mais comum no ser) igual a nenhum quantum
energtico especfico de transio eletrnica. Assim
sendo, a molcula permanece em seu estado
fundamental eletrnico. Contudo, durante a interao
com o fton incidente, alguns quanta de energia iguais
aos fnons podem ser fornecidos molcula, e como
resultado, ocorre o espalhamento inelstico da radiao.

A intensidade de radiao eletromagntica I , por

definio, a energia radiante que, por unidade de tempo,
atravessa uma unidade de rea ortogonal direo de
propagao da radiao. Quando molculas de um
material sofrem transio radioativa entre nveis de
energia a elas permitidos, a intensidade da radiao
monocromtica com nmero de onda

altera-se em relao ao seu valor incidente sobre o

material. A deteco e a medida dessas variaes, para
cada nmero de onda da radiao incidente, so
efetuadas e registradas por instrumentos denominados
espectrofotmetros, cujos registros so chamados
espectros. Os espectrofotmetros podem ser de
absoro ou de emisso (instrumentos distintos) e cada
aparelho destina-se a uma determinada faixa de
nmeros de onda.
Tabela 4: Energias moleculares e respectivas frequncias

Figura 11: Conservao de energia para espalhamento

Regio

Microondas

Infravermelho

Infravermelho

Visvel e

Distante
-1

11

11

Ultravioleta
13

14

10 - 1016

10 - 10

Comprimento de
Onda / m

3x10-1 - 3x10-3

3x10-3 - 3x10-5

3x10-5 - 6,9x10-7

6,9x10-7 - 2x10-7

Nmero de Onda /
cm-1

0,033 - 3,3

3,3 330

330 - 14500

14500 50000

Energia / J. molcula-

6,6x10-25 - 6,6x10-23

6,6x10-23 - 6,6x10-21

6,6x10-21 - 2,9x10-19

2,9x10-19 - 1,0x10-18

Processo molecular

Rotao de molculas
poliatmicas

Rotao de pequenas
molculas

Vibrao de ligaes
flexveis

Transies

10 - 10

14

Frequncia / s

10 - 10

13

so amplicados. A tcnica muito til no estudo de

molculas como polipeptdeos que devem mostrar
centenas de bandas convencionais no espectro Raman.
Tambm aplica-se na associao de modos normais
com seus shifts de frequncia observados.

Figura 12: Exemplo de espectro Ramancido acetilsaliclico

Surface-Enhanced
Resonance
Raman
Spectroscopy (SERRS)/ Disperso Raman de
ressonncia Amplificada Por Superfcie (SERS)
Combinao entre SERS e Espectroscopia Raman de
ressonncia que usa a proximidade a uma superfcie
para aumentar a intensidade do sinal e o comprimento
de onda associado maxima absorbncia da molcula
analisada.
Espectroscopia Raman de resoluo
angular No s os dados padro de espectroscopia
Raman so detectados, mas tambm o ngulo de sada
com respeito ao feixe incidido. Se a orientao da
amostra conhecida, a informao detalhada da relao
da disperso de fnons pode tambm ser detectada em
teste nico.
Hyper Raman Um efeito no linear no qual
os modos vibracionais interagem com o Segundo
harmnico da excitao. Isso requer potncia
extremamente alta para possibilitar a observao dos
modos vibracionais normalmente silenciosos. O
aumento da intensidade usualmente do tipo SERS.

Figura 13: Espectro Raman da calcita e nveis vibracionais

Os Tipos de Espectroscopia Raman

Atualmente existem diversos tipos de espectroscopia
Raman. As variaes visam ao incremento da
sensibilidade, resoluo espacial ou aquisio de
informaes especficas de ressonncia.
Surface Enhanced Raman Spectroscopy/
Disperso Raman Amplificada Por Superfcie
(SERS) Normalmente feita em substrato de prata ou
ouro ou coloides contendo esses elementos. A banda
plasmnica da prata e do ouro excitada pelo laser
resultando no aumento do campo eltrico nos entornos
do metal. Como as intensidades Raman so
proporcionais ao campo eltrico, ocorre grande aumento
do sinal (at da ordem de 1011). Esse efeito foi
observado originalmente por Martin Fleishmann, mas
prevaleceu a explicao proposta por van Duyne em
1977. Uma teoria foi elaborada por Lombardi e Birke.
Espectroscopia Raman de ressonncia O
comprimento de onda de excitao adequado a uma
transio eletrnica da molcula ou cristal de forma que
os modos vibracionais associados ao estado eletrnico

Spontaneous
Raman
Spectroscopy/
Espectroscopia Raman (SRS) Usada no estudo da
dependncia do espectro Raman de molculas com
respeito temperatura
Optical Tweezers Raman Spectroscopy
(OTRS)/Espectroscopia Raman por Pina ptica
Usada no estudo de partculas individuais ou mesmo em
processos bioqumicos em clulas isoladas por pinas
pticas.
Stimulated
Raman
Spectroscopy/
Espectroscopia Raman Estimulada um pulso de
dois comprimentos de onda espacialmente coincidentes
(com polarizao paralela ou perpendicular) transfere
populaes do estado fundamental para um
rotovibracional excitado. Se a diferena de energia
corresponde a uma transio Raman permitida e se
nenhuma das frequncias corresponde ressonncia
eletrnica. Dois ftons UV aplicados antes da relaxao
proporcionam a deteco de espectros Raman
intramoleculares e intermoleculares de gases ou clusters
moleculares. uma tcnica de dinmica molecular
muito utilizada.
Spatially Offset Raman Spectroscopy
(SORS) o espalhamento Raman detectado de
regies lateralmente afastadas do ponto de excitao por

laser, levando a contribuies menores vindas da

camada superficial do que na espectroscopia Raman.
Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy
(CARS) dois feixes de laser so usados para gerar um
feixe coerente na frequncia anti-Stokes a ser
intensificado por ressonncia.
Raman optical activity/ Atividade ptica
Raman (ROA) medidas vibracionais de atividade
ptica em pequenas diferenas na intensidade do
deslocamento Raman de molculas quirais submetidas a
feixes de luz polarizada esquerda e direita ou
componentes circularmente polarizadas da luz
espalhada.
Transmisso Raman permite anlise
espectroscpica de amostras turvas, como ps, cpsulas,
tecido vivo etc. Foi uma tcnica por muito tempo
ignorada desde sua proposio na dcada de 60, mas
reavivada em 2006 para ensaios rpidos de doses de
frmacos. H ainda aplicaes em medicina
diagnstica.
Tip-Enhanced
Raman
Spectroscopy/
Espectroscopia Raman Intensificada por Ponta
(TERS) Usa uma ponta metlica (comumente de
prata ou ouro de microscopia de fora atmica) para
aumentar os sinais Raman de molculas da vizinhana.
A resoluo especial aproximadamente da extenso do
pice da ponta (20-30 nm). TERS j foi mostrada como
capaz de ter sensibilidade em nvel de uma nica
molcula.

CONCLUSO
A espectroscopia Raman mostra-se uma tcnica de
grande significncia tanto no cenrio cientfico, quanto
tecnolgico.
Na cincia ajuda a entender a matria a nvel quntico e
contribui para estudos cristalogrficos, mineralogia,
farmacologia, nanotecnologia, fsica do estado slido,
medicina diagnstica, gentica, fsico-qumica, qumica
orgnica, materiais complexos e tantas outras reas do
saber dependentes de sistemas cujas propriedades de
grande aplicabilidade no so acessveis ao olho nu.
Tecnologicamente, hoje foram criadas bases de dados
de padres Raman de quase todas as substancias de fcil
identificao para o planejamento de scanners. Existem
bancos de informao para narcticos, poluentes e
explosivos. Em laboratrios, espaos pblicos, como
aeroportos por exemplo, crucial controlar a presena
dessas substncias.
Para o futuro, portanto, a espectroscopia Raman poder
ter vasta utilizao no progresso cientifico e tecnolgico
da sociedade, tanto por seus usos j conhecidos, quanto

s potenciais aplicaes que

engenhadas.

ainda podem ser

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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2010)

ANEXOS
Prmios Nobel em espectroscopia
Seguem, em ordem crescente na linha do tempo, os
nomes dos cientistas que contriburam e contribuem
para o avano da espectroscopia, agraciados pela
Fundao Nobel. Os prmios referem-se tanto a

trabalhos tericos e prticos referentes a tcnicas,

quanto a aplicaes e descobertas.

N. Bloembergen (1981) fornece contribuies

ptica no linear

Contribuies experimentais:

H.G. Dehmelt e W. Paul (1989) inventam a

armadilha de ons

H. A. Lorentz e P. Zeeman (1902) pela

descoberta do desdobramento das raias
espectrais de um espectro em resposta
aplicao de um campo magntico amostra
J. Stark (1919)
pela descoberta
do
desdobramento de
raias espectrais de
um
espectro
submetido
a
aplicao
de
campo eltrico
amostra
C. V. Raman
(1930)
pela
demonstrao de
shifts de raias
espectrais originados de espalhamento inelstico
da luz Efeito Raman
W. E. Lamb Jr. (1955) pela descoberta de
desdobramentos no primeiro estado excitado do
hidrognio atmico
R. S. Mulliken (1966) e G. Herzberg (1971) por
suas contribuies espectroscopia molecular
A. L. Schawlow (1981) pelo trabalho no campo
de espectroscopia a laser
A. Zewail (1999) pelos estudos dos estados de
transio de reaes qumicas usando
espectroscopia de femtossegundos.
Contribuies tericas:
M. Planck (1918) pela descoberta do quantum
N. Bohr (1922) por ser o primeiro a associar as
regularidades dasa linhas espectrais com as
propriedades qunticas dos tomos
P.A.M. Dirac e E. Schrodinger (1933) pelas
contribuies teoria quntica atmica
W. Pauli (1945) pela descoberta do princpio de
excluso
Invenes relacionadas espectroscopia
A.A. Michelson (1907) cria o Interfermetro de
Michelson, marco na histria da instrumentao
espectroscpica da fsica moderna
C.H. Townes , N.G. Basov and A.M. Prokhorov
(1964) desenvolvem o maser, uma fonte de
radiao coerente que levou inveno do laser,
que possibilitou o desenvolvimento de toda a
espectroscopia moderna
A. Kastler (1966)desenvolve mtodos pticos no
estudo da ressonncia hertziana nos tomos

Breve biografia de Sir Chandrasekhara Venkata

Raman
Chandrasekhara Venkata Raman nasceu em
Trichinopoly, na ndia setentrional, em 7 de Novembro
de1988. Seu pai era laureado em fsica e matemtica, de
forma que propiciou a Raman imerso no mundo
acadmico desde cedo. Em 1902, entrou no Presidency
College em Madras e em 1904 passou no exame para
Bacharel em primeiro lugar, com medalha de ouro em
Fsica. Em 1907 recebeu aprovao com louvor e
distino em seu trabalho de ps-graduao.
Suas primeiras pesquisas em ptica e acstica dois
campos de investigao aos quais ele dedicou toda sua
carreira foram feitos enquanto ele ainda era estudante.
Em 1917, trabalhando na Universidade de Calcut em
difrao da luz, descobriu que quando uma luz intensa
passa atravs de um meio transparente, uma pequena
frao de luz espalhada em todas as direes, com
frequncias ligeiramente diferentes daquela do feixe
incidente. A importncia da descoberta de Raman foi
amplamente reconhecida e recebeu o prmio Nobel de
Fsica em 1929. Raman trabalhou tambm em acstica
de instrumentos musicais.
Utilizando um mecanismo para controlar o movimento
do arco, ele mediu os efeitos da velocidade e da posio
do arco, e desenvolveu a teoria da vibrao que o arco
produz nas cordas do violino. Ele investigou tambm a
natureza harmnica dos instrumentos indianos. Entre
1934 e 1942 publicou trabalhos tericos e experimentais
de difrao da luz por ondas acsticas ultrassnicas e
hipersnicas e sobre efeitos produzidos por raio-X em
cristais expostos luz. Em 1948 desenvolveu estudos
espectroscpicos em cristais e seu laboratrio passou a
trabalhar tambm com estrutura e propriedades pticas
de diamantes e outros materiais (gata, opala e prolas).
Outros de seus interesses foram a ptica das substncias
coloidais, anisotropia eltrica e magntica e a fisiologia
da viso humana.
Destaca-se que C. V. Raman foi o primeiro indiano a
vencer o prmio Nobel, tendo realizados seus estudos e
formao completamente na ndia.

Efeito Raman
Ricardo Simionato Boffa
INTRODUO
Esta monografia tem como objetivo estudar uma das
diversas tcnicas espectroscpicas, sendo ela o efeito
Raman ou espalhamento Raman. A espectroscopia
Raman nos da informao sobre as vibraes
moleculares. Ela est envolvida no espalhamento da luz
incidente e a informao obtida das mudanas
resultantes na frequncia da luz. Uma vantagem desta
tcnica que pode ser feita facilmente em amostras
contendo gua (maioria das amostras biolgicas). Alm
disso, o espalhamento da luz ocorre nas regies do
visvel e do ultravioleta do espectro eletromagtico.
Entretanto, a intensidade do espectro Raman muito
fraca. Se, entretanto a frequncia da luz incidente tiver
um valor dentro da banda de absoro eletrnica do
cromforo da molcula, ento algumas vibraes
associadas com aquele cromforo podem ser
drasticamente melhoradas. Se a frequncia de excitao
for a mesma da frequncia de mxima absoro do
cromforo, a tcnica ento ser chamada de
Espectrocopia Raman Ressonante.

ANLISE TERICA
Histrico
Este fenmeno foi previsto teoricamente por Smekal em
1923 e verificado experimentalmente por C.V.Raman e
K.S.Krishnan em 1928, tendo este recebido o Prmio
Nobel de Fsica em 1932 por este feito.
A partir da, teve incio a assim chamada espectroscopia
Raman. O nmero de trabalhos publicados aumentava a
cada ano, tendo sido obtidos e interpretados os
espectros de milhares de substncias. Antes do advento
dos primeiros espectrmetros de absoro no
infravermelho comerciais (incio da dcada de 40), a
grande maioria dos dados vibracionais de que se
dispunha era oriunda dos espectros Raman. Uma vez
que o fenmeno fsico envolvido diferente do da
absoro, as regras de seleo tambm so diferentes e
as informaes obtidas pelas duas tcnicas se
complementam.
A partir da dcada de 40, com o desenvolvimento dos
mtodos de clculo de coordenadas normais, passo-se a
ter uma slida base matemtica na atribuio das
freqncias observadas. Vrios compostos tiveram sua
estrutura elucidada atravs da aplicao da teoria de
grupo, a qual permite a previso do nmero e tipo de
modos vibracionais ativos no espalhamento Raman e na
absoro no infravermelho.

A obteno dos espectros Raman era uma tcnica

artesanal, pois para a obteno da radiao excitante
eram utilizadas, entre outras fontes, lmpadas de vapor
de mercrio, as quais emitiam uma srie de outras
linhas indesejadas, sendo necessrio o uso de filtros
especiais para isolar a linha de interesse. Entretanto,
vrios compostos absorviam intensamente estas linhas
ou eram por ela decompostos fotoquimicamente,
impedindo a obteno do espectro raman.
Nesta poca, Stammreich, Sala, Bassi, Forneris e
Ayrosa, do Departamento de Fsica da Faculdade de
Filosofia, Cincias e Letras da USP, desenvolveram
lmpadas especiais de hlio e de rubdio, com alta
durao e luminosidade, as quais, emitindo linhas na
regio do amarelo e do vermelho, permitiram a
obteno dos espectros Raman inditos de uma srie de
compostos importantes.
Outros avanos na instrumentao, tais como emprego
de espectrmetros de varredura com duplos ou triplos
monocromadores
e
deteco
por
tubos
fotomultiplicadores facilitaram a tarefa relativamente
complicada de se obter um espectro Raman.
Atualmente,a deteco feita por detectores
multiplexados como CCDs (Charge Coupled Devices)
que permitem a obteno do espectro inteiro
simultaneamente, diminuindo drasticamente os tempos
de aquisio espectral.

Descrio Fsica
Geralmente, o espalhamento ocorre quando os eltrons
em uma molcula oscilam em fase com a onda
eletromagntica aplicada. O quo forte ser o
espalhamento depende da polarizao dos eltrons na
molcula. A maioria dos eltrons oscilantes espalham
luz na mesma frequncia da onda incidente
(espalhamento Rayleigh). Entretanto, durante o tempo
que os eltrons oscilam, uma vibrao pode ocorrer que
far com que parte da energia da luz incidente seja
transferida molcula(e vice versa). Isso causar uma
mudana na frequncia da luz espalhada e esse
fenmeno conhecido como o efeito Raman.
A energia quantizada, ento a transferncia de energia
pela molcula deve corresponder uma diferena E
entre os nveis de energia da molcula fazendo o
espalhamento.
Uma representao esquemtica dos processos
envolvendo os experimento de espalhamento Raman
mostrado na figura 1. O nvel de energia no qual a

molcula oscilante excitada s vezes chamado nvel

de energia virtual. Deste nvel a molcula pode perder
sua energia elsticamente por espalhamento direto, ou
seja, emitir uma luz na mesma frequncia que a
irradiada (espalhamento Rayleigh). Alternativamente,
se a molcula muda seu estado vibracional, o
espalhamento inelstico. A frequncia do
espalhamento ser menor que a frequncia irradiada se
a molcula for para um estado vibracional maior
durante o espalhamento. Esse processo resulta em
linhas Stokes no espectro Raman. Se a molcula for
para um estado vibracional menor durante o
espalhamento, a frequncia de espalhamento ser maior
e linhas anti-Stokes sero produzidas. Na figura 2 podese se ver um exemplo do espectro Raman considerando
o espalhamento Rayleigh, as linhas Stokes e as linhas
anti-Stokes.

Figura 1: Espalhamento Raman (Para comparao, o

processo envolvido no IR mostrado). As linhas horizontais
representam nveis de energia vibracionais diferentes nos dois
estados eletrnicos

Uma molcula pode ser distorcida mais facilmente em

algumas direes do que em outras. Neste caso dizemos
que a polarizabilidade anisotrpica. Se ela pode ser
distorcida igualmente em todas as direes, a
polarizabilidade isotrpica.
Assim, a regra de seleo no espalhamente Raman
requer que uma vibrao resulte numa mudana na
polarizabilidade molecular.

Espalhamente Raman Ressonante

No efeito Raman normal, a radiao de excitao
possua energia bem menor do que a necessria para
ocorrer uma transio eletrnica na molcula.
Entretanto, na medida em que esta radiao se aproxima
da transio, observa-se um grande aumento da
intensidade das bandas Raman fundamentais, podendo
at aparecer harmnicas e combinaes com
intensidade aprecivel. Os valores das freqncias
vibracionais no se alteram, pois so funes somente
dos estados vibracionais do estado eletrnico
fundamental (e no dos estados intermedirios). Os
modos vibracionais que sero intensificados so aqueles
em que a coordenada interna de equilbrio
substancialmente diferente nos estados fundamental e
excitado.
Dentre as caractersticas do espalhamento Raman
ressonante, podemos citar o grande aumento da
intensidade das bandas Raman fundamentais (at 106),
podem ser observadas tambm bandas harmnicas e
combinaes com intensidade aprecivel, os valores das
freqncias vibracionais no se alteram, por serem
funo somente dos estados vibracionais do estado
eletrnico fundamental e no dos estados excitados, os
modos vibracionais mais intensificados so aqueles em
que a coordenada molecular interna de equilbrio
substancialmente diferente nos estados eletrnicos
fundamental e excitado, dentre outras
Algumas das vantagens do uso da tcnica ressonante
com relao normal a elevada intensificao do
espalhamento, a seletividade, pois intensificam modos
vibracionais que pertenam ao grupo cromforo
responsvel pela transio eletrnica que se est
investigando, etc.

Figura 2: Exemplo de Espectro Raman

Regra de seleo para o espalhamento Raman

No efeito Raman a atividade est ligada ao momento de
dipolo induzido na molcula pelo campo eltrico da
radiao (diferente do infravermelho onde se considera
a variao do momento dipolar intrnseco com a
vibrao). como se houvesse uma interao do campo
eletromagntico da radiao com o campo eltrico
produzido pelo movimento eletrnico.

Na figura 3 pode-se ver um esquema ilustrando o

aumento da intensidade da luz espalhada no
espalhamento Raman ressonante em comparao com o
normal

CONCLUSES
Analisando as diversas formas de espalhamento Raman,
podemos ver que para os casos ressonante e prressonante teremos um ganho muito melhor do que
utilizando a tcnica normal.

Figura 3: Diferena entre espalhamento Raman normal e

ressonante

Espalhamento Raman Pr-Ressonante

Muitras vezes, o experimentalista no possui uma fonte
de luz apropriada para irradiar na banda mxima de
absoro do cromforo. O ganho no espalhamento
mximo quando a frequncia irradiada corresponde
condio de ressonncia. De acordo que a frequncia de
irradiao desvia desta frequncia, o ganho decresce
rapidamente. Por exemplo, a 4-nitroanilina tem uma
banda de absoro centrada em 350 nm. Irradiaes em
457,9 nm ainda produzem um ganho relativo de 20 na
banda, 1334 cm-1 devido ao grupo nitro comparado
com a radiao 633 nm (que essencialmente produz o
espectro Raman convencional). ento possvel usar
uma srie de comprimentos de onda dependendo do das
fontes de luz laser disponveis e ainda obter um ganho
razovel. claro, entretanto, que mesmo este ento
chamado espalhamento Raman pr-ressonante podendo
levar ganhos, quanto mais perto a frequncia de
irradiao estiver do mximo no pico de absoro,
melhor ser o ganho. Na figura 4 est um exemplo
mostrando os nveis de energia num processo de
espalhamento Raman pr-ressonante

Figura 4: Pre-Resonance Raman Scattering

Dentre algumas aplicaes, estas tcnicas podem ser

usadas para estudar as transies eletrnicas em
compostos de coordenao, os estados eletrnicos
moleculares excitados, as transies eletrnicas em
espcies de valncia mista. Vale lembrar que para o
espalhamento Raman convencional, a maior vantagem
a de que a gua espalha to fracamente que no mais
obscurece tanto o espectro resultante, como no caso da
espectroscopia utlizizando o infravermelho. Para o
espalhamente Raman ressonante, vemos que ele
consegue investigar as vibraes de stios especficos
que esto associados diretamente com o cromforo.
Somente as vibraes que distorcem a molcula na
mesma direo das transies eletrnicas permitidas do
cromforo so eficientemente aumentadas. E por fim
para o espalhamento Raman pr-ressonante temos a
bvia vantagem de no precisarmos estar fornecendo
luz irradiada exatamente no mximo de absoro da
banda do cromforo.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Iain D. Campbell Raymond

Biological Spectroscopy 1984

http://www.webexhibits.org/causesofcolor/14D.h
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http://masi.iqsc.usp.br/files/EspectroscopiaRaman1.pdf

A.

Dwek

Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier e seu

Uso na Anlise do Vinho
Vanessa Kiraly Thomaz Rodrigues
INTRODUO
A espectroscopia estuda a interao da radiao
eletromagntica com a matria, sendo um dos seus
principais objetivos o estudo dos nveis de energia de
tomos ou molculas. Normalmente, as transies
eletrnicas so situadas na regio do ultravioleta ou
visvel, as vibracionais na regio do infravermelho e as
rotacionais na regio de microondas e, em casos
particulares, tambm na regio do infravermelho
longnquo. Em uma molcula, o nmero de vibraes, a
descrio dos modos vibracionais e sua atividade em
cada tipo de espectroscopia vibracional (infravermelho
e Raman) podem ser previstas a partir da simetria da
molcula e da aplicao da teoria de grupo. Embora
ambas as espectroscopias estejam relacionadas s
vibraes moleculares, os mecanismos bsicos de
sondagem destas vibraes so essencialmente distintos
em cada uma. Em decorrncia disso, os espectros
obtidos apresentam diferenas significativas: quando da
ocorrncia de um mesmo pico nos espectros Raman e
no infravermelho observa-se que o seu tamanho relativo
nos espectros muito diferente.
Existe, tambm, o caso onde um certo pico aparece em
um espectro e totalmente ausente em outro. Devido a
essas diferenas, a espectroscopia no infravermelho
superior em alguns casos e em outros a espectroscopia
Raman oferece espectros mais teis.
De modo geral, pode-se dizer que as espectroscopias
Raman e infravermelho so tcnicas complementares. A
condio para que ocorra absoro da radiao
infravermelha que haja variao do momento de
dipolo eltrico da molcula como conseqncia de seu
movimento vibracional ou rotacional (o momento de
dipolo determinado pela magnitude da diferena de
carga e a distncia entre dois centros de carga).
Somente nessas circunstncias, o campo eltrico
alternante da radiao incidente interage com a
molcula, originando os espectros. De outra forma,
pode-se dizer que o espectro de absoro no
infravermelho tem origem quando a radiao
eletromagntica incidente tem uma componente com

freqncia correspondente a uma transio entre dois

nveis vibracionais.
A vibrao dos tomos no interior de uma molcula
apresenta energia coerente com a regio do espectro
eletromagntico correspondente ao infravermelho (100
a 10000 cm-1).
Os tomos em uma molcula nunca esto imveis. Se,
em um sistema, h N tomos livres para se
movimentarem nas trs dimenses, o sistema ter 3N
graus de liberdade. Se, no entanto, esses tomos
estiverem ligados entre si, formando uma molcula,
continuaro ainda existindo 3N graus de liberdade,
sendo trs graus para a translao do centro de massa da
molcula e, para uma molcula no linear, trs graus
para a rotao da mesma em torno dos trs eixos,
restando assim, 3N-6 graus de liberdade para as
vibraes.
Para molculas lineares, como no h rotao em torno
do eixo internuclear, restam 3N-5 graus de liberdade
para as vibraes. Esses graus de liberdade
correspondem aos diferentes modos normais de
vibrao de uma molcula.
Um modo normal de vibrao aquele em que cada
ncleo realiza uma oscilao harmnica simples em
torno de sua posio de equilbrio, todos os ncleos se
movem com a mesma freqncia e em fase e o centro
de gravidade da molcula permanece inalterado.
Na prtica, nem sempre o nmero de modos normais de
vibrao corresponde ao nmero de bandas observadas
no espectro. Isso ocorre devido existncia de
vibraes de mesma energia (degenerescncia),
apresentando a mesma freqncia e, conseqentemente,
a mesma posio no espectro.
Alm das freqncias associadas s vibraes normais,
freqncias adicionais podem aparecer no espectro,
resultantes dos seguintes fatores:
Sobretons - bandas com valores de freqncia
correspondentes a mltiplos inteiros daqueles das
vibraes normais. Por exemplo, seja o valor da
freqncia de um dado modo normal de vibrao, os

sobretons vo aparecer com valores aproximados de 2,

3, etc.
Bandas de combinao so combinaes lineares
das freqncias normais ou mltiplos inteiros destas.
Por exemplo, sejam a e b valores de freqncia de
modos normais de vibrao, podem ocorrer as bandas
de combinao (a + b), (a - b), (a + 2b), etc.
As atividades dos sobretons e das bandas de
combinao podem ser deduzidas pela teoria de grupos.
Em todos os casos as intensidades dessas bandas sero
menores quando comparadas com as dos modos
normais.
As vibraes moleculares podem ser classificadas em
deformao axial (ou estiramento) e deformao
angular e podem ser simtricas ou assimtricas. As
vibraes angulares podem ainda ser classificadas como
no plano ou fora do plano. Os diferentes tipos de
vibrao so mostrados na figura 1.

A regio do espectro eletromagntico correspondente ao

infravermelho se estende de aproximadamente 0,75 m
at quase 1 mm, mas o segmento mais freqentemente
utilizado pelos qumicos est situado entre 2,5 e 25 m
(4000 a 400 cm-1), conhecido como regio fundamental
ou infravermelho mdio. A regio de mais baixa
freqncia (600 a 200 cm-1) conhecida como
infravermelho longnquo e a regio de mais alta
freqncia (4000 cm-1 at a regio do visvel) como
infravermelho prximo ou regio de sobretons.
O espectro infravermelho de um composto qumico
considerado uma de suas propriedades fsico-qumicas
mais caractersticas e, por conta disto, a espectroscopia
na regio do infravermelho tem extensa aplicao na
identificao dos compostos. Outra importante
aplicao do infravermelho, mas ainda bem menos
utilizada, a anlise quantitativa de misturas de
compostos. Como a intensidade de uma banda de
absoro proporcional a concentrao do componente
que causou esta banda, a quantidade de um composto
presente em uma amostra pode ser determinada atravs
de uma curva de calibrao (intensidade da banda
versus concentrao) construda a partir de amostras
com concentraes conhecidas do composto em
questo.

No entanto, quanto mais complexa a amostra, ou seja,

quanto maior o nmero de interferentes presentes, mais
difcil se torna a construo de uma calibrao
univariada confivel, sendo necessrio lanar mo de
clculos estatsticos mais rebuscados, que permitam a
utilizao de vrios comprimentos de onda para
determinao de uma nica propriedade, obtendo-se,
assim, uma calibrao multivariada.

ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO
POR TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)
A base de qualquer espectrmetro FTIR o
interfermetro de Michelson (figura 2). Nesse sistema, a
radiao de uma fonte monocromtica hipottica
dividida em dois feixes, cada um correspondendo
idealmente a 50% do original, no "beamsplitter"
(divisor de feixe). Um dos feixes (A) segue em direo
ao espelho de posio fixa no qual reflete de volta para
o "beamsplitter", onde parte deste feixe reflete de volta
para a fonte e parte vai para o detector. O outro feixe
(B) parte do "beamsplitter" em direo ao espelho
mvel. O espelho mvel tambm reflete o feixe B, parte
de volta para a fonte e parte para o detector. Se a
posio do espelho mvel tal que o feixe B percorre a
mesma distncia que o feixe A antes de chegar ao
detector (=n, onde n=0,1,2,...), ento os dois feixes
esto em fase, reforando um ao outro (interferncia
construtiva) e, neste caso, a energia que chega ao
detector ser mxima. Por outro lado, se a posio do
espelho mvel for tal que o caminho do feixe B seja
diferente daquele do feixe A por (n+1)/2, ento os dois
feixes estaro 90 fora de fase, cancelando um ao outro.
A energia que chega no detector, nesse caso, ser
mnima. Portanto, medida que o espelho mvel
percorre determinada distncia, um interferograma,
como o mostrado na figura 2, formado.
A intensidade da radiao que chega no detector, I(),
varia como uma funo cosseno da retardao ptica :

Quando uma fonte de radiao policromtica usada, o

interferograma pode ser interpretado como a soma dos
cossenos das ondas que contribuem para a freqncia e,
para uma fonte contnua de infravermelho, esta soma
torna-se uma integral:

O interferograma de uma fonte de freqncia nica

uma funo cosseno com periodicidade que varia com o
valor da freqncia. O interferograma de uma fonte de
duas freqncias pode ser calculado pela soma algbrica
das duas funes cosseno correspondentes a cada uma
das linhas individuais da fonte, como mostrado na
figura 3.

Apesar de o interferograma conter toda a informao

fornecida pelo espectrmetro sob um dado conjunto de
condies, a forma com que essa informao se
apresenta no muito til para os espectroscopistas,
muito menos para os qumicos analticos. Essa
informao convertida em espectro, relacionando-se
as intensidades com as respectivas freqncias, atravs
da transformada de Fourier. A relao entre o
interferograma e o espectro dada pela equao (04):

onde B() a intensidade do espectro em funo da

freqncia.
O interferograma , portanto, formado pela soma de
todas as ondas de diferentes amplitudes e freqncias
que chegam ao interfermetro e possui todas as
informaes espectrais da amostra.
As principais vantagens da espectroscopia FTIR so:

O instrumento apresenta poucos elementos

pticos e no necessita de fenda (vantagem de
Jacquinot). A potncia da radiao que chega ao
detector maior do que nos instrumentos dispersivos e
maiores relaes sinal/rudo so observadas.

Um interferograma tpico de uma fonte de

infravermelho mostrado na figura 4. Nota-se que
quando =0, as ondas esto em fase e medida que o
espelho se move, a partir de , em ambas as direes,
I() varia de acordo com as contribuies das vrias
freqncias que podem estar em fase ou fora de fase.

Melhores preciso e exatido em termos de

comprimento de onda.

Todos os sinais da fonte alcanam o detector

simultaneamente (vantagem de Fellgett ou multiplex).
Essa caracterstica torna possvel a obteno de todo o
espectro de uma s vez e, com essa economia de tempo,
possvel aumentar o nmero de varreduras (scans)
para aumentar a razo sinal/rudo.
Apesar de a equao 4 mostrar que um espectro
completo requer a integrao de menos infinito at mais
infinito, o deslocamento do espelho mvel num
instrumento FTIR real no pode ser estendido ao
infinito. necessrio, ento, que um tratamento
matemtico, chamado apodizao, seja feito no

interferograma para que este possa ser convertido em

espectro. As duas maneiras mais comuns, disponveis
na maioria dos instrumentos FTIR, so as apodizaes
boxcar e triangular, mostradas na figura 5.

POTENCIALIDADES DA ESPECTROMETRIA
DE INFRAVERMELHO POR TRANSFORMADA
DE FOURIER (FTIR) NA ANLISE DE VINHO:
O vinho provm de uma sequncia de processos
qumico-biolgicos que condicionam a sua composio,
em que a multiplicidade de compostos originados
determinante nas caractersticas organolpticas que o
produto apresenta.

ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO
POR REFLETNCIA TOTAL ATENUADA
(ATR):
A espectroscopia de Reflexo Interna ou Refletncia
Total Atenuada (ATR) uma tcnica utilizada para se
obter espectros no infravermelho de amostras como:
pastas, adesivos e p que no podem ser analisados
pelos mtodos normais, como pastilhas ou filmes.
O princpio deste tipo de espectroscopia baseia-se no
fato de que quando um feixe de radiao passa de um
meio mais denso (cristal de ATR) para um meio menos
denso (amostra), ocorre reflexo. A frao do feixe de
luz incidente que refletida aumenta conforme aumenta
o ngulo de incidncia, e quando excede um
determinado ngulo crtico (a) a reflexo completa.
No ponto de reflexo (de acordo com observaes
experimentais) o feixe atua como se penetrasse a uma
pequena distncia dentro da amostra. A profundidade de
penetrao (dp) dada pela equao 5:

O conhecimento das modificaes que a composio

sofre ao longo do processo de vinificao igualmente
relevante para a anteviso do potencial de evoluo do
vinho. Sendo o vinho um produto cuja composio
manipulvel por fraude, esto fixados valores limite
para certos parmetros fsicos e qumicos, os quais so
objeto de controlo pelas autoridades, neles se
estabelecendo a base da lealdade das trocas comerciais.
Os laboratrios enolgicos encontram-se perante o
desafio de prestarem uma resposta rpida a solicitaes
cada vez mais diversas e exigentes, em que resultados
fiveis a baixos custos operacionais so uma
preocupao dominante.
Nos ltimos anos, vm sendo lanados no mercado
diversos equipamentos que utilizam a Espectrometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR). s
aplicaes quase exclusivamente centradas no controlo
de leite sucederam novos desenvolvimentos na rea
vitivincola, quer no controlo de massas vnicas no
momento da vindima, quer no controlo de vinhos e
outros produtos da mesma fileira.
A espectrometria FTIR permite a determinao
automatizada dos parmetros de maior importncia na
caracterizao de mostos, de vinhos e de vinagres.
Sendo uma metodologia que:
origina rapidamente uma informao sumria sobre
o produto (30 s / amostra)

no poluente j que no utiliza reagentes

no carece de pessoal especializado para ser

operada em rotina
A radiao de penetrao chamada onda evanescente.
Se a amostra absorve em certo comprimento de onda
evanescente, h uma atenuao do feixe a
comprimentos de onda correspondentes s bandas de
absoro no infravermelho, originando o espectro.
A tcnica ATR tem grande utilidade para examinar
materiais densos ou com alta absoro, como o caso
da gasolina, e tambm solues aquosas.

verstil, podendo ser direcionada para outras

determinaes complementares a sua utilizao em
laboratrios de controle perspectiva-se da maior
importncia.

PRINCPIOS
A metodologia de anlise por FTIR no constitui um
processo de anlise absoluto. O valor analtico do

parmetro a determinar obtido pela aplicao de um

algoritmo em que so compensadas as contribuies de
interferentes relativamente ao valor que adviria da
ponderao direta das absorbncias nos diversos
comprimentos de onda.
Para tal, necessrio efetuar calibraes analticas
especficas, estabelecidas atravs da quantificao dos
parmetros a analisar por mtodos correntes. A seleo
de comprimentos de onda apropriados para
quantificao de cada parmetro determinante no
desenvolvimento de novas calibraes, pelo que se deve
dispor de uma grande diversidade de vinhos, com
caractersticas to prximas quanto possvel dos que
iro ser objeto de anlise.
Para efetuar uma calibrao, o equipamento deve ler o
espectro de infravermelho de um conjunto de amostras
de vinho e os parmetros a calibrar devem ser
quantificados nesses vinhos, de modo a serem usados
como valores de referncia (Figura 6).

A leitura do espectro de infravermelho de uma amostra

de vinho permite o clculo do resultado dos
parmetros calibrados (Figura 8).

MATERIAL E MTODOS
Amostras

O equipamento seleciona os comprimentos de onda

(Filtros), que para cada parmetro, apresentam maior
variao estatstica para os valores de referncia
analticos. Seleciona tambm os filtros de referncia de
modo a obter os canais, isto , as razes entre as
absorbncias dos filtros e as absorbncias dos filtros de
referncias.
A calibrao para cada parmetro consiste depois no
clculo de coeficientes para cada canal se selecionado
atravs da regresso PLS ou Partial Least Squares
minimizando o CVE ou Cross-validation error
(Figura 7).

Nos ensaios realizados foram utilizadas 897 amostras de

vinho divididas em diferentes subclasses de vinhos:
425 tintos, 296 brancos, 96 rosados e 80 espumantes.
A nica preparao das amostras necessria foi a
desgaseificao por ultra-sons no caso dos vinhos
apresentarem elevada concentrao de CO2 como o
caso dos espumantes e de alguns vinhos rosados.
Equipamento
O equipamento utilizado foi um espectrmetro
Winescan FT120 fabricado pela FOSS (Figura 9) que
permite a leitura do espectro de infravermelho na gama
de 926 a 5012 cm-1.

Para a calibrao global, todas as amostras foram

usadas para calibrar todos os parmetros, com exceo
dos acares totais.
Decidiu-se, no caso dos acares totais, dividir todas as
amostras em dois subgrupos: um contendo as amostras
em que a concentrao de acares totais era igual ou
inferior a 5 g/L e outro contendo as amostras com
concentrao de acares totais superior a 5 g/L. Estes
subgrupos de amostras foram usados para produzir duas
calibraes diferentes para os acares totais.

O Winescan FT120 calcula os resultados atravs de

uma regresso PLS utilizando 15 filtros por parmetro.
Todos os parmetros calibrados so analisados em
duplicado, no mesmo tempo de anlise (60 segundos) e
utilizando um volume de amostra de 20 mL.
Analisa-se em duplicado uma amostra durante 60
segundos e utilizando um volume de 20 mL. Foi
utilizado o lquido para o acerto de zero (reagente S6060), o lquido para limpeza do equipamento (reagente
S-470) e o equalizador. Todos os produtos foram
fornecidos pela FOSS.

Com o objetivo de melhorar a performance do

equipamento,
foram
desenvolvidas
calibraes
especficas dividindo as amostras em diferentes
subclasses: tintos, brancos, rosados e espumantes.

CONTROLE DE QUALIDADE
O controlo da qualidade dos resultados assegurado
pela utilizao da soluo zero, de uma soluo de
equalizao e de uma amostra de controlo dirio
constituda por um vinho, dividido por vrios frascos e
conservado no frigorfico.

RESULTADOS:
MTODOS ANALTICOS DE REFERNCIA

Preciso

Os parmetros desenvolvidos no equipamento de FTIR

foram os seguintes:

A preciso das calibraes foi avaliada atravs da

repetibilidade (r) e a preciso intermdia (PI). Os
resultados obtidos so os apresentados na Tabela 2.

Massa Volmica, Ttulo Alcoomtrico Volmico,

Extracto Seco Total, Acares Totais, Acidez Total,
Acidez Voltil, Dixido de Enxofre Total, pH, cido
Ctrico e ndice de Polifenois Totais
Os mtodos utilizados para obter os resultados
analticos de referncia foram os indicados na Tabela 1.

Exatido
A exatido da calibrao foi avaliada atravs do erropadro (SE) e do coeficiente de variao (CV(%)) e
calculada com um grupo de 75 amostras. Os resultados
obtidos so os apresentados na Tabela 3.
CALIBRAES
Foi obtida uma calibrao global com um conjunto de
897 amostras de vinho divididas em diferentes
subclasses de vinhos: 425 tintos, 296 brancos, 96
rosados e 80 espumantes.

Franaise dOenologie, No. 181, mars/abril

2000, p. 10-13.

Foi utilizado um grupo de 125 amostras para comparar

a exatido da calibrao global vs. calibrao
especfica. Todas as amostras foram analisadas pelo
equipamento em ambas as calibraes (global e
especfica) e o SE foi calculado para cada subclasse. As
calibraes especficas apenas conduziram a melhores
resultados no caso da determinao de acares totais
(Tabela 4).

Patz, C-D, et al., Wine Analysis using FTIR,

In focus, Vol. 24, No. 1, 2000, p. 16-18.

Dubernet, M., Dubernet, M. e Grasset F.,

Nouvelles applications de lanalyse infra-rouge
dans les vins et les mots, Feuillets Verts OIV,
N.1089.

Gishen M. e Holdstock M., Preliminary

evaluation of the performance of the Foss
Winescan FT120 instrument for
the
simultaneous determination of several wine
analyses, The Australian Wine Resarch
Institute, Anual Technical Issue 2000, p. 75-81.

Reference Manual - WineScan FT120, Foss,

Issue 4 GB, August 2000.

E.C. Regulation N. 2676/90 dated 17/9/1990,

Official Journal of the European Communities
N.L272 of3/10/1990

A calibrao especfica desenvolvida para a anlise de

acares totais conduz a resultados mais ajustados aos
obtidos por mtodos analticos de rotina, sendo
indiferente o uso de uma calibrao global ou especfica
para os restantes parmetros.

CONCLUSO
Esta metodologia est particularmente destinada s
situaes em que o prazo de resposta crtico e a
utilizao de mtodos oficiais no se torna imperativa.
A no utilizao de reagentes, a simplicidade de
operao a elevada cadncia e os baixos custos de
anlise e de manuteno tornam a espectrometria FTIR
competitiva relativamente a outros equipamentos
baseados em tecnologias analticas seqenciais, por
fluxo contnuo ou por fluxo segmentado, disponveis h
longos anos no mercado.
A calibrao global permite bons resultados para quase
todos os parmetros. As calibraes especficas obtidas
permitiram uma melhoria na exatido dos resultados
dos acares totais.

BIBLIOGRAFIA

Dubernet, M., Dubernet, M., Utilisation de

lanalyse infrarouge transforme de Fourier
pour lanalyse oenologique de routine, Revue

Espectroscopia Vibracional: Infravermelho

Andrea Rodrigues Cardoso
OBJETIVO
Discutir os princpios fundamentais que embasam a
tcnica de espectroscopia de infravermelho.

INTRODUO
O termo espectroscopia, em cincia, refere-se ao uso da
interao
entre
qualquer
tipo
de
radiao
eletromagntica e a matria para o estudo dos tomos e
molculas que a compem, bem como das ligaes que
determinam sua estrutura. Pode-se dizer, em termos
mais gerais, que mesmo nossos olhos so detectores
espectroscpicos, j que por meio deles que
percebemos a interao entre a luz e tudo que nos cerca,
permitindo identificarmos, por exemplo, todas as cores
de um jardim florido.

Histria: A descoberta das radiaes ultravioleta e

infravermelha
Apesar de a decomposio da luz em um espectro de
cores somente ter sido descrita em maiores detalhes por
Isaac Newton, no sculo XVII, com o experimento da
passagem da luz por um prisma, tal fenmeno
conhecido desde a Antiguidade sabia-se que as cores
do arco-ris resultavam da decomposio da luz solar.

ingls William Hyde Wollaston

descoberta, tambm nessa poca.

fez

mesma

J a radiao infravermelha, objeto deste estudo, foi

descoberta pelo ingls William Herschel em 1800. O
astrnomo percebeu que, ao expor o bulbo de um
termmetro de mercrio s diferentes regies coloridas
do espectro, a temperatura subia mais rapidamente
quanto mais prximo o bulbo estivesse da regio do
vermelho e mais ainda: descobriu que a elevao da
temperatura era ainda mais rpida na regio posterior ao
vermelho. Esta radiao, tambm invisvel aos nossos
olhos, foi ento chamada de infravermelho.
A
radiao
eletromagntico

infravermelha

no

espectro

A regio do espectro eletromagntico que compreende a

radiao
infravermelha
localiza-se
entre
os
comprimentos de onda da radiao visvel (entre 400
nm e 800nm, aproximadamente) e das microondas (at
1 mm). Quase todos os compostos que tm ligaes
covalentes em sua estrutura absorvem radiaes de
frequncias no infravermelho, sendo a regio
vibracional dessa parte do espectro a de maior interesse
para anlises estruturais.
A relao entre o comprimento de onda e a frequncia
da radiao dada pela velocidade da luz: c=; onde c
a velocidade da luz, o comprimento de onda e a
frequncia da radiao. J a energia E dada por: E=h;
onde h a constante de Planck.

Mais tarde, em 1777, o qumico sueco Carl Wilhelm

Scheele deduziu que a luz violeta deveria ser a mais
energtica do espectro, por meio de um experimento em
que colocava amostras de cloreto de prata nas diferentes
regies do espectro solar. O princpio, neste caso, o
mesmo da fotografia em preto e branco, cujo filme
contm uma suspenso de brometo de prata, o qual
escurece ao ser iluminado: a luz promove a reduo dos
ons prata, formando prata metlica finamente dividida,
que preta. Desta forma, ao colocar amostras
separadamente em cada regio do espectro, Scheele
observou que, quanto mais prxima da extremidade
violeta estivesse a amostra, mais intenso era o processo
de escurecimento isso indicava uma sequncia
energtica no espectro de luz.

comum identificar a radiao eletromagntica pelo

seu nmero de onda, cuja unidade usual o cm-1. O
nmero de onda pode ser obtido da seguinte forma:
~ = 1 / , ou seja, o inverso do comprimento de onda
(dado em centmetros). Uma das razes para o uso desta
medida o fato de ser diretamente proporcional
energia. No caso da radiao infravermelha, a regio
vibracional corresponde ao intervalo de nmero de onda
entre 4000 e 400 cm-1.

A partir do mesmo experimento, o alemo Johann

Wilhelm Ritter descobriu, em 1801, a existncia de uma
radiao invisvel aos nossos olhos, porm mais
energtica que a violeta, razo pela qual tal radiao
recebeu o nome de ultravioleta. Isso foi possvel graas
deciso do cientista alemo de colocar uma amostra
de sal de prata tambm na regio do espectro alm do
violeta ele verificou que o processo de escurecimento
ocorria ainda mais intensamente. Independentemente, o

As absores de radiao no infravermelho que so

quantizadas correspondem a variaes de energia
entre 8 e 40 kJ/mol, as quais, por sua vez, correspondem
s frequncias vibracionais de estiramento e flexo da
maioria das ligaes covalentes das molculas. A
absoro ocorre somente quando a frequncia da
radiao infravermelha incidente igual frequncia
natural de vibrao de alguma ligao covalente
existente na molcula e, nesse caso, a energia absorvida

ABSORO NO INFRAVERMELHO

leva ao aumento da amplitude desses movimentos

vibracionais.
Alm disso, somente as ligaes que tm momento de
dipolo eltrico varivel no tempo absorvem esse tipo de
radiao a variao do dipolo eltrico deve ocorrer na
mesma frequncia da radiao incidente para que haja
absoro. Por essa razo, ligaes que so simtricas
(ou quase simtricas), ou seja, que tem grupos idnticos
(ou quase idnticos) no absorvem radiao no
infravermelho. o caso, por exemplo, das ligaes das
molculas de H2 e Cl2 e tambm de alcenos e alcinos
simtricos ou pseudossimtricos (quase simtricos).

Figura 1: Exemplo de molcula simtrica ( esquerda) e

molcula pseudossimtrica.

O
ESPECTRO
DE
INFRAVERMELHO

ABSORO

NO

Uma molcula pode ter, em sua estrutura, diversas

ligaes covalentes que iro absorver radiao
infravermelha de diferentes frequncias. Assim, de
acordo com o tipo e a quantidade de ligaes presentes
na molcula, gerado um perfil de absoro de
infravermelho tal padro nico para cada molcula e
a distingue das demais. Portanto, na grande maioria dos
casos, substncias com o mesmo espectro infravermelho
ou seja, cujos espectros de absoro coincidem pico a
pico so compostas pelos mesmos tipos de molculas,
nas mesmas quantidades e podem ser consideradas
idnticas.
Pelas mesmas razes, o espectro de absoro no
infravermelho pode ser utilizado para determinar
estruturas moleculares desconhecidas. So conhecidos
os padres de absoro de diversos tipos de ligaes
covalentes (Figura 1), o que permite, por meio da
anlise do espectro de absoro de uma molcula,
inferir quais tipos de ligaes so encontrados na sua
estrutura. Sabe-se, por exemplo, que absores entre
1615 cm-1 e 1815 cm-1 normalmente devem-se
existncia de carbonilas (ligaes C=O) na molcula em
estudo.

MODOS DE ESTIRAMENTO E FLEXO

Alguns tipos de vibrao de ligaes em molculas so
denominados vibraes ativas no infravermelho, o que
significa que fornecem um padro de absoro desse
tipo de radiao. Como j mencionado, as ligaes
podem vibrar em modos de estiramento e em modos de
flexo. Tais modos de estiramento simtrico e
assimtrico e de flexo tesoura ou dobramento
angular, balano, rotao e toro so chamados de
absores fundamentais e so exemplificados na Figura
3. Os modos de estiramento simtrico e assimtrico
esto sempre presentes em grupos em que pelo menos
dois de trs ou mais tomos so idnticos.
As absores fundamentais so assim chamadas pois
surgem da excitao do estado fundamental para o
primeiro estado excitado. No entanto, muitas vezes
essas absores fundamentais vm acompanhadas de
outros tipos de absoro, as quais aparecem,
normalmente, como picos menos intensos no espectro e
que tornam a sua anlise mais complicada. Esse o
caso dos sobretons, que so absores correspondentes
a excitaes do estado fundamental para estados de
maior energia (em relao ao primeiro estado excitado).
Essas absores so relacionadas a frequncias que so
mltiplos inteiros daquelas relacionadas s absores
fundamentais.
Outro tipo de absoro resulta da soma de duas
frequncias vibracionais, dando origem a uma terceira
se esta nova vibrao ativa no infravermelho,
chamada de banda de combinao. Caso a nova
frequncia resulte da subtrao de duas frequncias e
seja ativa no infravermelho, a vibrao identificada no
espectro como banda de diferena.
Caso haja combinao entre as vibraes fundamentais
e sobretons ou bandas de combinao, a nova vibrao
chamada de ressonncia de Fermi. Pode haver
tambm acoplamento entre frequncias vibracionais e
rotacionais estas ltimas, apesar de no serem ativas
no infravermelho, podem provocar alargamentos de
banda, os quais dificultam ainda mais a resoluo de
estruturas por anlise do espectro.

Figura 2: Regies de absoro relacionadas s vibraes de

estiramento das ligaes mais comumente encontradas.

Figura 3: Modos de vibrao

EFEITOS
DAS
LIGAES

CARACTERSTICAS

DAS

maiores forem as massas e, consequentemente, a massa

reduzida, menores sero as frequncias de vibrao.
Apesar de os efeitos sobre o valor de K mencionados

Como uma simplificao, as ligaes entre tomos

podem ser interpretadas como massas conectadas por
molas que podem ser comprimidas ou estiradas alm de
um comprimento de equilbrio, o qual corresponderia
distncia mdia de ligao. Alm disso, para simplificar
ainda mais o problema, somente molculas diatmicas
sero avaliadas nas consideraes que se seguem.
A energia de vibrao de um oscilador harmnico varia
periodicamente entre cintica e potencial. No total, ela
.
proporcional frequncia de vibrao:
Tal frequncia pode ser determinada facilmente, uma
vez que so conhecidos os valores da constante de fora
K, que varia de acordo com o tipo de ligao entre os
tomos, e da massa reduzida, que dada por:

Partindo da segunda lei de Newton e da lei de Hooke,

obtm-se uma equao para a frequncia natural de
vibrao, a qual pode ser reescrita em termos de nmero
de onda:

Substituindo os valores da velocidade da luz e da

e expressando
em termos das massas
constante
atmicas em kg/mol, chega-se seguinte relao:
,
Onde

influenciarem o valor de , uma boa aproximao

qualitativa pode ser obtida supondo que K valha 5, 10 e
15 dinas/cm para ligaes simples, duplas e triplas,
respectivamente. Desta forma, possvel calcular as
posies aproximadas das bandas no espectro
infravermelho.

ESPECTROFOTMETRO
DE
INFRAVERMELHO
POR
TRANSFORMADA
DE
FOURIER
Um dos equipamentos mais utilizados em
espectroscopia de infravermelho o espectrmetro de
infravermelho por transformada de Fourier ou FTIR (do
ingls, Fourier transform infrared spectrometer), cujo
funcionamento tem como base o interfermetro de
Michelson. Neste tipo de interferometria, a radiao
incidente passa por um divisor de feixe um espelho
semi-refletor posicionado em um ngulo de 45 em
relao ao feixe incidente resultando no aparecimento
de dois feixes perpendiculares entre si: um deles
correspondente poro da radiao que passa pelo
divisor sem deflexo e chega a um espelho mvel e o
outro, poro que refletida (a um ngulo de 90) e
chega a um espelho fixo. Ambos os feixes so refletidos
nos espelhos e voltam ao divisor de feixe. No entanto,
devido ao movimento do espelho mvel, o caminho
percorrido pelo primeiro feixe varia com o tempo e
difere daquele percorrido pelo segundo, criando, desta
forma, um padro de interferncia quando tais feixes se
reencontram no espelho divisor, as quais podem ser
construtivas ou destrutivas.

(M1 e M2 so as massas atmicas) e K expressa em

dinas/cm.
Por meio da anlise da ltima relao obtida para , vse que, quanto maior a constante de fora K, mais alta
a frequncia de vibrao isso significa que as
frequncias de vibrao de ligaes mais fortes so
mais altas do que as frequncias de vibrao de ligaes
mais fracas. Em uma primeira aproximao, os valores
adotados para essa constante, para ligaes duplas e
triplas, podem ser obtidos dobrando ou triplicando,
respectivamente, os valores adotados para uma ligao
simples. Outros fatores que afetam o valor de K e,
portanto, as frequncias de vibrao so a hibridizao
(as ligaes so mais fortes na seguinte ordem
sp>sp2>sp3), o tipo de vibrao a constante K tem
valores menores para flexes em comparao a
estiramentos e a existncia de efeitos de ressonncia,
que diminuem o valor de K. Alm disso, quanto

Figura 4: Diagrama esquemtico de FTIR

No caso do FTIR, o feixe resultante da combinao dos

feixes que percorreram diferentes caminhos pticos
direcionado para a amostra, a qual absorve as
frequncias correspondentes s vibraes naturais das
ligaes presentes em sua estrutura. Por fim, o feixe,
que j leva consigo toda a informao obtida pela
passagem pela amostra, chega ao detector e um

interferograma criado. Como esse processo muito

rpido (um interferograma pode ser obtido em menos de
um segundo), inmeros interferogramas podem ser
criados rapidamente e armazenados na memria de um
computador.
Entretanto, a anlise direta de um interferograma
muito complexa. Como a apresentao dos dados feita
no formato de intensidade em funo de tempo, a
informao a respeito das frequncias que caracterizam
as vibraes no fica explcita. Por essa razo,
desejvel que a informao seja apresentada no formato
de intensidade em funo de frequncia. Para tanto,
aplicada uma ferramenta matemtica, muito utilizada
em processamento de sinais, que capaz de converter
os dados obtidos, no caso, no domnio de tempo em
dados no domnio de frequncias trata-se da
transformada de Fourier. O tratamento dos dados com
esta ferramenta matemtica feito por meio da interface
existente entre o computador, que faz essa
transformao usando os interferogramas armazenados,
e o sistema de deteco. Desta forma, obtido o tpico
espectro infravermelho, que permite a leitura direta das
frequncias de absoro.

entretanto, ao fato de que o brometo de potssio absorve

gua, a qual pode interferir no espectro obtido.

COMENTRIO A RESPEITO DA ANLISE DO

ESPECTRO DE INFRAVERMELHO
O espectro de infravermelho deve ser analisado no s
de acordo com a posio (frequncia relacionada) dos
picos de absoro, mas tambm de acordo com a sua
intensidade e a sua forma, j que estas, muitas vezes,
facilitam a identificao e distino entre possveis
ligaes pertencentes estrutura (um exemplo de
espectro de infravermelho est ilustrado na Figura 4, no
tpico 6).
possvel encontrar, em alguns livros, alm de tabelas
de correlao para anlise do espectro de infravermelho
(Tabela 1), que fornecem as frequncias das vibraes
para diversas ligaes (em unidades de nmero de
onda) e as intensidades caractersticas, informaes a
respeito do formato dos picos e de possveis
sobreposies.

CONSIDERAO FINAL
As tcnicas de espectroscopia de infravermelho
resultam em perfis de absoro cuja anlise
relativamente simples, mas que fornece informaes
valiosas a respeito da estrutura das substncias.
Figura 4: Exemplo: espectro infravermelho de 3-metil-2butanona.

PREPARAO DE AMOSTRAS
Quanto parte experimental, uma das dificuldades da
espectroscopia de infravermelho determinar o tipo de
porta-amostras que pode ser utilizado. Isso se deve ao
fato dos materiais mais comumente utilizados, como
vidro e plstico, apresentarem alta absoro no
infravermelho. Neste caso, o ideal que o portaamostras seja constitudo de substncias inicas, como
o cloreto de sdio ou o brometo de potssio.
No caso de amostras lquidas, so usadas lminas
polidas compostas por qualquer um dos sais citados.
Quando estas so comprimidas, forma-se uma fina
camada da amostra lquida. Como as lminas se
quebram facilmente e so feitas de sais, que so
solveis em gua, nenhum solvente usado a amostra,
inclusive, deve ser desidratada.
Quanto s amostras slidas, um dos mtodos que
usado consiste em aplicar presso a uma mistura feita
da amostra finamente dividida e de brometo de potssio
em p. Este se funde em altas presses, envolvendo o
composto analisado e formando, portanto, uma matriz
a esta matriz se d o nome de pellet de KBr, o qual pode
ser inserido no espectrmetro. Deve-se atentar,

Tabela 1. Correlao para a anlise do espectro de infravermelho. No cdigo de letras usado para caracterizar as intensidades, w
significa intensidade fraca; m significa intensidade mdia e s significa intensidade forte.

REFERNCIAS

Espectroscopia de infravermelho. Disponvel

em:
<http://www.sorocaba.unesp.br/professor/ste
ve/TCM%20POSMAT%202S%202011/Espe
ctroscopia%20IR/Infravermelho%20I.pdf>.
Acesso em: 19 nov. 2011.

FILGUEIRAS C. A. L. A espectroscopia e a
qumica: Da descoberta de novos elementos
ao limiar da teoria quntica. Qumica Nova
Na Escola: Espectroscopia e Qumica, n. 3,
p. 22-25, mai. 1996.
LAMPMAN, G. M. et al. Spectroscopy. 4 ed.
Belmont: Brooks/Cole, 2010. p. 15-31.

OLIVEIRA L. F. C. Espectroscopia
Molecular. Qumica Nova Na Escola:
Cadernos Temticos, n. 4, p. 24-30, mai.
2001.

Espectroscopia Visvel e Ultravioleta

Andre de Campos Rauber

PRINCPIOS BSICOS
A espectroscopia de absoro no visvel e ultravioleta
(UV-Vis) baseada na especificidade (ou quase) de
absoro de cada molcula em um comprimento de
onda. A interao se d por meio da troca de eltrons
entre o feixe incidente e a molcula absorvente
tornando-se, portanto, valiosa para a identificao dos
grupos funcionais na molcula. Pode ser utilizada para
diversas finalidades, como ser discutido mais adiante.
A regio ultravioleta do espectro geralmente
considerada na faixa de 200 a 400 nm, e a regio do
visvel entre 400 a 800 nm. As energias correspondentes
a essas regies so ao redor de 150 a 72 kcal.mol-1 na
regio ultravioleta, e 72 a 36 kcal.mol-1 para a regio
visvel. Energias dessa magnitude correspondem,
muitas vezes, diferena entre estados eletrnicos de
muitas molculas, o que torna a tcnica bastante til.
Como toda espectroscopia de absoro, est baseada na
transio de momento de dipolo, neste caso de um
estado com energia mais baixa para outro de energia
mais alta estabilizando a molcula. A ideia bsica a
excitao de alguma ligao molecular (um dipolo),
utilizando radiao com a mesma frequncia de
ressonncia da mesma, para que possa ocorrer absoro
de luz (eltrons) e a molcula passe a um estado
excitado, no qual a energia de repouso mais alta do
que a anterior.
De um ponto de vista prtico, o aspecto mais importante
do clculo quntico a determinao de quanta luz
absorvida pela amostra. Isto descrito pela lei de BeerLambert, que d a relao entre a intensidade da luz
incidindo na soluo (I0), e a intensidade da luz saindo
da soluo (I).
Log (I0/ I) =A=cl
A= absorbncia (sem unidade)

= absorvidade molecular ou coeficiente de extino

A absoro pelos compostos orgnicos e inorgnicos

relacionada com uma deficincia de eltrons na
molcula. Nos inorgnicos, o comprimento de onda de
absoro das transies d-d depende do metal
envolvido, do nmero de grupos coordenados, da
basicidade, dos tomos doadores e da geometria dos
grupos coordenados.
Nos compostos orgnicos, os que possuem dupla
ligao absorvem fortemente no ultravioleta remoto. Os
compostos que possuem ligaes simples e duplas
alternadamente, chamadas de ligaes conjugadas,
produzem absoro em comprimentos de ondas
maiores. Quanto mais extenso for o sistema conjugado,
mais longos sero os comprimentos de onda absorvidos,
podendo chegar regio do visvel. Forma-se o
conceito de cromforos sendo estes os grupos
qumicos responsveis pelo aparecimento da absoro
em algum comprimento de onda (por exemplo, o grupo
carbonila, que absorve radiao com comprimento de
onda por volta de 290nm, com variaes dependendo do
resto da molcula).

DESVIOS DA LEI DE LAMBERT-BEER

Desvios qumicos
Deslocamento do equilbrio: quando um analito
dissocia, associa ou reage com um solvente para formar
um produto que tem um espectro de absoro diferente
do dele. Ex: indicador cido-base.
Dissociao de complexos: excesso ou insuficincia de
agente complexante, o que impede a realizao da
medida.
Desvios instrumentais
Em solues muito concentradas, a absoro pode
mudar devido s interaes entre as molculas, que se
encontram mais prximas.

(Lmol-cm-)
c = concentrao do material absorvedor (mol.L-)

LIMITAES DA TCNICA

l= espessura da amostra da amostra atravs da qual a

luz passa. (cm)

Mesmo tendo amplas aplicaes, a espectroscopia UVVis no fornece muitas informaes sobre a estrutura de
molculas mais complexas de forma totalmente

confivel. um mtodo utilizado mais quando se tem

conhecimento do que se quer medir. Porm, quando
acoplada a outros tipos de medidores analticos, como
um cromatgrafo ou espectrmetro de massas, pode ser
de grande utilidade.

- gerar radiao continua, ou seja, emitir todos os

comprimentos de onda dentro da regio espectral
utilizada (melhor ainda se for com a mesma potncia);

ESPECTROFOTMETROS

- ser estvel, isto , a potncia radiante deve ser

constante;

Uma
caracterstica
muito
importante
dos
espectrofotmetros a seleo de radiaes
monocromticas,
que
possibilita
inmeras
determinaes quantitativas regidas pela Lei de Beer.
Porm, quando se quer fazer uma anlise espectral de
determinada substncia, ou mistura de compostos,
necessria a utilizao de ondas eletromagnticas em
uma ampla faixa de comprimentos de onda para poder
estudar o fenmeno da absoro.
Quando a regio espectral usada a ultravioleta/visvel,
so necessrios componentes ticos de quartzo e
detectores altamente sensveis capazes de detectar
radiaes nessa extensa faixa espectral em que atua o
instrumento. Os espectrofotmetros, em geral, contm
cinco componentes principais: fontes de radiao,
monocromador, recipientes para conter as solues,
detectores e indicadores de sinal.

Fontes de radiao

Monocromador

Compartimento
Amostra/padro

Dispositivo de
processamentos de dados

Sistema detector

Figura 1: esquema dos componentes principais de um

espectrofotmetro

FONTES DE RADIAO
As fontes de radiao mais comuns baseiam-se na
incandescncia e so muito prticas no infravermelho e
no visvel, mas devem atuar em temperaturas elevadas
na faixa do ultravioleta. So constitudas por filamentos
de materiais que so excitados por descargas eltricas
com elevada voltagem ou aquecimento eltrico.
Para que uma fonte de radiao seja considerada de boa
qualidade deve:

- ter intensidade de potncia radiante suficiente para

permitir a sua deteco pelo sistema detector da
mquina;

- ter vida longa e preo baixo (relativo aplicao que

se deseja fazer)

TIPOS DE FONTES DE RADIAO

Lmpada de filamento de tungstnio: incandescente,
produz emisso continua na faixa e 320 a 2500 nm. O
invlucro de vidro (quando utilizado) absorve toda
radiao abaixo de 320 nm, limitando o uso da lmpada
para o visvel e infravermelho.
Lmpada de quartzo-iodo: incandescente, o invlucro
de quartzo emite radiao de 200 a 3000 nm. Sua
vantagem que pode atuar na regio do ultravioleta.
Lmpada de descarga de hidrognio ou de deutrio: a
mais usada para emisso de radiao ultravioleta.
Consiste em um par de eletrodos fechados em um tubo
de quartzo ou vidro, com janela de quartzo, preenchido
com gs hidrognio ou deutrio. Aplicando alta
voltagem, produz-se uma descarga de eltrons que
excitam outros eltrons gasosos a altos nveis
energticos. Quando os eltrons voltam a seus estados
fundamentais, emitem radiao contnua de 180 a 370
nm.
Lmpada de catodo oco: tipo especial de fonte de linha.
preenchida com um gs nobre, a fim de manter uma
descarga de arco. O ctodo tem a forma de um cilindro
oco, fechado em uma extremidade, revestido com o
metal cujas linhas espectrais se desejam obter. O nodo
um fio reto ao lado do ctodo. A energia do arco causa
ejeo dos tomos metlicos do revestimento do ctodo
os quais, excitados, emitem os seus espectros
caractersticos.
Laser: a melhor fonte de luz monocromtica. Pelo
processo de emisso estimulada, os lasers produzem
uma enxurrada de feixes muito estreitos e intensos de
radiao com todas as ondas procedentes em fase entre
si (so coerentes). Isto permite uma concentrao de
energia num ponto muito pequeno, mesmo que esteja
numa distncia considervel.

MONOCROMADORES
So dispositivos essenciais dos espectrofotmetros e
tem como funo a seleo do comprimento de onda
que se tem interesse para a anlise. constitudo de
uma fenda de entrada de um elemento de disperso de
radiao e de uma fenda de sada. O elemento de
disperso pode ser um prisma ou uma rede de difrao.
1.
Monocromador prismtico: a radiao
policromtica procedente da fonte de radiao passa
pela fenda de entrada e incide sobre a face de um
prisma, sofrendo desvio. Os prismas de quartzo so
indicados para trabalhar na regio ultravioleta, embora
tenham mais disperso que o vidro. Na regio do visvel
so empregados primas de vidro. Os prismas de quartzo
apresentam desvantagem de serem altamente
refringentes e oticamente ativos.

Figura 3: imagens de redes de difrao do hidrognio e do

hlio, respectivamente

RECIPIENTES
So usados como recipientes cubas ou cubetas
retangulares de vidro ou quartzo. As cubetas de vidro
so usadas quando se trabalha na regio do visvel. J as
de quartzo so utilizadas tanto para a regio do
ultravioleta quanto para o visvel, pois so transparentes
radiao ultravioleta (diferentemente do vidro).
Uma cubeta geralmente tem 1 cm como padro que,
tambm, simplifica os clculos da expresso da Lei de
Beer.

Figura 2: Decomposio da luz por um prisma

2) Monocromador reticular: o principal elemento de

disperso dos monocromadores reticulares a rede de
difrao, que consiste em uma placa transparente com
inmeras ranhuras paralelas e de mesma distncia.
Possuem resoluo melhor que os prismas e podem ser
utilizadas em todas as regies espectrais.

Para aplicaes industriais, como, por exemplo, no

controle de qualidade de lotes de produo, utiliza-se
um sistema automatizado em que as amostras circulam
em srie em cubetas adequadas. Esse sistema
chamado de anlise por injeo de fluxo ou FIA (do
ingls Flow Injection Analysis)

TIPOS DE ESPECTROFOTMETROS PARA

REGIO VISVEL E ULTRAVIOLETA
Os espectrofotmetros variam em sua complexidade e
desempenho. Existem modelos simples e mais
sofisticados, equipados com softwares especiais de
acordo com a necessidade prtica.
Os componentes dos espectrofotmetros esto
relacionados com a faixa do comprimento de onda, a
exatido e a preciso requeridos para as anlises. Podem
ser de dois tipos:
- espectrofotmetros mono-feixe;
- espectrofotmetros duplo-feixe.

Espectrofotmetros mono-feixe: ajusta-se a absorbncia

em 0%, fechando o obturador entre a fonte de radiao
e o detector. Aps isto, faz-se o ajuste de absorbncia
em 100% colocando o solvente (branco) no caminho
tico, abrindo o obturador e variando a intensidade da
radiao at que o sinal chegue a este valor. Ento
substitui- se o recipiente com solvente pelo recipiente
com a amostra e o percentual de absorbncia da mesma
lido no indicador de sinal.

Anlise quantitativa: a condio essencial para qualquer

determinao por espectrofotometria no visvel e
ultravioleta a observao da lei de Beer.
Outras condies como pH, tcnicas de extrao por
solventes, ajuste do estado de oxidao, remoo prvia
dos interferentes, controle da fora inica do meio, e as
variaes das temperaturas tambm so observadas.

Espectro de protenas
Espectrofotmetros de duplo-feixe: utiliza-se uma
cubeta com a soluo de referncia (branco) e outra
com a amostra que se quer analisar. Passando um feixe
por cada cubeta e utilizando um software programado
para subtrair as absorbncias da amostra pela referncia
faz-se a medida de absorbncia no comprimento de
onda desejado.

Alm destas especificaes, como j foi dito antes,

pode-se ter um espectrofotmetro UV-Vs que faz uma
anlise de todo o espectro de absoro (ou de uma
ampla faixa) da molcula, ou molculas, presentes na
amostra a ser analisada. Para isto h necessidade de
outro software e programaes diferentes no
equipamento para que varie o comprimento de onda do
feixe incidente enquanto mede a respectiva absorbncia
e, geralmente, os dados so dados como absorbncia em
funo do comprimento de onda da radiao podendo
ser utilizados para a visualizao grfica.
Existem ainda os ensaios com variao (ou no) do
comprimento de onda, mas que analisa a alterao da
absorbncia em funo do tempo. Estes ensaios so
bastante teis para anlises de degradao (por
exemplo, de poluentes) e podem ser utilizados, tambm,
para o estudo de cintica enzimtica (velocidade de
reao de catlise nas condies especficas de anlise
como concentrao, pH, tipo de tampo, temperatura)
para se determinar as constantes cinticas de MichaelisMenten e padronizar o ensaio.

PROCEDIMENTOS
ANALTICOS
ESPECTROFOTOMETRIA
VISVEL
ULTRAVIOLETA

EM
E

Anlise qualitativa: pela analise da absorbncia

possvel determinar qual espcie qumica esta presente
na amostra. Tambm possvel detectar contaminaes
ou processos de decomposio de matrias-primas pela
comparao dos espectros de absoro da matria e do
padro da mesma.

- possuem espectro bem caracterstico;

-so influenciadas pelo meio local: variam sua estrutura
dependendo de fenmenos isoeltricos;
-mostra a quantidade de hlice e folha (absores
caractersticas);
-caso a protena esteja desnaturada, o espectro ser
diferente.

Espectro de cidos nuclicos

-tem a absorbncia menor que a soma das absorbncias
dos nucleotdeos individuais (hipocromicidade) o que
ocorre devido ao empilhamento ou alinhamento dos
planos paralelos das bases;
-se ocorrer um
hipercromicidade

acrscimo

na

absoro

-serve para determinar se esto estruturados.

AUTOMAO
NOS
ESPECTROFOTOMTRICOS

MTODOS

Os principais motivos para o desenvolvimento de um

sistema que viabilizasse vrias determinaes
simultneas com o mnimo de trabalho humano foram:
- preencher as necessidades dos laboratrios de analises
clnicas, devido ao crescente nmero de analises;
- o aumento do nmero de espcies qumicas a serem
determinadas no sangue e na urina como anlise de
rotina.
O uso desses instrumentos em laboratrios de anlises
clnicas foi logo estendido a laboratrios de controle de
qualidade de processos industriais num variado tipo de
amostras como ar, gua solo, produtos agrcolas e
farmacuticos.
As vantagens dos mtodos automatizados so:
- maior velocidade no processamento das anlises;

- maior confiabilidade nos resultados;

- minimizao de contaminaes;
- diminuio na gerao de resduos;
- menor consumo de amostras e reagentes.

BIBLIOGRAFIA

http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula042010.
ppt.pdf
http://picjr-agua-e-vida.blogspot.com/
http://osfundamentosdafisica.blogspot.com/20
11/05/caiu-no-vestibular_19.html
Galo A. L., Colombo M. F., Espectrofotometria
de
longo
caminho
ptico
em
espectrofotmetro
de
duplo-feixe
convencional: uma alternativa simples para
investigaes de amostras com densidade
ptica muito baixa. Revista Qumica Nova.
Vol. 32. No.2, 2009
Silverstein, R. M., Bassler, G. C., Morrill,
T. C., Identificao espectromtrica de
compostos orgnicos 5 ed., LTC.
Vinad, Maria Elisabeth do Canto; Vinad,
Elsa
Regina
do
Canto,
Mtodos
espectroscpicos de analise quantitativa,
editora UFSM

Espectroscopia de Fluorescencia
Pedro Michelo Neuber

INTRODUO
A espectroscopia de fluorescncia (tambm chamada de
espectrofluorometria, ou apenas fluorometria) uma
tcnica de espectroscopia eletromagntica que, como o
prprio no diz, se baseia na anlise da fluorescncia de
uma amostra. A tcnica analisa a emisso de diferentes
ftons com diferentes energias e comprimentos de onda,
de acordo com suas intensidades, podendo determinar a
estrutura dos diferentes estados vibracionais da
molcula.

FLUORESCNCIA
A primeira observao de fluorescncia foi descrita por
Nicols Monardes em 1565, em uma infuso de um tipo
de madeira (Lignum nephriticum). O composto
responsvel era produto de oxidao de um dos
flavonides encontrados na mesma. Fluorescncia em
fluorita, um tipo de mineral, foi descrita em 1819, por
Edward D. Clarke, e em 1822, por Ren Just Hay. Sir
David Brewster observou o fenmeno para clorofila, em
1833, e Sir John Herschel, em 1845, para quinina. O
nome fluorescncia surgiu em 1852, por George
Gabriel Stokes, dado ao fenmeno de converso de
radiao ultravioleta em visvel por um vidro de urnio,
descrito pelo mesmo. O nome deriva do mineral
fluorita, o mesmo observado por Clarke em 1819.
Fluorescncia corresponde basicamente absoro de
radiao eletromagntica por uma substncia, e
consequente emisso de radiao em outro
comprimento de onda (usualmente maior, ou seja, com
menor energia). Atravs da absoro de ftons de um
dado comprimento de onda, a molcula passa do estado
eletrnico fundamental a um estado eletrnico excitado.
Uma vez neste estado, a molcula pode dissipar a
energia de duas formas: atravs de um processo de
decaimento radiativo ou no-radiativo. No decaimento
radiativo, a molcula libera o excesso energtico atravs
da emisso de um fton. J no no-radiativo, a energia
transferida para vibraes, rotaes e translaes das
molculas vizinhas.
Assim sendo, a molcula excitada, sujeita a colises
com as molculas vizinhas, perde energia de forma noradiativa ao longo da sequncia dos nveis vibracionais,
at o mnimo do estado eletrnico excitado. A diferena
de energia entre este e o estado fundamental grande
demais para ser absorvida pelas molculas circundantes.
Desse modo, a molcula sofre uma emisso espontnea

e libera a energia em fora de radiao, retornando ao

estado fundamental. Essa emisso espontnea
denominada fluorescncia ou fosforescncia. A
diferena fundamental entre ambas est no tempo de
emisso: na fluorescncia, ocorre em intervalos curtos,
da ordem de nanossegundos, aps a radiao excitadora
cessar; enquanto na fosforescncia, o tempo maior,
durando fraes de segundos ou segundos, ou at
mesmo horas, em casos extremos. Em termos da
natureza dos estados eletrnicos excitados, a
fluorescncia se d com a presena de apenas um estado
singleto excitado, enquanto na fosforescncia
fundamental a presena de um estado tripleto excitado
(Figura 1).
A fluorescncia se d em um comprimento de onda
maior (menor frequncia e energia) do que a radiao
excitadora, pois o decaimento radiativo s ocorre depois
que a molcula j perdeu parte da energia de forma noradiativa. A energia de fluorescncia (emitida)
simplesmente a diferena entre a energia absorvida e
dissipada:

E flu = Eabs Evib Esol

(1)

em que Eflu corresponde energia de emisso

(fluorescncia), Eabs energia de absoro, Evib
energia de decaimento no-radiativo (vibracional), e Esol
energia dissipada pelo solvente (tratada adiante).
Diversos fatores podem afetar a eficincia quntica
fluorescente (razo entre o nmero de ftons emitidos
por fluorescncia e o nmero de ftons absorvidos, ou
ento a razo entre as intensidades de emisso e
absoro) de uma substncia. Os principais so a
estrutura da molcula (por razes bvias) e o solvente
em que ela se encontra. Embora seja difcil prever
teoricamente se uma molcula exibir luminescncia
(sem o prvio conhecimento da diferena de energia
relativa entre o estado excitado singleto e o
fundamental), possvel faz-lo, de um modo geral, de
acordo com alguns requisitos. Primeiramente,
molculas relativamente rgidas e ricas em eltrons
(como no caso das molculas aromticas), contendo ou
no heterotomos em sua cadeia principal, so
potencialmente fluorescentes. Estruturas moleculares
rgidas (com restries de liberdade vibracional) tm o
processo de decaimento no-radiativo significantemente
minimizado. J uma estrutura molecular planar favorece
a fluorescncia, pois aumenta a interao e conjugao
entre o sistema de eltrons . A presena de grupos
substituintes na molcula tambm fator importante,
pois afeta a intensidade e o tipo de luminescncia:

grupos hidroxi (-OH), metoxi (-OR), amino (-NR2),

cianeto (-CN) e sulfnico (-SO3H) tm tendncia em
amplificar a fluorescncia; grupos cetnicos (-C=O),
carboxlicos (-COOH) e halognios (-X) favorecem o
cruzamento intersistemas, trocando a multiplicidade da
populao excitada do estado singleto para o estado
tripleto, favorecendo a fosforescncia, e, por
consequncia, diminuindo a fluorescncia.
A natureza do solvente tambm fator relevante. O
solvente pode deslocar o espectro de fluorescncia em
relao ao espectro de absoro, pois ele pode ter
interaes diferentes com as molculas no estado
fundamental e no estado excitado. As molculas no
tm tempo suficiente para se reorganizarem durante a
transio, de modo que a absoro e a fluorescncia
ocorrem em ambientes caractersticos diferentemente
solvatados. Em outras palavras, as molculas do
solvente rapidamente se reorientam em torno da
molcula luminescente logo aps ser promovida para o
estado excitado e antes do retorno para o estado
fundamental. Consequentemente, a energia relativa do
estado excitado aps a fluorescncia pode ser
significantemente diferente do que era durante o
processo de absoro. No caso das transies -*,
comuns na fluorescncia, a molcula no estado excitado
mais polar e tem carter mais bsico do que quando
ela se encontra no estado fundamental. Assim, o
aumento da polaridade do solvente, ou do seu carter
prtico, acarreta uma diminuio da energia relativa do
estado excitado, com deslocamento do espectro de
emisso em direo ao vermelho. No caso das
transies n-*, o estado excitado menos polar e o
aumento da polaridade ou do carter prtico do solvente
ocasiona deslocamentos em direo ao azul.

Alm disso, a intensidade da fluorescncia depende da

capacidade das molculas do solvente de aceitarem os
quanta de energia eletrnicos e vibracionais. Molculas
com nveis de vibrao muito espaados, como a gua,
podem aceitar um grande quantum de energia
eletrnica, de modo a extinguir a fluorescncia.
Outras substncias podem desativar o estado excitado
singleto por meio do quenching dinmico. Quenching
pode ser definido como transferncia de energia, por
processo no-radiativo, do fluorforo (substncia que
emite a radiao por fluorescncia) no estado excitado
para outras molculas (agentes desativadores), que por
sua vez passam para o estado excitado enquanto o
fluorforo retorna para o estado fundamental. O
quenching dinmico um processo colisional e por isso
requer o contato entre as espcies envolvidas. Em
conseqncia, a magnitude dessa desativao
proporcional concentrao do agente desativador e da
sua capacidade de difuso no meio.
Assim como o espectro de absoro proporcional
concentrao da amostra, o espectro de fluorescncia
ter intensidade proporcional concentrao do
fluorforo. A relao existente entre concentrao e a
intensidade da radiao absorvida (Ia) dada pela Lei
de Beer-Lambert (Equao 2).

(2)
em que I0 e It so, respectivamente, as intensidades de
radiao incidente e transmitida, a absortividade
molar caracterstica da molcula absorvente, C a
concentrao do fluorforo e l a espessura do caminho
tico percorrido pela radiao dentro da cubeta onde se
encontra a amostra. No processo de fluorescncia, Ia
passa a ser denominada de radiao de excitao. Como
vrios processos competem pelo decaimento do estado
singleto excitado, a intensidade de fluorescncia If
(Equao 3) obtida multiplicando-se a Equao 2 por
que corresponde frao de molculas no estado
excitado que efetivamente fluorescem.
(3)
Assim, combinando-se as Equaes 2 e 3, temos a
Equao 4:

Figura 1: Diagrama de energia de transies eletrnicas.

Inicialmente a molcula absorve radiao, levando-a do
estado fundamental S0 ao estado singleto excitado S2 ou S1
(podendo haver converso interna entre ambos). A molcula
ento perde energia por relaxao vibracional (decaimento
no-radiativo), at o nvel mais baixo do estado singleto
excitado. Ocorre ento a emisso de radiao (fluorescncia),
e a molcula volta ao estado fundamental S0. Tambm pode
ocorrer cruzamento intersistemas, no qual a populao S1
convertida ao estado tripleto excitado, T1, de modo que a
emisso ser de fosforescncia.

(4)

que nos d a intensidade de fluorescncia em funo da

intensidade incidente e os parmetros da amostra.

ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCNCIA
Instrumentao
O aparato bsico de um espectrofotmetro composto
por: uma fonte de luz, dois filtros ou monocromadores,

amostra a ser analisada, e um detector. A luz emitida

pela fonte passa pelo primeiro filtro/monocromador,
para se isolar o comprimento de onda adequado ao
experimento, e atinge a amostra, que absorve parte dela.
Ocorre ento o processo de fluorescncia descrito
anteriormente, e a amostra emite luz em todas as
direes. Parte da luz emitida passa pelo segundo
monocromador, e chega ao detector, que analisa o sinal.
Usualmente coloca-se o detector a 90 do feixe de luz
incidente, para minimizar o risco do mesmo detectar luz
incidente transmitida ou refletida pela amostra (Figura
2).

Figura 3: Espectro de emisso de uma lmpada de vapor de

Mercrio. Nota-se a emisso discreta relativa aos picos de
maior intensidade.

Figura 2: Esquema de um espectrofotmetro de

fluorescncia: fonte de luz, monocromador para a luz
incidente, amostra para anlise, monocromador para a luz
emitida, e detector.

Diversos tipos de fontes luminosas podem ser

utilizados, como lmpadas, fotodiodos ou lasers. No
caso do laser, a emisso tem uma largura espectral
muito pequena, de modo que o uso de filtro ou
monocromador dispensado. O problema que, desse
modo, o comprimento utilizado torna-se muito
especfico, no servindo para a excitao de todas as
amostras. Devido ao fato de que a radiao excitadora
deve possuir alta energia, para ser capaz de excitar os
eltrons da molcula e disparar o processo de
fluorescncia, geralmente so utilizadas lmpadas que
tenham uma boa emisso na banda UV (ultravioleta) e
visvel. Neste caso utiliza-se um monocromador para
transmitir apenas o comprimento de onda adequado
amostra analisada. Exemplos so lmpadas de arco de
Xennio, lmpadas de vapor de Mercrio, e lmpadas
de Deutrio. A lmpada de vapor de mercrio no
possui um espectro de emisso contnuo nessa regio,
emitindo apenas em determinadas linhas (Figura 3).
Desse modo, seu uso mais restrito. J as lmpadas de
arco de Xennio e de Deutrio possuem um espectro
contnuo que pode ser utilizado, sendo a de Xennio na
regio de 300 a 800 nm (Figura 4), e a de Deutrio na
regio de 200 a 400 nm (Figura 5).

Figura 4: Espectro de emisso de uma lmpada de arco de

Xennio. E utilizada pela emisso contnua na regio de UV e
visvel.

Figura 5: Espectro de emisso de uma lmpada de Deutrio.

Utilizada pela boa emisso contnua na regio de UV.

Como j mencionado, monocromadores so utilizados

para selecionar o comprimento de onda desejado a ser
transmitido da radiao incidente. O esquema bsico de
um monocromador est mostrado nas Figuras 6, 7 e 8.
O feixe de luz incidente entra pela primeira fenda,
colimado, e atinge um elemento de disperso, que pode
ser, por exemplo, um prisma ou uma grade de difrao
(geralmente usa-se a grade). O elemento de disperso
ento separa os comprimentos de onda em diferentes
ngulos, e apenas um deles atinge a fenda de sada.
possvel selecionar o comprimento desejado atravs da
rotao do elemento dispersor. A calibrao feita com
certo limite de tolerncia.

Figura 7: Monocromador com grade de difrao por

reflexo. A rotao da grade permite a seleo do
comprimento de onda.

Figura 8: O feixe de luz incidente refletido e colimado por

uma lente ou espelho curvo, atingindo a grade de difrao,
que separa os comprimentos de onda em diferentes ngulos.

Por fim, os detectores podem ser tanto nicos ou arrays

de detectores. Os arrays so capazes de detectar
diversos comprimentos de onda simultaneamente,
dispensando o uso de um monocromador aps a
emisso para varrer o espectro de fluorescncia. O
posicionamento do detector, como j mencionado,
feito a 90 do feixe incidente, de modo a evitar a
interferncia no sinal pelo mesmo. Com essa geometria,
o detector capta apenas a pouca luz espalhada pela
amostra. Assim, a razo sinal/rudo otimizada, em
relao ao posicionamento direto, a 180.
Figura 6: Esquema geral do monocromador inserido no
espectrofotmetro.

Anlise dos Dados

Em um experimento tpico de espectroscopia por
fluorescncia, utiliza-se uma radiao excitadora nica,
e os diferentes comprimentos de onda de fluorescncia
so medidos com o uso do monocromador. Obtm-se
ento um espectro de emisso da substncia. Tambm
possvel fazer o oposto, manter a radiao emitida a um
comprimento constante, e varrer o espectro de radiao
incidente com o monocromador, obtendo-se um
espectro de excitao. Combinando os dois mtodos,
possvel obter um mapa de emisso, que mostra a
intensidade de emisso como funo tanto dos
comprimentos de onda de excitao, quando de
emisso. Os espectros obtidos tm a mesma forma dos
espectros mostrados para as lmpadas, nas Figuras 3, 4

e 5 (mas, obviamente, variam de substncia para

substncia).
Diferentemente de outras tcnicas espectroscpicas, a
obteno dos espectros no fcil, e diversos fatores
podem distorc-los, sendo necessrias correes. Essas
distores geralmente esto associadas instrumentao
ou amostra. No primeiro caso, existem vrios fatores a
serem analisados. Primeiramente, a fonte de luz no
possui uma intensidade constante para todos os
comprimentos de onda, de modo que varie durante o
experimento e entre experimentos. A abordagem
utilizada para minimizar esse efeito a utilizao de um
detector de referncia, que capte o sinal da radiao
incidente com um divisor de feixe. Alm disso, os
monocromadores tambm no possuem uma eficincia
de transmisso constante. Ela varia com o comprimento
de onda da radiao, e com o tipo de dispersor utilizado.
A soluo integrada anterior: colocar o divisor de
feixe aps o monocromador, para que o detector de
referncia tenha como base s variaes do
monocromador. A deteco tambm apresenta
problemas. A porcentagem da fluorescncia medida
depende da eficincia quntica do detector (isto , a
porcentagem de ftons detectados), que varia de
aparelho para aparelho, e tambm depende do
comprimento de onda detectado, e da idade do
detector, j que ele tende a deteriorar com o tempo.
Outro fator que pode interferir nos espectros a
composio do(s) material(is) utilizado(s) na ptica que
direciona os feixes de luz, e que compe a cubeta onde
se encontra a amostra. importante que o material no
absorva luz na banda de comprimentos de onda de
excitao ou de emisso. O mais comumente utilizado
o quartzo, pois transparente para comprimentos de
onda de 200 a 2500 nm, faixa mais comum na
fluorescncia.
Com relao s distores ocasionadas pela amostra,
tambm devem ser levados em conta diversos fatores.
Primeiramente, o efeito da radiao incidente de
fotodecomposio da amostra, que pode diminuir a
intensidade de fluorescncia conforme o fluorforo
degradado. Alm disso, espalhamentos de luz do tipo
Rayleigh e Raman tambm influenciam o sinal.
Reabsoro da radiao emitida por outra molcula
tambm pode ocorrer, formando uma espcie de filtro
inerente amostra. Assim, a intensidade de radiao ao
ser constante ao longo da soluo. Esses fatores no
podem ser corrigidos como os outros, e devem ser
levados em conta durante a anlise dos espectros.

APLICAES
Alm de sua utilizao em qumica analtica, a
Espectroscopia de Fluorescncia tem utilidade em
diversas anlises e procedimentos, tais como
acompanhamento de reaes qumicas e bioqumicas,
medidas de microviscosidade e frico, dinmica de
solventes, medidas de distncias moleculares, entre
outros. Diehl e Trierweiler[1] apontam diversas

utilizaes recentes de espectrofluorometria 2D em

processos biotecnolgicos anlise e acompanhamento
do cultivo de fungos para produo de frmacos,
monitoramento de pH, estimao de variveis na
fermentao, e mtodos no-invasivos para a
determinao de variveis na produo de cerveja.
Maciel e Bagnato[2] descrevem um mtodo para
diagnstico de leses teciduais a base de Espectroscopia
de Fluorescncia.

REFERNCIAS

Dieh, F. C.; Trierweiler, J. O. . Espectroscopia

de Fluorescncia 2D: Fundamentos, Aplicaes
e Perspectivas. Seminrio do Programa de PsGraduao em Engenharia Qumica VIIIOktoberforum PPG EQ. 2009.

Maciel, V H ; Menezes, P. F. C. ; Bagnato, V. S.

. Fluorescncia ptica no diagnstico de leses
teciduais.. In: PDT 2007 - Terapia Fotodinmica:
Integrao
dos
Aspectos
Moleculares,
Tecnolgicos e Aplicaes na rea de Sade,
2007, So Pedro. Caderno de Resumos, 2007.

Peter Atkins, Julio de Paula. Fsico-Qumica,

8 Ed., Vol. I, LTC Editora, Rio de Janeiro,
2003.

J. Lakowicz, Principles of Fluorescence

Spectroscopy. Plenum Press, New York and
London, 1983.

http:// en.wikipedia.org/wiki/
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Deuterium_arc_lamp

http://zeiss-campus.magnet.
lightsources/xenonarc.html

http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/
sources.html

org

Fluorescence_

fsu.edu

wiki

/articles/

Espectroscopia: Histrico Geral, a Espectroscopia de

Fluorescncia e uma Possvel Aplicao na Terapia
Fotodinmica
Ana Paula Pereira Guimares
ESPECTROSCOPIA: HISTRIA
Isaac Newton nasceu pouco depois da meia-noite do
dia de Natal, em 1642, de parto prematuro. O seu pai,
um agricultor bastante prspero que morreu antes do
seu nascimento, deixando
mulher, Hannah, a
responsabilidade sobre as propriedades agrcolas e o
cuidado da frgil criana. Aos 12 anos, quando morava
com seu tio, Isaac foi para uma escola, sendo
considerado aluno mdio pelos professores e insocivel
pelos seus colegas. Ignorava o trabalho da escola e
passava a maior parte do tempo a construir modelos
mecnicos de madeira, como moinhos de vento, e a
fazer suas prprias experincias.
Felizmente, seu gnio havia sido reconhecido pelo seu
tio, com quem vivera, e pelo diretor da escola em que
estudara, e com a ajuda deles, Newton foi admitido na
Universidade de Cambridge em 1661. Sem condies
financeiras de pagar os custos universitrios, Isaac
pagava a universidade com trabalho, limpando os
quartos.
Numa tarde de domingo de 1664, Isaac e John Wickins,
um companheiro de quarto, decidiram visitar uma feira
de materiais pticos. Isaac ficou maravilhado com um
prisma (Margenau, 1971). Aps adquirir um prisma,
Newton comeou a fazer diversas observaes em seu
quarto. Ele deixava um raio de luz passar por uma fenda
na porta e verificava que o feixe se abria ao sair do
prisma, revelando ser constitudo realmente de
diferentes cores dispostas na ordem em que apareciam
no arco-ris. Para que essas cores
no fossem
acrescentadas pelo prprio vidro, Newton fez o feixe
colorido passar por
um segundo prisma. Como
resultado, as cores voltaram a se juntar, provando que
sua recomposio formava outro feixe de luz branca,
igual ao inicial. Newton argumentou que a luz branca
era na verdade uma mistura de diferentes tipos de raios
que eram refratados em ngulos ligeiramente diferentes,
e que cada tipo de raio diferente produzia uma cor
espectral diferente (Faria, 1987). Nessa poca, o
fenmeno que dava origem ao arco-ris j havia sido
estudado por Thierry de Freiberg. Ele sups que a luz
produzida num prisma era um "efeito de superfcie",
uma distoro gerada na interface ar/vidro, e no uma
decomposio da luz.

Figura 1: Gravura de Newton sculo 18.

Em 1672, aps doar um telescpio refletor inventado

por ele para a Royal Society, Newton eleito membro
da Royal Society e apresenta um relatrio sobre a
teoria das cores, revelando suas experincias sobre a
decomposio da luz branca pelo prisma. Ele demonstra
no relatrio que as cores primitivas ou fundamentais
(amarelo, azul e vermelho) possuem carter especial e
no so passveis de decomposio. Este trabalho
apresentado Academia Real de Cincias foi em
seguida lanado num opsculo com o ttulo "Nova
teoria da luz e da cor".
Em 1703 foi eleito presidente da Royal Society, e foi reeleito a cada ano at sua morte. Newton publica o livro
Opticks apenas em 1707 o qual trata da nova teoria da
luz e da cor. Ele foi agraciado com o ttulo de
cavalheiro (Sir) em 1708 pela Rainha da Inglaterra
Anne pelas diversas contribuies a cincia. Com isso
ele foi o primeiro cientista a receber esta honra. Newton
morreu em 31 de maro de 1727 em Londres,
Inglaterra.

AS LINHAS DE FRAUNHOFER
Nascido em Straubing na Alemanha em 6 de maro de
1787, Joseph Von Fraunhofer. Esteve sempre cercado
por pessoas ligadas ao trabalho artesanal,
particularmente fabricao e ao corte do vidro e de
artefatos pticos, desenvolvendo assim pequena
habilidade no desenho e construo de artefatos de
vidro.

Aps a morte de seus pais, com apenas 12 anos de

idade, Fraunhofer foi levado pelos seus guardies
para Munique para tornar-se aprendiz de Philipp A.
Weichselberger, um rude fabricante de espelhos e
vidros ornamentais. Porm, devido sua limitada
educao formal, Fraunhofer passou a ser tratado como
um mero empregado. Com dificuldades e sem
motivao, Fraunhofer no desistiu de um sonho,
tornar-se um fabricante de culos.
No dia 21 de julho de 1801 a oficina em que
Fraunhofer trabalhava desmoronou, e ele ficou
soterrado sobre os escombros. Solidarizado com a
situao do rfo Fraunhofer, Elector Maximilian
Joseph IV (posteriormente, Rei Maximilian I)
presenteou-o com 18 Ducats (moeda da poca).
Aps a recuperao do acidente, Fraunhofer continuou
a trabalhar com Weichselberger, sendo permitido a
assistir as aulas dominicais e tendo comprado, com o
presente ganho, seus prprios equipamentos para
fabricao de vidro e livros sobre ptica e a natureza
da luz, a fim de desenvolver suas habilidades com
vidros e lentes.
Quando j havia adquirido uma liberdade como
profissional, Fraunhofer conheceu Joseph Niggl do
Instituto de Munique, onde comeou a dar os
primeiros passos para a fabricao de lentes. Em
maio de 1806, Fraunhofer foi convidado por
Utzschneider diretor do instituto de Munique para
trabalhar no instituto em um posto de aprendiz. Em
menos de um ano ele j produzia suas prprias lentes e,
algum tempo depois, j possua sua prpria oficina.
No ano de 1814 Fraunhofer realizou a mesma
experincia de decomposio da luz branca com
prismas realizada por Newton, porm o espectro
obtido por Fraunhofer era originado com maior
incidncia de luz solar e submetido a uma grande
ampliao, observando assim o espectro com maior
detalhe. Com efeito, Fraunhofer observou que o
espectro solar no era continuo, mas apresentava
falhas: inmeras linhas escuras foram observadas. Ao
utilizar um telescpio para observar a luz refratada
pelo prisma identificou 574 riscas escuras no espectro
da luz do Sol (Friana et.al., 2003). Para designar as
oito riscas mais proeminentes usou as letras de A a G
no sentido vermelho-violeta. Fraunhofer foi, no
entanto, incapaz de explicar por que razo estas linhas
se encontravam no espectro da luz do Sol. Fraunhofer
no fazia idia que este espectro era um mapa
codificado da composio qumica do Sol. Na
Figura 4 pode-se ver o espectro da luz solar obtido por
Fraunhofer.
Em
particular
Fraunhofer
ficou
impressionado com duas linhas, bastante fortes, que
apareciam no espectro da luz solar, as quais
denominou de "linhas D".

Figura 2: Espectro solar obtido por Fraunhofer

Fraunhofer tambm observou, com auxilio de

telescpios, linhas nos espectros das estrelas Srius,
Castor, Pollux, Capella, Betelgeuse e Procyon. Na
verdade Fraunhofer utilizava as linhas do espectro
solar para calibrar seus instrumentos (vidros e
prismas), identificando quais eram os de melhor
qualidade fabricados naquela poca. Como pequenas
variaes na quantidade e mistura de quartzo (SiO
2), cal (CaO) e soda (carbonato de sdio, Na 2CO 3)
no composto que compem o vidro (basicamente SiO
4), fazem que os prismas fabricados desloquem o
comprimento de onda em diferentes ngulos,
Fraunhofer usava as linhas do espectro solar para
determinar as propriedades dos vidros. Apresentando
seus resultados na Academia de Cincias da Bavria,
foi eleito membro e passou a ministrar aulas na
Universidade da Bavria por muitos anos, apesar de no
possuir educao formal. Apesar de suas realizaes e
contribuies, Fraunhofer no compreendeu a origem
das linhas espectrais que observou. Sabia apenas que
era uma caracterstica de cada astro observado (Friana
et.al., 2003).
Fraunhofer faleceu em 7 de junho de 1826 e foi
cremado em Munique com honras de estado.

CONTRIBUIES DE BUNSEN E KIRCHHOFF

Robert Wilhelm Eberhard Von Bunsen nasceu em 31
de maro de 1811 em Gottingen, Alemanha. Aps
estudo bsico na cidade de Holzminden, Bunsen
estudou qumica em Gottingen, recebendo seu
doutorado com apenas 19 anos.
Como Bunsen, Kirchhoff veio de uma famlia de
intelectuais. Gustav Robert Kirchhoff nasceu em 12
maro 1824 em Konigsberg, Prssia (atual Kaliningrad,
Rssia).
Kirchhoff foi educado em Knigsberg onde se
graduou em Fsica na Universidade de Konigsberg em
1847. Em seu primeiro trabalho em 1845 (ainda como
aluno), enunciou as leis que levam seu nome e que
permitem o clculo da corrente, tenso e resistncia de
um circuito eltrico. Quando foi ministrar aulas de
Fsica na Universidade de Breslau, Kirchhoff conheceu
o tambm professor de qumica Bunsen de quem ficou
grande amigo (Figueiras, 1996). Em 1854, Kirchhoff
muda para Heidelberg, comeando uma parceria muito
proveitosa com Bunsen, que j era um qumico
conceituado, pois j havia desenvolvido o queimador
denominado Bico de Bunsen, uma adaptao de um
projeto de Michael Faraday, alm de diversas
contribuies qumica e geologia.

Bunsen desenvolveu o queimador para identificar

metais e seus sais pelas caractersticas de suas chamas
coloridas que estes emitiam quando
aquecidos
(Moura Nunes, 2005). Foi quando Kirchhoff sugeriu
analisar os espectros emitidos por essas chamas, e
conseqentemente espectros de raios solares obstrudos
por vapores metlicos, desenvolvendo um aparato
denominado espectroscpio, o qual continha um prisma
como elemento dispersor. Nos espectroscpios
utilizados por Bunsen e Kirchhoff no havia um
elemento que pudesse detectar a intensidade da
radiao. As observaes eram feitas a "olho nu" e
anotadas de acordo
com as sua coloraes e
intensidades.

caractersticos quando a luz atravessava os gases na

atmosfera do Sol (Faria, 1987). Este trabalho
direcionaria uma nova era na astronomia.

ESPECTROSCOPIA:DEFINIO E CLASSIFICAES
H pouco tempo o termo espectroscopia designava o
estudo da interao entre radiao e matria como uma
funo do comprimento de onda (). Realmente,
antigamente, a espectroscopia referia-se ao uso de luz
visvel dispersa de acordo com seu comprimento de
onda. Logo depois, o conceito foi expandido de forma
que pudesse compreender qualquer medida de uma
grandeza como funo tanto do seu comprimento de
onda ou frequncia. Assim, este termo tambm pode se
referir a uma resposta a um campo alternado ou
freqncia varivel (). Um outra extenso do termo
espectroscopia, adicionou energia como uma varivel,
dada quando obtido o relacionamento muito prximo
expresso por E=h para ftons.
O resultado grfico de uma tcnica espectroscpica
qualquer, a resposta como uma funo do comprimento
de onda - ou mais comumente a frequncia - chamado
de espectro.. Sua impresso grfica pode ser chamada
espectrograma ou, por comodidade, simplesmente
espectro.

Figura 3: Ilustrao de Kirchhoff iluminando espectros.

Como os espectros de absoro que produziu em suas

experincias coincidiam sempre com os espectros de
emisso do mesmo elemento, Kirchhoff concluiu
que cada elemento absorve precisamente a mesma luz
que emite (Faria, 1987). Na Figura 7 tem-se alguns
exemplos de espectros obtidos por Kirchhoff.

Figura 4: Espectros

Munido deste conhecimento, Kirchhoff decodificou aos

estudos das linhas de Fraunhofer. As linhas escuras e a
sua posio indicavam que a atmosfera do Sol continha
sdio, magnsio, ferro, clcio, cobre, zinco entre outros
elementos, pois estes espectros j eram conhecidos
de Kirchhoff e Bunsen. Eles explicaram que as
linhas escuras observadas no espectro do Sol eram
causadas pela absoro de comprimentos de ondas

O mtodo utilizado para anlise de elementos simples,

da estrutura qumica e compostos inorgnicos ou grupos
funcionais de uma substncia orgnica utilizando
radiao eletromagntica. O exame pode ser destrutivo
ou no destrutivo; os exames mais interessantes so os
que no destroem as amostras, e dos quais resultem
dados precisos.
Sempre quando se excita uma substncia com uma
fonte de energia, esta pode emitir como
absorver radiao em determinado comprimento de
onda, desta forma permitindo uma observao do
comportamento do corpo de prova. Os resultados da
anlise espectroscpica de uma amostra providenciam
dados sobre a estrutura do analiso, tais como geometria
de ligao, natureza qumica de ligandos de um dado
tomo, comprimentos de ligaes qumicas, etc.. A base
da espectroscopia a natureza ondulatria das radiaes
eletromagnticas, cuja varivel a frequncia
fundamental. Esta determina o nmero de oscilaes
realizadas pela onda por unidade de tempo, e o
comprimento de onda, distncia percorrida pela onda
durante um perodo de tempo correspondente a uma
unidade de freqncia, sendo o produto destas definido
como a velocidade de propagao da onda.

NATUREZA DA EXCITAO MEDIDA

O tipo de espectroscopia depende da grandeza fsica
medida. Normalmente, a grandeza que medida uma

intensidade, tanto da energia absorvida quanto da

produzida.

Espectroscopia magntica: envolve interaes

de matria com radiao eletromagntica tais como luz.

Espectroscopia de eltrons: envolve interaes

com raios catdidos.

Espectroscopia de Auger: envolve a induo

do efeito Auger com um raio catdico. Neste caso a
medio tipicamente envolve a energia cintica do
eltron como varivel.

Espectroscopia acstica: envolve a frequncia

do som.

Espectroscopia dieltrica: envolve a frequncia

de um campo eltrico externo.

Espectroscopia mecnica: envolve a frequncia

de um stress mecnico externo, e.g. a toro aplicada a
uma pea de material.

PROCESSOS DE MEDIO
So trs os principais tipos de processo pelos quais a
radiao interage com a amostra e analisada:

Espectroscopia de absoro - Correlaciona a

quantidade da energia absorvida em funo do
comprimento de onda da radiao incidente.

Espectroscopia de emisso - Analisa a

quantidade de energia emitida por uma amostra contra o
comprimento de onda da radiao absorvida. Consiste
fundamentalmente na reemisso de energia previamente
absorvida pela amostra

Espectroscopia de espalhamento (ou de

disperso) - Determina a quantidade da energia
espalhada (dispersa) em funo de parmetros tais como
o comprimento de onda, ngulo de incidncia e
o ngulo de polarizao da radiao incidente.
MTODOS DE ESPECTROSCOPIA
Existem diversos mtodos de anlises espectroscpicas,
tanto molecular quanto atmica. Para cada um deles os
instrumentos de medida sofrem variaes. Os mtodos
so:

Espectroscopia rotacional ou espectroscopia de

microondas

Espectroscopia de infravermelho

Espectroscopia Raman

Espectroscopia UV/visvel, Espectroscopia no

visvel ou Espectroscopia ultravioleta

Espectroscopia
fluorometria

de

fluorescncia

Espectroscopia de raios-X

Espectroscopia de plasma

ou

Espectroscopia fotoacstica

Espectroscopia de absoro atmica

Espectroscopia de absoro molecular

Espectroscopia de absoro magntica nuclear

Espectroscopia de ressonncia magntica

nuclear ou de Ressonncia paramagntica eletrnica

Espectroscopia de Moussbauer

Espectroscopia de massa.

Os mtodos experimentais em espectroscopia oferecem

contribuies notveis para estado da arte da fsica
atmica e molecular, da qumica e da biologia
molecular. Muito do nosso atual conhecimento acerca
da estrutura da matria baseado em investigaes
espectroscpicas. Informaes sobre a estrutura
molecular e sobre a interao de molculas com seus
vizinhos podem ser derivadas de diversos modos a
partir dos espectros de emisso e/ou absoro gerados
quando a radiao interage com os tomos e/ou
molculas da matria.
Medidas do comprimento de onda de linhas espectrais
permitem a determinao de nveis de energia de
sistemas atmicos e moleculares. A intensidade da
linha proporcional probabilidade de transio que
mede quo fortemente dois nveis de uma transio
molecular (ou atmica) esto acoplados. Uma vez que
a probabilidade de transio depende das funes de
onda de ambos os nveis de energia, medidas de
intensidade so teis para verificar a distribuio
espacial de cargas dos eltrons excitados, a qual pode
ser estimada a partir de solues aproximadas da
equao de Schrdinger.
A largura natural de uma linha espectral pode ser
resolvida por tcnicas especiais, permitindo determinar
os tempos de vida mdios de estados moleculares
excitados. Medidas da largura Doppler do a
distribuio de velocidades das molculas emitindo ou
absorvendo e, com ela, a temperatura da amostra. Do
alargamento por presso e deslocamentos por presso
de linhas espectrais, podem ser obtidas informaes
acerca de
processos de coliso e potenciais
interatmicos. Os efeitos de desdobramento Stark e
Zeeman por campos eltricos e magnticos externos so
importantes para medir momentos de dipolo eltricos
ou magnticos, e esclarecem o acoplamento dos
diferentes momentos angulares em tomos ou
molculas, mesmo com configuraes eletrnicas
complexas. A estrutura hiperfina de linhas espectrais d
informao sobre a interao entre os ncleos e a
nuvem eletrnica e permite determinar, tambm,
momentos de dipolo magntico nuclear ou momentos
de quadrupolo eltrico. Medidas resolvidas no tempo
permitem o acompanhamento da dinmica das
molculas nos estados fundamentais e excitados, para
estudos de processos de coliso e mecanismos de

transferncia de energia.
Estes so alguns exemplos das formas pelas quais a
espectroscopia contribui para o conhecimento do
mundo sub-microscpico dos tomos e das molculas.
Contudo, a quantidade de informao que pode ser
extrada de um espectro depende essencialmente do tipo
de fonte de radiao usado para "iluminar" as
amostras,
se coerente (laser) ou incoerente; da
resoluo temporal ou espectral; instrumentos de
disperso usados, e finalmente, da sensibilidade de
deteco que pode ser atingida.

ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCNCIA
A espectroscopia de fluorescncia, tambm chamada
espectrofluorometria ou simplesmente fluorometria
um tipo de espectroscopia eletromagntica a qual
analisa a florescncia de uma amostra. Isto envolve o
resultado da absoro de energia radiante e emisso de
parte desta energia na forma de luz de baixa energia,
normalmente, mas no necessariamente luz visvel. A
emisso de luz se d pela excitao de eltrons nas
molculas de certos compostos, normalmente
usando luz ultravioleta.
Seu princpio terico que luz emitida ou fluorescncia
proporcional concentrao do composto analisado.
A forma de luz emitida tem, quase sempre,
comprimento de onda maior de que a luz absorvida (lei
de Stokes).
relativamente caro e difcil de manter, muito sensvel,
permitindo a anlise de certos metais por poderem ser
transformados em complexos orgnicos, associados
com ons ou quelatos fluorescentes. Exemplos de
compostos que so usados em espectroscopia de
fluorescncia para a formao de quelatos so os
corantes fluorescena e rodamina, assim como seus
derivados.
Equipamentos que medem a fluorescncia
chamados fluormetros ou fluormetros.

so

utilizado frequentemente em anlises de amostras de

alimentos e biolgicas na determinao de elementos
trao que sejam mais difceis de analisar por outras
tcnicas. Um exemplo de um mineral analisado
o selnio.
Uma tcnica complementar a espectroscopia de
absoro.

APLICAO
DA
TCNICA:
FOTODINMICA (TDF)

TERAPIA

Escolhi essa aplicao porque fiz um ano de iniciao

cientfica com terapia fotodidmica, e apesar de no
apresentar meus resultados, gostei de pesquisar mais
trabalhos sobre o tema.

Para o estudo da distribuio de fotossensibilisadores

(FS) em tecidos fotossensibilizados, uma das tcnicas
que se apresenta mais interessante (em especial quando
se considera seu uso nas condies clnicas) a
espectroscopia de fluorescncia. Ela tem sido apontada
como tcnica alternativa para a diferenciao ptica de
tecidos biolgicos e para a identificao de alteraes
metablicas, bem como para um diagnstico auxiliar
para vrios tipos de leses.
Afim de explicar o funcionamento da tcnica de
espectroscopia de fluorescncia e as vantagens nas
aplicaes clnicas da TDF, segue uma rpida
explicao sobre os tipos de luminescncia (a emisso
de ftons a partir de estados eletrnicos excitados), da
qual a fluorescncia uma das formas.
Dependendo da natureza do estado fundamental e dos
estados excitados de uma molcula, o processo de
emisso de luz recebe diferentes denominaes. Num
estado excitado singleto, o eltron no orbital de maior
energia tem orientao de spin diferente da do eltron
no orbital de menor energia eles so ditos
desemparelhados (S=0). Num estado tripleto, os
eltrons esto emparelhados, o que significa que eles
tm a mesma orientao de spin (S=1). A converso
para um estado fundamental no exige alterao na
orientao de spin, mas ela necessria para uma
transio entre um estado singleto ou vice-versa. A
fluorescncia o fenmeno de emisso de foto por meio
d euma transio radiativa entres estados de mesma
multiplicidade de spin (eltrons emparelhados ou
desemparelhados em ambos os nveis de energia), e a
fosforescncia da emisso a partir de transio para o
estado fundamental de eltrons entre estados de
diferente multiplicidade (geralmente transitando de
tripletos para singletos). Transies do tipo das que
ocorrem na fluorescncia so permitidas pelas regras
de seleo da mecnica quntica (ou seja, tem alta
probabilidade de ocorrerem), e tm altas taxas de
emisso da ordem de 108 s-1 que resultam em tempos
de vida (tempo mdio de existncia dos estados
excitados) da ordem de 10 ns. J as transies que
geram a fosforescncia so proibidas pelas regras de
seleo (ou seja, pouco provveis de acontecerem) e ,
portanto, apresentam baixas taxas de emisso taxas
essas cujas ordens variam
de milissegundos a
segundos.
As molculas em estados excitados que surgem devido
absoro de um fton so pouco estveis
energeticamente, e por isso tendem a liberar a energia
absorvida novamente na forma dos ftons. Em gases
sob condies de baixa presso e temperatura, onde a
interao das molculas relativamente pequena, esses
ftons liberados que provocaram a excitao da
molcula, fenmeno que recebe o nome de
fluorescncia ressonante. Ela no acontece, entretanto,
em condies de presso ou temperatura mais elevadas,
nem em slidos e lquidos, pois a interao vibracional
entre as molculas nestes meios e condies faz com
que estas percam parte da energia absorvida, levando as

molculas ao menos nvel vibracional do estado

eletrnico m que se encontram.

compostos especficos em meios turvos atravs de

tcnicas pticas.

Portanto, quando a fluorescncia ocorre, a energia do

fton liberado pelas molculas menor que a dos ftons
absorvidos e consequentemente, seu comprimento de
onda maior que o dos absorvidos. Isto faz com que a
fluorescncia observada seja deslocada na direo da
regio do vermelho do espectro eletromagntico com
relao regio de excitao. Segundo Lakowicz, uma
vez que os espectros de emisso resultantes da
fluorescncia refletem os nveis vibracionais do estado
eletrnico fundamental da molcula excitada,
provvel empreg-los para a caracterizao e
identificao desta.

Na TDF, a espectroscopia de fluorescncia pode ser

empregada para o rastreamento dos FS in vivo, uma vez
que estes em geral so fluorforos com alto rendimento
quntico. Existem grandes vantagens na verificao da
presena de FS no tecido e de obter-se uma
quantificao do mesmo atravs da espectroscopia de
fluorescncia. Uma delas que esta uma tcnica noinvasiva, isto , no induzido nenhum tipo de
alterao no tecido a ser investigado, nem h a
necessidade de coleta de uma amostra tecidual e os
procedimentos posteriores associados a uma anlise
qumica, por exemplo. Alm disso, possvel obter uma
avaliao em tempo real devido rpida resposta da
fluorescncia excitao. Isto torna mais rpidos e
seguros os procedimentos clnicos, uma vez que
possvel identificar imediatamente a presena ou
ausncia do espectro do FS no tecido. Desta forma, no
se faz necessria a espera por anlises laboratoriais, que
levariam tempo e poderiam prejudicar a identificao
do momento em que mxima presena do FS no
tecido.

Tecidos biolgicos possuem uma imensa quantidade de

molculas que interagem diferentemente com a luz, as
quais se denominam cromforos. Existem trs tipos
principais de cromforos: fluorforos (grupos qumicos
que absorvem a luz e a convertem em fluorescncia),
absorvedores (grupos que absorvem a luz mas no a
convertem em fluorescncia) e espalhadores (estruturas
que modificam a direo do fton que com ela interage,
sem entretanto modificar sua energia e, portanto, seu
comprimento de onda). As propriedades pticas de cada
cromforo variam com o comprimento de onda de
excitao e com sua prpria estrutura e, desta forma,
da composio do tecido investigado. O metabolismo
do tecido tambm interfere com estas propriedades,
umas vez que os cromforos, e a sua conseqente
interao com a luz sofrem a influncia dos meios em
que se encontram.
A turbidez uma associao de fenmenos pticos que
implica na maior incidncia dos fenmenos de
espalhamento e absoro com relao fluorescncias.
Ao penetrar um meio turvo, a luz de excitao perde
intensidade (devido aos compostos absorvedores) e
percorre um caminho tortuoso, difcil de ser previsto
(devido ao efeito de cromforos espalhados no meio).
Alm disso, tambm a luz da fluorescncia emitida por
um fluorforo inserido no meio passa por estes
obstculos antes de deixar o meio e poder ser coletada
na superfcie por um detector. A luz originada na
fluorescncia espalhada pelos compostos espalhadores
molculas e estruturas de tamanhos variados, que
acabam por modificar a direo original dos ftons que
sobre elas incidem, semelhante ao que ocorre com a luz
de excitao. Parte da fluorescncia pode ser absorvida
por cromforos absorvedores presentes no meio (sendo
a hemoglobina a principal, em tecidos biolgicos), o
que acaba modificando a intensidade de fluorescncia
observada para os comprimentos de onda absorvidos, e
s vezes chega mesmo a mascarar a existncia de
fluorescncia em dadas regies do espectro, podendo
ser observado como depresses ou vales. A
fluorescncia coletada, portanto, a parte da mesma
que consegue chegar superfcie do tecido, e que
geralmente sofreu a influncia destes efeitos antes de
faz-los. Por isso, bastante complexa a investigao
da presena e a quantificao da concentrao de

H uma grande barreira a ser superada, e esta a

turbidez do meio. Apesar das variadas interaes que a
luz originada da fluorescncia sofre ao sair do tecido
devido sua turbidez, a determinao da concentrao
do FS dentro do tecido dificilmente poderia ser feita de
outra forma que no a quantificao da intensidade de
fluorescncia observada do tecido fotossensibilzado
investigado. Outras tcnicas certamente exigiriam
remoo tecidual ou outros recursos que igualmente
provocariam danos ou prejuzo ao paciente ou
aplicao da terapia.

RESULTADOS E DISCUSSO

Dados assim mostram a necessidade da medida de

fluorescncia para avaliao da distribuio do FS no
tecido. possvel assim com dados desse tipo verificar
a distribuio de fotossensibilizador,no caso, em fgado
de ratos Wistar.

BIBLIOGRAFIA

Dissertao: Identificao e quantizao de

fotossesibilizador em tecido
heptico por
espectroscopia de fluorescncia e sua
importncia na terapia fotodinmina Jos
Dirceu Vollet Filho

TCC: Espectroscopia ptica: Histrico, conceitos

fsicos e aplicaes. David Elprin Cipio Lopes

http://pt.wikipedia.org/wiki/Espectroscopia

Espectroscopia por Fluorescncia

Jssica Baleiro Okado
OBJETIVOS
O presente trabalho tem como inteno explicar um
pouco sobre espectroscopia de fluorescncia e os
parmetros que afetam modelos experimentais usando
tal tcnica, explorar quais instrumentos experimentais
existem, e como panorama futuro, buscar tcnicas de
espectroscopia de fluorescncia e aplicaes

INTRODUO
Em fsica e qumica, o termo espectroscopia a
designao para toda tcnica de levantamento de dados
fsico-qumicos atravs da transmisso, absoro ou
reflexo da energia radiante incidente em uma amostra.
O tipo de espectroscopia utilizada depende da grandeza
fsica medida em geral, a grandeza que medida uma
intensidade, tanto da energia absorvida quanto da
produzida.
A espectrometria teve sua origem com Bunsen e
Kirchnoff, no inicio da dcada de 1860. Teve fator
importante no desenvolvimento da mecnica quntica,
explorando os nveis de energia de tomos e molculas.
Esses nveis de energia eletrnica, nucleares,
rotacionais e vibracionais, podem ser tratados
separadamente, na maioria das vezes, mas alguns casos
de espectroscopia envolvem combinaes desses nveis
de energia.
A espectroscopia rotacional tem origem nas rotaes
quantizadas de molculas no espao tridimensional, a
vibracional surge das vibraes dos tomos
individualmente em molculas, em relao uns aos
outros, tais movimentos ocorrem em freqncias mais
altas que as rotaes, portanto, espectros vibracionais
so observados usando luz de energia mais alta que na
espectroscopia rotacional.
Em espectroscopia, um sistema atmico ou molecular
com uma determinada funo de onda e energia,
absorve ou emite energia, normalmente, na forma de luz
e ao faz-lo, passa a ser descrito por outra funo de
onda com energia diferente. Em todas as formas de
espectroscopia, a observvel de maior interesse a
diferena entre as energias das funes de onda entre os
estados inicial e final.

Quando se depara com um espectro para interpretar, o

conhecimento das regras de seleo uma ferramenta
indispensvel para obter informao fsica a partir desse
espectro. A espectroscopia rotacional e vibracional pode
ser simplificada em funo das regras de seleo.
Tanto as tcnicas de fluorescncia como fosforescncia
so muito uteis no estudo terico da estrutura qumica,
ligaes, configurao eletrnica em molculas, nveis
de energia em teoria de orbitais moleculares. Ainda,
devido a imposies fsicas do uso da fosforescncia,
em qumica analtica, a aplicao dos fenmenos
luminescentes est restringida a fluorimetra, que
consiste na quantificao de radiao emitida por
fluorescncia de uma espcie qumica que possuem
estas caractersticas e que diretamente proporcional a
sua concentrao.
A espectroscopia de fluorescncia, tambm chamada de
espectrofluorimetria, ou simplesmente fluorimetria,
um tipo de espectroscopia eletromagntica, a qual
analisa a fluorescncia da amostra. Isso envolve o
resultado da absoro de energia radiante e emisso de
parte dessa energia, na forma de luz de baixa energia,
normalmente, mas no necessariamente luz visvel, a
emisso de luz se d pela excitao de eltrons nas
molculas de certos compostos, normalmente usando
luz ultravioleta. uma tcnica complementar
espectrometria de absoro.

FLUORESCNCIA MOLECULAR
A luminescncia molecular a emisso de radiao
eletromagntica (na regio do ultravioleta prximovisvel) proveniente de molculas que foram excitadas,
retornando ao seu estado fundamental. Esse fenmeno
denominado de fotoluminescncia, quando a absoro
de ftons de luz (h) o responsvel pela excitao da
molcula pela elevao de eltrons de valncia de um
orbital menos energtico para um de maior energia. A
luminescncia molecular formalmente divida em
fluorescncia e fosforescncia, dependendo da natureza
do estado excitado envolvido no processo. Se o estado
excitado singleto, (spin do eltron no orbital excitado
mantm sua orientao original), tem-se a
fluorescncia. J na fosforescncia, a orientao do

eltron que foi promovido para o estado excitado

invertida (tripleto).
Em conseqncia da reteno da orientao original, o
retorno de uma populao que se encontra em estado
singleto para o estado fundamental (que tem carter
singleto) permitido e ocorre muito rapidamente, da
ordem de nanossegundos. Assim, a fluorescncia um
fenmeno luminescente mais comum que a
fosforescncia. Como conseqncia direta disso,
possvel observar mais facilmente fluorescncia na
temperatura ambiente e diretamente em soluo, o que
torna o procedimento experimental fluorimtrico
bastante simples e com limites de deteco tpicos da
ordem de partes por milho
A figura abaixo mostra um diagrama parcial de nveis
de
energia
para
uma
hipottica
molcula
fotoluminescente. S0 o estado fundamental.
Normalmente um singleto. As linhas da esquerda
representam S1 e S2 e correspondem, respectivamente,
ao primeiro e segundo estado singleto excitado.
direita, T1 corresponde ao primeiro estado tripleto
excitado. O estado tripleto menos energtico que o
correspondente estado singleto excitado.

A fluorescncia a base da fluorimetria, que engloba o

conjunto de tcnicas analticas baseadas na deteco de
ftons emitidos por molculas excitadas de carter
singleto, quando estas retornam para o estado
fundamental.

FATORES
QUE
FLUORESCNCIA

INFLUENCIAM

Para que ocorra a fluorescncia, uma molcula precisa

ter estrutura apropriada e estar em meio que favorea a
desativao radiativa do primeiro estado singleto (S1)
para o estado fundamental (S0), sendo esses dois fatores
crticos na magnitude da eficincia quntica
fluorescente (f) de uma substncia. Esta que definida

pela razo entre o numero de ftons emitidos por

fluorescncia e o numero de ftons absorvidos. Uma
molcula ser significativamente fluorescente se sua
eficincia quntica tiver magnitude considervel (entre
0,1 e 1).
Estrutura: molculas relativamente rgidas e ricas em
eltrons , contendo ou no heterotomos em sua
cadeia, so potencialmente fluorescentes. Uma estrutura
planar favorece a fluorescncia, pois aumenta a
interao e conjugao entre o sistema de eltrons . A
fluorescncia advm das transies *-> (entre
orbital PI anti-ligante e orbital PI-ligante) e em menor
escala *->n (orbital anti-ligante e no-ligante). A
presena de grupos substituintes na molcula tambm
importante, pois afeta a intensidade e o tipo de
luminescncia.
Meio: alguns fatores tambm so essenciais, tais como:
temperatura, pH, caractersticas do solvente, e presena
de outras espcies. A polaridade e o carter prtico do
solvente so importantes, pois afetam a energia do
estado excitado. No caso das ligaes -*, a
molcula no estado excitado mais polar e tem carter
mais bsico do que quando ela se encontra no estado
fundamental. Assim, o aumento da polaridade do
solvente ou do seu carter prtico, acarreta numa
diminuio da energia relativa do estado excitado, com
deslocamento do espectro em direo ao vermelho,
causando diminuio da fluorescncia. O efeito do ph
nos sistemas de solventes prticos relevante em
fluorescncia de molculas aromticas
O conhecimento dos parmetros experimentais
fundamental para se aproveitar o potencial Maximo do
fenmeno luminescente, em aplicaes de qumica
analtica, pois a manipulao de condies pode
acarretar em significante aumento tanto da sensibilidade
quanto
da
seletividade
das
determinaes
fluorimtricas.
Ainda, substncias que no apresentam luminescncia
intrnseca natural podem ser induzidas a fluorescer ou
fosforecer atrs de diversas reaes que modificam a
estrutura da molcula e conseqentemente as
propriedades fsico-qumicas dessas substancias,
obtendo um derivado luminescente (derivao). Para a
obteno desses derivados pode-se efetuar, por
exemplo, reaes com agentes oxidantes, redutores,
fluoro gnicos ou fosforognicos.

RELAES QUANTITATIVAS

A relao existente entre concentrao C e a intensidade

de radiao (ia) dada pela lei de Beer-Lambert:
Ia=Io-It = Io.(1-10-Cl)
Onde Io e It so, respectivamente, as intensidades de
radiao incidente e transmitida, a absortividade
molar caracterstica da molcula absorvente, C a
concentrao do analito e l a espessura do caminho
ptico percorrido pela radiao dentro do
compartimento onde se encontra a amostra. No
processo luminescente, Ia passa a ser denominada de
radiao de excitao
O efeito quantitativo da presena de agentes
desativadores na fluorescncia medida dado pela
relao de Stern-Volmer:

fonte de excitao passa atravs de um filtro ou

monocromador, e incide sobre a amostra. Um a parte da
luz incidente absorvida pela amostra e algumas das
molculas da amostra produzem fluorescncia. A luz
fluorescente emitida em todas as direes. Parte dessa
luz passa por um segundo filtro ou monocromador e
chega a um detector, o qual geralmente se encontra a
90, com relao ao feixe de luz incidente, para
minimizar o risco de que a luz incidente refletida
chegue ao detector.
Os componentes de um espectrofluormetro so muito
similares a um espectrmetro de luz visvel-UV. Um
diagrama simplificado de um equipamento desses
aparecen a figura:

IF0/IF = 1 + Kq [Q]
Onde IF0 e IF so as intensidade das fluorescncias na
ausncia e na presena do agente desativador Q, Kq a
constante de Stern-Volmer, que por sua vez a razo
entre a constante de velocidade do quenching Kq e o
somatorio das outras constantes de velocidade dos
processos de desativao do estado excitado singleto. O
caso da fluorescncia, espera-se desativao
significativa apenas nos casos onde o agente
desativador for um componente majoritrio na matriz
onde o analito se encontra.

CONFIGURAO EXPERIMENTAL
Em um experimento tpico, para observao do espectro
de emisso, so medidas as diferentes freqncias de
luz fluorescente emitidas pela amostra, mantendo a luz
de excitao a um comprimento de onda constante. Um
espectro de excitao se mede com registro de uma
srie de espectros de emisso utilizando luz de
diferentes comprimentos de onda

O feixe duplo padro til para compensar as

flutuaes na intensidade da fonte de excitao. O Feixe
de referncia passa atravs de um atenuador de radiao
e se ajusta ate que a sua intensidade seja igual
intensidade do feixe de fluorescncia que passa pelo
recipiente da amostra com soluo de branco.

INSTRUMENTAO

O feixe de radiao dirigido no recipiente da amostra

passa por um filtro (Fluormetro) ou por um
monocromador (especrofluormetro), onde se seleciona
o comprimento de onda da radiao que vai incidir na
amostra. A radiao fluorescente emitida pela amostra
espalhada em todas as direes, sendo mais conveniente
medi-la em um ngulo de 90 com respeito ao feixe
incidente, j que a radiao dispersada pela soluo
pode interferir com a radiao emitida pela espcie
fluorescente.

Em espectrometria de fluorescncia, se utilizam,

geralmente dois tipos de instrumentos: fluorimetros de
filtro e espectrofluorimetros. Ambos os tipos de
instrumentos utilizam o seguinte esquema: a luz de uma

Tanto o feixe de referncia como o feixe da amostra so

dirigidos a um sistema de foto tubos e posteriormente a
um amplificador diferencial, que se encontra conectado
a um sistema de leitura. A seleo e compra do

Um espectro de fluorescncia sempre implica em

comprimento de onda maior que utilizado para a
excitao da espcie, pois como se v no diagrama,
parte da energia que a molcula recebe se dissipa em
forma de calor (processos no radioativos) e somente
parte desta energia se reemite como radiao
eletromagntica (fluorescncia).

espectrofluormetro feita essencialmente pelo custo e

finalidade do trabalho que se deseja fazer.

COMPONENTES DE FLUORMETROS
Fontes de excitao: Diversos tipos de luz podem ser
utilizados como fontes de excitao, incluindo laser,
fotodiodos e lmpadas. Arcos de xennio e lmpadas de
mercrio. O laser s emite luz de alta irradiao em um
intervalo muito estreito de comprimento de onda, em
geral de 0,01nm, sendo desnecessrio o monocromador
de excitao ou o filtro. A desvantagem deste mtodo,
que o comprimento de onda de um laser no se pode
mudar muito. Uma lmpada de vapor de mercrio
uma lmpada linear, o que significa que emite luz
prxima do pico de comprimentos de onda. Ao
contrario, um arco de xennio tem um espectro de
emisso continuo com intensidade quase constante em
uma regio de 300-800 nm, e radiao suficiente para as
medidas bem acima de 200nm.
A lmpada de tungstnio comum no tem intensidade
suficiente para ser utilizada em fluorescncia. So
comumente utilizadas lmpadas de Xennio e de
mercrio. A lmpada de xennio mais verstil que a
de mercrio. O espectro deste tipo de lmpada
contnuo de 250nm a 600nm, com um pico de mxima
intensidade em 470nm.

Filtros e monocromadores: em fluorimetros podem ser

usado filtros ou monocromadores. um monocromador
transmite luz de comprimento de onda e tolerncia
ajustveis. O tipo mais comum de monocromador
utiliza uma rede de difrao, ou seja, a luz colimada
entre em uma rede e sai com um ngulo diferente,
dependendo
do
comprimento
de
onda.
O
monocromador
pode
ento,
selecionar
que
comprimentos de onda transmite. Para tornar possvel
medio de anisotropia se combinam dois filtros de
polarizao: um depois do monocromador de excitao
ou filtro, e outro antes do monocromador de emisso ou
filtro.
Para fluormetros de filtros, utiliza-se freqentemente
filtros de absoro e de interferncia.
A fluorescncia se mede em geral, a 90 em relao
luz de excitao. Utiliza-se essa geometria ao invs de
colocar um sensor na linha da luz de excitao em um
ngulo de 180, a fim de evitar interferncia da luz de
excitao transmitida. O monocromador no perfeito e
transmitir luz com outros comprimentos de onda
diferentes do estabelecido. Um monocromador ideal s

transmite luz em uma regio especifica e tem uma

transmisso independente do comprimento de onda. Ao
medir em um ngulo de 90, s a luz dispersa pela
amostra provoca luz. Isso se traduz em uma melhor
relao sinal-ruido, e reduz o limite de deteco a um
fator de aproximadamente 10000, se comparada com a
geometria de 180. Por outro lado, a fluorescncia
tambm pode ser medida pela parte de trs,
procedimento que se utiliza para amostras turvas.

Detectores: os detectores podem ser s de um canal ou

de mltiplos canais. O detector de um canal s pode
detectar a intensidade de um comprimento de onda de
cada vez, enquanto o de mltiplos canais detecta
intensidades em todos os comprimentos de ondas
simultaneamente, sendo desnecessrio o uso de
monocromador de emisso ou filtro.
Como o sinal de fluorescncia de baixa intensidade,
so requeridos sistemas de amplificao potentes. Por
isso, so mais utilizados fotomultiplicadores, sendo
bastante usados foto tubos, em geral em equipamentos
mais baratos. A amplitude do sinal de sada, e, portanto,
a sensibilidade, diretamente proporcional a potncia
da fonte.

Cubetas: so utilizadas cubetas de vidro comum,

quando a radiao manejada na regio visvel. Para
ultravioleta, so utilizadas cubetas de quartzo.

TIPOS DE ESPECTROS DE FLUORESCNCIA

Trs principais tipos de espectros de fluorescncia
podem ser obtidos para cada amostra, em funo do tipo
de informao desejada: espectro de emisso, de
excitao de excitao/emisso sincronizado.

Espectro de emisso: para se registrar o espectro de

emisso de um composto, irradia-se a amostra com um
comprimento de onda de excitao fixo e mede-se a
intensidade da luz reemitida, numa faixa espectral
definida. Consiste fundamentalmente na reemisso de
energia previamente absorvida pela amostra.
O
comprimento de onda de excitao ideal para registrar o
espectro de emisso de um composto fluorescente
determinado , em geral, escolhido em funo do seu
espectro de absoro. Na maior parte dos casos, este
comprimento de onda recebe corresponde ao mximo
de absoro.

Espectro de excitao: para registrar o espectro de

excitao, se varia o comprimento de onda de excitao,
enquanto, o comprimento de onda de observao (ou
emisso) mantido constante. O comprimento de onda
de observao ideal aquele que corresponde posio
do mximo do espectro de emisso do composto
considerado. Para um composto puro, a forma do
espectro de excitao corrigido deve ser similar, seno
idntica quelas de seu espectro de absoro e
independente do comprimento de onda de observao,
se todos os estados excitados produzidos pela absoro
se transformam por converso interna at o nvel
vibracional mais baixo do primeiro estado singleto
excitado.

Espectro sincronizado: os espectros sincronizados so

obtidos pela varredura simultnea de uma faixa
espectral de comprimento de onda de excitao e de
emisso, apresentando um intervalo () constante
entre eles. Esta tcnica tem sido utilizada para estudar
misturas de fluorforos e, em alguns casos, espectros
bem estruturados podem ser obtidos a partir de misturas
para os quais, em espectrofluorimetria convencional,
obtinha-se espectros com bandas sobrepostas. O
intervalo () a ser utilizado para um determinado
composto , em geral, escolhi empiricamente. Quando o
espectro de excitao e o de emisso so simtricos, o
melhor intervalo aquele que representa o (),
expresso em comprimentos de onda, entre os mximos
de excitao e de emisso.

CORREO DE ESPECTROS
A fluorescncia um mtodo de anlise relativamente
simples, muito sensvel e no-destrutivo que se aplica a
numerosas molculas. Apesar dessas vantagens, muitos
laboratrios hesitam em usar essa tcnica por falta de
intercalibrao entre os resultados obtidos com
diferentes instrumentos.
Para determinar as caractersticas prprias de
fluorescncia de uma molcula, necessrio corrigir o
espectro de excitao, pela variao, com comprimento
de onda, da intensidade da fonte de excitao e tambm
pela variao da transmisso do monocromador de
emisso e do fotomultiplicador, com o comprimento de
onda. Essas correes so fundamentais se os resultados
obtidos por diferentes instrumentos devem ser
comparados entre si, o u ainda, para o resultado das
propriedades de fluorescncia de um composto

determinado, como por exemplo, o rendimento

quntico. Os procedimentos necessrios para obter
espectros corrigidos com relao s funes
instrumentais, aos efeitos de difuso, e aos efeitos de
filtro interno, tm sido discutido, ao longo dos anos, por
diferentes autores.
Os diferentes tipos de distores podem ser
classificados em relao ao instrumento e a amostra.
Pensando inicialmente nas distores causadas por
instrumentos, a intensidade das fontes de luze as
caractersticas dos comprimentos de onda variam com o
tempo durante cada experimento. Por outro lado,
nenhuma lmpada tem uma intensidade constante em
todas as freqncias. Para corrigir isso, pode-se aplicar
um feixe separador depois do filtro ou monocromador
de excitao, para dirigir uma poro da luz a um
detector de referncia.
Alem disso, deve-se ter em conta, que o rendimento de
transmisso dos monocromadores ou filtros, j que
tambm podem variar com o tempo. A eficcia da
transmisso do monocromador varia dependendo do
comprimento de onda. Esta a razo pela qual se deve
colocar um detector de referncia aps o filtro ou
monocromador de excitao. A porcentagem de
fluorescncia detectada tambm depende do sistema.
Por outro lado, a eficincia quntica do detector, a
porcentagem de ftons detectados, varia entre os
diferentes detectores, segundo o comprimento de onda e
tempo.
Distores causadas pela amostra: a foto decomposio
pode diminuir a intensidade da fluorescncia com o
tempo. Deve-se tambm levar em conta a disperso da
luz. Os tipos mais importantes de disperso, nesse
contexto, a disperso de Rayleigh e de Raman. A luz
dispersa por disperso de Rayleigh tem o mesmo
comprimento de onda que a luz incidente, enquanto que
a disperso de Raman, a luz troca de comprimentos de
onda para mais largos. A disperso de Raman
resultado de um estado eletrnico virtual induzido pela
luz de excitao. A partir desse estado virtual, as
molculas podem voltar a um nvel vibracional
diferente do estado basal.
Em espectros de
fluorescncia sempre so observados uma diferena
constante nos comprimentos de onda em relao com o
de excitao.
Outros aspectos a se considerar so os efeitos de filtro
interior. Estes incluem reabsoro, que ocorre porque
outra molcula ou parte de uma macromolcula absorve
nos comprimentos de onda em que o fluorforo emite
radiao. Neste caso, uma parte da totalidade dos ftons
emitidos pelo fluorforo, pode ser reabsorvida. Outro

efeito do uso de filtro interno ocorre por causa de altas

concentraes de absoro das molculas, incluindo o
fluorforo. O resultado que a intensidade de excitao
da luz no constante ao longo da soluo. Como
resultado, s uma pequena porcentagem da luz de
excitao chega aos fluorroforos que so visveis para
o sistema de deteco. Os efeitos do filtro interior
trocam o espectro e a intensidade de luz emitida, e, por
tanto, devem ser considerados a analisar o espectro de
emisso de luz fluorescente.

Mediante a anlise de diferentes freqncias de luz

emitida por espectroscopia de fluorescncia, junto com
suas intensidades relativas, possvel determinar as
estruturas de diferentes nveis de vibrao.

APLICAES

Algumas aplicaes dos mtodos de reflexo total

interna de fluorescncia - TIRF, em ligao de
protenas e para teste de superfcies artificiais, medio
da concentrao de molculas prximas a uma
superfcie, observao de taxas de reao em
biosuperfcies.

So vrias as tcnicas que envolvem o uso de

espectroscopia de fluorescncia, entre elas pode-se
citar: FRET, FLIM (tempo de vida de fluorescncia em
microscopia de imagem), BRET (ressonncia de
transferncia de energia biomoluminescente, FRAP,
TIRF (reflexo total interna de fluorescncia),
observao de espectro de correlao de fluorescncia.

A espectroscopia de fluorescncia e suas aplicaes em

fsica e biologia tem se desenvolvido muito rpido
desde 1980. O crescimento no interesse em
fluorescncia pareceu ser devido a avanos em
resoluo temporal, mtodos de analise de dados e
melhora da instrumentao. Com esses avanos, hoje a
performance em experimentos em medidas com boa
resoluo temporal com suficiente resoluo boa para
comparar os resultados com fatores dinmicos e
estruturais de macromolculas, comprovar estruturas de
protenas, membranas e cidos nuclicos, e adquirir
imagens bidimensionais de microscopia da qumica de
distribuio de protenas em culturas celulares. Avanos
de laser e tecnologia de detectores, tambm resultaram
em aumento de interesse no uso de fluorescncia para
qumica clinica e analtica.

Espectroscopia usando radiao sncroton em tempo

real, pode ser usada em analise de protenas e peptdeos,
estudos de membrana, processos de fotossntese, e de
processos de estado excitado. Espectroscopia de
fluorescncia por correlao (FCS) pode analisar
funes de magnitude como densidade molecular, peso
molecular e agregado e polidisperso de molculas.

REFERNCIAS

Por causa de numerosos melhoramentos e aparecimento

de novos mtodos, fica difcil resumir as inmeras
aplicaes do mtodo de fluorescncia na cincia.,e por
isso s sero citados neste trabalho. Por exemplo,
possvel estudar tcnicas com fluorescncia da tirosina
para estudo de protenas e peptdeos, dado as
propriedades de absoro da tirosina, usando estado
singletos e tripletos da tirosina e tirosinato. Mecanismos
de quenching da emisso da tirosina em peptdeos e
protenas permite estudar ligaes peptdicas, energia de
ressonncia transferida de estado singleto-singleto, ou
tripleto-tripleto, pontes dissulfeto e grupos sulfidrilos e
interaes com cadeias laterais, rotao de grupos
aromticos, alem de estudos com espectroscopia de
fluorescncia em relaxao molecular.

possvel aplicar mtodos de fluorescncia em

dinmica de cidos nuclicos e de membrana e mtodos
pra imunodiagnsticos.

Lakowichz, J. Topics in Fluorescence

spectroscopy. Vol 1- Techniques. 1991- Ed
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Lakowichz, J. Topics in Fluorescence
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http://ebookpp.com/es/espectroscopia-defluoresc%C3%AAncia-pdf-2.html

Espectroscopia de Fluorescncia
Priscilla Jukeram Bergo
INTRODUO
O fenmeno da fluorescncia
O fenmeno estudado conhecido como luminescncia
molecular consiste na emisso de radiao
eletromagntica (na regio do ultravioleta prximovisvel) proveniente de molculas que foram excitadas,
retornando ao seu estado fundamental. Esse fenmeno
denominado de fotoluminescncia, quando a absoro
de ftons de luz (hex) o responsvel pela excitao da
molcula pela elevao de eltrons de valncia de um
orbital menos energtico para um orbital de maior
energia. A luminescncia molecular formalmente
dividida em fluorescncia e fosforescncia, dependendo
da natureza do estado excitado envolvido no processo.
Se o estado excitado envolvido singleto, onde o spin
do eltron no orbital excitado mantm sua orientao
original, tem-se a fluorescncia (Figura 1). Por outro
lado, na fosforescncia, a orientao do eltron que foi
promovido ao estado excitado invertida (estado
excitado tripleto, Tn). Em conseqncia da reteno da
orientao original, o retorno de uma populao que se
encontra no estado excitado singleto para o estado
fundamental (que tem carter singleto), permitido e
ocorre muito rapidamente (tempo de vida na ordem de
ns). Assim, a fluorescncia intrinsecamente um
fenmeno luminescente mais comum que a
fosforescncia, competindo eficientemente com
processos de desativao no-radiativos do estado
excitado. Como conseqncia direta disso, possvel
observar facilmente fluorescncia na temperatura
ambiente e diretamente em soluo, o que torna o
procedimento experimental fluorimtrico bastante
simples.

Figura 1: Representao do estado fundamental e dos estados

excitados singleto e tripleto.

Em condies normais a maior parte das molculas se

encontra no nvel energtico vibracional mais baixo do
estado eletrnico So (estado fundamental). A absoro
de um quantum de luz promove a passagem dos eltrons
a nveis superiores de energia. Durante o retorno ao
estado fundamental, uma parte da energia absorvida
reemitida, sendo este fenmeno conhecido como
luminescncia. Se a energia reemitida a partir do
primeiro estado singleto excitado (S1), o fenmeno
corresponde fluorescncia. A fluorescncia

corresponde, em princpio, ao processo inverso do

fenmeno da absoro, uma vez que se produz sempre
pela emisso de energia a partir do nvel mais baixo do
primeiro estado singleto excitado.
A fluorescncia de um composto depende de sua
estrutura molecular e est quase sempre associada ao
sistema eletrnico . Os eltrons envolvidos numa
ligao esto, geralmente, fortemente ligados a
molcula sendo necessrio fornecer mais energia para
levar estes eltrons a ocuparem um orbital molecular
vazio. Assim, os espectros eletrnicos produzidos por
transies
* se situam nas zonas de
comprimentos de onda mais curtos do espectro
eletromagntico. Os eltrons , ao contrrio, esto mais
livres que os eltrons . O espectro de emisso
correspondente se situa na regio de comprimentos de
onda mais longos.
Como descrito anteriormente aps a absoro de
radiao de comprimento de onda caracterstico, a
populao de molculas promovida para um estado
excitado singleto, Sn, (Figura 2). Segundo a regra de
Kasha, a molcula se desativa por relaxamento atravs
dos nveis vibracionais de estados eletrnicos de mesma
multiplicidade at atingir o primeiro nvel vibracional
do estado excitado singleto de menor energia (S1). Este
processo de relaxamento recebe o nome de cruzamento
interno (CI) e um fenmeno que ocorre com muita
rapidez (10-l3 a 10-11 s) e sem emisso de radiao.

Figura 2: Diagrama de Jablonski modificado. (A) absoro

de um fton, (S0) estado fundamental, (Sn) estado excitado
singleto, (S1) primeiro estado excitado singleto, (RV)
relaxamento vibracional, (CI) cruzamento interno, (CSI)
cruzamento inter-sistemas, (Tn) estado excitado tripleto.
(Adaptado de Cardoso, 2003)

A partir de S1, se a multiplicidade da populao

molecular no mudar, ela pode seguir dois caminhos
para retornar ao estado fundamental. Primeiro, se a
diferena de energia entre S1 e S0 (estado fundamental)
no for muito grande e existir possibilidade de

sobreposio de nveis vibracionais, a molcula pode

ser levada ao mais baixo nvel vibracional de S1 por
relaxamento vibracional sem emisso de radiao
eletromagntica, ou seja, ocorre um CI. Se, no entanto,
a diferena energtica entre S1 e S0 for relativamente
grande, a desativao para o estado fundamental se d
com emisso de radiao na forma de fluorescncia. A
fluorescncia a base da fluorimetria que engloba o
conjunto de tcnicas analticas baseadas na deteco dos
ftons emitidos por molculas excitadas de carter
singleto quando estas retornam para o estado
fundamental.
Para que ocorra a fluorescncia, uma molcula precisa
ter estrutura apropriada e estar em um meio que
favorea a desativao radiativa S1 S0, sendo esses
dois fatores crticos na magnitude da eficincia quntica
fluorescente (f) de uma substncia. A eficincia
quntica fluorescente de uma substncia a razo entre
o nmero de ftons emitidos por fluorescncia e o
nmero de ftons absorvidos (Equao 1). Uma
molcula ser significativamente fluorescente se sua
eficincia quntica tiver magnitude considervel (entre
0,1 e 1).

If
Ia

= ( f )

(1)

onde If e Ia so respectivamente as intensidades da

radiao fluorescente e absorvida.
Embora seja difcil prever teoricamente se uma
molcula exibir luminescncia sem o prvio
conhecimento da diferena de energia relativa entre o
estado excitado singleto e o fundamental.

diminuindo fluorescncia (Ingle e Crouch, 1988),

resumindo os grupos doadores de eltrons aumentam a
eficcia de emisso de fluorescncia enquanto que os
retiradores de eltrons reduzem a intensidade de
fluorescncia.
Somando aos fatores anteriores temos, os fatores
externos passveis de influenciar a emisso de
fluorescncia que so: a temperatura e o solvente. Um
aumento da temperatura se traduz por um aumento da
probabilidade de colises no estado excitado
aumentando as converses internas e, em conseqncia,
uma diminuio da eficcia de fluorescncia.. As
interaes soluto-solvente podem tambm afetar de
maneira significativa o sinal de fluorescncia por
processos complexos. O grau de perturbao depende
do pH, da solvatao, da possibilidade de formar
ligaes de hidrognio, da viscosidade, da fora inica e
da polaridade do solvente, entre outros.
Existem ainda perturbaes do espectro de emisso de
fluorescncia que so devidos aos fenmenos de difuso
da luz: a difuso de Rayleigh, a difuso Tyndall e a
difuso Raman. As duas primeiras so difuses do tipo
"elstico", isto , sem mudana do comprimento de
onda da luz incidente. A Raman, por outro lado, uma
difuso "inelstica" que se acompanha de um
deslocamento do comprimento de onda. A difuso
Rayleigh provocada pela presena, sobre o trajeto do
raio luminoso incidente, de partculas de tamanho muito
inferior ao comprimento de onda da luz incidente, como
as molculas de gua, por exemplo. A difuso Tyndall
provocada por suspenses de dimenses coloidais.
Enfim, a banda Raman provm da difuso, pelas
molculas do solvente, de uma parte da luz incidente
(menos de 1%) e sua posio relativa depende da
natureza das molculas do solvente utilizado.

Fatores que influenciam na fluorescncia

Primeiramente, molculas relativamente rgidas e ricas
em eltrons (como no caso das molculas aromticas),
contendo ou no heterotomos em sua cadeia principal,
so
potencialmente
fluorescentes.
Estruturas
moleculares rgidas (com restries de liberdade
vibracional) tm o processo de desativao noradiativo por CI significantemente minimizado com
conseqente aumento da f. J uma estrutura molecular
planar favorece a fluorescncia, pois aumenta a
interao e conjugao entre o sistema de eltrons . A
fluorescncia advm de transies * (entre orbital
pi anti-ligante orbital pi ligante) e em menor escala
*n (entre orbital pi anti-ligante orbital noligante). A presena de grupos substituintes na molcula
tambm fator importante, pois afeta a intensidade e o
tipo de luminescncia, sendo que a presena de grupos
hidroxi (-OH), metoxi (-OR), amino (-NR2), cianeto (CN) e sulfnico (-SO3H) tm tendncia em amplificar a
fluorescncia. Por outro lado, grupos cetnicos (-C=O)
carboxlicos (-COOH) e halognios (-X) favorecem o
cruzamento intersistemas, trocando a multiplicidade da
populao excitada (S1 Tn) e por conseqncia

A instrumentao em fluorescncia
A instrumentao para as medidas de fluorescncia
(figura 3) comporta uma fonte de luz para excitar a
amostra, um monocromador para selecionar o
comprimento de onda de excitao, um compartimento
para a amostra, um segundo monocromador para isolar
e analisar a emisso fluorescente proveniente da
amostra, um fotomultiplicador e, finalmente, um
registrador para determinar a intensidade da emisso de
fluorescncia.

Como vrios processos competem pela desativao do

estado excitado singleto, a intensidade de fluorescncia
If (Equao 3) obtida multiplicando-se a Equao 2
por f que o fator que indica a frao de molculas no
estado excitado que efetivamente fluorescem.

I f = f Ia

(3)

Assim, combinando-se as Equaes 2 e 3, temos a

Equao 4:

I f = f I 0 ( I 10 cl )

Figura 3: Principais componentes de um espectrofluormetro

Existem trs tipos de instrumentos para as medidas

de fluorescncia: aqueles que trabalham com filtros,
aqueles que trabalham com prismas e aqueles que
utilizam redes de difrao (diffractions grading) como
monocromadores. Em geral, os filtros absorvem um
faixa de comprimentos de onda definida da luz
incidente policromtica e selecionam assim, a passagem
de comprimentos de onda previamente escolhidos. Os
prismas trabalham segundo o princpio dos ndices de
refrao que so diferentes segundo os comprimentos
de onda. As grades de difrao decompem a excitao
policromtica em seus componentes, pelo princpio das
interferncias destrutivas e construtivas da luz.
Os monocromadores de rede de difrao so os mais
eficazes para eliminar a faixa de comprimentos de onda
da luz incidente sobre a amostra, o que aumenta a
sensibilidade das medidas.
Os instrumentos atuais mais precisos so geralmente
equipados com dois monocromadores duplos para
excitao e para emisso, o que minimiza os efeitos de
difuso parasita.

Relaes quantitativas
A relao existente entre concentrao (C) e a
intensidade da radiao absorvida (Ia) dada pela Lei
de Beer-Lambert (Equao 2).

I a = I 0 I t ( I 10cl )

(2)

onde I0 e It so, respectivamente, as intensidades de

radiao incidente e transmitida, a absortividade
molar caracterstica da molcula absorvente, c a
concentrao do analito e l a espessura do caminho
tico percorrido pela radiao dentro do compartimento
onde se encontra a amostra. No processo luminescente,
Ia passa a ser denominada de radiao de excitao.

(4)

Considerando que a amostra contendo o fluorforo

(substncia fluorescente) esteja em soluo, que exista
mnima perda por espalhamento da radiao de
excitao, e que os valores de cl seja menor que 0,02
(condies opticamente finas observadas em solues
diludas de fluorforo), pode-se fazer a expanso em
srie da Equao 4. Os termos superiores da srie
podem ser negligenciados para simplificar o
procedimento, obtendo-se assim a Equao 5:

I f = 2,3 f I 0cl

(5)

I f = kc

(6)

ou

onde o valor de k pode ser facilmente obtido a partir de

uma curva analtica.
O efeito quantitativo da presena de agentes
desativadores na fluorescncia medida dado pela
relao de Stern-Volmer (Equao 7).

I F0
= 1 + K q [Q]
IF

(7)

onde IF0 e IF so as intensidades das fluorescncias na

ausncia e na presena do agente desativador Q, Kq a
constante de Stern-Volmer, que por sua vez a razo 50
entre a constante de velocidade do quenching Kq e o
somatrio dos outras constantes de velocidade dos
processos de desativao do estado excitado singleto a
mencionar: a constante de velocidade da fluorescncia
KF , a constante de velocidade do cruzamento interno
(KCl) e a constante de velocidade do cruzamento
intersistemas (Kcis), que por sua vez o processo de
mudana de multiplicidade do estado excitado (S1
Tn). A relao entre Kq e kq dada pela Equao 8,
onde o tempo de vida do evento luminescente na
ausncia do agente desativador.

K q = kq 0

(8)

Considerando que a taxa para coliso biomolecular em

soluo na temperatura ambiente da ordem de 1010 L
mol-1s-1, e que de todas as colises resultam em
desativao, o valor mximo para kq ser 1010 L mol1s-1. No caso da fluorescncia, cujo tempo de vida da

ordem de ns (por exemplo, = 1 ns), o valor esperado

para Kq 10 L mol-1, que ao ser substitudo na Equao
de Stern- Volmer, implica em um quenching dinmico
da
fluorescncia
quase
negligencivel
para
concentraes de agente desativador na ordem de 1
mmol L-1.
Para efeito de comparao, no caso da fosforescncia
(que tem 0 da ordem de ms), kq pode alcanar 107 L
mol-1, o que implica em total desativao da
luminescncia com concentraes de agente desativador
na ordem de 1 mmol L-1.
Assim, no caso da fluorescncia espera-se desativao
significativa apenas em casos onde o agente desativador
for um componente majoritrio na matriz onde o analito
se encontra (por exemplo, uma substncia ativa
associada presente em maior quantidade ou um veculo,
no caso de medicamentos), j considerando as diluies
inerentes preparao da amostra.
Fica claro a partir da discusso acima, que o
conhecimento dos parmetros experimentais
fundamental para se aproveitar o potencial mximo do
fenmeno luminescente, em aplicaes na qumica
analtica, pois a manipulao de condies pode
acarretar em significante aumento tanto da sensibilidade
quanto da seletividade das determinaes fluorimtricas

Tipos de espectros de fluorescncia

Trs principais tipos de fluorescncia podem ser obtidos
para cada amostra, em funo do tipo de informao
desejada: o espectro de emisso, o espectro de excitao
e o espectro de excitao/emisso sincronizado.
O espectro de emisso: Para registrar o espectro de
emisso de um composto, irradia-se a amostra com um
comprimento de onda de excitao fixo e mede-se
intensidade da luz reemitida, numa faixa espectral
definida. O comprimento de onda de excitao ideal
para registrar o espectro de emisso de um composto
fluorescente determinado , em geral, escolhido em
funo de seu espectro de absoro. Na maior parte dos
casos, este comprimento de onda corresponde ao
mximo de absoro.
O espectro de excitao: Para registrar o espectro de
excitao, faz-se variar o comprimento de onda de
excitao, enquanto, o comprimento de onda de
observao (ou emisso) mantido constante. O
comprimento de onda de observao ideal aquele que
corresponde posio do mximo do espectro de
emisso do composto considerado. Para u composto
puro, a forma do espectro de excitao corrigido deve
ser similar, seno idntica quele de seu espectro de
observao, se todos os estados excitados produzidos
pela absoro se transformam por converso interna at
o nvel vibracional mais baixo do primeiro estado
singleto excitado.

O espectro sincronizado: Os espectros sincronizados

so obtidos pela varredura simultnea de uma faixa
espectral de comprimento de onda de excitao e de
emisso apresentando um intervalo () constante entre
eles. Esta tcnica tem sido utilizada para estudar
misturas de fluorforos e, em alguns casos, espectros
bem estruturados puderam ser obtidos a partir de
misturas para as quais, em espectrofluorimetria
convencional, obtinham-se espectros com bandas
sobrepostas. O intervalo () a ser utilizado para um
composto determinado , em geral, escolhido
empiricamente. Quando o espectro de excitao e o de
emisso so simtricos, o melhor () aquele que
representa o intervalo de excitao e de emisso.

A correo dos espectros

A fluorescncia um mtodo de anlise relativamente
simples, muito sensvel e no destrutivo que se aplica a
numerosas molculas. Apesar destas vantagens, muitos
laboratrios hesitam ainda em utilizar este mtodo por
falta de intercalibrao entre os resultados obtidos com
diferentes instrumentos.
Para determinar as caractersticas prprias de
fluorescncia de uma molcula necessrio corrigir o
espectro de excitao pela variao, com o
comprimento de onda, da intensidade da fonte de
excitao e tambm pela variao da transmisso do
monocromador de excitao. Para a emisso, aplica-se
uma correo para a variao da resposta do
monocromador de emisso e do fotomultiplicador, com
o comprimento de onda. Estas correes so
fundamentais se os resultados obtidos por diferentes
instrumentos devem ser comparados entre si ou ainda,
para o estudo das propriedades de fluorescncia de um
composto determinado, como por exemplo, o
rendimento quntico. Os procedimentos necessrios
para obter os espectros corrigidos com relao s
funes instrumentais, aos efeitos de difuso e aos
efeitos de difuso e aos efeitos de filtro interno, tm
sido discutidos ao longo dos anos por diferentes autores.
A maior parte dos espectrofluormetros comerciais est
em condies de efetuar as correes pelas funes
instrumentais.

APLICAES
O artigo escolhido para ilustrar uma aplicao da
espectroscopia de fluorescncia, mostrado na figura 4,
tem como objetivo mostrar aos alunos de graduao o
uso do laser em laboratrio para assim, incentiv-los
nessa interessante rea.

incorporado aos laboratrios de ensino: um laser de

nitrognio com um monocromador de 25 cm, um
osciloscpio digital, uma barreira com interface de
computador integrada a um espectrmetro de
fluorescncia resolvido em nanossegundos (mostrado na
figura 6). Com ele, pode-se obter o espectro de emisso
e examinar seu tempo de evoluo, mostrando aspectos
complementares do espectro (que sero observados
pelos prprios estudantes) e a cintica de formao dos
estados excitados do pireno.
Figura 4 Artigo escolhido como ilustrao.

O baixo nmero de experimentos didticos com laser

nos laboratrios de fsico-qumica um reflexo dos
poucos artigos publicados nessa rea de ensino durante
a dcada de 90. Isso vem mudando e artigos na
educao tm sido mais freqentes. Com isso, durante a
graduao, experimentos com laser levam a um contato
mais cedo dos alunos com a espectroscopia podendo
despertar seu interesse e lev-los a uma ps-graduao.
Um exemplo disso o estudo espectroscpico do pireno
no estado excitado e a formao de um dmero com o
estado fundamental, chamado excmero. O pireno
(figura 5) foi escolhido nesse caso, porque uma
molcula muito bem estudada e foi observado nela a
formao do excmero pela primeira vez.

Figura 6 Aparato experimental

O pireno tem duas grandes vantagens: ele absorve no

comprimento de onda do laser de nitrognio e tem um
longo tempo de meia-vida no estado excitado e, com
isso, pode-se observar/mostrar com o aparato
experimental descrito algumas caractersticas:
O espectro de emisso da fluorescncia com
diferentes concentraes mostra que quanto maior a
concentrao do pireno, maior a formao do excmero.

Figura 5 Molcula do pireno.

Os excmeros so dmeros de estado excitado, sendo

que sua formao pode ser representada por essa
equao (9):
(9) M* + M (MM)*
onde * se refere ao estado excitado.
O processo bi-molecular, mas sob condies de baixa
concentrao de M* (como, por exemplo, com fonte de
excitao de baixa intensidade, onde [M*] << [M]) o
processo pode ser considerado pseudo - 1 ordem,
podendo ser estudado por este programa de simulao.
O excmero mais conhecido o pireno, que possui G=
-4kcal/mol para a equao de formao acima, o que
resulta em uma constante de equilbrio K = k12/k21 =
855. Observa-se que o monmero M* (no estado 1,
curva N1) apresenta um decaimento exponencial
simples, enquanto que o excmero (MM)* (no estado 2,
curva N2) possui uma curva ascendente inicial que
devida sua formao, seguida pelo decaimento
posterior.
O experimento conta com um aparato experimental
relativamente simples, seguindo o intuito de ser

Com o perfil de decaimento da fluorescncia,

variando a concentrao e o comprimento de onda,
pode-se calcular o tempo de vida do primeiro estado
eletronicamente excitado e dos fotoprodutos.
Fazendo a comparao com dois solventes
viscosidade diferente, pode-se mostrar que
dependncia entre essa viscosidade e a taxa
formao dos excmeros em altas concentraes
pireno.

de
h
de
de

Por fim, dissolvendo oxignio reativo com a

molcula de pireno excitada a uma taxa prxima
difuso molecular, mostra-se a relao do tempo de vida
da fluorescncia com a viscosidade do solvente.

O interessante levar o aluno a essas concluses com

experimentos simples que podem abrir grandes portas
para o estudo da espectroscopia, uma ferramenta
poderosa no estudo da estrutura e dinmica atmica e
molecular.

Aqui sero mostrados os grficos obtidos pelo

espectrmetro e suas anlises para chegar as devidas
concluses.
Variando as concentraes do pireno variando de 10-2 a
10-5 M em diferentes solventes com viscosidades bem
diferentes: hexano e tetradecano. Para concentraes
menores que 10-5 M, os espectros emitidos so muito
prximos pela baixa formao do excmero.
Observando os grficos da figura 7, ento, pode-se ver
que para 10-4 e 10-3 M a relao entre
monmero/excmero menor em tetradecano.

Figura 8: Perfis de decaimento da fluorescncia do

monmero e excmero.

A figura 8 mostra as curvas monitoradas em 480 nm e

380 nm, ou seja, para o monmero e o excmero,
respectivamente. O perfil para 380 nm um decaimento
de primeira ordem e pode ser representado pela equao
(10):

I (t ) = A0e K a t

(10)

onde Ka = 0,0056 ns-1.

J para o excmero, uma vez que ele composto de um
monmero e um estado excitado, o perfil descrito por
uma combinao linear de dois termos, mostrado na
equao (11):

I (t ) = Ae K a t + Be K b t

(11)

onde Ka=0,0058 ns-1 e Kb=0,0173 ns-1. Observando o

valor de Ka pode-se dizer que consistente, quando
comparado ao Ka do monmero.
O tempo de decaimento para o primeiro caso estimado
em aproximadamente 180 ns enquanto para o segundo
58 ns. Esses tempos de decaimento mostram que o
tempo de vida mdio do excmero bem menor que do
monmero, mostrando, pela figura, que existe uma
curva ascendente inicial para o excmero. Essa curva
relacionada a sua formao.

CONCLUSES

Figura 7: Grficos variando a concentrao do pireno nos

diferentes solventes Hexano e Tetradecano.

Tambm foram estudados os perfis do tempo de

decaimento da fluorescncia para os diversos espectros.

O fenmeno da fluorescncia consiste na absoro de

energia por um eltron, passando do estado fundamental
(S0) para o estado excitado (S1); este eltron ao retornar
ao estado fundamental acompanhado pela libertao
de energia em excesso atravs da emisso de radiao.
Alguns fatores podem influenciar nessa fluorescncia,
sendo alguns intrnsecos da molcula e outros externos,
que so, temperatura e o solvente.
A instrumentao na fluorescncia relativamente
simples, precisando de uma fonte de luz para excitar a
amostra, um monocromador para selecionar o
comprimento de onda de excitao, um compartimento

para a amostra, um segundo monocromador para isolar

e analisar a emisso fluorescente proveniente da
amostra, um fotomultiplicador e, finalmente, um
registrador para determinar a intensidade da emisso de
fluorescncia.
H, fundamentalmente, trs tipos de fluorescncia que
podem ser obtidos com a espectroscopia em funo do
tipo de informao desejada: o espectro de emisso, o
espectro de excitao e o espectro de excitao/emisso
sincronizado.
A espectroscopia por fluorescncia pode ajudar nos
laboratrios experimentais de graduao para despertar
o interesse dos alunos de graduao a entenderem esse
fenmeno, uma vez que a espectroscopia com o uso de
laser tem ajudado muito no desenvolvimento da cincia,
tanto nas reas da qumica quanto da biologia e fsica.
O experimento mostrado no artigo escolhido para
ilustrar a aplicao da espectroscopia de fluorescncia
permite estudar a influncia dos diferentes solventes na
formao do excmero e tempo de vida mdio dos
estados excitados e os resultados espectroscpicos
obtidos permitem chegar a essas concluses de forma
bem didtica, sendo, portanto bem flexvel para o seu
entendimento.

A fluorescncia um fenmeno de importncia mpar

para a espectroscopia e despertar o interesse dos alunos
por essa rea fundamental para que ela continue
contribuindo para a cincia em suas diversas reas.

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Fundamentos e Aplicaes de Espectroscopia Ultrarpida de Bombeioe-Prova (Pump-Probe Spectroscopy)

Caio Vaz Rimoli
INTRODUO
Espectroscopias so tcnicas fsicas que usam a luz para
interrogar as propriedades da matria. A princpio, as
tcnicas espectroscpicas foram usadas com a
finalidade particular de distinguir materiais por meio de
absoro ou emisso luminosa, uma vez que cada tomo
ou molcula possui um espectro de emisso ou absoro
caracterstico como uma impresso digital.
Atualmente, com o avano das pesquisas e o advento de
novas
tecnologias,
as
modernas
tcnicas
espectroscpicas so capazes de oferecer ainda mais
informaes a respeito dos materiais. Por exemplo, a
tcnica de Espectroscopia por Ressonncia Magntica
Nuclear capaz de determinar a sequncia de
aminocidos e a estrutura tridimensional de
macromolculas complexas, chamadas protenas; a
Espectroscopia RAMAN usa o espalhamento inelstico
de luz para analisar os modos de vibrao e rotao das
molculas; j as Espectroscopias Ultrarrpidas so
capazes de analisar a dinmica dos nveis de energia
moleculares, isto , o tempo de vida de um estado
excitado ou taxas de transferncia de carga ou de
energia entre quaisquer nveis energticos intra ou
intermoleculares. Em particular, este texto ficar
limitado a descrever a Espectroscopia Ultrarrpida de
Bombeio-e-Prova, EUBP, (Pump-probe Ultrafast
Spectroscopy, PPUS), que uma tcnica bastante
comum em centros de excelncia no exterior. Ela ainda
pouco usada nos pases em desenvolvimento, uma vez
que requer a utilizao de lasers pulsados ultracurtos
(subpicossegundos em geral) e, em alguns casos,
tambm requer toda uma instrumentao voltada a
controlar a disperso do pulso. Resumindo, a tcnica
ainda bastante cara. Como o leitor possa talvez ter
percebido, a necessidade de usar pulsos ultracurtos
sugere que quanto mais curto o pulso, melhor. Pois
bem, como veremos com maiores detalhes adiante,
bem isso o que acontece: quanto menor a largura do
pulso, maior a resoluo da tcnica todavia,
infelizmente, mais caros os lasers tambm. Enfim, nesta
monografia vamos explorar os fundamentos tericos e
experimentais da espectroscopia ultrarrpida de
bombeio-e-prova; discutir um pouco sobre duas
diferentes maneiras (isso implica tambm em
montagens) de aquisio de dados4; por fim, vamos
comentar a respeito de algumas das infinitas aplicaes
da tcnica5-8, que vo desde pesquisa em fotofsica
bsica at estudos mais interdisciplinares como anlise
em tempo real das reaes de fotossntese e a

caracterizao do tempo de extino ultrarrpida de luz

(quenching) de polmeros luminescentes, etc.

FUNDAMENTOS TERICOS

Conceitos a respeito da grandeza a ser medida

Afinal, como possvel medir a velocidade com que
uma dada populao de molculas em um determinado
nvel energtico deixa aquele nvel e passa para outro
especificamente? A fim de responder a tal pergunta,
precisamos relembrar um pouco o conceito de
transmitncia da Lei de Beer-Lambert.

Figura 02: Ilustrando a seo

de choque() em relao
rea(A) que o Laser incide
sobre a amostra.

Equao 01 Lei de LambertBeer

Figura 01: Ilustrao da Lei de Beer-Lambert. Legenda: T =
Transmitncia; I0 = Intensidade Luminosa Incidente; I =
Intensidade Luminosa Emergente; () = Seo de Choque
de Absoro; l = Caminho ptico dentro da amostra; n() =
Densidade volumtrica de molculas absorvedoras; c=
concentrao de molculas absorvedoras; = absortividade
molar. *(Imagem adaptada do wikipedia, Nov/11).

A grandeza a ser medida em uma espectroscopia

ultrarrpida de bombeio-e-prova a transmitncia
(daqui p/ frente, s
diferencial normalizada
transmitncia diferencial ou simplesmente TD). Ela
consiste na diferena de transmitncia entre duas
situaes as quais a amostra se encontra:
1)
Ton - Transmitncia de um pulso branco de
baixa intensidade (probe) na amostra, quando esta foi
previamente excitada por um pulso de bombeio intenso
com um 0 tpico (pump);

2)
Toff Transmitncia de um pulso branco de
baixa intensidade (probe) na amostra, quando esta no
foi previamente excitada - estava no escuro.
Ou seja:

Onde o Toff no denominador serve para normalizar a

funo. O membro mais direita desta equao ns
vamos detalhar mais adiante. A princpio, seria
interessante dar um exemplo para esclarecer os
fundamentos da tcnica. Imagine que em uma dada
condio, a amostra tenha uma TD grande (TD>0.1, por
Situao Toff

exemplo). Esta situao caracterstica de uma amostra

que interage muito com a luz. Isto , muito da
populao que antes estava no estado fundamental foi
transferida para o estado excitado devido interao
com a luz de comprimento de onda 0. Quando nesta
circunstncia (excitada com 0), a incidncia na amostra
de um pulso branco de baixa intensidade (probe) tem a
transmisso de deste 0 privilegiado, visto que h uma
populao menor de molculas absorvedoras deste. Ou
seja, um menor nmero de ftons do feixe incidente I0
com comprimento de onda 0 absorvido pela amostra
e, por conseguinte, mais ftons so transmitidos maior
a intensidade do feixe I com o comprimento de onda
0 que chega ao detector. H, neste caso, portanto, um
aumento da transmitncia de luz com 0 em relao
quele no estado de escuro (off), sem excitao veja
o diagrama de Jablonski na Figura 03

Situao Ton

Incidindo-se somente o Pulso branco de

Probe . Transmite um pouco cada cor.

Incidindo um pulso de Bombeio Intenso

de um certo , excitando vrias
molculas na amostra.

Aps um atraso , incide-se um Pulso

branco de Probe. Transmite mais
agora do que na situao Toff

Figura 03: Esquema usando Diagramas de Jablonski Transmitiu mais luz de cor do que se no tivesse tido o
bombeio antes (o monocromador seleciona qual ser analisado).

I.

Obtendo a Equao 02 a partir da Lei de Lambert-Beer:

Considerando uma amostra de espessura l que, para um certo 0 (ou 0), tenha uma seo de choque
(0). Seja tambm non a densidade de populao de molculas que absorveram o probe quando a amostra
foi previamente bombeada pelo do pulso de pump, a uma dada 0. Analogamente, noff a densidade de
populao de molculas absorvedoras do probe quando no houve bombeio prvio. Ento, usando a Lei
de Lambert-Beer (Equao 01), podemos escrever a transmitncia diferencial como:

Expandindo em Taylor at a 1 ordem:

O nmero de molculas excitadas (que deixaram o nvel inicial) pelo pulso de bombeio (pump) :

posto mo, pensando na diminuio da quantidade de molculas do estado

O sinal negativo em
inicial. Fazendo a devida substituio, obtemos a Equao 02, como havamos prometido (c.h.p.):

Faremos uma pausa para pensar um pouco a respeito

desta equao. A seo de choque uma grandeza que
representa a rea de absoro luminosa a uma dada
freqncia, , para um tipo de molcula. Cada tipo
molecular tem uma seo de choque caracterstica, isto
, tem uma rea (janela de absoro) diferente e,
portanto, uma capacidade de absoro luminosa distinta
para cada freqncia. J nexc a densidade de molculas
que foram excitadas pelo pulso intenso de bombeio
(pump) a uma certa cor especfica*. Ou seja, nexc
representa a populao que foi para o estado excitado.
Esta populao maior ou menor, dependendo do
quanto tempo o pulso de prova (probe), chega amostra
excitada. Pode ocorrer, por exemplo, que um material
interaja muito fortemente com uma determinada cor.
No obstante, dependendo do atraso do Pump em
relao ao Probe, possvel que toda a excitao j
tenha sido dispersa e toda a populao, que antes estava
em um estado de maior energia, tenha voltado ao estado
fundamental. Logo, a populao que vai para o estado
excitado depende to atraso, , do pulso de prova (probe)
em relao ao pulso de bombeio (pump) que chegam
amostra ( ver Figura 000). *[Este pulso tem uma
intensidade privilegiada em um dado 0 , em seu centro,
enquanto os outros comprimentos de onda que o
compem tm menor intensidade. Logo, , por ser
muito pequeno, acaba sendo 0 . Cuidado para
no confundir a freqncia correspondente de um dado
, com as freqncias no espao de Fourier que, no
somatrio, geram um pulso estreito de .].

quisermos medir com que velocidade um nvel

energtico deixa de ser povoado, ou seja, a dinmica
(transiente) do nvel de energia, basta fazermos uma
medida de TD fixando um dado comprimento de onda e
variando o atraso em que o pulso de bombeio chega
amostra em relao ao pulso de prova. A importncia de
se ter um pulso ultracurto consiste, sobretudo, na
resoluo temporal de amostragem: quanto mais curto o
pulso, mais rpidos os fenmenos possveis de serem
observados.

II.
Tipos bsicos de comportamento analisados
por Transmitncia Diferencial (TD).
a.

, ou seja

A amostra transmite mais quando h o bombeio prvio

do que quando no tem.
Fenmenos
tpicos:
fotobranqueamento
(photobleaching, PB) e emisso estimulada (stimulated
emission, SE). O PB ocorre quando analisado um
nvel de energia em que a populao eletrnica foi
esgotada e, portanto, no h eltrons para absorverem a
radiao do probe, como antes tinha sem bombeio
prvio. A SE ocorre, em geral, quando h uma inverso
de populao pr-estabelecida estado mais energtico
est mais populoso que o menos energtico. A
incidncia de luz de mesmo gap de energia entre os
nveis faz com que haja uma cachoeira de eltrons,
causando uma metralhadora de ftons propiciando
uma TD maior que no escuro.

1.0

Espectrmetro

Quando

T/T
0.5

b.

Quando

, ou seja

0.0

(nm)

A amostra transmite menos quando h o bombeio

prvio do que quando no tem.

1.0

T/T
0.5

Obturador
mecnico

Fenmeno tpico: Absoro fotoinduzida (photoinduced

absortion, PA). A incidncia do feixe de bombeio
estabelece uma tendncia no material de absorver ainda
mais ftons de uma dada energia. Em uma populao de
molculas, aquele nvel a ser interrogado pode ter sido
sobrecarregado de eltrons pelo bombeio.

0.0

(fs)

c
Excitao
AOP
Prova
Luz branca

Figura 04: Esquema (muito) simplificado de uma

Espectroscopia de Bombeio-e-Prova
Ento, veja bem de novo a Equao 02:

Note que grandeza maravilhosa a Transmitncia

Diferencial (TD). Dela, extramos tanto o espectro da
molcula (a partir de ), quanto dinmica dos nveis
energticos (a partir de ). Para adquirir estas medidas
muito simples. Se quisermos o espectro molecular,
basta fixar o atraso, =0=cte, o que implica que
nexc=cte. Logo, a TD proporcional seo de choque,
isto , s frequncias do espectro molecular. J se

FUNDAMENTOS EXPERIMENTAIS

I.

Detalhando a tcnica: Modelos de Aquisio

de Dados4.
Vimos at ento as idias fundamentais por detrs da
tcnica de Espectroscopia Ultrarrpida de Bombeio-eProva (EUBP). Vamos agora entrar mais em detalhes,
afinal como feita a medida da Transmitncia
Diferencial (TD)? Embora o princpio seja o mesmo, h
diferentes maneiras de se faz-la4. Consequentemente,
h diferentes tipos de montagens e, inclusive, diferentes
maneiras de se tratar os dados, propagar erros, etc.
Como a transmitncia diferencial uma medida que

envolve uma razo, ou seja, X = A/B, podemos

adquirir os dados de duas maneiras principais. A
primeira maneira quando fazemos a mdia de A e de
B antes e depois fazemos a diviso das mdias. Esta
chamada avarage-first-divide-last (AFSL):

divide-last, pois quando eles implementaram esta

tcnica h vrios atrs, o custo computacional para se
tratar os dados usando SBS era enorme. Entretanto, no
Brasil, mais particularmente, no IFSC, a primeira
estao experimental de Espectroscopia Ultrarrpida de
Pump-Probe Shot-by-Shot na Amrica Latina est em
fase final de implementao.

Equao 03: Avarage-first-divide-last (AFDL)

a.
Montagem de aquisio
avarage-fisrt-divide-last:

Nesta, o erro relativo expresso por:

Onde:

J a segunda maneira seria dividir primeiro cada A/B e

depois fazer a mdia das razes. Esta poderia ser
chamada divide-first-avarage-last, mas como A/B, no
nosso caso, significa a transmitncia diferencial de cada
pulso, ento chamamo-la de Shot-by-Shot (SBS):

Equao 04: Shot-by-shot (AFDL)

Nesta, o erro relativo expresso por:

Equao 05: Erro relativo por Shot-by-Shot:

Onde a covarincia (desvio cruzado) de A e de B :

O ltimo termo da Equao 05 diminui o erro relativo

global da equao. H duas situaes a limites. O
melhor caso quando o rudo proveniente das medidas
de A e de B so somente devido ao laser, pois guia para
um erro relativo nulo. Como os rudos estariam
completamente correlacionados (AiBi), o termo de
covarincia vai cancelar a soma das incertezas
individuais, resultando em um erro relativo nulo. J o
pior caso quando as flutuaes de A e de B so
completamente independentes, no correlacionadas. Ou
seja, por mais que eu colete dados, sempre haver a
soma das incertezas individuais. Logo, a concluso
bvia do melhor esquema de deteco seria daquele do
tipo shot-by-shot. Entretanto, praticamente todos os
centros de pesquisa no exterior usam avarage-first-

de

dados

tipo

Em uma montagem experimental tipo AFDL, a amostra

excitada com um pulso de bombeio (pump) ultracurto,
cujo escolhido9 da ordem de dezenas a centenas
de femtossegundos (fs), alterando as propriedades
pticas do material. Essa amostra opticamente
alterada investigada atravs de um pulso de prova
branco (probe) de fraca intensidade, cujo atraso
relativo ao pulso de excitao controlado pelo estgio
de translao (Adjustable Delay) ver Figura 05. Usase um cristal de safira ou de fluoreto de clcio que,
quando incidido por um pulso intenso e curto de luz,
capaz de produzir um pulso branco (supercontnuo9)
devido a fenmenos no lineares de terceira ordem ().
O comprimento de onda, , a ser analisado
selecionado pelo monocromador no final do percurso
ptico. Nesta tcnica, usa-se um chopper que bloqueia o
feixe luminoso em uma certa freqncia previamente
ajustvel e um amplificador Lock-In, que capaz de
coletar sinais muito pequenos sintonizados nessa
frequncia, muitas vezes escondidos pelos rudos. Note
que apenas dois feixes incidem na amostra: o do
bombeio e o de prova. A aquisio de sinais mais
tradicional feita da seguinte forma. Primeiramente,
com o pulso de bombeio bloqueado, coloca-se o
chopper sobre o feixe de prova antes deste chegar na
amostra a uma dada freqncia (tipicamente da ordem
de 200 Hz). A ideia que o feixe de prova seja
modulado: metade o sinal nulo; metade sinal
transmitido sem bombeio prvio, Toff. O Lock-In tem
duas entradas: uma do sinal e uma referncia. Ele um
instrumento que consegue amplificar um sinal de
mesma freqncia, , que recebe de uma referncia por
multiplicao desses dois. No final do processamento
de dados, ele retifica este sinal resultante das
multiplicaes, transformando em um patamar DC.
Logo, a sada de um amplificador Lock-In um nvel
DC proporcional mdia da amplitude do sinal de
entrada. No nosso caso em questo, a referncia
externa (chopper). Ento, quando medimos somente o
sinal de probe usando o chopper, temos como sada do
Lock-In um sinal proporcional ao Toff. Em um segundo
momento, retira-se o chopper do feixe de probe, liberase o feixe de pump para incidir sobre a amostra e
coloca-se o chopper neste feixe antes que ele incida
sobre a amostra (ver Figura 000). A idia agora que o
feixe de bombeio seja modulado em 200 Hz. Ento,
nesta situao, o chopper a 200 Hz faz com que metade
do tempo a amostra seja excitada pelo pulso de
bombeio, Ton, e a outra metade no, Toff. Logo o Lock-

In ter como entrada um sinal mdio referente Ton e Toff

. Por conseguinte, a sada ser proporcional T. Uma
vez com as mdias feitas, s calcular a razo .

Figura 06: Montagem experimental realizada no IFSC pelo

Grupo de Polmeros e CePOF. (BS = Beam Splitter; CM =
Curved Mirror; F = Filter; L = Lens; M = Mirror; MC =
Monochromator; PD = Photodiode; S = Sapphire; Sa =
Sample; SH = Shutter).

Figura 05: Montagem tpica de Espectroscopia Ultrarrpida

de Bombeio-e-Prova. (*Adaptado do Lanzani et. al.)

b.
shot:

Montagem de aquisio de dados tipo shot-by-

Em uma montagem experimental tipo SBS, no h um

chopper modulando os feixes, nem um amplificador
Lock-In a princpio. O feixe de prova dividido em dois
por um beamsplitter. Um dos feixes resultantes ser o
feixe de prova propriamente dito e o outro ser usado
como referncia. Ambos incidem na amostra
simultaneamente, o feixe de probe coincide
espacialmente com o feixe de bombeio, enquanto que o
de referncia no. Com trs detectores, um para cada
feixe, conectados a um computador, consegue-se
realizar o clculo da transmitncia diferencial shot-byshot. O Ton dado pelo probe, o Toff pelo feixe de
referncia. O sinal de pump coletado pelo fotodiodo
usado para normalizar todas as medidas.

APLICAES E EXPERIMENTOS
VADOS NA LITERATURA:

I.

OBSER-

Anlise da dinmica em tempo real de

quenching de um polmero conjugado por
transferncia de carga para um fulereno:

Ideia fundamental por trs:

O polmero MDMO-PPV um polmero conjugado que
luminescente ele fluoresce quando excitado com luz
visvel. Quando adicionamos o C60 (fulereno) soluo
do MDMO-PPV, este deixa de emitir no visvel quando
excitado ele se apaga (quenching). Tal fenmeno se
deve a uma transferncia de eltrons que estavam no
estado excitado do MDMO-PPV para o fulereno mais
rpida do que a relaxao radiativa do polmero para o
seu estado fundamental (ver Figura 07). J na Figura 08
observada a dinmica dos estados excitados a 580nm
e a 700nm. Nos dois casos, a linha cheia representa a
dinmica do polmero puro. A linha com pontos

representa uma mistura de MDMO-PPV com o

Fulereno. Note que em ambos os casos, a mistura
polmero/fulereno h uma queda abrupta de tempo de
vida de ~40fs na emisso estimulada (TD>0), abrindo
espao para um comportamento novo: absoro foto
induzida. Logo, o fulereno rouba os eltrons do estado
excitado (quenching em ~40fs) e este rouba os do
estado fundamental (causando absoro fotoinduzida).
como se o fulereno sugasse os eltrons do polmero
quando a mistura est sob excitao luminosa
apagando o PDMO-PPV.
Idia fundamental por trs:
A colheita de luz por parte dos carotenides um
processo fundamental nas primeiras reaes da
fotossntese. Com o advento de lasers pulsados com
cerca de ~10 a 20fs, aumentou-se a resoluo temporal
e, por conseguinte, foi possvel verificar a existncia de
um estado excitado singleto intermedirio do caroteno, que antes fora previsto somente em teoria.
Esse resultado sugere que deve ser feita uma
reavaliao no caminho de transferncia de energia
entre carotenides e clorofilas durante os primeiros
estgios da fotossntese.

Figura 07: Esquema do processo de quenching usando

Diagrama de Energia

III.
Estudo da
hidrognio na gua:

dinmica

das

ligaes

de

Ideia fundamental por trs:

Usou-se EUBP com um laser de ~150 fs incidindo na
regio espectral de 4,4 m. Foi analisada a banda de
excitao do estiramento do OH. Usando os dados
espectrais e mecnica estatstica de processos no
lineares, conseguiu-se fotografar os movimentos da
interao de hidrognio em tempo real.

CONCLUSES
Figura 8 (a) Transiente com probe a 580nm. (b) Transiente
com probe a 700nm.

II.
Descoberta de um estado excitado
intermedirio dos carotenides durante a colheita de
luz:

A tcnica de espectroscopia ultrarrpida de bombeio-eprova (EUBP) capaz de analisar tanto o espectro

molecular quanto sua dinmica em tempo real. Para
tanto, usa-se a transmitncia diferencial (TD), que a
diferena de transmitncia da amostra com bombeio
prvio luminoso e no. H dois tipos de abordagens
para a aquisio de dados de transmitncia diferencial:
1) avarage-first-divide-last (AFDL); 2) divide-firstavarage-last, mais conhecida como shot-by-shot (SBS).
Por tradio, usa-se a AFDL, pois, na poca em que foi
implementada nos centros de pesquisa de excelncia no
exterior, no havia capacidade para processamento
computacional da SBS, que, matematicamente, propaga
menos erro. O IFSC est implementando uma estao

de EUBP-SBS, cujo docente responsvel o Prof. Dr.

Paulo Barbeitas Miranda do Grupo de Polmeros
Bernhard Gross. Estao experimental situa-se em um
dos laboratrios do Centro de Pesquisas em ptica e
Fotnica, CePOF, cujo docente responsvel o Prof.
Dr. Srgio Carlos Zilio. A espectroscopia ultrarrpida
de pump-probe, por ser uma tcnica muito bsica e
geral, tem aplicaes em diversas reas da cincia.
Alguns exemplos de uso da tcnica so: anlise de
transferncia de carga entre molculas; anlise de
transferncia
de
energia
entre
molculas;
acompanhamento em tempo real de reaes
fotoqumicas; acompanhamento em tempo real de
movimentos moleculares; etc. Por conseguinte, pode-se
us-la em reas como: fotofsica de polmeros
conjugados e desenvolvimento de dispositivos
orgnicos eletrnicos (como OLEDs), fsica da matria
condensada, engenharia dos materiais, reaes
fotoqumica e biofotoqumicas, planejamento de
biossensores luminosos, enfim, qualquer estudo que
envolva transio entre nveis energticos.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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M. F. Mendona. Projeto e construo de um
amplificador paramtrico ptico. Dissertao
de Mestrado. rea de Concentrao: Fsica
Aplicada, Orientador: Prof. Dr. Paulo Barbeitas
Miranda.

Estudo de Protena por Dicrosmo Circular

Letcia Marchese
INTRODUO
Desde o final dos anos 1980, houve um explosivo
crescimento em biologia estrutural, atualmente o
nmero de estruturas de alta resoluo de protenas
adicionadas no Protein Data Baking (PDB) tem crescido
mais de 2000 por ano. Isto permitiu percepes muito
mais detalhadas em relao funo de sistemas cada
vez maiores, incluindo conjuntos de complexos
celulares, tais como proteassoma e grandes subunidades
ribossmicas. O crescimento em biologia estrutural
impulsionado pela evoluo da tecnologia do DNA
recombinante
que
permite
uma
produo
quantativamente significativa de protenas necessrias;
assim como pelos avanos na anlise de dados e
bioinformtica. No entanto, h uma percepo crescente
em respeito a importncia de se realizar estudos
estruturais em condies em que as protenas se
encontram ativas (ou seja, geralmente em soluo), bem
como em outras condies a fim de obter medidas das
taxas de mudana estruturais de protenas que muitas
vezes so essenciais para sua funo biolgica. Nesse
contexto o dicrosmo celular (DC) tornou-se cada vez
mais reconhecida como uma tcnica valiosa para
enfrentar essas questes estruturais. A espectroscopia de
dicrosmo circular a propriedade que uma molcula
quiral tem de absorver diferentemente a luz
circularmente polarizada direita e esquerda.
Alm do mais a necessidade de se estudar mudanas
estruturais de peptdeos e protenas que, por muitas
vezes, so essenciais para a sua funo biolgica,
juntamente com a possibilidade do estudo estrutural
destas molculas em ambientes que mimetizam as
condies fisiolgicas e de membrana celular, tornaram
a espectroscopia eletrnica de dicrosmo circular (CD)
uma tcnica cada vez mais difundida. Neste item sero
abordadas caractersticas importantes para a
compreenso da espectroscopia de CD aplicada a
estudos estruturais de peptdeos e protenas.
Considerando que o plano da luz linearmente polarizada
pode ser visto como um somatrio de duas
componentes circularmente polarizadas e de mesma
magnitude, porm girando em sentidos contrrios, temse uma em sentido horrio (ER) e outra em sentido antihorrio (EL) (Figura 1 (A)). A espectroscopia eletrnica
de dicrosmo circular baseia-se na absoro preferencial
de uma das componentes circulares da luz.

Figura 1: Efeito do dicrosmo circular sobre as componentes

circularmente polarizadas ER (sentido horrio e em
vermelho) e EL (sentido anti-horrio e em azul). (A)
Componentes circularmente polarizadas de mesma amplitude
que, quando combinadas, geram radiao plana polarizada
(em verde); (B) componentes de magnitude diferente que
resultam em uma luz elipticamente polarizada (elipse em
verde). (C) Elipcidade , tangente obtida pela razo do menor
e do maior eixo da elipse.

Os instrumentos de CD medem a diferena de

absorvncia das componentes circulares da luz
polarizada linearmente (E = EL-ER) em funo do
comprimento de onda (). Esta diferena descrita
normalmente em termos de elipcidade (), a qual
representa a tangente obtida da razo entre o menor e o
maior eixo da elipse (Equao 1), conforme
representada na Figura 1.0C.

A elipcidade pode assumir valores positivos ou

negativos em funo de qual componente da luz
preferencialmente absorvida.
Peptdeos e protenas so amplamente estudados por
CD, pois esto repletos de centros quirais (carbonos ,
C) distribudos ao longo da cadeia principal em hlices
alfa, folhas beta, estruturas desordenadas e voltas
denominadas estruturas secundrias. Portanto,
possvel caracterizar a estrutura secundria dessas
macromolculas e quantific-las por seus espectros de
CD. A regio do UV-distante nos espectros de CD,
entre 180 e 260 nm, fornece informaes capazes de
caracterizar e discriminar as estruturas presentes nestas
molculas. A Figura 3 mostra os espectros de CD de
protenas compostas por diferentes tipos de estrutura
secundria
Nos estudos estruturais de peptdeos e protenas, o
efeito de CD geralmente pequeno, correspondendo a
uma diferena de absorvncia (E=EL-ER) da ordem de
3x10-4. Dessa forma, imprescindvel uma
quantificao da concentrao de peptdeos e protenas
para garantir que os dados obtidos sejam realmente
significativos. Assim, sabendo-se a concentrao molar
(m) da amostra, a elipcidade molar no comprimento de

onda ([]molar, ) pode ser determinada segundo a

Equao 2:

onde a elipcidade observada (em graus) no

comprimento de onda e d o comprimento do
caminho tico (cm). Os sinais de CD, devido s
variaes de , surgem somente quando ocorre absoro
de radiao por parte de grupos cromforos. No caso de
peptdeos, o grupo amido (R1-(C=O)-NH-R2) que
forma a ligao peptdica o de maior importncia nos
estudos por dicrosmo circular, embora possam ainda
existir contribuies de grupos aromticos. A absoro
em comprimentos de onda () menores que 240 nm
deve-se a transies eletrnicas na ligao peptdica,
cujas intensidades e energias intrnsecas dependem dos
ngulos de rotao e (Figura 1.10). Esses ngulos,
por sua vez, dependem da conformao, do estado de
agregao e das interaes que a molcula pode fazer
com o solvente ou com outras espcies (ex. detergente
ou fosfolipdeos). Os ngulos e definem as
condies de coplanaridade dos orbitais envolvidos na
ligao peptdica, sendo caractersticos para cada tipo
de estrutura secundria regular (Figura 2).

Figura 3: Espectros de dicrosmo circular tpicos de

peptdeos estruturados. A tabela direita apresenta os
principais comprimentos de onda de absoro e as
respectivas transies eletrnicas, representativos de cada
tipo de estrutura.

Finalmente, a determinao da estrutura secundria

mdia pode ser realizada ento por comparao dos
espectros de CD de uma dada amostra com espectros de
padres de estrutura secundria conhecida e a
quantificao do contedo de estruturao pode ser
realizada por meio de clculos de desconvoluo.
Nestes clculos considerado que o espectro de CD do
peptdeo seja uma combinao linear de diferentes
espectros.
Portanto, as informaes obtidas por CD facilitam
biocaracterizao, ou caracterizao bioanaltica da
enzima hidroxinitrila liase (XfHNL) da bactria Xylella
fastidiosa (X. fastidiosa), um patgeno de planta que
causa a clorose variegada dos citros (CVC), tambm
conhecida como amarelinho. A XfHNL nunca antes
isolada em X. fastidiosa, poder ser til para a
compreenso dos mecanismos de ao das protenas
renvolvidas na patogenicidade quando a bactria est
presente em plantas hospedeiras.

METODOLOGIA
A espectroscopia de CD em protenas e peptdeos uma
ferramenta muito utilizada no estudo de mudanas
conformacionais induzidas por interaes da protena
com ligantes especficos e solventes, assim como
verificar alteraes ocorridas em funo da temperatura,
do pH, da fora inica e monitorar fenmenos de
desnaturao e renaturao na interao com ligantes.

Figura 2: Sistema R1-(C=O)-NH-R2 com suas respectivas

transies eletrnicas.

Como resultado, bandas espectrais devidas s absores

caractersticas associadas aos ngulos e de cada
estrutura secundria podem ser facilmente atribudas a
diferentes conformaes do peptdeo. Os espectros de
dicrosmo circular dos padres para estruturas
cannicas (-hlice, folha- e randmica) podem ser
visualizados na Figura 3, juntamente com os principais
comprimentos de onda de absoro e as respectivas
transies eletrnicas para cada tipo de estrutura.

A estimativa do contedo de estrutura secundria de

uma protena feita com base num grupo de protenas
de referncia que possuem estrutura secundria e
espectros de CD conhecidos. Com o auxlio de
programas computacionais, que utilizam diferentes
mtodos de desconvoluo, so extradas as
componentes comuns dos espectros de CD da protena
analisada e a porcentagem que as mesmas representam
no espectro.
As medidas de CD foram realizadas a temperatura
controlada de 25C utilizando o espectropolarmetro
JASCO J-720 (JASCO Corporation, Tquio, Japo), na
faixa de 198 a 250 nm em cubetas cilndricas de quartzo
de caminho ptico de 1 mm. Os espectros de CD foram
tipicamente recuperados empregando-se mdias de 16
varreduras. As contribuies dos tampes obtidos sob
condies idnticas foram subtradas e todos espectros
de CD foram corrigidos a fim de eliminar quaisquer
efeitos de rudo. Os espectros originais foram ainda
filtrados com Transformadas de Fourier, preservando as
bandas tpicas de cada espectro. Em todos os casos, eles
foram obtidos em elipticidade () e, convenientemente
transformados em elipticidade molar ([]).

As solues proticas provenientes de uma purificao

em coluna de afinidade, devidamente dialisadas, foram
utilizadas para analisar a integridade das estruturas
secundrias nas condies de extrao e monitorar as
possveis mudanas conformacionais induzidas por
influncia do pH atravs das medidas de CD. A
concentrao das amostras foi de 10 M em tampo
acetato-borato-fosfato de sdio 20 mM contendo NaCl
150 mM. As amostras foram incubadas em solues
tamponadas a pH variando de 3 a 10.

Estudos de Estabilidade Trmica

Os estudos de estabilidade trmica da XfHNL foram
realizados para averiguar a natureza das transies de
desenovelamento e renovelamento trmico, monitoradas
pela espectroscopia de dicrosmo circular. A Figura 5
mostra os espectros de dicrosmo circular da XfHNL
em diferentes pHs a 25 C.

As contribuies de estrutura secundria pelo espectro

de CD das protenas recombinantes foram calculadas
utilizando o pacote de desconvoluo CDPro software
package, que inclui trs programas SELCON3,
CONTINLL e CDSSTR, providos de um grupo de
protenas de referncia contendo 43 espectros de CD. A
partir dos resultados fornecidos pelos trs programas,
uma mdia destes resultados foi realizada para
encontrar as fraes de estruturas secundrias dos
espectros de CD.
Com a definio da condio oligomrica da XfHNL
partiu-se para a nvestigao da estrutura secundria por
espectroscopia de dicrosmo circular (CD) no UVdistante. A Figura 4 mostra o espectro de CD da
XfHNL em tris-HCl (pH 8,0) contendo NaCl 150 mM e
glicerol 5%, condio cuja estabilidade da protena foi
preservada.

Figura 4: Espectro de dicrosmo circular da XfHNL. O

espectro de CD indica que a XfHNL constituda de
estruturas -hlices e folhas . A XfHNL foi incubada em
tampo tris-HCl 20mM, NaCl 150 mM e glicerol 5%, pH 8,0.
As medidas de CD foram realizadas a 25C. A concentrao
da protena rXfHNL 10 M.

A XfHNL apresentou um espectro de CD caracterizado

por dois mnimos pronunciados em torno de 222 e 207
nm, e um mximo positivo em torno de 196 nm. Estas
bandas so caractersticas de protenas contendo
estruturas em -hlice (ref). A desconvoluo do
espectro em pH 8,0 estimou 35,3 % de elementos
helicoidais, 10,9 % de estruturas betas e 53,3 % de
outras estruturas. A estabilidade estrutural de XfHNL
foi ento avaliada frente a variao de pH, temperatura
e na presena de um agente desnaturante.

Figura 5: Espectros de CD da XfHNL em diferentes pH. A

concentrao da protena foi de 10 M em tampo acetateborato-fosfato 20 mM, de pH 3,0 a 10,0; contendo NaCl 150
mM.

O espectro de CD da XfHNL nativa, caracterstico de

protena contento elementos e -hlice, foi preservado
no intervalo de pH entre 4,9 e 10,1. Apenas pequenas
variaes foram observadas no valor da elipticidade
molar dos mnimos negativos em 222 e 207 nm. Essas
diferenas nos contedos de estruturas secundrias
foram estimadas pela desconvoluo dos espectros de
CD. A desconvoluo do espectro em pH 7,8 estimou
35,5 % de elementos helicoidais, 11,1 % de estruturas
betas e 53,4 % de outras estruturas. Diminuindo o pH
para 7,0 e 4,0, por exemplo, a desconvoluo resultou
em 29,1 e 23,6 % de elementos helicoidais, 15,2 e 17,5
% de estruturas betas, e 55,7 e 58,9 % de outras
estruturas.
A reduo da elipticidade molar provavelmente
representa a diminuio de estruturas helicoidais. No
entanto, em pHs extremamente cidos como o pH 3,0,
foram observados um forte decrscimo na elipticidade
molar e um pequeno deslocamento do mnimo em 207
para 206 nm, e a perda do mnimo em 222 nm do
espectro nativo da XfHNL. Neste pH, um notvel
rearranjo e/ou perda de estruturas helicoidais pode ter
ocorrido, pois a protena passou a apresentar um
espectro de CD tpico de protenas com estruturas noordenadas; provavelmente perdendo parte da sua
estrutura secundaria ordenada. Neste caso, no foi
possvel calcular o contedo de estrutura secundria.
Conforme descrito na literatura estas observaes
podem ser explicadas atravs do comportamento
protico no processo bsico de enovelamento. Cerca de
80 % das cadeias laterais apolares dos resduos de

aminocidos hidrofbicos Ala (13,1 %), Val (10 %),

Leu (9,0 %), Ile (5,2 %), Phe (2,4 %), Met (2,0 %), Trp
(1,2 %) que constituem a seqncia primria da
XfHNL, esto localizados no interior da molcula, fora
do contato com gua (meio hidroflico), e esta
assumida a conformao mais estvel, geralmente, o
estado nativo (enovelado).
A Figura 6 mostra a isoterma de desnaturao da
protena XfHNL em tampo acetato-borato-fosfato (pH
8,0) em diversas temperaturas. O processo de
desnaturaco da XfHNL foi monitorado pela mudana
na elipticidade em 222 nm, que a banda dominante
caracterstica de estruturas helicoidais e est dentro da
regio do espectro onde a razo sinal/rudo de alta
qualidade.

Figura 7: Dependncia do Tm de XfHNL com o pH,

monitorado por CD. O tampo utilizado foi acetato-boratofosfato de sdio 20 mM contendo NaCl 150 mM, variando em
pH de 5,0 a 10,0. A concentrao da protena foi de 20 M. A
temperatura de transio (Tm) de 52,6C para o pH de maior
estabilidade (pH 8,0) foi obtida atravs da regresso
representada pela curva polinomial.

Os resultados mostram que a protena XfHNL

relativamente sensvel a alterao de sua estrutura
secundria em pHs cidos ou bsicos, em funo do
aumento da temperatura. A temperatura de transio
apresentou pequena variao para os valores de pHs
entre 6,0 e 8,0. Contudo, um maior decaimento nos
valores de Tm observado em pH abaixo de 6,0 e
acima de 8,0.
Figura 6: Transio da desnaturao trmica da XfHNL. A
concentrao da protena foi de 20 M em tampo acetatoborato-fosfato de sdio 20 mM contendo NaCl 150 mM. A
curva de desnaturao trmica foi construda a partir dos
espectros de CD monitorados a 222 nm. A Tm, temperatura
de transio, foi de 52,6 C, obtida atravs da regresso
sigmoidal.

A desnaturao trmica de XfHNL mostrou-se um

processo irreversvel, uma vez que as amostras
aquecidas at 80 C no voltaram a apresentar espectro
de CD semelhante ao seu estado nativo, mesmo aps
rpido ou lento resfriamento para 20 C. A curva
sigmoidal indica que este processo envolve
aparentemente uma transio de dois estados. A
temperatura de transio do estado enovelado para o
desenovelado da protena, Tm, foi de 52,6 oC.

Estudos da Estabilidade Qumica

A estabilidade da estrutura secundria de XfHNL, na
presena de um agente qumico, tambm foi estudada
por CD. As medidas de CD foram realizadas a 25C
empregando concentraes de 0 a 6 M do agente
caotrpico uria adicionado em tampo de lise tris-HCl
a pH 8,0. Trs concentraes distintas da protena
XfHNL foram empregadas neste estudo (5, 10 e 20
M). A Figura 8 mostra os espectros de CD da XfHNL
(20 M) em diferentes concentraes de uria.

A curvas de desnaturao da XfHNL em funo da

temperatura foi realizada em vrios pHs. A Figura 7
mostra a dependncia da temperatura de transio da
enzima XfHNL com a variao do pH.

Figura 8: Desnaturao da XfHNL induzida por uria. A

concentrao da protena foi de 20 M em tampo tris-HCl
contendo NaCl 150 mM, glicerol 5% e concentraes

crescentes de uria. Os espectros de CD foram obtidos

individualmente.

O espectro de CD da XfHNL em uria a 0 M manteve

os dois mnimos negativos a 207 e 222 nm. Com o
aumento da concentrao de uria na soluo protica
pode ser observado um concomitante decrscimo na
elipticidade a 222 nm, sugerindo uma perda cooperativa
no contedo de -hlice da estrutura secundria. A
completa desnaturao da enzima ocorreu em 5,0 M de
uria, uma vez que o espectro de CD da XfHNL nesta
condio corresponde ao espectro de uma protena sem
estrutura secundria ordenada.
A partir dos resultados de desnaturao qumica obtidos
por CD foram construdas as isotermas de desnaturao,
onde a elipticidade, expressa em termos da frao de
protena desnaturada, fD , foi colocada no eixo das
ordenadas e a variao da concentrao do agente
desnaturante no eixo das abscissas. A frao de protena
desnaturada foi calculada pela relao:

Partindo das equaes anteriores, a energia livre de

desnaturao ( GU ) para o modelo de dois estgios
pode ser expressa como uma funo linear da
:
concentrao de uria, onde

extrapolando a energia livre do desnovelamento na

ausncia de uria, m a inclinao do grfico GU
versus a concentrao de uria [U], e R e T so a
constante dos gases e a temperatura absoluta,
respectivamente. Combinando as equaes 6 e 7 e
em termos da frao
rearranjando os valores de
de protenas desenoveladas, a concentrao de uria
pode ser obtida diretamente das curvas de desnaturao
ajustando-as com a equao 8:

A equao 10 pode ser rearranjada e resolvida para

determinar
a e elipticidade ou centro de massa da rea
onde
do pico (no caso de espectroscopia de fluorescncia) da
amostra em uma determinada condio,
e
so os
valores de elipticidade para os estados desnaturado e
nativo.
A anlise das isotermas foi feita assumindo que a
protena um homodmero e que a desnaturao ocorre
como um processo reversvel de dois estgios, sem a
formao de intermedirios passveis de serem
detectados. Assim, o ajuste das curvas foi realizado
como descrito por Mallam, e colaboradores aplicando o
modelo homodimrico de dois estados, em que duas
populaes de protena existem em equilbrio,
denominadas homodmeros enovelados (D) e
monmeros desenovelados (M). Esse modelo descrito
pelas equaes 3 e 4.

A concentrao de protenas monomrica, Pt, para

qualquer concentrao de uria pode ser descrito em
termos da frao de protena desnaturada como descrito
pela equao 5.
A partir das equaes 4 e 5,
termos de and .

onde U1/2 a frao da concentrao de uria em que

50% da protena est na forma desenovelada (fij = 0,5)
Assim, os dados de CD foram tratados seguindo este
modelo e as curvas para cada concentrao de protena
foram ajustadas individualmente com a equao 8,
utilizando para isso o programa Origin 7.0.
Realizando os clculos termodinmicos descritos
anteriormente, o processo de desnaturao da XfHNL
foi avaliado pela construo das isotermas de
desnaturao (unfolding). Adicionalmente, o processo
inverso de reenovelamento (refolding) tambm foi
acompanhado, utilizando como ponto de partida, a
protena XfHNL desnaturada a 8 M de uria. O
processo de reenovelamento foi realizado atravs da
adio da protena totalmente desnaturada em solues
contendo concentraes decrescentes do agente
caotrpico. A Figura 9 mostra os ajustes com os
parmetros termodinmicos associados aos processos
termodinmicos de desnaturao e renaturao protica.

pode ser expresso em

Figura 9: Desnaturao e renaturao da XfHNL induzida

por uria. Cada curva foi monitorada a 222 nm e expressas

em termos da frao de protenas desnaturada em funo da

concentrao de agente desnaturante. A concentrao da
protena empregada em (A) foi de 20 M em tampo de lise
tris-HCl. As isotermas em (B) so representativas do processo
de desnaturao qumica da XfHNL a diferentes
concentraes.

antes de atingir a transio. Contudo, deve-se destacar

que estas possveis formas no puderam ser detectadas
pelo mtodo de anlise empregado.
BIBLIOGRAFIA

As isotermas construdas indicaram que no h

formao de intermedirios detectveis durante a
transio do desenovelamento, independente das
concentraes proticas empregadas (5, 10 e 20 M). A
desnaturao ocorreu como um processo reversvel, no
qual cerca de 90% do sinal da elipticidade inicial foi
restaurada.
Atravs dos espectros de CD da XfHNL, analisados de
acordo com o modelo de dois estgios, foi possvel
calcular os valores termodinmicos descritos acima a
fim de verificar a independncia destes mediante
diferentes valores de concentrao protica. A Tabela 1
e
apresenta alguns destes valores como
.

a diferena da energia livre

entre 1 mol de dmero e 2 mols de monmero

desenovelado na ausncia do desnaturante.

Tabela 1: Dados termodinmicos

concentraes da XfHNL por CD.

para

diferentes

A dependncia da concentrao protica para o

equilbrio das curvas de desenovelamento em um
sistema homodimrico pde ser explicada em termos da
, definida como
=
constante de equilbrio
. Assim, para uma dada concentrao de
e
G permaneceram
agente desnaturante,
constantes para todas as concentraes proticas e
somente a frao de cada espcie presente no equilbrio
mudou com . Um sistema homodimrico, U1/2
definido como a concentrao de desnaturante onde a
frao de monmeros desnovelados igual frao de
= , em
monmeros presentes como dmeros. Isto
que a concentrao de U1/2 ocorrer dependente de ,
assim uma mudana na concentrao de agente
desnaturante com a concentrao total de protena pde
ser esperada, mas a variao de energia livre,
, permaneceu praticamente constante
independentemente da mudana no valor de e U1/2 .
Como o valor de m uma constante para cada protena
este no foi afetado pela concentrao protica.
Deste modo, o modelo de dois estgios homodimrico
descreve adequadamente os resultados experimentais.
Entretanto, existe a possibilidade que a forma dimrica
da XfHNL possa dissociar-se produzindo monmeros

Santos, C. A., Trivella, D.B.B., de Toledo, M. A.

S., Saraiva, A. M., Schneider, D. R. S., Beloti, L.
L, Pelloso, A.C., Azzoni, A., Aparicio, R., A. P.
de Souza; Small-angle X-ray scattering studies
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Universidade Estadual de Campinas.
Kelly M. S., Kelly, Jess J. T., Price C. N., How
to study proteins by circular dichroism,
Biochimica et Biophysica Acta 1751 (2005) 119
139.
Cordeiro Y., Avanos em Engenharia de
Protenas e Sntese de Peptdeos, Departamento
de Frmacos, Faculdade de Farmcia, UFRJ.

Princpios Bsicos sobre XPS

Evandro Jos Mulinari
INTRODUO
Podemos usar inmeras tcnicas na caracterizao de
slidos inorgnicos com o objetivo de obter
informaes estruturais, morfolgicas, texturais deles.
Na caracterizao da superfcie dos slidos inorgnicos,
vrios mtodos espectroscpicos e microscpicos so
utilizados, uma vez que o estudo das propriedades
superficiais tem grande importncia para diversas reas,
tais como catlise heterognea, semicondutores,
mecanismos de corroso, atividade de superfcies
metlica, propriedades cidas de xidos mistos, estudos
e comportamento de membranas biolgicas, cermicas,
vidros etc. Dentre as tcnicas espectroscpicas, a de
fotoeltrons
excitados
por
raios-X
(X-Ray
Photoelectron Spectroscopy, XPS, tambm conhecida
por Electron Spectroscopy for Chemical Analysis,
ESCA) uma das mais utilizadas. Esta tcnica fornece
dados sobre a composio atmica da superfcie, a
identificao elementar, o estado qumico e o nmero
de coordenao dos tomos locados prximos a
superfcie da amostra.
Devido aos recentes avanos tecnolgicos a tcnica de
XPS tornou-se mais popular nas ltimas dcadas, tais
como o desenvolvimento de instrumentao e de
softwares necessrios para a obteno e
processamento dos dados e tambm, ampliao do
conhecimento dos princpios fsicos envolvidos e da
matemtica envolvida. Esses fatores levaram a uma
anlise e interpretao mais precisa dos dados
experimentais. As anlises por XPS necessitam que a
superfcie investigada esteja livre de gases absorvidos,
por isso o desenvolvimento de sistemas de ultra-alto
vcuo (UHV) foi de grande importncia.

A TCNICA XPS
O princpio bsico da tcnica de XPS (espectroscopia
fotoeletrnica de raios-X) o efeito fotoeltrico. A
anlise de superfcie de um material realizada pelo
XPS atravs da anlise de energia de eltrons emitidos
de uma amostra atingida por raios-X monoenergticos.
Estes ftons tm uma fora de penetrao no slido,
limitada na ordem de 1 a 10 micrmetros. Eles
interagem com os tomos na regio da superfcie, pelo
efeito fotoeltrico (figura 1), causando a emisso de
eltrons.

Figura 1: Representao esquemtica do processo XPS, onde,

as trs linhas de baixo, El, E'l e E"l, representam as energias
dos eltrons das camadas mais internas K e L de um tomo, e
as trs linhas de cima, E, E e E, representam alguns dos
nveis de energia de outros eltrons de valncia ou de uma
camada.

A energia cintica Ec do fotoeltron que deixa o tomo

alvo depende da energia do fton incidente, h, e
expressa pela lei fotoeltrica de Einstein,
onde El a energia de ligao do fotoeltron com
relao ao nvel de Fermi e a funo-trabalho do
espectrmetro, que um fator que corrige o meio
eletrosttico em que o eltron formado e medido.
Em XPS mede-se a intensidade de fotoeltrons N(E)
como funo de suas energias cinticas (Ec). Porm, os
espectros de XPS so usualmente apresentados na
forma de grficos, no qual N(E) uma funo de El.
Uma tcnica torna-se sensvel superfcie se a radiao
a ser detectada no viajar mais do que algumas
camadas atmicas (0,5 a 3,0 nm) atravs dos slidos. Os
eltrons com energia cintica entre 10 e 1500 eV so
ideais ao estudo de superfcies, pois seus caminhos
livres mdios nos slidos so daquela ordem. Em XPS,
os fotoeltrons possuem energia cintica na faixa de
100 a 1400 eV, e quando gerados prximos a superfcie
tornam esta tcnica bastante adequada ao estudo da
superfcie de slidos.
Os elementos presentes na superfcie da amostra so
caracterizados diretamente pela determinao das

energias de ligao dos picos fotoeltricos. A energia de

ligao pode ser considerada como a energia de
ionizao do tomo. Isso se d pelo fato de que os
nveis de energia do processo de foto-emisso so
quantizados, sendo assim os fotoeltrons possuem uma
distribuio de energia cintica de picos discretos
relativos s camadas eletrnicas do tomo fotoionizado. Informaes sobre a composio superficial
da amostra so obtidas atravs da rea integrada do
pico, que proporcional ao nmero de tomos no
volume detectado.
O XPS reproduz diretamente a estrutura a nvel
eletrnico, desde as camadas mais internas at a
superfcie atmica. Todos os elementos, desde o Ltio
at o mais pesado, podem ser analisados, mesmo que os
elementos sejam s uma parte de um composto
qumico. As energias de ligao so no somente
especficas para cada elemento como tambm contm
informaes qumicas, pois os nveis de energia dos
eltrons de caroo (eltron de camada mais interna)
dependem fracamente do estado qumico do tomo.
Estes deslocamentos qumicos esto tipicamente no
intervalo de 0 3 eV. Estes deslocamentos qumicos
podem ser explicados assumindo que a atrao do
ncleo por um eltron interno diminuda pela presena
de outros eltrons. Quando um eltron de valncia
removido da ligao qumica, os eltrons que
permanecem so atrados mais firmemente pelo ncleo.
Isto leva a um incremento da El das camadas mais
internas. As medidas desta "variao qumica"
permitem a determinao do estado de tal tomo.
A anlise das energias de ligao do material deve ser
acompanhada da anlise de um padro para que sejam
avaliados os deslocamentos qumicos oriundos de
outros efeitos, tais como o carregamento nas superfcies
isolantes e as variaes na funo-trabalho, cuja teoria
ainda no esta bem estabelecida.

Figura 2: Resultado tpico de XPS e background.

Os picos fotoeltricos so superpostos por um fundo

(background). Este background resulta de fotoeltrons
produzidos dentro do nodo da fonte de raios-X, que
estiveram sujeitos a um ou mais processos de

espalhamento inelstico antes de serem emitidos da

superfcie. Para uma determinao quantitativa da
composio, se integra a rea de pico depois de subtrair
o "background" (figura 2). Essas reas so divididas por
fatores de sensibilidade elementar relativa os quais tm
que ser obtidos de compostos conhecidos
estequiometricamente.

Figura 3: Os picos satlites.

A presena de um buraco interno aps a ionizao afeta

a distribuio dos eltrons emitidos, levando a
deslocamentos, separao de picos e o surgimento de
picos satlites. Os picos satlites chamados de shake up
e shake off (figura 3) correspondem a efeitos dos
estados finais que se originam quando o fotoeltron
concede energia a um outro eltron do tomo. Este
eltron vai para um estado no ocupado (shake up) ou
no ligado (shake off) de maior energia. Como
conseqncia, o fotoeltron perde energia cintica e
aparece a um maior valor de energia de ligao no
espectro. Por exemplo, no caso do cobre, as
caractersticas dos picos shake up dos nveis 2p3/2 e 2p1/2
9

so o diagnstico de uma camada 3d no ocupada no

2+

Cu .
A Figura 4 ilustra um espectro exploratrio (chamado
long scan) de XPS. Este espectro mostra picos
provenientes de uma amostra contendo vrios
componentes suportados sobre alumina, utilizando
radiao do nodo de magnsio. Nota-se que as
interferncias por superposio de picos so
insignificantes, pois os picos tendem a ser bem
separados, at mesmo no caso de elementos adjacentes
na tabela peridica como o carbono, nitrognio,
oxignio e alumnio. Observa-se que as energias de
ligao para os eltrons 1s aumentam com o nmero
atmico, pois h um aumento da carga positiva do
ncleo (C1s < N1s < O1s), e que mais de um pico para um
dado elemento pode ser observado, que o caso do
enxofre e do alumnio que apresentam picos para os
eltrons dos nveis 2s e 2p (este com as duas
componentes spin-rbita 2p3/2 e 2p1/2).

de caroo). Como conseqncia, a energia de ligao de

um fotoeltron contm informao do estado do tomo
antes da foto-ionizao (estado inicial) e do tomo
ionizado depois da emisso do eltron (estado final).
O espectro de XPS do nvel 3d do crio contido em
CeO2 um bom exemplo de como o estado final do
tomo influencia nos dados de fotoemisso. O estado
fundamental do CeO2 uma mistura das configuraes
0

Figura 4 : Espectro exploratrio de XPS de uma amostra

contendo vrios componentes suportados sobre alumina.

Na prtica, os dados de XPS so usados como se fossem

caractersticos dos tomos como esto antes do evento
do efeito fotoeltrico acontecer. Porm, os dados de
fotoemisso representam um estado no qual o eltron
acabou de deixar o tomo. Considerando um tomo
contendo N eltrons, com energia total no estado inicial
i. O tomo absorve um fton de energia h, o evento de
-17

-14

absoro ocorre em menos de 10 s. Aps 10 s, o

tomo emite um fotoeltron com uma dada energia
cintica Ec e passa para um estado final com um eltron
a menos e um buraco no nvel interno. O balano da
energia deste evento :

multi-eletrnicas 4 f e 4 f L, onde L denota um buraco

nos orbitais 2 p do oxignio. Os dubletos 3 d5/2 e 3 d3/2
so geralmente denominados u e v e se estendem no
intervalo de 880 a 920 eV. Para o CeO2, os estados
finais decorrentes da fotoemisso do nvel 3d do Ce
originam seis picos correspondentes aos trs pares dos
dubletos spin-rbita (3d5/2 e 3d3/2), decorrentes das
diferentes ocupaes do estado final 4 f do Ce
fortemente hibridizados com os orbitais 2 p do
oxignio. Os picos v e v so atribudos aos estados
antiligantes e ligante da mistura das configuraes
9

eletrnicas 3 d 4 f (O 2 p ) e 3 d 4 f (O 2 p ) do Ce(IV)
9

e v ao estado final 3 d 4 f (O 2 p ) do Ce(IV). A

mesma explicao foi dada a srie de estruturas u.
Portanto, o espectro final do CeO2 composto de seis
picos fotoeltricos como mostrado na Figura 5.

Onde, EiN a energia total de um tomo com N eltrons

no estado inicial, isto , antes da fotoemisso ocorrer e
EfN-1 a energia total do tomo com N-1 eltrons e um
buraco no nvel l, no estado final. O rearranjo dos
termos mostra que a energia de ligao com relao ao
nvel de Fermi :

Os N-1 eltrons remanescentes no estado final do

tomo, assim como os eltrons dos tomos da
vizinhana, sentem a ausncia do eltron do caroo (ou
seja, sentem a presena do buraco do caroo). Como
resultado, eles relaxam para uma energia total menor do
tomo de uma quantidade Erelax. Esta energia de
relaxao, que tem contribuies intra e extra-atmicos,
est includa na energia cintica do fotoeltron. Ento, a
energia de ligao no igual energia do orbital do
qual o fotoeltron emitido e a diferena causada pela
reorganizao dos eltrons remanescentes quando um
eltron removido de uma camada mais interna (eltron

Figura 5: Espectros de XPS do nvel 3d do Ce do CeO2.

PRINCIPAIS CARACTERSTICAS DE UM XPS

Disponibilidade comercial

Muito grande.

Anlise de dados

Biblioteca de dados grande e avanada.

Facilidade de Uso

Fcil e muito rpido.

Danos de excitao

Mnimas.

Informao

Qumica, elementar.

Anlise detalhada

Com alguns limites.

Vantagem principal

Anlise espacial.

Desvantagem principal

Baixa resoluo espacial.

Popularidade

Grande.

Quantificao

Melhor que +/- 10%.

Reprodutibilidade

Alta (erro de 1%).

Profundidade de amostragem

3 - 10 nm.

Resoluo Espacial

Normalmente 1 - 5 mm, melhor 5 m.

Sensibilidade

0.3 - 0.5%, pequenas fraes de monocamadas.

Preparao da Amostra

Fcil.

Carregamento da Superfcie

Em materiais no condutores, sim.

Estado da Arte

Avanado, estabelecido.

Exigncias de Vcuo

UHV.

Gama de Elementos

Todos, menos H e He.

Destrutivo?

No, mas alguns danos ocorrem em materiais sensveis ao raio-x.

Anlise elementar

Sim, semi-quantitativa sem padronizaes e quantitativa com

padronizaes.

Informao da Estrutura Qumica

Sim.

Profundidade Analisada

5 - 50 .

Profundidade de Perfil

Sim, acima de 50 . Maiores profundidades requerem sputter do

perfil.

Resoluo de profundidade

Algumas dezenas de angstroms - dependendo de condies.

Resoluo lateral

5 mm 75 m;
Materiais compatveis ao vcuo; amostras planas.

Exigncias das Amostras

Tamanho aceitado depende de instrumento particular usado.
Usos principais

Determinao da composio do estado qumico elementar no

mximo em 30 .

Tamanho

10' X 12'.

EQUIPAMENTOS
Basicamente um equipamento de XPS composto de
uma cmara de ultra-alto vcuo (ultra high vacuum,
UHV), uma fonte de raios-X, um canho de ons, um
manipulador de amostra, um espectrmetro, um
detector de eltrons e um computador para aquisio e
tratamento de dados. Obviamente que dependendo do
equipamento utilizado, a sua configurao pode mudar
dependendo dos diferentes acessrios que podem
comp-lo. Como citado anteriormente, necessrio

utilizar a cmara de UHV para que a superfcie a ser

analisada esteja livre de gases adsorvidos e de
contaminantes. Isso se d pelo fato de que os eltrons
podem colidir com molculas de gases residuais,
necessitando assim de um livre caminho mdio
suficiente 10 cm para atingir a amostra ou o detector,
-5

sendo necessrias presses menores que 10 Pa. Para

uma presso da cmara de UHV igual a 10
aproximadamente

10

segundos

at

-12

Pa leva-se

que

uma

monocamada seja adsorvida sobre uma superfcie. As

bombas mais utilizadas para se atingir a condio de
UHV na cmara so a bomba de difuso (ou mecnica),
a bomba turbo-molecular e a bomba inica.
Em geral, as amostras so introduzidas dentro do
ambiente da cmara do UHV atravs de sistemas tipo
air-lock que permitem uma transferncia em questo de
segundos. O principal contaminante da superfcie de
uma amostra colocada na cmara o carbono, alm do
oxignio, cloro, enxofre, clcio e nitrognio. O
bombardeamento sobre a superfcie por ons de gases
+

inertes, como, por exemplo, o de Ar , pode ser feito

com o propsito de obter uma superfcie mais limpa, o
aquecimento tambm pode ser utilizado. Outros
mtodos de limpeza da superfcie a ser analisada
envolvem a fratura de materiais frgeis em UHV e
tratamentos qumicos a temperaturas elevadas sob
presso parcial de O2 ou H2.
A fonte de ftons em um equipamento de XPS gera
raios-X moles (de baixa energia) produzidos a partir de
um nodo de alumnio ou de magnsio. Para o caso do
alumnio, o intervalo do espectro de raios-X utilizado
0 - 1200 eV e para o magnsio 0 - 1400 eV. A Figura 6
mostra a dependncia do livre caminho mdio de
diferentes materiais para o espalhamento inelstico em
funo de sua energia cintica, chamada de curva
universal, que exibe uma regio de mnimo na faixa de
10-500 eV, correspondendo a um livre caminho mdio
entre 0,4 e 2 nm. O livre caminho mdio em
combinao com a orientao da emisso fotoeltrica d
origem chamada profundidade de escape na ordem
de 2-10 monocamadas atmicas do material analisado.
O analisador de eltrons mais usado em XPS o
analisador
hemisfrico
concntrico
(concentric
hemispheric analyser, CHA). Para muitos materiais uma
alta resoluo em energia de eltrons (< 0,1 eV)
necessria na anlise da superfcie para que os
deslocamentos qumicos sejam medidos com preciso.

Figura 7: Esquema de um equipamento de XPS do

grupo de Fsica de Superfcies da Unicamp.

A cmara primria dedicada transferncia de

amostras da atmosfera para a segunda cmara (cmara
principal), praticamente sem alterar o vcuo desta
ltima. Na parte inferior est o sistema de
bombeamento composto por duas bombas turbomoleculares com bombeamento primrio realizado por
bombas mecnicas. Este bombeamento turbo-molecular
-10

permite obter presses da ordem 10 Pa. Por ltimo,

uma bomba inica utilizada para bombear
isoladamente a cmara principal, que propicia uma
-12

Pa. A cmara
presso residual prxima de 10
principal dedicada exclusivamente a anlise de
amostras, e equipada com um tubo de raios-X, um
canho de ons para gases inertes, um manipulador
XYZ que permite um ajuste fino da posio da
amostra, um sistema de aquecimento da amostra e um
analisador CHA equipado com um detector de eltrons
do tipo channeltron.

SITUAO ATUAL DO XPS NO BRASIL

O Brasil possui alguns sistemas XPS. Um deles est
localizado no Instituto de Fsica da UNICAMP, no
CENPES-Petrobrs e no COPPE-UFRJ.

CONCLUSO
Quando utilizamos o XPS, ele rene vrias vantagens
na anlise de superfcies que nos desvela grande
informao a cerca delas. So eles:

O comportamento sobre toda superfcie pode

ser estudado pela microanlise;

As camadas da superfcie podem ser perfiladas

com respeito profundidade;

Figura 6: Curva universal para o livre caminho mdio em

funo da energia cintica dos eltrons. Os pontos indicam
medidas individuais.

A Figura 7 exibe o esquema de um equipamento de

XPS, no qual a configurao do sistema de UHV
composta por duas cmaras isoladas por uma vlvula.

Perfis prximos a superfcie podem ser obtidos

com a ajuda da variao do ngulo de partida;

O uso analtico de XPS para maiores

profundidades pode ser feito com a ajuda de corroso de
ons;

Quando uma molcula for absorvida em uma

superfcie, est molcula pode estar em vrios
ambientes com substncias qumicas diferentes. A

natureza e populao destes locais de absoro

diferentes variaro com parmetros como presso,
carregamento e temperatura da amostra. Estas variaes
podem ser estudadas com o auxilio do XPS;

Coleta de dados rpida e instrumentao

relativamente simples;

Disponibilidade de uma gama extensa de

espectros de referncia para materiais diferentes;

Tratamento terico bem desenvolvido;

Sensvel a todos os elementos (menos H e He);

Fotoemisso angular no destrutiva;

Permite identificar diferentes

qumicas de estados de oxidao formal;

mudanas

REFERNCIAS

Niemantsverdriet, J. W.; Spectroscopy in

Catalysis: An Introduction, VCH Publishers,
New York, 1995.

Smith, G. C.; Surface Analysis by Electron

Spectroscopy: Measurement and Interpretation;
Plenum Press; New York, 1994.

O'Connor, D. J.; Sexton, B. A.; Smart, R. St. C.;

Surface Analysis Methods in Materiais
Science; Springer-Verlag; Berlin, 1992.

Cezar, J. C.; Estudo por EXAFS de

nanopartculas de cobalto imersas em uma
matriz de cobre Dissertao de Mestrado;
UNICAMP, Campinas, SP, 1998.

Nascente, P. A. P.; Anlise de Superfcies por

Espectroscopia de Eltrons Rev. Bras. Aplic.
Vcuo 1998, 17, 15.

Ribeiro, E. S.; Francisco M. S. P.; Gushikem Y.;

Gonalves J. E.; Principios bsicos de XAS e
XPS ChemKeys; UNICAMP; Instituto de
Qumica, Campinas, SP.

Damiani F.; Tatsch P. J.; X Rays Photoelectron

Spectroscopy
XPS/ESCA;
UNICAMP;
Campinas, SP.

Ressonncia Paramagntica Eletrnica

Lus Felipe Santos Mendes
A tcnica de Ressonncia Paramagntica Eletrnica
basicamente fundada em conceitos de mecnica
quntica relativstica e eletromagnetismo avanado.
Portanto inicar os estudos de RPE utilizando um
formalismo matemtico pode ser, e , extremamente
tedioso e desmotivador. Entretanto, podemos mostrar os
conceitos bsicos da tcnica sem utilizar em demasiada
o formalismo matemtico, deixando para aqueles que
realmente se interessarem pelo assunto que vo atrs
das referencias propostas e de outras disponveis na
literatura.
Esse texto ser divido em algumas partes principais.
Primeiro iremos conversar um pouco sobre a tcnica e
quando ela pode ser aplicada em sistemas de interesse.
Passaremos depois para uma discusso das principais
interaes envolvidas. Como haver outro trabalho
sobre RPE, foi conversado que iramos complementar
um o trabalho do outro, de tal forma que no presente
trabalho discutiremos somente aplicaes e teoria da
RPE no regime pulsado. Portanto ser dado tambm um
enfoque do tratamento semi-clssico da evoluo da
magnetizao resultante, descrito por Bloch.

das partculas qunticas e surge naturalmente nas

solues da mecnica quntica relativstica descrita por
Dirac.
Como foi visto no curso de eletromagnetismo,
partculas carregadas aceleradas possuem um momento
magntico associado, em particular aquelas que
possuem uma acelerao radial relacionada um
momento angular, possuem um momento magntico
dada pela razo giromagntica. Bom, se spin um
momento angular, e estamos interessados em estudar
prtons e eltrons, de se esperar que essas partculas
funcionem como pequenos ims, ou no? Classicamente
quando colocamos um im pequeno na presena de um
im grande, a tendncia de menor energia que eles se
alinhem a favor (equilbrio estvel) ou contra o campo
do outro (equilbrio instvel). Falando de eltrons que
o que nos interessa para a tcnica, quando inserimos um
eltron em um campo externo, a mecnica quntica nos
diz que surge uma quantizao espacial do spin em duas
direes, uma a favor e outra contra o campo. Esse
fenmeno conhecido como efeito Zeeman e descrito
pela hamiltoniana:

INTRODUO
Definir a tcnica de RPE pode ser complicado, mas
tentarei fazer isso em uma nica sentena: RPE uma
tcnica de espectroscopia que detecta uma transio de
nveis do spin eletrnico induzida por uma radiao
eletromagntica, na presena de um campo magntico
esttico. Pois bem, porque na presena de um campo
magntico esttico?Quais so os nveis do spin? O que
spin?
A descoberta do spin acorreu por acaso durante um
experimento com tomos de Ag realizado por Stern e
Gerlach. O experimento consistia na emisso de um
feixe colimado de Ag contra um campo magntico
uniforme na direo perpendicular a trajetria. O
resultado clssico esperado seria um borro visto que
a Ag, como um tomo paramagntico, poderia ter
associado ao momento angular orbital do eltron de
valncia, qualquer orientao espacial do momento
magntico associado. Com o que se conhecia da
mecnica ondulatria, se esperava 2l+1 posies de
desvio do feixe, porm o que se foi observado foram
duas orientaes adotadas. A concluso mais bvia que
se pode tirar desse experimento que o fenmeno no
pode ser associado ao momento angular orbital, visto
que esse por estar associado ao numero quntico
principal, s pode assumir valores inteiros. Esse
momento angular estranho observado, de magnitude
1/2, foi nomeado spin. Ele uma propriedade intrnseca

e a razo giromagntica para o eltron,

Onde
conhecida como magnton de Bohr, S o operador spin
vetorial, B0 a campo magntico esttico e g
conhecido como tensor g. Para um eltron livre, g vale
2,002319. Geralmente a Hamiltoniana Zeeman para o
tambm contribui com a Hamiltoniana
ncleo (
efetiva.
Quando aplicado uma autofuno de spin do
operador hamiltoniano, o operador representa a energia
. A
do estado e S se quantiza em dois valores:
transio de um nvel para o outro feita utilizando
ftons, e chegamos na equao fundamental da RPE:

Onde a frequncia de onda empregada.

Existe um problema quanto ao material que fornece
sinal em RPE. Pelo principio de excluso de Pauling,
sabemos que somente dois eltrons podem ocupar um
determinado estado quntico, desde que seus spins
sejam opostos. Bom, ento para o caso diamagntico
uma transio induzida necessariamente compensada
por uma outra transio, pelo principio de Pauling. Aqui
surge o principal limitante da tcnica, somente sistemas
paramagnticos fornecem sinal de RPE. Onde encontrar
sistemas paramagnticos? Podemos encontrar em

radicais orgnicos e inorgnicos, estados tripletos e

complexos de ons paramagnticos como o cobre, por
exemplo.
Nesse
caso,
como
bons
fsicos
biomoleculares, podemos j pensar que essa tcnica
quase intil para estudo de biomolculas e que devemos
ficar na boa e velha ressonncia magntica nuclear,
difrao de raio-X e outras, e deixar a RPE para aqueles
que se interessam por sistemas particulares. Calma, eu
ainda no falei, mas a tcnica extremamente mais
sensvel que a de RMN, visto que o momento
magntico do eltron da ordem de 1000 vezes maior
que a do prton, e alm disso ela extremamente
sensvel ao microambiente em que se encontra o
eltron. No podemos descartar uma tcnica como essa,
e para contornar o problema do diamagnetismo surge,
por exemplo, a marcao de spin em fosfolipdios para
modelos de membrana, e a marcao de spin stiodirigida para protenas e cidos nuclicos.
Os leitores mais fsicos talvez se perguntaram o como
que se caracteriza o microambiente do spin, dito
anteriormente. Aqui no tem jeito, e peo desculpas ao
leitor mais leigo no assunto, mas preciso ao menos
citar
algumas
hamiltonianas
importantes
na
caracterizao do nosso sistema. Ns j aprendemos
uma, a mais importante para ns, que a do efeito
Zeeman. Uma outra importante a devida ao efeito
relativstico do acoplamento spin-rbita. Porque esse
acoplamento importante? Como se sabe o
acoplamento spin-orbita esta relacionado a um sistema
de coordenadas molecular, e para esse nosso caso onde
o spin quantizado, o efeito principal surge na
anisotropia do tensor g. Ento uma medida de RPE
depende da posio da amostra com relao ao campo?
Sim, infelizmente (embora para alguns casos um
felizmente seria mais apropriado, como no estudo de
cristais, por exemplo) depende. Entretanto, devemos
lembrar que nem todos os sistemas possuem orientao
a longo alcance. Deixe-me explicar melhor, por
exemplo um cristal. Nele existe uma orientao
espacial, e portanto a posio dele com relao ao
campo externo depende e muito. Porm em espectros
como o de p onde existem um ensemble de pequenos
cristais randomicamente orientados, e o de amostra em
soluo onde a frequncia de rotao dos sistemas
maior que o da microonda, o que medimos um valor
).
isotrpico (
Bom, ento no s pegar um sistema e medir, temos
que saber com que tipo de amostra estamos trabalhando.
Porm isso contornvel. Agora surge uma outra
pergunta: Sempre medimos a mesma coisa? Ou seja,
sempre o mesmo espectro para toda amostra na mesma
condio? Com o que foi apresentado at agora, essa
uma duvida pertinente. interessante pensarmos em
como o eltron se encontra no espao. Prximo ao
eltron desemparelhado se encontra o seu ncleo. Os
prtons possuem spin? Sabemos que sim. Existem
ncleos com momento total de spin diferente de zero?
Tambm sabemos que sim, pois se no, no existiria
ressonncia magntica nuclear. Um aluno que ainda no

dormiu lendo esse texto se perguntaria, ser que a

quantizao desse spin nuclear interfere com o spin
eletrnico? Bom, temos um im externo, para todo o
caso os prtons so como ims, os eltrons tambm...
deve haver uma interao entre esses sistemas, mesmo
que fraca. E existe! Esse tipo de acoplamento entre spin
nuclear e spin eletrnico chamada de acoplamento
hiperfino e onde reside o real poder da tcnica de
RPE. Para um sistema com n spins nucleares
interagindo com um nico eltron, a hamiltoniana da
interao hiperfina dada por:

Onde Ai o tensor hiperfino, em unidades de frequncia

e Ii o spin nuclear do i-simo ncleo. Somente o valor
isotrpico do tensor A pode ser medido em sistemas em
soluo.
Aqui percebemos que para o caso de s haver as
hamiltonianas estudadas, os nveis devido ao efeito
Zeeman so quebrados em subniveis quando I
diferente de zero. Por exemplo, se o momento de spin
nuclear vale 1, existem 3 orientaes possveis no
espao para tal. Como para o eltron existem j dois
nveis, iro existir ao todo seis nveis com diferentes
energias para o eltron. Confuso? Talvez a figura 1
ajude a entender isso.

Figura 1: desdobramento dos nveis de energia do operador

sujeito a interao hiperfina com um ncleo 3/2

Os valores de +- 1 e 0 representam as orientaes do

spin nuclear. Pela regra de seleo, transies s so
permitidas para o caso onde no h mudana de valor
no spin nuclear, e portanto s temos para esse sistema
trs transies possveis e esperaremos somente trs
linhas de ressonncia. Sendo ms e mi o momento
magntico do eltron e do ncleo respectivamente,
podemos representar as regras de seleo para transio
como sendo:

Essa regra de seleo vlida para a aproximao de

campo alto, que o caso onde a interao Zeeman
eletrnica muito maior que as de mais interaes. Essa
regra frequentemente violada em EPR.
Existe uma tcnica especial utilizada para flipar tanto
o spin eletrnico quanto o spin nuclear. Esse tipo de
tcnica emprega duas fontes de ondas eletromagnticas
(microondas e radio frequncia) e conhecida como
Ressonncia Dupla Eltron-Ncleo (ENDOR do ingls
Electron Nuclear Double-Resonance). Experimentos
ENDOR no sero discutidos nessa monografia.

Agora temos o conhecimento necessrio para ao menos

identificar a hamiltoniana efetiva em um experimento
de RPE, em especial no regime de onda contnua (CW).
A Hamiltoniana de spin nomeada de Abragam-Pryce,
pela contribuio dos autores, dada por:

H 0 = H ZE + H ZFS + H HF + H ZN + H Q
A Figura 2 nos permite ter uma idia aproximada da
amplitude dessas interaes.

Existe uma interao que conhecida como interao

de contato de Fermi. Como foi estudo em fsica
moderna e quntica, na resoluo do tomo de
hidrognio em particular, lembramos que em alguns
casos existe uma probabilidade no nula de o eltron ser
encontrado no ncleo. Na posio do ncleo a interao
eletrosttica e muito grande, o que leva a uma energia
cintica eletrnica extremamente alta, com velocidades
prxima a da luz. Esse contanto leva o nome de Fermi
e basicamente um efeito relativstico. A hamiltoniana
dessa interao descrita abaixo.
Figura 2: Amplitude aproximada de algumas interaes do
Hamiltoniano de spin

A presena da delta de Dirac na equao acima serve

para mostra que somente os orbitais onde existe a
probabilidade de o eltron se encontrar no ncleo que
contribuem para a hamiltoniana. Portanto o tipo de
interao esperada somente para eltrons no orbital s.
Para S > 1/2 e em simetrias menores que cbicas, a
degenerescncia do estado fundamental pode ser
levantada por interaes que no dependem do campo
externo e por isso so denominadas de interaes de
campo zero. Neste caso, a Hamiltoniana efetiva pode
ser dada por:

RPE NO REGIME PULSADO

Como ser descrita pelo trabalho de outro aluno, a
tcnica de RPE CW muito poderosa na caracterizao
de amostras paramagnticas, e a mais amplamente
utilizada pelos pesquisadores. Entretanto existe um
limitante da tcnica que diminui a resoluo das
interaes existentes quando o sinal claramente
dominado por uma ou duas dessas interaes. Alguns
experimentos envolvendo relaxao de spin podem ser
utilizados para tentar resolver o problema, porm os
resultados so sempre semi-quantitativos. Alm disso as
contribuies no fenmeno de relaxao no podem ser
separadas.

onde D o tensor de interao de campo zero ou tensor

de estrutura fina. Essa interao um pouco mais
complexa de se entender, entretanto ela cumpre um
papel importante na hamiltoniana efetiva, e portanto
necessrio ao menos cita-la no texto.

Em casos onde a elucidao dessas interaes, ou ao

menos de uma em particular que no se sobreponha as
demais, precisam serem caracterizadas, a tcnica de
RPE em regime de onda pulsada passa a ter
considervel importncia.

A ltima interao que ser tratada aquela conhecida

como interao quadrupolar. No caso de spins nucleares
Ik > 1/2 existe a interao entre o quadrupolo eltrico do
ncleo com um gradiente de campo eltrico que
geralmente estabelecido pela distribuio de cargas na
vizinhana do centro paramagntico. A interao
quadrupolar nuclear pode ser escrita como:

Antes de falar da tcnica em si, precisa ao menos

introduzir as equaes de Bloch. A tcnica de RPE
possui alta sensibilidade, porm impossvel estudar
um spin isolado. O que estudamos um ensemble de
spins, com a distribuio das quantizaes de spin dadas
pela estatstica de Boltzmann. Portanto o que medimos
uma magnetizao total da amostra, e o como ela
evolui quando interagimos com ela via ftons. Para
nossa sorte a magnetizao total grande e sai do
regime quntico. A evoluo temporal do vetor
magnetizao descrita pelas equaes de Bloch.

Analisando essa equao, podemos observar que o

tratamento dado a ela ser anlogo ao construdo para a
interao de campo zero.

As equaes de Bloch representam um sistema de

equaes diferenciais de primeira ordem para as

componentes cartesianas do vetor magnetizao M

=(Mx, My, Mz) no referencial do laboratrio. Para os
casos que iremos considerar adiante, o sistema
magntico de interesse est sujeito a um campo
magntico esttico, Bo = Bo(0, 0, 1 ), e um campo
magntico circularmente polarizado e dependente do
tempo, B1 = B1[cos(mw t) , sen(mw t) , 0] que surge
devida ao campo da radiao eletromagntica utilizada,
de tal forma que o campo magntico total vale B = (B1
cos(mw t), B1 sen(mw t), Bo). Estas definies
consideram que, devido s regras de seleo impostas s
transies de RPE, o campo magntico oscilante
proveniente da radiao de microondas (B1) deve estar
orientado perpendicularmente ao campo esttico B0.
A equao de movimento para um determinado spin
isolado, nas condies propostas acima, dada por:

de relaxao transversal, T2, e do tempo de relaxao

longitudinal, T1 (eu irei explic-los melhor mais pra
frente, por enquanto apenas acreditem em mim quando
eu digo que eles existem)
A resoluo completa desse sistema complexa devida
aos acoplamentos das equaes diferenciais, entretanto
possvel estudar alguns casos particulares. Uma
situao interessante um caso particular das equaes
anteriores e ocorre quando o sistema observado na
condio de ressonncia, isto , = 0, resultando:

dm x
dt

dm y
dt
dmz
dt

Mas:

= 0 ,

= 1 mz ,

= 1 m y .

Dadas as condies iniciais, as equaes anteriores

podem ser facilmente resolvidas. Considerando que em
t = 0 a magnetizao est em equilbrio termodinmico,
isto ,
(0) =
(0) = (0, 0, Mo), encontra-se:

mx = 0 ,
conveniente descrever o movimento da magnetizao
num referencial onde B1 seja independente do tempo.
B1 torna-se independente do tempo em um novo
referencial que gira em torno do eixo z com a
freqncia mw. Neste novo referencial, denominado de
referencial girante, a evoluo do vetor magnetizao
= (mx, my, mz) descrita pelas equaes de Bloch
no referencial girante:

dm x
dt

dm y
dt
dm z
dt

= my

mx
T2

= m x 1 m z
= 1 m y

mz = M 0 cos1t .
Estas equaes descrevem a rotao da magnetizao,
com a freqncia de Rabi 1, em torno do eixo x do
referencial girante, no qual aplicado o campo B1. Se o
tempo de aplicao da microonda for p, o ngulo de
rotao
ser
dado
por
Quando
= 1 p .
= 1 p = 2 (figura 3-a) toda a magnetizao ser
transferida para o plano xy na direo -y, ou seja,

my
T2

mz M 0
T1

Sendo que o eixo z se mantm inalterado pela

transformao de coordenadas, mz = Mz e mo= Mo.
Nestas
equaes
utilizamos:
1 = g e e B1 / h ,
usualmente denominada de freqncia de Rabi e
= e mw , onde e = g e e Bo / h a freqncia de

Larmor eletrnica. As equaes descrevem a dinmica

da magnetizao sujeita a processos de relaxao que
foram includos fenomenologicamente atravs do tempo

m y = M 0 sen 1t ,

m x ( p ) = 0 ,

m y ( p ) = M 0 ,
m z ( p ) = 0 .

Figura 3: Rotao da magnetizao M devido aplicao de

um pulso de /2 (a) e um pulso de (b).

claro que trabalhar na condio de ressonncia

impossvel de se construir totalmente pois dentro do
ensemble diversos spins sentem um campo que pode
no ser exatamente igual ao de seus vizinhos. Portanto
na viso de um observador no referencial girante, aps
o pulso de /2, ele ira notar que os spins com frequncia
igual de Larmor adotada iro permanecer
estacionrios no plano xy, enquanto os fora da
ressonncia iro se defasar. Vou construir um exemplo,
suponha que eu estou querendo medir a magnetizao
resultante e o meu detector esta posicionado no eixo x
positivo. A minha magnetizao inicial esta posicionada
no eixo z, que o mesmo do campo magntico esttico.
Aps o pulso de /2 toda a magnetizao vai para o
eixo x e o sinal do meu detector mximo. Porm,
como nem todos os spins esto em ressonncia, ira
ocorrer uma defasagem que ir diminuir o sinal que eu
obtenho at o ponto em que a defasagem no plano
completa. Talvez a figura 4 ilustre melhor o que eu
quero dizer.

Figura 4: ilustrao do comportamento real da magnetizao

aps um pulso de /2, medido em um tempo muito menor que
o tempo de relaxao transversal (T2). 1) aps aplicao do
pulso de /2. 2)inicio da defasagem da magnetizao. 3)
defasagem completa no plano transversal. Junto
apresentado a resposta no detector da magnetizao (FID)

Agora eu gostaria de introduzir um outro pulso

importante para a tcnica que o de . Os pulsos de /2
e so os mais amplamente utilizados, embora
possamos construir pulsos de qualquer ngulo apenas
controlando o seu tempo de durao. Pensando o bvio,
se minha magnetizao esta em z e eu aplico um pulso
de , a magnetizao resultante se encontrar no eixo z
negativo. O resultado esse mesmo, mas no essa
aplicao que eu quero exemplificar.
Se o leitor se recordar sobre o que foi dito
anteriormente, lhe foi apresentado dois tempos de
relaxao. A relaxao transversal T2 foi explicada
anteriormente e representa a defasagem da
magnetizao no plano transversal. O tempo T1 est
relacionado com o fato de que o mnimo de energia para
o sistema o alinhamento paralelo ao campo esttico.
Quando o sistema forado a realizar as transies para
o eixo negativo de z formando as magnetizaes no
plano transversal, por exemplo, a tendncia do sistema
voltar ao eixo z positivo, de voltar ao equilbrio
descrito pela equao de Boltzmann. O tempo de
relaxao longitudinal T1 representa essa tendncia do

sistema de voltar ao equilbrio inicial aps a aplicao

do conjunto de pulsos.
Para a RMN que est relacionada com o momento
magntico dos ncleos, os tempos de relaxao so
normalmente mais longos. Para a RPE pulsada, o T2
to curto que ao se aplicar um pulso de /2 a
magnetizao observada no detector j a nula. Isso
ocorre porque durante as aplicaes dos pulsos (que
possuem alta potncia) preciso proteger o detector.
Entre o tempo de trmino do pulso e volta do sistema
em regime de deteco, existe um tempo curto
conhecido como tempo morto, que para os sistemas
paramagnticos j maior que T2. O que fazer? nesse
tipo de momento que a inteligncia humana posta em
prova e as idias mais simples e brilhantes surgem.
Imaginem os spins como simples corredores realizando
uma disputa no plano transversal. Uns correm mais que
outros, e portanto depois de um tempo t eles ocuparam
todo o plano (esse corresponderia a defasagem
completa). Imagine agora que eu dou um grito e mande
todos pararem, virarem para trs e correrem com a
mesma velocidade de antes. Concorda comigo que
depois de um tempo t aps eu gritar eles iro voltar a
situao inicial (que seria todos no ponto de largada)?
Talvez ento se eu conseguir alterar a velocidade
angular em 180 eu recupere meu sistema e contorne o
tempo morto. Isso possvel utilizando o pulso de . A
figura 5 mostra o que quero dizer.

Figura 5: Evoluo da magnetizao em um experimento

tpico para observar o eco de spins atravs de uma seqncia
de dois pulsos.

O novo sinal obtido no tempo 2t possui as informaes

do primeiro sinal obtido com o pulso de /2 e , por isso,
ele conhecido como eco. A tcnica de spin-eco foi
descrita pela primeira vez por Hahn e com ela podemos
recuperar toda perda de coerncia causada por
alargamentos no homogneos.
Com o que foi apresentado at o momento o leitor j
possui uma base superficial da tcnica e j esta
familiarizado com os conceitos de pulso de e suas
fraes, bem como o surgimento do eco de Hahn.
Podemos agora trabalhar um exemplo clssico de RPE
pulsada que a tcnica de ESEEM dois pulsos.

MARCAO DE SPIN STIO-DIRIGIDA

Como dito anteriormente as tcnicas de RPE so

ferramentas poderosas no estudo de fenmenos
biolgicos na escala microscpica, entretanto o fato de

se exigir um centro paramagntico se torna um limitante

srio no estudo de biomolculas.
As biomolculas, tais como protenas e cidos
nuclicos, so em sua maioria diamagnticas, e portanto
no fornecem sinal em RPE. Para se contornar esse
problema surge a tcnica de marcao de spin stiodirigida, ou do ingls Site-Directed Spin Labeling
(SDSL).
Em protenas, basicamente a tcnica de SDSL consiste
na insero de marcadores paramagnticos em regies
especificas. A marcao consiste na reao entre o
marcador de spin e o grupo tiol de resduos do tipo
cistena, normalmente inseridos via mutao stiodirigida. A figura 6 representa um exemplo de marcao
utilizando uma sonda paramagntica do tipo nitrxido.

a interao. Essa hamiltoniana parte da anloga clssica

de interao dipolar ideal.

o operador de spin do dipolo i, na direo z.

Sendo
O valor de e r so exemplificados na figura 7. As de
mais constantes j foram anteriormente apresentadas.

Figura 7: representao do acoplamento dipolar sujeito a um

campo magntico externo
Figura 6: representao da reao entre o marcador
(MTSSL) e o grupo sulfidrila da protena [6]

O radical nitrxido protegido estericamente pelos

grupos metila do anel, o que o torna estvel em soluo.
O eltron desemparelhado se encontra na ligao N-O e
possui, portanto, uma forte interao hiperfina com o
tomo de nitrognio, que possui spin 1. Espectros de
RPE CW mostram bem esse padro.

RESSONNCIA DUPLA ELTRON-ELTRON

Em baixas temperaturas e com amostras desordenadas

contendo centros paramagnticos de spin S=1/2, a
largura de linha dos espectros de RPE dominada por
alargamentos inomogneos causados por acoplamentos
hiperfinos no resolvidos com ncleos prximos e pela
anisotropia do tensor g. Nestes casos, experimentos de
RPE pulsados, como a sequncia do eco de Hahn,
podem ser feitos para refocalizar todas as
inomogeneidades estticas e recuperar a largura de linha
homognea dada pela taxa de relaxao transversal
1/T2, assim aumentando consideravelmente a resoluo
espectral.
A Ressonncia Dupla Eltron-Eltron uma tcnica de
RPE pulsada utilizada para elucidar o acoplamento
dipolar entre centros paramagnticos em uma mesma
estrutura. Os limites da tcnica compreendem um range
de 2 a 8 nm (aproximadamente). Utilizando uma
sequncia de 4 pulsos, possvel elucidar um FID
modulado por uma funo do tipo cosseno, que carrega
todas as caractersticas da interao dipolar estudada.
Por que interessante elucidar esse tipo de interao?
Responder essa questo mais fcil quando
apresentamos formulas matemticas. Sem resolver a
hamiltoniana, apresentada a parte secular que domina

Portanto, para uma amostra randomicamente orientada,

a dependncia da interao dipolar carrega a informao
sobre a distncia entre os marcadores. Com isso,
possvel elucidar os vnculos de uma estrutura, no s
de dentro de uma protena, por exemplo, mas entre
complexos de protenas. A vantagem que a tcnica
no exige a formao de cristais ou limita o tamanho do
sistema. Alm disso, todo o experimento conduzido
em soluo.
Abaixo apresentado um espectro tpico obtido em um
experimento DEER. O Espectro V(t) corresponde ao
FID. Aps remoo e tratamento dos dados (no
explicados no trabalho), obtido a funo F(t) que aps
a transformada de Fourier cosseno fornece o padro de
Pake, que carrega toda informao sobre a interao
dipolar.

Figura 8: Separao da funo evoluo dipolar V(t) (a) em

um fator devido a um Background B(t) e o fator de forma F(t)
(b) (simulao). Em (b) representado tambm a distribuio
de distancias devido ao ensemble de acoplamentos dipolares
na amostra. Figura de Gunnar Jeschke [5].

As distncias r obtidas constituem os vnculos entre

marcadores, sendo a largura da distribuio quela que
carrega o comportamento espacial da estrutura. Com o
conjunto de vnculos, possvel observar o
comportamento temporal da estrutura.

REFERENCIAS

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W. L. Hubbell et al., Structure 4, 779 (1996).

Espectroscopia por Raios-X

Andr Monteiro Paschoal
INTRODUO

Quando raios-X de freqncia suficiente (energia)

interagem com uma substncia, os eltrons das camadas
interiores do tomo so animados para os orbitais
vazios exteriores, ou podem ser completamente
removido, o tomo ionizantes. O interior shell "buraco"
ser ento preenchida por eltrons de orbitais exteriores.
A energia disponvel nesse processo de excitao
emitida como radiao (fluorescncia) ou ir remover
outros eltrons menos vinculados do tomo (efeito
Auger). As freqncias de absoro ou de emisso
(energias) so caractersticas especficas do tomo.
Alm disso, para um tomo especfico, pequena
freqncia (energia) variaes que so caractersticos da
ligao qumica ocorrem. Com um aparelho apropriado,
esses raios-X caractersticos de freqncias ou energias
de eltrons Auger podem ser medidos. Espectroscopias
de raios-X de absoro e de emisso so usadas em
cincias qumicas e de materiais para determinar a
composio elementar e as ligaes qumicas.
A Espectroscopia de Fotoeltrons Excitados por raios X
(XPS) - X-ray Photoelectron Spectroscopy - tambm
conhecida por Espectroscopia de Eltrons para Anlise
Qumica - Electron Spectroscopy for Chemical Analysis
(ESCA) - ou s vezes por Espectroscopia Rtgen de
fotoeltrons uma tcnica experimental de anlise que
encontra grande aplicao em reas onde o estudo
fsico-qumico de amostras mostra-se importante. Em
especial, de grande valia em trabalhos na rea da
fsica do estado slido. Sendo essencialmente uma
tcnica de anlise de superfcie, a espectroscopia XPS
fundamenta-se no efeito fotoeltrico experimentalmente
descoberto por Heinrich Hertz em 1887 e teoricamente
explicado por Albert Einstein, explicao terica que
lhe valeu o Prmio Nobel de Fsica em 1921.
Em essncia esta tcnica consiste em iluminar-se uma
amostra com raios-X e coletar os fotoeltrons por ela
emitidos em um analisador de eltrons capaz de
resolver os eltrons coletados em funo das respectivas
energias cinticas (velocidades) que possuem e de,
ento, cont-los. Um grfico de contagem de eltrons
(corrente) x energia cintica (velocidade) estabelecido
geralmente atravs de um mecanismo de coleta de
dados automatizado, e um espectro de XPS obtido.
Os
espectros
XPS
permitem
identificar
quantitativamente, em profundidades da ordem de

dezenas de nanmetros e com incerteza de frao

centesimal de camada atmica, todos os elementos
qumicos na superfcie da amostra, o ambiente qumico
dos elementos - seus estados de oxidao, suas
concentraes relativas na amostra - e em casos
especficos permite inclusive inferir a morfologia da
superfcie em anlise

CONCEITOS

Raios-X so produzidos quando qualquer partcula

eletricamente carregada, de suficiente energia cintica,
rapidamente desacelerada. Eltrons so normalmente
usados, a radiao sendo produzida em um "tubo de
raios-X" o qual contm uma fonte de eltrons e dois
eletrodos metlicos. A alta voltagem mantida entre os
eletrodos (algumas dezenas de milhares de volts)
rapidamente atrai os eltrons para o nodo, ou alvo, no
qual eles colidem a alta velocidade. Raios-X so
produzidos no ponto de impacto e irradiam em todas as
direes. Se q a carga de um eltron e V a voltagem
atravs dos eletrodos, ento, a energia cintica (em
Joules) dos eltrons no momento do impacto dada
pela equao abaixo:
K = qV = 1 mv^2,
onde m a massa do eltron e v sua velocidade em m/s
exatamente antes do impacto. Para uma voltagem de
30.000 V esta velocidade , aproximadamente, um tero
da velocidade da luz. A maior parte da energia cintica
dos eltrons que atingem o alvo convertida em calor,
menos de 1% transformado em raios-X.
Quando os raios-X que saem do alvo so analisados,
encontrado que eles so constitudos de uma mistura de
diferentes comprimentos de onda e a variao de
intensidade com comprimento de onda depende da
voltagem do tubo. Figura 4 mostra o tipo de curvas
obtidas. A intensidade zero at um certo comprimento
de onda, chamado de limite de comprimento de onda
curto (SWL), aumenta rapidamente at um mximo e,
ento, diminui, sem um limite definido no lado de
comprimentos de onda longos. Quando a voltagem
aumentada, a intensidade de todos os comprimentos de
onda aumenta e tanto SWL quanto a posio do
mximo se deslocam para comprimentos de ondas
menores. A radiao representada pelas curvas suaves
mostradas na Figura 1 (correspondendo a voltagens de

at 20 kV) chamada de contnua, ou radiao branca,

j que ela constituda, como a luz branca, de raios de
vrios comprimentos de onda. Radiao branca
tambm chamada de bremsstrahlung, termo alemo
para radiao de frenagem, porque ela causada pela
desacelerao dos eltrons.

Bremsstrahlung:

Radiao produzida quando eltrons acelerados so

freados bruscamente contra um alvo. A palavra de
origem alem significa: Bremsen= Frear e Strahlung=
radiao.

X caractersticos so portanto dependentes dos nveis de

energia da eletrosfera e, dessa forma, seu espectro de
distribuio em energia discreto.
Como a emisso de raios-X caractersticos um
fenmeno que ocorre com energia da ordem da energia
de ligao dos diversos nveis da eletrosfera, as energias
de emisso dos raios-X caractersticos variam de alguns
eV a dezenas de keV. Agora, baseados no modelo de
Bohr podemos entender como so gerados os raios
caractersticos, e por qu o espectro obtido com o
tungstnio apresenta apenas linhas discretas.

Quando partculas carregadas, principalmente eltrons,

interagem com o campo eltrico de ncleos de nmero
atmico elevado ou com a eletrosfera, elas reduzem a
energia cintica, mudam de direo e emitem a
diferena de energia sob a forma de ondas
eletromagnticas, denominadas de raios-X de freamento
ou "bremsstrahlung".

Quando o eltron proveniente do ctodo incide no

nodo, ele pode expulsar um eltron orbital. A rbita de
onde o eltron ser expulso, depende da energia do
eltron incidente e dos nveis de energia do tomo do
nodo. A lacuna deixada por este eltron ser
preenchida por um eltron mais externo

A energia dos raios-X de freamento depende

fundamentalmente da energia da partcula incidente. Os
raios-X gerados para uso mdico e industrial no
passam dos 500 keV, embora possam ser obtidos em
laboratrio raios-X at com centenas de MeV. Como o
processo depende da energia e da intensidade de
interao da partcula incidente com o ncleo e de seu
ngulo de "sada", a energia da radiao produzida pode
variar de zero a um valor mximo, sendo contnuo seu
espectro em energia.

O espectro contnuo devido rpida desacelerao

dos eltrons ao atingirem o alvo, j que qualquer carga
desacelerada emite energia. Nem todos os eltrons so
desacelerados da mesma maneira. Alguns so parados
em um nico impacto e liberam toda a sua energia de
uma vez. Outros so desviados vrias vezes pelos
tomos do alvo, sucessivamente perdendo uma frao
de sua energia cintica total at que ela seja totalmente
gasta. Aqueles eltrons que so parados em um nico
impacto do origem aos ftons de mxima energia, isto
, a raios-X com comprimento de onda mnimo. Tais
eltrons transferem toda a sua energia qV em energia do
fton e podemos escrever as equaes (1) e (2):

Raios-X Caractersticos:

Quando ocorre a captura eletrnica ou outro processo

que retire eltrons da eletrosfera do tomo, a vacncia
originada pelo eltron imediatamente preenchida por
algum eltron de orbitais superiores. Ao passar de um
estado menos ligado para outro mais ligado (por estar
mais interno na estrutura eletrnica),o excesso de
energia do eltron liberado por meio de uma radiao
eletromagntica, cuja energia igual diferena de
energia entre o estado inicial e o final. Vai ocorrer
instabilidade do tomo do nodo, com "saltos"
qunticos e libertao de radiao electromagntica
caracterstica do respectivo material, at que o estado
energtico do tomo seja mnimo. A denominao
"caracterstico" se deve ao fato dos ftons emitidos, por
transio, serem monoenergticos e revelarem detalhes
da estrutura eletrnica do elemento qumico e, assim,
sua energia e intensidade relativa permitem a
identificao do elemento de origem.
A produo de Rx s ocorre por materiais de nmero
atmico elevado (como o caso do tungstenio). Os raios-

Figura 1: Espectro de raios-X de um alvo de Molibdnio, em

funo da voltagem aplicada. As larguras das linhas no
esto em escala.

(1) (2)
Esta equao fornece SWL (em Angstroms) como uma
funo da voltagem aplicada V. Se um eltron no
parado em uma nica coliso, mas sofre um impacto
que somente decresce sua velocidade parcialmente,
ento, somente uma frao de sua energia qV emitida
como radiao e o fton produzido tem energia menor
que hmax e um comprimento de onda maior que
SWL. A totalidade destes comprimentos de onda,
maiores que SWL constituem o espectro contnuo.
Quando a voltagem em um tubo de raios-X aumentada
acima de um certo valor crtico, caracterstico do metal
do alvo, mximos de intensidade bem definidos
aparecem em certos comprimentos de onda, superpostos
no espectro contnuo. Como eles so finos e como seus
comprimentos de onda so caractersticos do metal
usado no alvo, eles so chamados de "linhas
caractersticas". Estas linhas pertencem a vrios grupos,
conhecidos com K, L, M, etc., em ordem crescente de
comprimento de onda, todas as linhas juntas formando o
"espectro caracterstico" do metal usado como alvo. H
vrias linhas no grupo K, mas somente as trs mais
fortes (K1, K2 e K1) so observadas normalmente.
Estas linhas caractersticas podem ser vistas na curva
superior da Figura 4. A intensidade de qualquer linha
caracterstica, medida acima do espectro contnuo,
depende tanto da corrente no tubo e do valor pelo qual a
voltagem aplicada excede a voltagem crtica de
excitao para aquela linha.

intensidade desta radiao pode ser medida com um

contador adequado, como na figura 5(a). Como radiao
de vrios comprimentos de onda difratada em
diferentes direes no espao, este mtodo algumas
vezes simplesmente chamado de dispersivo. Um
espectrmetro de disperso de comprimento de onda
tambm chamado de espectrmetro de cristal.

2) Disperso de energia. Neste espectrmetro no

envolvida difrao. Os vrios comprimentos de onda na
radiao emitida pela amostra so separados com base
em suas energias por meio de um contador de Si(Li) em
um analisador multicanal (MCA). Este contador produz
pulsos de alturas proporcionais s energias do feixe
incidente e o MCA, ento, separa as vrias alturas de
pulsos, como indicado na Figura 5(b). Como no h
separao espacial dos vrios comprimentos de onda
(energias), tal espectrmetro , algumas vezes,
simplesmente chamado de "no dispersivo". Ele mais
recente e menos comum que um espectrmetro de
cristal.

Qualquer elemento, se usado como alvo em um tubo de

raios-X e bombardeado com eltrons com energia
suficientemente alta, emitir uma linha caracterstica do
espectro. Estas mesmas linhas sero emitidas se o
elemento for bombardeado com raios-X com energia
suficientemente alta (fluorescncia).
Neste fenmeno ns temos a base para um mtodo de
anlise qumica. Se os vrios elementos de uma amostra
a ser analisada forem induzidos a emitirem suas linhas
caractersticas atravs de bombardeamento com raios-X
ou eltrons, ento, estes elementos podem ser
identificados atravs da anlise da radiao emitida.
Esta anlise feita em um espectrmetro de raios-X de
duas maneiras diferentes:

1) Disperso de comprimento de onda. A radiao

emitida pela amostra difratada pelos planos da rede
cristalina (com espaamento conhecido d) de um
monocristal. De acordo com a lei de Bragg ( = 2d sen
) radiao de um nico comprimento de onda
difratada para cada posio angular do cristal e a

Figura 2: Espectrmetros de raios-X. Neste exemplo, os

elementos 1 e 2 na amostra emitem comprimentos de onda
caractersticos 1 e 2. Estes comprimentos de onda so
medidos separadamente atravs de difrao em cristal em (a)
ou por anlise de altura de pulso em (b).

COMO FUNCIONA UM ESPECTRMETRO DE

RAIOS-X.

Uma fonte de raios-X, normalmente um tubo, emite

ftons que so dirigidos sobre a superfcie da amostra.
Este ao bater no eltron de uma camada interna do

tomo o expulsa do tomo. A seguir um eltron de

maior energia muda para preencher o nvel eletrnico
inferior. Como esse eltron tem maior energia, emite
um fton X para diminu-la. O fton X emitido chamase "radiao", caracterstica do elemento. Em uma
amostra estimulada por raios-X, cada elemento tem a
sua radiao caracterstica. Podemos identific-lo pela
energia e quantific-lo pela intensidade, permitindo a
anlise elementar de C(6) at U(92).
Os raios-X emitidos pela amostra so detectados,
processados, classificados e contados. Desta forma
podemos conhecer quais so os elementos presentes no
material analisado e pela intensidade de cada radiao
caracterstica saber a quantidade do elemento na
amostra, seja em partes por milho ou em percentual.
Os espectrmetros XRF podem fazer determinaes
desde poucas ppm at 100%.
Como uma tcnica comparativa, deve-se usar padres
certificados que permitam construir curvas de
calibrao relacionando as cps (pulsos por segundo)
com a concentrao elementar.

COMO SE SEPARAM AS RADIAES DE CADA

ELEMENTO.

Os primeiros espectrmetros usavam tubos de alta

potncia, agora com os enormes avanos da tecnologia
de materiais, dos computadores e da microeletrnica
so fabricados instrumentos de potncia menores que
um watt. Por exemplo, o XMET3000 pesa menos de
dois quilos e utilizado como analisador de metais e
identificador de ligas. Totalmente porttil alimentado
por baterias recarregveis. O tubo de raio-X desse
analisador j no usa filamento aquecido. So populares
espectrmetros de potncia baixa e mdia de 0,3 at 200
Watt. Os de altssima potncia de 3 ou 4 kWatt tem
aplicaes cada dia mais especficas e sendo muito
onerosos pelos sistemas auxiliares pneumticos e de
resfriamento. Em resumo, j no necessrio comprar
carssimos espectrmetros de pesquisa para CQ.

EDX versus WDX

Os sistemas MDX, espectrmetros multi-dispersivos,

resolveram a questo. Na realidade trata-se de
espectrmetros de novssima e avanada tecnologia que
renem num s analisador as duas tcnicas EDX e
WDX. Desse modo, h as vantagens dos detectores de
gases para elementos leves e dos detectores slidos de
EDX para os de nmero atmico maior.

Da amostra estimulada saem ftons de muitas energias

e comprimentos de onda que h necessidade de separlas. Nos sistemas pticos nas faixas visveis de luz,
usam-se prismas e redes de difrao.
Com raios-X existem duas tcnicas conhecidas como
WDX (Dispersivo de Comprimento de Onda) e EDX
(Dispersivo de Energia). No WDX usam-se cristais que
difratam o raio x, dependendo do comprimento de onda
em ngulos que esto sujeitos a sua energia (Lei de
Bragg). Com um arranjo mecnico adequado, a radiao
da amostra chega ao detector de forma monocromtica.
Existem seqenciais e simultneos.
No EDX modernos detectores slidos tm a capacidade
de separar os componentes de uma radiao branca e
contar cada intensidade, ou seja, separam as radiaes
de cada elemento.
Muito se fala das vantagens de cada tcnica. O
consenso geral que, para elementos leves o WDX
melhor e para os de nmero atmico maior o EDX
mais recomendvel.

A POTNCIA DOS ESPECTRMETROS DE

RAIOS-X.

Figura 3: Componentes de um espectrmetro para anlise

por fluorescncia de Raios X.

APLICAES DA TCNICA

Importncia industrial e cientfica:

Propriedades fsicas de metais, polmeros e ligas

arranjo espacial e determinao das distncias
interatmicas determinao das estruturas de esterides,
vitaminas, antibiticos, outros compostos (e. g.
orgnicos, inorgnicos e organometlicos)

nico mtodo analtico capaz de fornecer

informao qualitativa e quantitativa sobre os
compostos presentes numa amostra (e. g. mtodo de ps
composico % de uma mistura slida de KBr e NaCl
+ + - vvs. outros mtodos composio % de K , Na ,
Br - ee Cl )

Difrao de Raios-X: Aplicaes em Biomateriais

A caracterizao por difrao de raios-X tem sido

largamente na identificao de fases cristalinas e
contedo amorfo de biocermicas, como hidroxiapatita,
trifosfato de clcio (TCP), fosfatos de clcio amorfos e
outras. As figuras a seguir so exemplos de utilizao
na anlise destes biomateriais.

Figura 4: Exemplos de espectros de difrao de raios-X para

biocermicas, mostrando evoluo das fases em funo do
tratamento trmico (HA, TCP, CaO).

Figura 3b: Espectros de difrao de raios-X para

biocermicas de fosfato de clcio, obtidas por vrias rotas de
processamento aquoso, de A2 A6 (fases HA, TCP).
Figura 5: Difratograma de farelo de osso bovino (a);
hidroxiapatita/HA (b).

SAXS Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo

Bruno Luan Soares Paula de Mello
INTRODUO

Espalhamento de raios-X a baixo ngulo (SAXS) uma

tcnica de espalhamento elstico de raios-X em ngulos
muito
baixos
por
amostras
que
possuem
inomogeneidades em escalas nanomtricas. Essa regio
de baixos ngulos contm diversas informaes da
molcula estudada, tais como, forma, tamanho,
distncias caractersticas de materiais parcialmente
ordenados e tamanhos de poros. Portanto, SAXS
pertence famlia de espalhamento de raios-X que so
usados para caracterizao de materiais. No caso de
molculas biolgicas, como protenas, a vantagem da
utilizao de SAXS frente cristalografia de protenas e
ressonncia magntica nuclear (NMR) que no se
precisa de um cristal ou de realizar a expresso protica
em meio com istopos. Alm disso, a resoluo
estrutural utilizando NMR problemtica para
macromolculas de alto peso molecular (>40 kDa). Por
outro lado, o que se obtm do estudo de SAXS uma
mdia espacial da posio da molcula (devido ao seu
movimento desordenado e aleatrio na soluo). Isso
leva a uma perda de informao estrutural se o
compararmos com a cristalografia. A tcnica de SAXS,
na verdade, usada para determinao de estruturas em
microescala e nanoescala em termos do tamanho mdio
de partculas, formas mdias, distribuies e razes
rea/volume. O material pode se encontrar tanto no
estado slido quanto no lquido, alm de poder
apresentar domnios slidos, lquidos ou gasosos. O
mtodo tem acurcia, no destrutivo e geralmente
requer uma preparao mnima da amostra. As
aplicaes incluem materiais de diversos tipos, tais
como metais, cimento, leo, plsticos, polmeros,
protenas e at comidas e farmacuticos, tanto em
pesquisa como em controle de qualidade. A fonte de
raios-X pode ser obtida em um laboratrio ou em um
sncrotron.
INSTRUMENTAO

A instrumentao bsica de um instrumento de SAXS

composta por uma fonte de raios-x, colimador, porta
amostra, beam stop e dois detectores, sendo um de
referncia. A partir de um instrumento de SAXS, um
feixe de raios-x monocromtico direcionado para uma
amostra, onde uma parte espalhada, enquanto a maior
parte passa pela amostra sem interagir. Portanto, para
no danificar o detector com essa grande intensidade de
luz que no interage com a amostra, necessrio um
beam stop que impede essa luz de alcanar o detector. A
parte do feixe espalhada forma um padro de

espalhamento que detectado por um detector que pode

ser uma cmera CCD. O feixe que atinge o detector de
referncia obtido atravs da reflexo do feixe por um
filme, tal como esquematizado na figura 1. Sua funo
monitorar a absoro do feixe pela amostra e a
estabilidade do feixe.

Figura 1: instrumentao bsica de um equipamento de SAXS

O padro de espalhamento contm a informao

estrutural da amostra. O maior problema que deve ser
perpassado na parte tcnica de SAXS a separao da
intensidade fraca de espalhamento da intensidade muito
mais forte do feixe que passa pela amostra sem
interagir. Quanto menor o ngulo desejado, mais difcil
fica essa separao. Esse problema pode ser comparado
com o encontrado quando se tenta observar um objeto
que irradia e se encontra perto do sol. Ou seja, esse
feixe muito intenso deve ser bloqueado. A grande
maioria das fontes de raios-X produzem feixes
divergentes e isso intensifica ainda mais o problema.
Em princpio, o problema pode ser contornado focandose o feixe atravs de espelhos, mas isso no uma
tarefa fcil.

PRINCPIOS DO ESPALHAMENTO DE RAIOS-X

Espalhamento de raios-X por eltrons livres

O uso dos raios-X na caracterizao estrutural de

materiais depende essencialmente de sua interao com
a matria atravs dos eltrons que constituem seus
tomos e molculas, j que eles so sensveis aos
campos eltrico e magntico. Se a radiao incidente
monocromtica, os campos eltrico e magntico podem
ser representados por uma funo peridica do tipo

r r
E = E0 cos 2t
r r
H = H 0 cos 2t

(1)

r
r
E0 e E so, respectivamente, o campo eltrico

r
r
incidente e o espalhado, e H 0 e H so,
respectivamente, o campo magntico incidente e o
espalhado, e a freqncia da radiao.

onde o ngulo entre a direo do feixe espalhado e a

direo do campo eltrico da onda incidente, o a
constante dieltrica do vcuo, R a distncia entre o
eltron e o ponto de observao, c a velocidade da luz,
e m e e so respectivamente, a massa e carga do

A direo da propagao dos raios-X pode ser dada pelo

eltron. A expresso

onde

r
r r
P = (c / 4 ) E H . Vamos

vetor de Poynting:
considerar um eltron situado na origem de um sistema
de coordenadas xyz (figura 2), sobre o qual incide um
feixe paralelo, polarizado e monocromtico de raios-x.
O eltron sob a ao do campo eltrico

r
E0 da onda

incidente sofre a ao de uma fora dada por:

r
r
F = eE0 cos 2t

e2
tem a dimenso de
4 0c 2 m

comprimento e, de acordo com o eletromagnetismo

clssico, denominada comprimento de espalhamento
ou raio do eltron (2,82.10-15 m). Para simplificar a
notao, a amplitude da onda espalhada por um eltron
livre ser designada apenas por Ae

Ae =

(2)

e2
4 0c 2 m (6)

Para o caso do feixe incidente no polarizado, vamos

considerar o campo eltrico do feixe incidente
composto por duas componentes perpendiculares. Na
figura 3 temos um feixe no polarizado, propagando-se
na direo Ox e incidindo sobre um eltron situado em
O. Para determinar a natureza do campo eltrico
espalhado na direo OP, o campo eltrico incidente
pode ser decomposto em duas componentes
perpendiculares, uma paralela ao plano OXP, E//, e outra
perpendicular, E.

Figura 2: viso esquemtica do espalhamento de raios-X por

eltrons livres. Um eltron est localizado na origem O na
qual um feixe monocromtico, paralelo e polarizado de raiosX incidente.

Sob a ao dessa fora o eltron acelerado:

r
r
r F eE0
a= =
cos 2t
m
m

Figura 3: viso esquemtica do espalhamento de raios-X por

um eltron sobre a ao de um feixe no polarizado.

(3)

Em decorrncia dessa acelerao o eltron torna-se uma

fonte esfrica de ondas eletromagnticas de mesma
freqncia que a radiao incidente (espalhamento
elstico). O espalhamento produzido pelo eltron foi
analisado por J. J. Thomson, o qual determinou que o
campo eltrico produzido dado por:

E=

ea sin
4R 0 c 2 (4)

Sob a ao desses dois campos o eltron adquire uma

acelerao com componentes perpendicular e paralela,
dadas respectivamente por a=eE/m e a//=eE///m.
Substituindo estas expresses na equao 5, obtemos o
campo eltrico da onda espalhada:

E ' =
E// ' =

Substituindo a equao (3) na (4), temos:

e 2 E0
sin
E=
cos 2wt
m
4R 0c 2

(5)

e 2 E
AE
= e
2
4 0 Rc m
R

e 2 E// cos 2 Ae E// cos 2

=
4 0 Rc 2 m
R

(7)

A intensidade Io do feixe incidente pode tambm ser

decomposta em uma componente perpendicular e outra
paralela proporcionais a respectivamente E2 e E//2 .

E// = E

Figura 4: Viso esquemtica do espalhamento de raios-X por

um par de eltrons. (A). Um eltron est localizado na origem

I0
2

A intensidade total espalhada no ponto P ser dada por:

I ( 2 ) = [ E // ' 2 + E ' 2 ]

vetores B1 ,

(1 + cos 2 2 )
I e2

I (2 ) = 02
2
R 4 0 c 2 m

(1 + cos 2 2 )
I
I (2 ) = 02 ( Ae ) 2
2
R

(1 + cos 2 2 )
2

2l

Para introduzir o conceito de interferncia,

consideremos em uma partcula, dois eltrons espaados
por uma distncia r, imersos em um feixe de raios-X
paralelo e monocromtico, como ilustrado na figura
(4A). As ondas espalhadas sero coerentes
(espalhamento incoerente tambm pode ocorrer, mas
este desprezvel para baixos ngulos).

(11)

Como a diferena de caminho ptico dada por

l = AB + BC , a diferena de fase :

2 (AB + BC )

(10)

Espalhamento de raios-X por um par de eltrons,

interferncia

(B)

Como existe uma diferena de caminho ptico entre os

dois feixes, haver obrigatoriamente uma diferena de
fase entre eles dada por:

Pode-se ver pelas equaes (6) e (9) que praticamente

apenas os eltrons contribuem efetivamente para a
intensidade espalhada, pois esta varia inversamente com
o quadrado da massa da partcula e a massa do prton
cerca de 1837 vezes maior do que a massa do eltron. O
termo (1 + cos2 2)/2 chamado de fator de polarizao
e indica que, quando o feixe incidente no polarizado,
a onda espalhada parcialmente polarizada. Em
experimentos de SAXS, o ngulo mximo de
espalhamento fica em torno de 5 graus. Logo, (1 + cos2
2)/2 praticamente 1.

(A)

r
r
B0 , e q .

(9)

Levando-se em conta ainda que Io e R podem ser

considerados constantes durante a medida, a intensidade
espalhada pelo eltron dada por:

I e ( R,2 ) = Ae2

e o outro a uma distncia r . Existe uma diferena (AB + BC)

no caminho ptico entre os dois feixes espalhados, causando
uma diferena de fase. (B). Relao geomtrica entre os

(12)

As direes dos feixes, incidente e espalhado so dadas

pelos versores

r r
B0 e B1 .

r r
AB = r B0
r r
BC = r B1

(13)

E a diferena de fase pode ser reescrita:

=
Onde:

Ento:

r r r
2r ( B1 B0 )

(14)

r r
r 2 ( B1 B0 )
q=

(15)

r r
= r q = rq cos 2

(16)

r r
Onde 2 o ngulo entre r e s . Assim, somente o
r r
produto dos componentes r q relevante para .

Na prtica, devido ao enorme nmero de eltrons em

uma macromolcula, conveniente introduzir o
r
conceito de densidade eletrnica (r ) . Reescrevendo a
amplitude de espalhamento em termos de

r
(r ) :

r
r
A( q ) = Ae ( r )e i

(17)

Substituindo a equao (16) na (17):

r
r rr
A( q ) = Ae ( r )e ir q dV

(18)

A Figura (4B) mostra as relaes geomtricas existentes

entre os vetores

r
2B1

r
2B0

, e q . Pode ser visto

r
facilmente que q perpendicular a bissetriz do ngulo
r
r
2B1
2B0
entre

, e que seu mdulo :

4 sin

(19)

De acordo com as propriedades de Fourier, a

r
transformada inversa de A(q ) (equao 18) permite o
clculo da

r
(r ) ,

o qual uma quantidade real e

positiva. Contudo, para obter a (r ) , a fase e o mdulo

r
r
A(q ) = A(q ) ei

r
A(q ) so requeridos:

(21)

A intensidade de espalhamento, a qual medida

experimentalmente, dada pela multiplicao entre a
amplitude de espalhamento e seu conjugado.

Lei da Reciprocidade

Qualquer processo de espalhamento caracterizado por

uma lei de reciprocidade, a qual fornece uma relao
inversa entre o tamanho da partcula e o ngulo de
espalhamento. Considere duas esferas com densidade
eletrnica
, raios R1 e R2 e sob a ao do mesmo
feixe de raios-x. O diferencial dI a intensidade
espalhada para um elemento de volume dV para dois
diferentes pontos da esfera. Assim, existe uma diferena
de caminho ptico nas das esferas. Se 2 zero, ento q
e so nulos para todos os elementos de volume. A
mesma diferena de caminho igual a , por exemplo,
ocorre a mais altos ngulos para a esfera menor. As
curvas de espalhamento para as duas esferas claramente
revelam a reciprocidade existente entre os espaos real
e o de espalhamento, tambm chamado de espao
recproco. Uma conseqncia para a relao de
reciprocidade entre os espaos real e recproco que
quanto maior for a partcula, maior ser a concentrao
do seu espalhamento em baixos ngulos.

Figura 5: Lei da reciprocidade entre os espaos real e

recproco. Duas esferas com densidade eletrnica constante
e raios R1 e R2 sofrendo a ao do mesmo feixe de raiosx.

r
r 2
r 2
r 2
I ( q ) ( A( q ) ) = A( q ) e i e i = A( q )

(22)

r
Experimentalmente somente o mdulo de I ( q ) pode
ser determinado, sendo a sua fase perdida. Este
denominado Problema da Fase. Desta forma, no
r
podemos determinar I (q ) .

Espalhamento de raios-X por um tomo

A equao 18 pode ser calculada para os tomos de

todos os elementos sempre que se conhea a funo
r
r
(r ) . Para q = 0, a integral da equao 18 resulta no
nmero total de eltrons dos diversos tomos neutros,
r
isto , o seu nmero atmico Z. Conforme q cresce, as
diferenas de fase levam a uma diminuio progressiva
r
do valor de A(q ) . Curvas deste tipo so mostradas
para o carbono e o oxignio na figura 6.

Figura 6: Representao esquemtica para a amplitude de

espalhamento do carbono (linha azul) e do oxignio (linha
vermelha)

A intensidade de espalhamento I (q ) pode ser medida

quantitativamente, e proporcional ao quadrado da
amplitude de espalhamento A(s):

r
r
r
I (q ) A(q ) A(q )*

r
r
A(q )* o complexo conjugado de A(q ) .

do vetor de espalhamento

q=

O problema da fase

onde

(20)

Por definio, o fator de espalhamento atmico a

razo entre a amplitude espalhada pelo tomo e a
amplitude espalhada por um eltron.

r
r
A(q ) tomo
f (q ) =
Ae

(23)

todo o objeto espalhador e cujo valor a mdia dos

r r
produtos das densidades eletrnicas nos pontos r1 e r2 .
2o passo: Consiste na integrao no espao

r
C(r) para obter I (q ) :

Espalhamento de raios-X para um grupo de n

tomos

Uma vez obtidos os fatores de espalhamento atmicos,

a equao 18 pode ser reescrita levando-se em conta o
r
vetor posio r j de cada tomo e somando-se sobre
todos n tomos, com fator de espalhamento fj:
n

r
A(q ) = f j e

r r
iq r j

j =1

(24)

A intensidade de espalhamento pode ser obtida se as

coordenadas atmicas dos tomos so conhecidas. Para
r
n tomos com fatores de espalhamento f j ( q ) = f j e

coordenadas rj para cada centro de espalhamento, a

funo Intensidade dada por:
n n
r r
r
iq r
I (q ) = f j f k e jk
j =1 k =1

(25)

r
I (q ) =

r
(r ) .

Patterson props o clculo da transformada de

Fourier tomando como coeficientes as intensidades dos
feixes espalhados, obtidos pelo produto de
r
A(q ) (equao 18) e seu complexo conjugado:
r r r
r
r
r
I (q ) = dV1dV2 (r1 ) (r2 )e iq ( r1 r2 )

(26)

Se considerarmos a partcula isolada (na prtica, um

sistema diludo), esta integral depende apenas dos pares
de distncias relativas entre os elementos de volume da
mesma e do produto das respectivas densidades
eletrnicas. Esta integral pode ser calculada em dois
passos:

1o passo: Matematicamente esta etapa

corresponde ao clculo da funo de auto-correlao
r r r
r
~(r ) , fazendo r = r2 r1 constantes.

~(r ) = (r1 ) (r2 )dV

(27)

Esta funo, conhecida como funo de Patterson ou

funo de distribuio de pares, definida num novo
espao C(r) (espao de correlao) no qual cada
r r
r
r corresponde a uma distncia (r2 r1 ) tomada sobre

(28)

Para um sistema concentrado de macromolculas em

soluo, a intensidade de espalhamento dada por

r
r
r
r
I * (q ) = I (q ).S (q ) , onde I (q ) chamado fator de

forma (equao 26) e est relacionada com as distncias

intrapartculas, ou seja, correlaes de distncias
r
internas
das
macromolculas,
enquanto S (q )
chamado fator de estrutura, e est associado com
correlaes entre as partculas. Para sistemas diludos,
r
os quais sero abordados aqui, S ( q ) se aproxima de 1,
e somente o fator de forma contribui para o
espalhamento.
Podemos concluir que a distribuio das intensidades
espalhadas no espao recproco funo da distribuio
de densidade eletrnica da partcula atravs da sua
funo de autocorrelao e que esta ltima pode ser
obtida diretamente das intensidades espalhadas pelo
clculo da transformada inversa de Fourier da equao
28:

Transformada inversa da funo Intensidade

Devido ao Problema da Fase, no possvel inverter

r
diretamente A(q ) para obter a densidade eletrnica

~ 2 ( rr )e i qr rr

dV

~ 2 ( r ) = ( 21 ) 3 I ( q ) dV *e iqr

rr

(29)

onde dV o elemento de volume no espao recproco.

Uma propriedade importante da funo de
autocorrelao a existncia de um centro de inverso
r
r
nessa funo, pois o produto ( r1 ) ( r2 ) igual

a (r2 ) (r1 ) , resultando no mesmo valor para a

funo tanto para r quanto para r, independentemente
do fato da partcula espalhadora possuir ou no um
centro de inverso. Devemos ainda notar a relao de
reciprocidade existente entre as equaes 28 e 29, pois
r
os seus valores dependem apenas do produto q r .

Assim conforme r cresce, forosamente

r
q diminui.

Espalhamento para sistemas diludos

Para anlise das curvas de SAXS, adotaremos algumas

restries simplificadoras:
(a) O sistema estatisticamente isotrpico devido
esfericidade da partcula, ou distribuio especial das
partculas ou ainda devido ao movimento randmico
das partculas no meio.
(b) No h interao de longa distncia entre as
partculas, isto , o sistema suficientemente diludo.

De acordo com a restrio (a),

~ 2 (r )

centro-

r
simtrica, dependendo somente do mdulo de r .
rr
iq r
pelo
Assim podemos substituir o fator de fase e
r
valor mdio em torno de r . A equao chamada de

frmula de Debye.

r r
iq r

~ 2 (r ) ,

com (0) = e 0 para valores

grandes de rs. Adicionando (r) e os limites de
integrao de 0 a na equao 32 e mudando o
parmetro de integrao para dr, a intensidade passa a
ser dada por:

sin qr
=
qr

Assim podemos reescrever as equaes 25 e 29:

n

I (q) = f i f j
i =1 j =1

As flutuaes de densidade eletrnica, tomadas em

relao ao meio que contm os espalhadores, podem ser
negativas ou positivas. Assim a presena de poros em
um material leva a uma flutuao negativa. Entretanto
a funo caracterstica (r) ser sempre positiva, uma
vez que, de acordo com a equao 33, ela dada por

sin qrij
qrij

I (q) = V 4r 2 dr (r )

(31)

sin qr
I (q) = dV~ 2 (r )
qr

(32)

Desta forma, o intervalo para medida usual de

espalhamento aproximadamente de 0 a 2,5o.
A conseqncia da segunda restrio que para grandes
valores de r , as densidades eletrnicas ficam
independentes e podem ser substitudas pelo seu valor
. A funo de autocorrelao deve tender

para um valor constante V

, enquanto que na

~ (0) toma o valor mximo V . Assim, no

origem
espao C(r) haver informao estrutural relevante
2

apenas na regio em que

for significativamente

diferente do valor constante final. Por essa razo a

funo de autocorrelao redefinida como

expressando

de

fato

apenas

as

flutuaes de densidade eletrnica responsveis pelo

fenmeno de espalhamento:

~ 2 (r ) = ( (r ) ) 2 = V (r )

(33)

Com a conveniente mudana de notao, a funo de

correlao ( r ) introduzida, a qual est associada
com a mdia da flutuao de densidade eletrnica entre
dois eltrons separados pela distncia r, onde r = r1 r2
.

(r ) = (r1 ) (r2 )

(35)

I (0) = V 4r 2 dr (r )
0

(34)

(36)

(r) encontrado atravs da transformada inversa de

Fourier da equao 35:

Devido sin(q.r) ser uma funo peridica, o

denominador q.r chamado de fator de amortecimento,
pois
possui mximos progressivamente menores.

sin qr
qr

Para q = 0

Ainda, a expresso da reciprocidade entre r e q

aparente na frmula de Debye. Se o produto q.r
mantido constante, um acrscimo em r causa um
decrscimo em q .

mdio

V (r ) =

q dqI (q)
2

sin qr
qr

(37)

Para r = 0

V (0) =

2 2 0

q 2 dqI (q) = V 2
(38)

O valor de I (0) dado pela equao 36

experimentalmente impossvel de medir por coincidir
com a direo do feixe incidente. Entretanto ele pode
ser obtido por extrapolao da curva I(s) e permite
obter, ao menos aproximadamente, o nmero total de
eltrons existente na partcula.
Por sua vez, a equao 38 nos diz que o valor da
integral da intensidade no espao recproco constante.
Mesmo que uma dada partcula apresente alteraes em
sua forma, se ela se conservar ntegra, o valor da
integral ser constante e igual a V , apesar das
eventuais alteraes que ocorram no padro de difrao
ou espalhamento. Esta constante chamada
Invariante, e dada por:
2

Q = q 2 dqI (q )
0

(40)

A condio de restrio para sistemas isotrpicos nos

levaram a considerar valores mdios dando, como
conseqncia, um carter escalar a distribuio da
funo de autocorrelao no espao C(r).

Redefinio da funo de correlao

Devido ao quadrado da diferena de densidade

eletrnica ser constante e sempre positiva para protenas
(a densidade das protenas so sempre maiores que a do
solvente), conveniente separar ( r ) , definida na
equao 33, na forma

( r ) = (
Onde

0 (r )

)2 0 ( r )

(41)

uma nova funo de correlao,

dependente somente da geometria da partcula, com

0 (0) = 1 e 0 (r Dmax ) = 0 (onde Dmax a
mxima distncia intra-partcula).

0 (r )

chamada

funo caracterstica e tem significado mais intuitivo.

Assim, conveniente reescrever as equaes 35, 36, 37,
38 e 39:
D

I (q) = V ( ) 4r 2 dr 0 (r )
2

sin qr
qr

I (0) = V ( ) 4r 2 dr 0 (r ) ( ) V 2
2

V 0 (r )( ) =

1
2

V 0 (0)( ) =
2

(41)

q dqI (q)
2

sin qr
qr

(42)

(43)

q dqI (q)
2

Q = q 2 dqI (q ) = V 2 2 ( )

(44)

(45)

Sistema isotrpico, diludo e monodisperso

Vamos assumir que o sistema de interesse uma

soluo diluda de partculas idnticas (monodisperso)
com densidade eletrnica constante , embebidas em
um meio com densidade constante 0 (solvente). Assim,
somente = ( p0 ) relevante para o
espalhamento. A condio de sistema diludo garante
que cada partcula contribua independente para a
intensidade de espalhamento. Como todas as partculas
so idnticas, somente uma nica partcula precisa ser
considerada.
Uma anlise mais completa para a determinao da
geometria da partcula pode tambm ser feita atravs do
clculo da funo de distribuio de distncias p(r),
onde p ( r ) = 4r
ser reescrita como:

I (q) = V ( )

0 ( r ) . Assim, a equao 41 pode

p(r )dr
0

sin qr
qr

(46)

A p(r) pode ser obtida a partir da transformada inversa

da transformada de Fourier de I(q). A funo p(r)
possui valor igual a 0 na mxima dimenso da partcula,
Dmax. importante lembrarmos que deveramos assumir
condies restritivas, tais como um sistema
monodisperso de partculas suficientemente diludas em
soluo para evitarmos os efeitos inter-partculas.
tambm importante ter um bom contraste de densidade
eletrnica entre as partculas e o solvente.
A p(r) contm a mesma informao da intensidade de
espalhamento I(q), mas a representao da p(r) no
espao real mais intuitiva. Alm disso, a forma da
partcula em soluo pode ser deduzida visualmente da
p(r). A figura 7 apresenta padres de espalhamento e a
p(r) caractersticos de objetos geomtricos com mesmo
Dmx. Partculas globulares possuem p(r) na forma de
uma funo gaussiana centro-simtrica com um
mximo em Dmax/2. Partculas alongadas possuem uma
p(r) com mximo
em menores distncias
correspondendo ao raio da seco de corte Rc. Partculas
achatadas mostram um mximo mais alargado, tambm
deslocando o mximo para distncias menores que
Dmax/2. p(r) com um mximo deslocado para distncias
maiores que Dmax/2 indicativo de cascas esfricas.
Partculas consistindo de bem separadas subunidades
apresentam dois mximos, o primeiro correspondendo
s
distncias
intra-subunidades
e
o
outro
correspondendo separao entre as subunidades.
Partculas muito anisotrpicas possuem padro de
espalhamento com um decaimento bem menor que o de
partculas globulares.

Figura 7: Intensidades de espalhamento e funo de

distribuio de distncias para diferentes objetos geomtricos

ANLISES DAS CURVAS DE SAXS

Para a anlise de uma curva de SAXS, conveniente

distinguir trs regies na curva de espalhamento.
Atravs da regio dos ngulos prximos de zero, podese determinar o raio de girao, Rg, da molcula.
Atravs da regio central, a razo I(0)/Q pode fornecer
informao relativa ao volume da molcula. J a regio
de mais alto ngulo fornece a relao superfcie/volume
da molcula.

Regio dos menores qs

na curva de SAXS,
determinao do raio de girao

Assumindo o caso ideal, de partculas esfricas no

interagentes em soluo, A. Guinier mostrou que para
q 0 , a curva de Intensidade pode ser descrita
como uma funo exponencial:
q Rg
3

(47)

Onde Rg o raio de girao correspondente a distncia

mdia quadrtica dos eltrons da partcula at o seu
centro de gravidade, analogamente ao raio de girao da
mecnica clssica. Para um sistema monodisperso, o
grfico de Guinier, ln I ( q ) q 2 , uma linha reta cuja
inclinao proporcional ao Rg. Contudo devemos ter
em mente que a aproximao de Guinier vlida
somente para os ngulos prximos de 0, respeitando a
equao q < 1,3/ Rg. tambm possvel obter Rg como
o segundo momento normalizado da funo de
distribuio de distncias p(r) da partcula. O valor de
Rg calculado a partir da p(r), pode ser comparado com
Rg obtido pelo mtodo de Guinier.

Regio central da curva de SAXS, determinao do

volume

Ao dividirmos a equao 42 pela 45, temos um termo

relativo a intensidade presente tanto no numerador
quanto no denominador da equao, todas as
caractersticas associadas a estas intensidades so
canceladas, permitindo que o clculo do volume seja
realizado em unidades arbitrrias:

I (0)
V
=
2 2
Q

I (q) ( ) V
2

8
2 2
= ( ) 4 S
4
q
q

(49)

O valor assinttico de I(q) x q esperado ser

proporcional a superfcie total da partcula:

S
= lim q q 4 I (q)
V Q

(50)

Os dados a altos ngulos so assumidos seguir um

comportamento linear em q 4 I (q) contra q . Se
houver heterogeneidades na densidade eletrnica da
partcula espalhadora, uma inclinao na regio linear
de q 4 I (q ) Bq 4 I (q ) + A verificada. Subtraindo a
constante de Porod, B, de I (q), o espalhamento
correspondente ser caracterstico de um corpo
homogneo.

CONCLUSES

Em se tratando de protenas, a tcnica de SAXS permite

que se obtenha alguns de seus parmetros estruturais
com relativa facilidade. Isto especialmente verdade
quando esta tcnica comparada com a de cristalografia
de protenas ou de NMR. claro que SAXS no
utilizado apenas para o estudo de protenas, mas
tambm pode ser usado para o estudo de colides de
todos os tipos, metais, cimentos, polmeros, dentre
outros. Por outro lado, as informaes estruturais
obtidas por SAXS no so to acuradas quanto aquelas
obtidas por cristalografia ou NMR. Ou seja, no
possvel a determinao da posio de todos os tomos
da molcula, mas sim de seu raio de girao, volume e
relao rea superficial/volume.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

(48)

importante frisar que para o clculo do volume, os

dados devem ser corretamente extrapolados a
I (0) utilizando a aproximao de Guinier.

A anlise da regio de mais alto ngulo de SAXS

contm informaes acerca dos aspectos finos da
partcula. Porod mostrou que se a partcula possui
densidade eletrnica uniforme (corpo homogneo) e
interface bem definida com a densidade eletrnica do
solvente, o comportamento assinttico no final da curva
de espalhamento inversamente proporcional a quarta
potncia de q:

I (q) = I (0)e

Regio de mais alto ngulo da curva de SAXS,

determinao da razo superfcie/volume

Craievich, A Small-Angle X-ray Scattering by

Nanostructured Materials. Handbook of Sol-Gel
Science and Technology (livro), p. 161-189,
2005.
Feigin, L. A.; Svergun, D. I. Structure Analysis
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Patterson, A. L. A direct method for the
determination of the components of interatomic
distances in crystals. Z. Kristallogr., v. 90, p.
517-542, 1935.

Espectroscopia de Fotoeltron
Jaqueline Yu Ting Wang
INTRODUO

A espectroscopia de fotoeltron envolve a ionizao de

tomos ou molculas bombardeando-as com ftons
monocromticos. Os eltrons ejetados da ionizao so
chamados de fotoeltrons.

1
h t = I + mev 2
2

(3)

Einstein desenvolveu a teoria do efeito fotoeltrico em

1906, mas a espectroscopia de fotoeltron, at onde se
sabe, s foi desenvolvida em meados de 1960, por
Siegbahn, Turner e Price.
Para um tomo ou molcula na fase gasosa, a figura 2
divide esquematicamente os orbitais (orbital atmico,
OA ou orbital molecular, OM) em orbital central e
orbital de valncia.
Cada orbital tomado como sendo no degenerado e
pode acomodar 2 eltrons com spins antiparalelos. A
energia orbital, sempre negativa, medida com relao
ao zero de energia, que correspondente remoo de
um eltron desse orbital no infinito. Os eltrons de
valncia tm energia orbital maior que os eltrons
centrais.

Figura 1: Variao da energia cintica dos fotoeltrons com

freqncia, , da radiao incidente.

O efeito foi observado originalmente em superfcies de

metais facilmente ionizveis, como os metais alcalinos.
O bombardeamento da superfcie com ftons na
freqncia de tunelamento no produz fotoeltrons at
que o limiar da freqncia seja atingido (ver figura 1).

Para remover eltrons centrais, pode ser usada uma

fonte monocromtica de raios-X, e essa tcnica
chamada de espectroscopia de fotoeltron de raios-X,
ou XPS. A radiao ultravioleta tem energia somente
para remover eltrons de valncia, e essa radiao
usada em espectroscopia de fotoeltron de ultravioleta,
ou UPS.

Na freqncia, t, a energia do fton suficiente apenas

para vencer a funo trabalho do metal, ento

h t =

(1)

Em altas freqncias, o excesso de energia dos ftons

convertido em energia cintica dos fotoeltrons

1
h t = + me v 2
2

(2)

ondeme e v so a massa e a velocidade.

A funo trabalho de metais alcalinos valem poucos
eletronvolts, portanto a energia da radiao ultravioleta
suficiente para produzir ionizao.
A espectroscopia de fotoeltron uma simples extenso
do efeito fotoeltrico envolvendo o uso de ftons de alta
energia incidente e aplicados no estudo de superfcies
slidas e de amostras na fase gasosa.

Figura 2: Processos ocorrendo em a) Espectroscopia de

fotoeltrons de ultravioleta, b) Espectroscopia de fotoeltron
de raios-X.

As equaes 1 e 2 ainda podem ser aplicadas, mas, em

particular para medidas na fase gasosas, a funo
trabalho usualmente substituda pela energia de
ionizao ( ). Ento a equao 2 fica

As figuras 2 (a) e 2 (b) ilustram o processo envolvido

no UPS e XPS. Ambos resultam na ejeo de um
fotoeltron a partir de um tomo ou molcula
que
ionizado para produzir o

M + h = M + + e

(4)

DESENVOLVIMENTO

Mtodos experimentais

A figura 3 ilustra o arranjo geral dos componentes de

um espectrmetro de fotoeltron de raios-X ou de
ultravioleta (ver figura 8 para um desenho real). Quando
a amostra na cmara bombardeada com ftons,
fotoeltrons so ejetados em todas as direes. Alguns
passam pela fenda de sada e pelo analizador de energia
de eltron que separa os eltrons de acordo com sua
energia cintica, enquanto que os ons so separados em
um espectrmetro de massa. Os eltrons passam pela
fenda de sada do analisador para um detector de
eltron, o espectro memorizado e este consiste ento
no nmero de eltrons por unidade de tempo, como uma
funo tanto da energia de ionizao ou da energia
cintica dos fotoeltrons. O analisador e a cmara alvo
devem ser mantidos a baixas presses, cerca de 10 Torr.

Figura 3: Os principais componentes do espectrmetro de

fotoeltron.

Fontes de radiao ionizante monocromtica

Figura 4: Diagrama de Grotrian para o Hlio.

Tais fontes so produzidas em sua maioria pela

descarga em gases de He ou Ne resultando em emisso
de radiao ultravioleta do tomo ou do on positivo.
Entre estes, o mais usado a descarga de hlio, que
produz, na sua maioria, radiaes de 21,22 eV devido
transio 21P1(1s12p1)-11S0(1s2) do tomo em 58,4 nm
(figura 4); este efeito referido como sendo radiao
He I, ou simplesmente He I.
possvel mudar as condies na lmpada de descarga
de hlio de tal forma que o hlio seja ionizado
predominantemente em He+(He II). A radiao
principalmente devido transio n=2 - n=1 do He II
(anlogo ao primeiro membro da srie de Lyman do
tomo de hidrognio na figura 5) em 30,4 nm com a
energia de 40,81 eV. Um filtro fino de folha metlica de
alumnio pode ser usado para remover qualquer
radiao de He I .

Para UPS utilizada uma fonte que fornece entre 20 eV

e 50 eV, pois a menor energia de ionizao de um
tomo tipicamente da ordem de 10 eV e desejvel
detectar processos de ionizao de alta energia.

Figura 5: Nveis de energia (linhas verticais e as transies

observadas (linhas horizontais) do tomo de hidrognio,
incluindo as sries de Lyman, Balmer, Paschen, Brackett e
Pfund.

Quando o nenio usado em uma lmpada de descarga,

produzida predominantemente radiao com
comprimentos de onda prximos, 74,4 e 73,6 nm,

correspondente a energias de 16,67 eV e 16,85 eV, por

isso, essa fonte menos til que a fonte He I, que
mais monocromtica e mais energtica.
As fontes mais usadas de radiao de raios-X so o
MgK e o AlK, onde o K indica que o eltron foi
ejetado pelo decaimento de eltrons na superfcie do
Mg ou Al, da camada K (n=1) e a radiao devida
energia emitida quando um eltron sai da prxima
camada de maior energia, no caso, a camada L (n=2)
para preencher a vaga na camada de menor energia. A
radiao MgK consiste em sua maioria de um dubleto
1253,7 eV e 1253,4 eV, e a radiao AlK tambm
consiste principalmente de um dubleto, com energias de
1486,7 eV e 1486,3 eV. Alm do mais, existe um fundo
fraco e contnuo, conhecido como bremsstrahlung, e
tambm diversas linhas satlites acompanhando ambos
os dubletos. O bremsstrahlung e as linhas satlites
podem ser removidos usando um monocromador,
ilustrado na figura 6.
Um cristal de quartzo Q curvado para formar uma
grade cncava de difrao de raios-X. A fonte de raiosX e a cmara alvo T do espectrmetro de fotoeltron
so colocadas sobre o crculo de Rowland. Este um
crculo cujo dimetro igual ao raio da curvatura da
grade e tem a propriedade de fazer com que a radiao
de uma fonte sobre o crculo seja difratada pela grade e
focada novamente em outro ponto sobre a curva.

Figura 6: Um monocromador de raios-X usando um cristal de

quartzo curvado Q; T a cmara alvo.

Um monocromador no somente remove linhas

indesejveis de fontes de raios-X, mas tambm estreitas
linhas amplificadas de outra maneira. Esta reduo da
largura da linha muito importante porque em um
espectro XPS, diferentemente do UPS, a resoluo
limitada pela largura da linha da radiao de ionizao.
Infelizmente, at depois do estreitamento da linha, para,
por exemplo, 0,2 eV (1600
), a largura da linha
ainda grande se comparada com a fonte ultravioleta de
hlio ou nenio. Por conta disso, apesar dos eltrons de
valncia e os eltrons centrais serem removidos pela
radiao de raio-X, uma resoluo ainda maior
alcanada quando as camadas de valncia so
analisadas pelo UPS.

Uma importante fonte tanto de radiao ultravioleta e

de raios-X o anel de armazenamento da fonte de
radiao sncroton (FRS). O ilustrado na figura 7 de
Daresbury (Inglaterra). Um raio de eltrons gerado em
um acelerador linear. Pulsos desses eltrons so
injetados tangencialmente no sncroton, onde so
acelerados por radiaes de 500 MHz, mas que tambm
causa a formao de bandas com intervalos de 2 ns
entre as bandas.
O eltron est restrito a uma rbita circular por dipolos
magnticos curvados. Quando os eltrons atingem uma
energia de 600 MeV eles so atirados tangencialmente e
entram no anel de armazenamento onde eles so
posteriormente acelerados at 2 GeV. Aps isso,
somente uma pequena quantidade de fora necessria
para manter os eltrons circulando.
Os eltrons que esto orbitando perdem energia
continuamente na forma de radiao eletromagntica,
que uma onda plana polarizada e emerge de forma
tangencial em pulsos de comprimento de 0,17 ns e
espaados de 2,0 ns.
Diversos pontos de radiao so arranjados ao redor do
anel e servem de estaes experimentais.

Figura 7: O anel de armazenamento de Daresbury

(Inglaterra).

A radiao contnua desde a regio do infravermelho

at dos raios-X, mas o ganho de intensidade, comparado
com as fontes mais convencionais, maior no
ultravioleta, particularmente na regio dos raios-X,
onde o ganho de um fator de 105 a 106.
Um monocromador deve ser usado para selecionar uma
banda estreita de comprimentos de onda.

Analisador de velocidade dos eltrons

Medidas da energia cintica dos fotoeltrons (equao

3) envolvem medidas de suas velocidades. Isto tem sido

obtido por vrios tipos de analisadores e a figura 8

mostra quatro deles.
Na grade analisadora com fendas, mostrada na figura 8
(a), os fotoeltrons so gerados ao longo dos eixos do
coletor de eltrons cilndrico.
Um potencial retardado, aplicado na grade cilndrica
retardadora, suavemente modificado e, quando isso
corresponde energia de alguns fotoeltrons
transmitidos, ocorre um decrscimo na corrente, I, de
eltrons detectada. Esta corrente apresenta uma srie de
degraus quando plotada contra um potencial retardado
V, cada degrau corresponde a uma energia de ionizao
da amostra.

chamados de chapas de setor esfrico, comumente

usado em um espectrofotmetro que opera tanto em
UPS quanto em XPS.

Detectores de eltrons

O detector pode ser um simples eletrmetro quando for

usada uma grade analisadora esfrica ou cilndrica.
Com os outros tipos, menos eltrons esto sendo
coletados e um multiplicador de eltrons, com maior
sensibilidade, ser necessrio. Isso consiste de um
nmero de dnodos, no qual cada um produz mais
eltrons do que recebe. Para uma corrente mensurvel,
so necessrios de 10 a 20 dnodos. Alternativamente,
um multiplicador de eltrons com vrios canais no
plano focal do analisador pode ser usado para capturar
simultaneamente eltrons com uma gama de energias
diferentes.

Resoluo

Figura 8: (a) grade de fendas, (b) grade esfrica, (c)

analisador cilndrico de 127 e (d) hemisfrico.

Fazendo um plot de dI=dV versus V aps usar um

circuito diferenciador, possvel converter os degraus
em picos no espectro do fotoeltron. O propsito da
grade fendada restringir os fotoeltrons que viajam
diretamente grade retardadora daqueles que so
emitidos perpendicularmente ao eixo do cilindro.
A fenda analisadora esfrica, mostrada na figura 8 (b),
tem a vantagem de coletar todos os fotoeltrons gerados
no centro, em qualquer direo em que eles estejam
viajando. Existem duas grades esfricas retardadoras
neste desenho.
Os analisadores mostrados na figura 8 (a) e 8 (b) so
usados principalmente para amostras gasosas. Os da
figura 8 (c) e 8 (d) podem ser usados para amostras
slidas tambm. No analisador cilndrico de 127
mostrado na figura 8 (c), alguns dos fotoeltrons
gerados entram na fenda e atravessam o caminho entre
duas chapas cujas sees cilndricas concntricas so de
127,28. Um campo eletrosttico varivel aplicado
atravs das chapas e os eltrons emergem da fenda de
sada somente se o campo tal que segue o caminho
circular mostrado. Os eltrons emergentes so contados
enquanto o campo varia suavemente. O analisador
semi-esfrico mostrado na figura 8 (d) trabalha com um
princpio similar, mas tem a vantagem de coletar mais
fotoeltrons. Um analisador consistido de duas chapas
concntricas que so parte de semi-esferas, tambm

Como j mencionado, a resoluo em XPS

freqentemente limitada pela largura da linha da
radiao ionizante. Em UPS a resoluo obtida depende
de fatos como a eficincia da proteo do
espectrofotmetro pelo espalhamento dos campos
magnticos (inclusive o da Terra) e da limpeza das
superfcies do analisador. A resoluo decresce quando
a energia cintica dos fotoeltrons est abaixo de 5 eV.
A mais alta resoluo obtida em UPS cerca de 4 meV
(32 cm-1), que significa que a tcnica tem baixa
resoluo se comparada com os mtodos de
espectroscopia discutidos anteriormente. Por esta razo
estruturas finas rotacionais acompanhando processos de
ionizao em UPS de gases so muito difceis de
observar. Apenas para algumas molculas de baixo
momento de inrcia, como H2 e H2O, isto tem sido
atingido.
A resoluo de 0,2 eV (1600 cm-1 ) da qual o XPS
tipicamente capaz muito baixa, na maioria dos casos,
at mesmo para estrutura grossa vibracional
acompanhada de ionizao ser observada.

ESPECTRO DO FOTOELTRON E SUA

INTERPRETAO

A mais simples, e provavelmente a mais importante

informao fornecida pelo espectro do fotoeltron so
as energias de ionizao dos eltrons centrais e os de
valncia. Antes do desenvolvimento da espectroscopia
de fotoeltron, pouco se sabia sobre isso, especialmente
para molculas poliatmicas. Para energias de ionizao
de eltrons centrais que eram inacessveis possvel
ilustrar a extenso para o qual os orbitais centrais
diferem de orbitais puramente atmicos imaginados na
teoria de valncia simples.

Espectro de fotoeltron de ultravioleta dos tomos

No caso de tomos UPS, improvvel produzir

informaes que no esto disponveis em outras fontes.
Alm do mais, muitos materiais tm to baixas presses
de vapor que seus espectros UPS poderiam ser gravados
apenas altas temperaturas. Os gases nobres, o
mercrio e os metais alcalinos so excees, mas
iremos considerar apenas o espectro do argnio.

com o crescimento do nmero atmico. Como ilustrado

na tabela de dados 1.

O espectro He I (21,22 eV) do argnio est ilustrado na

figura 9, os dois picos resultam da remoo do eltron
do orbital 3p no processo:

O estado que surge na configurao fundamental do Ar

S0. Porm, a configurao fundamental do Ar+ gera
dois estados,
e
, desde que
e
,
dando um termo

,e

. Esses dois estados

do Ar+ so separados pelo acoplamento spin-rbita.

Desde que o orbital 3p no preenchido esteja mais da
metade preenchido, o multipleto invertido, ento o
estado 2P3/2 fica abaixo do 2P1/2.
A separao de 0,178 eV dos dois picos na figura 9
reflete o acoplamento spin-rbita. O processo de
ionizao do Ar+(2P3/2)-Ar(1S0) aproximadamente
duas vezes mais intenso que o Ar+(2P1/2)-Ar(1S0). Isto
devido degenerescncia qudrupla do estado 2P3/2
comparada com a degenerescncia dupla do estado
2
P1/2.

Tabela 1: Menores energias de ionizao I de alguns gases

nobres.

Espectro de fotoeltrons de ultravioleta de molculas

a) Hidrognio

A configurao dos orbitais moleculares do H2

(g1s)2. O espectro UPS He I, na figura 10 causado
pela remoo de um eltron desse orbital molecular
para gerar o estado fundamental X2g+ do H2+.

Figura 10: O espectro de fotoeltron ultravioleta He I do

Uma caracterstica bvia do espectro que ele no

consiste de um nico pico correspondente ionizao,
mas sim a um sistema de faixa vibracional, muito
similar ao que deveramos observar numa transio em
uma molcula diatmica.

Figura 9: O espectro de fotoeltron de ultravioleta He I do

argnio.

O espectro de fotoeltron de ultravioleta He I do Kr e

do Xe parece semelhante ao Ar, mas a energia de
ionizao decresce e o acoplamento spin-rbita cresce

O princpio de Franck-Condon aplicvel ao processo

de ionizao, ento a ionizao mais provvel para um
estado vibracional do on, no qual a posio nuclear e
velocidade so as mesmas da molcula. Isso ilustrado
pelo processo H2+(X2g+)- H2+(X1g+) na figura 11, a
remoo de um eltron do g1s do orbital molecular
ligante resulta no aumento na distncia de equilbrio
internuclear no on e a transio mais provvel para
. A figura 10 mostra que h uma longa
que apenas alcana o

progresso vibracional
limite de dissociao para

H2+

em

Das separaes dos membros de progresso as

,
,
,... (equao 5)
constantes vibracionais
+
podem ser obtidas para H2 .

(5)
Comparaes do
H2+ com o

do estado X2g+ do
para o estado X1g+ do H2

mostra que a constante de fora vibracional (equao 6)

muito menor no estado fundamental do H2+ que no do
H2. Isso implica em uma ligao mais fraca em H2+
consistente com a remoo do eltron ligante.
(6)
As figuras 10 e 11 ilustram o ponto em que h dois
modos nos quais podemos definir a energia de
ionizao. Uma delas a energia de ionizao
adiabtica que definida como a energia da ionizao
. Essa quantidade pode ser sujeita a
de
uma incerteza aprecivel se a progresso for to longa
que seus primeiros membros so observados
fracamente, ou nem so observados.

b) Nitrognio

A configurao fundamental do orbital molecular do N2

dada pelo espectro UPS do He I mostrado na figura
12. De acordo com a ordem de orbitais moleculares
ocupados, a menor energia de ionizao (valor
adiabtico 15,58 eV) corresponde remoo do eltron
do orbital molecular mais externo,
. A segunda
(16,69 eV) e a terceira (18,76 eV) menores energias
correspondem remoo do
e
,
respectivamente.
No UPS do H2 podemos ver como a extenso da
progresso vibracional acompanhando a ionizao
consistente, pelo princpio de Franck-Condon, com a
remoo de um eltron de um orbital molecular
fortemente ligado.
Similarmente, a remoo de um orbital antiligado
fortemente poderia levar a um encurtamento da ligao
no on e uma longa progresso vibracional. Porm, a
remoo de um orbital molecular fracamente ligado ou
no ligado poderia resultar em pequenas mudanas no
comprimento de ligao e uma progresso muito curta
(figura 12).
Usando o princpio de Franck-Condon dessa maneira,
podemos ver que o sistema de bandas associado com a
segunda menor energia de ionizao, mostrando uma
longa progresso, consistente com a remoo de um
eltron de uma ligao de orbital molecular
.

Figura 12: Distribuio de intensidade de progresso

vibracional.
Figura 11: O princpio de Franck-Condon aplicado na
ionizao do H2 .

A segunda a energia de ionizao vertical, que a

energia correspondente intensidade mxima na
(esta pode estar entre faixas).
progresso
Alternativamente, a energia de ionizao vertical tem
sido definida como sendo aquela correspondente
transio do centro de gravidade do sistema de bandas,
que pode no ser fcil de determinar quando sistemas de
bandas se sobrepem.

As progresses associadas com a segunda e a terceira

menor energia de ionizao so curtas, indicando que a
ligao e a antiligao caracterstica dos orbitais
moleculares
e
, respectivamente, so no
pronunciados. Essas observaes so consistentes
tambm com o comprimento de ligao do N2+ em
vrios estados excitados conhecidos do espectro de
emisso eletrnica de alta resoluo.

estado fundamental
muito o ngulo.

do H2O+ no deveria afetar

Ambas as vibraes 1 , o stretching simtrico, e 2, o

dobrador de ngulos, mostram apenas progresses
curtas. O espectro de emisso de alta resoluo do
H2O+ mostra que o ngulo no estado
110,5,
uma mudana do estado fundamental maior do que o
esperado.

Figura 13: O espectro de fotoeltron ultravioleta He I do N2.

Na tabela 2 esses comprimentos de ligao so

comparados com o do estado fundamental do N2. Nos
estados X, A e B do N2+, tem um pequeno aumento, um
grande aumento e uma pequena diminuio,
respectivamen-te, se comparado com o estado X do N2.
H um fator de degenerescncia dupla associado ao
orbital p comparado a no degenerescncia de um
orbital s, ento se deve esperar que a intensidade
integrada do segundo sistema de bandas seja o dobro de
cada um dos outros dois. Porm, apesar do segundo
sistema de bandas ser o mais intenso, outros fatores
afetam essa intensidade relativa, por isso eles so
apenas um guia aproximado para o clculo de
degenerescncias orbitais.

Tabela 2: Comprimentos de ligao,

vrios estados eletrnicos.

de

Figura 14: O espectro de fotoeltron ultravioleta He I do

.

Remoo de um eltron do orbital molecular 3a1g da

H2O deveria levar a um grande aumento no ngulo no
estado
do H2O+, desde que esse orbital favorea
uma molcula linear, como mostrado na figura 15.

em

Orbitais moleculares do tipo SCF para o N2+ colocam o

estado
abaixo do estado
. Essa discrepncia
um exemplo do desdobramento do teorema de
Koopmans devido s deficincias nos clculos.

c) gua

A configurao fundamental do orbital molecular da

...
104,5.
E o ngulo HOH do estado fundamental
O espectro de fotoeltron de ultravioleta He I est
ilustrado na figura 14. A remoo de um eltron do
orbital
, o qual est demonstrado na figura 15, no
favorece qualquer ngulo em particular, para gerar o

Figura 15: Diagrama de orbital molecular de Walsh para

.
molcula

A observao de uma longa progresso na vibrao de

dobra, 2, mostrado na figura 14, consistente com o
aumento do ngulo para 180, por exemplo.
O terceiro sistema de bandas, envolvendo a remoo de
um eltron do orbital
, vibracionalmente
complexo, consistente com o orbital sendo fortemente
ligado e favorecendo uma molcula linear.

Provavelmente ambos 1 e 2 esto excitados, mas as

bandas nos sistemas so consideravelmente alargadas,
fazendo das anlises no confiveis.

d) Benzeno

A figura 16 mostra o espectro de fotoeltron de

ultravioleta He I do benzeno. Esse espectro gera
problemas de interpretao que so tpicos de molculas
grandes. Esses problemas esto relacionados
dificuldade de identificar o comeo de um sistema de
bandas quando h sobreposio com os sistemas
vizinhos e, geralmente, uma falta de estrutura
vibracional resolvida. O reconhecimento do incio do
sistema de bandas pode ser favorecido por clculos
confiveis dos orbitais moleculares, assim as anlises
do espectro de uma molcula grande freqentemente
resultado da teoria e do experimental.

A nica estrutura relativamente simples observada o

stimo sistema, no qual um eltron removido do
orbital 3a1g. H uma longa progresso no 1, o anel
ressonante a1g (figura 17) consistente com o eltron
vindo do orbital ligante CC.

Alm disso, estudos da dependncia do ngulo de

ejeo com a energia cintica dos fotoeltrons pode
ajudar na identificao de sistemas sobrepostos.

CONCLUSO

O espectro da figura 16, juntamente com um bom

clculo de orbital molecular, mostra que o sistema de
bandas com menor energia de ionizao devido
remoo de um eltron do orbital
. Porm, a

A partir desse trabalho, podemos concluir que a

espectroscopia de fotoeltron uma tcnica muito til e
eficiente em alguns termos para se obter o espectro de
amostras.

remoo de um eltron do orbital

d origem ao
terceiro, no ao segundo sistema de bandas. O segundo,
quarto, quinto,... sistemas de bandas so todos devido
remoo de eltrons de orbitais .
Esse exemplo ilustra os perigos de se considerar apenas
eltrons ocupando orbitais moleculares de alta
energia.

Figura 17: Anel ressonante do benzeno.

No caso da espectroscopia de fotoeltron de raios-X,

no muito confivel porque o espectro possui uma
resposta pouco precisa, o erro maior que a prpria
medida. Mas uma tcnica que possibilita obter o
espectro dos orbitais moleculares centrais dos tomos e
das molculas.
A espectroscopia de fotoeltron de ultravioleta produz
resultados confiveis e precisos. Aplicando essa tcnica
para se obter o espectro de fotoeltron de tomos, no
se obtm informaes que sejam inditas. Alm disso,
h um maior trabalho em se realizar essa tcnica ao
invs de qualquer outra que fornea as mesmas
informaes.

Figura 16: O espectro de fotoeltron ultravioleta He I do

Benzeno.

Estruturas vibracionais so, na melhor das hipteses,

somente parcialmente resolvidos. A estrutura no
primeiro e segundo sistemas de bandas complexa, o
que poderia ser devido, em parte, por existir um efeito
de Jahn-Teller em cada um deles. Tal efeito pode surgir
quando a molcula est em um estado E (ou T)
orbitalmente degenerado. O efeito de Jahn-Teller
envolve distoro da molcula como objetivo de
destruir a degenerescncia.

O uso dessa tcnica para se obter o espectro de

fotoeltron de molculas altamente recomendado pois
produz bons resultados, e estes tambm so confiveis.
Essa tcnica tambm produz informaes novas sobre a
molcula, informaes estas que no so encontradas
em outras tcnicas, ou se forem encontradas, no tm
uma resoluo to boa.

BIBLIOGRAFIA

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