PRACTICA N2: RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES

BOLON DE VERDE

Los objetivos y metodologas de cada prctica (fundamentos)

OBJETIVOS:

1. Aplicar el mtodo del nmero ms probable (NMP) para la determinacin de coliformes totales, fecales y E. Coli en el
bolon de verde.
2. Detectar si la muestra usada es apta para el consumo humano.
3. Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.
4. Determinar la presencia o ausencia de coliformes por formacin de gas CO2 en medios liquidos.
PROCEDIMIENTO
-

REACTIVOS
Butterfields buffered phosphate diluent:
Preparacin de la solucin stock:
Disolvemos 34g de KH2PO4 en 500 ml de agua destilada
Ajustamos el pH a 7,2 con aproximadamente 1,75 ml de NaOH 1M, y diluir a 1 L.
Mantenemos en refrigeracin.
Preparacin de diluyente:
Tomamos 1,25 ml de la solucin stock y llevarla a 1 L con agua destilada.
Preparamos 1 frasco con 90 ml de diluyente y 2 tubos con 9 ml de diluyente, segn la muestra que vaya a analizar.
Autoclavamos durante 15 minutos a 121 C para esterilizar.
Medios de cultivo
Caldo Lauryl sulfato triptosa
Caldo Verde brillante
Caldo E.coli

SIEMBRA
Preparacin de la muestra
Limpiamos la mesa de trabajo con alcohol y luego prender el mechero bunsen.
Limpiar el envase del producto con un algodn empapado en alcohol.
Proceder segn las indicaciones dadas en la norma INEN 1529-2:99 para control microbiolgico de los alimentos. Preparar
tres diluciones consecutivas 10-1 10-2 10-3
Preparacin de medios de cultivo
Distribuimos 10 ml de caldo lauryl sulfato triptosa en 10 tubos de cultivo, introducimos un tubo de cultivo durhan
invertido cerramos la tapa y esterilizamos
Distribuimos 10 ml de caldo verde brillante en 10 tubos de cultivo de capacidad de 15 ml, introduciimos un tubo de
cultivo durhan invertido, cerramos la tapa y esterilizamos
Distribuimos 10 ml de caldo E.coli en 6 tubos de cultivo de capacidad de 15 ml, introducimos un tubo de cultivo durhan
invertido, cerramos la tapa y esterilizamos
Prueba presuntiva:
Inoculamos 1 ml por dilucin a cada uno de los tres tubos con caldo lauryl sulfato triptosa.
Incubamos los tubos a 35C por 24-48 horas.

 Transcurrido el tiempo de incubacin, observamos la presencia de gas, en cualquier cantidad, en los tubos incubados o
presencia de enturbiamiento.

Prueba confirmatoria de coliformes totales:

Agitamos suavemente los tubos con produccin de gas y transferir tres asadas de cada tubo con gas a un tubo con caldo
lactosa bilis verde brillante (medio selectivo para bacterias GramIncubamos los tubos con caldo lactosa verde brillante a 35C por 24 -48 horas.
Transcurrido el tiempo de incubacin, observamos la presencia de gas/espuma en los tubos.
Consultamos la tabla ajunta para la emisin del resultado con base al nmero de tubos positivos y su dilucin.
Prueba confirmatoria de coliformes fecales:
Agitamos suavemente los tubos con produccin de gas y transferimos tres asadas de cada tubo con gas a un tubo con
caldo E. coli.
Incubamos los tubos con caldo lactosa verde brillante a 35C por 24-48 horas.
Transcurrido el tiempo de incubacin, observamos la presencia de gas en los tubos.
Consultamos la tabla ajunta para la emisin del resultado con base al nmero de tubos positivos y su dilucin.

Elementos tericos particulares al alimento y microorganismo analizado.

Las bacterias que deterioran los alimentos pueden dividirse en principio en tres clases, segn la temperatura a la que
crecen ms rpidamente, entre estos tenmos:
Las bacterias termfilas: crecen msrpidamente a temperaturas superiores a 40 45 C y hasta 75C en este grupo se
encuentran algunos bacilos que forman esporas y producen acidez.
Las bacterias psicrfilas: toleran el ambiente frio, muchos organismos que prosperan en el agua son de esta clase. Su
velocidad optima de crecimiento puede estar a temperaturas entre los 20 y los 30 C pero continan creciendo, aunque
ms lentamente, a temperaturastan bajas como de 0 a 5C.
Las bacterias mesfilas Las bacterias aerobias mesfilas son todas las bacterias capaces de desarrollarse en un medio
nutritivo incubado en condiciones de aerobiosis.
tienen su mayor velocidad de crecimiento a temperaturas comprendidas entre 25 y 40 C. esta clase comprende la mayor
parte de los organismos que tienen como husped el hombre y otros animales de sangrecaliente, por ejemplo: la
Salmonella y el Staphylococcus aureus. Los organismos que se producen en las plantas y en el suelo son mesfilos.
Se multiplican en aerobiosis
* temperatura de incubacin entre los 20 y los 37
* Pueden ser patgenas o saprofitas
Recuentos altos en alimentos estables a menudo indican materias primas contaminadas o tratamientos no satisfactorios
desde el punto de vista sanitario.
Los resultados debern presentarse en una tabla como la siguiente, debern explicar el resultado y evaluar sobre las
implicancias del mismo en cuanto a calidad del alimento (descomposicin, inocuidad).
GRUPO
1

GRUPO

MUESTRA

METODO
PLACA
1
Recuento en
placa
2
Boln de verde
Petrifilm
Blanco
MUESTRA

CALDO

Lauril sulfato
Boln de verde triptosa
Verde

10-1
TNTC
TNTC
TNTC

10-2
TNTC
TNTC
72

TUBO

10-1

10-2

1
2
3
1

+
+
+
+

+
+
+
+

10-3
UFC/g o ml
23
2,4 x 104 UFC/g SPC
25
Sin contaminacin
10-3 Serie reportada NMP/g
+
+
+
+

333

>1100
coliformes

333

>1100

brillante

E. coli

2
3
1
2
3

+
+
+
+
+

+
+
+
+
+

+
+
+
+
+

333

coliformes
totales
>1100
coliformes
fecales

Las conclusiones a las que lleg el grupo (cumplimiento de objetivos) y recomendaciones