UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

EVALUACIN DE LA ADICION DE SO2 SOBRE EL CONTENIDO DE

OCRATOXINA EN ELABORACION DE VINO TINTO.

PERFIL DE TESIS:
PREVIO A LA OBTENCIN DE TTULO DE :
INGENIERO AGROINDUSTRIAL.
PRESENTADO POR:
KATYA PILAR CALIZAYA MIRANDA
MOQUEGUA-PERU
2014

CONTENIDO
I.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. ............................................................ 6

II. ANTECEDENTES. ........................................................................................... 8

III. JUSTIFICACIN. ............................................................................................. 9
IV.

MARCO TEORICO. ..................................................................................... 10

4.1.

VINO. ........................................................................................................... 10

4.2.

MICOTOXINAS. .......................................................................................... 10

4.3.

OCRATOXINA A. ........................................................................................ 11

4.3.1.

PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE OCRATOXINA A. ..................... 11

4.3.2.

EFECTO DE LA CONTAMINACIN POR OCRATOXINA A. ............. 12

4.3.2.1. INTOXICACIN AGUDA. ............................................................................

4.3.2.1.1. INTOXICACIN SUBCRNICA. .......................................................... 12
4.3.2.1.2. NEFROTOXICIDAD. ................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
4.3.2.1.3. NEUROTOXICIDAD. ............................................................................ 12
4.3.2.1.4. CARCINOGENICIDAD. ........................................................................ 13
4.3.2.1.5. GENOTOXICIDAD. ............................................................................... 13
4.3.2.1.6. INMUNOTOXICIDAD. ........................................................................... 13
4.3.3.

ESPECIES PRODUCTORAS DE OTA EN VINO. ................................... 14

4.3.3.1. ASPERGILLUS CARBONARIUS. ........................................................... 14

4.3.4.

FACTORES INVOLUCRADOS EN LA PRESENCIA DE OTA EN VINOS

Y UVAS. ................................................................................................................ 14
4.3.4.1. ROTURA DE LA PIEL DE LA UVA: LOS PRINCIPALES HONGOS
PRODUCTORES DE OTA, ................................................................................... 15

4.3.4.2. PERODO DE MADURACIN DE LA UVA. ............................................ 16

4.3.4.3. PROCESO DE ELABORACIN DEL VINO. ........................................... 16
4.3.4.4. ZONA GEOGRFICA. ............................................................................. 16
4.3.5.

LMITE MXIMO TOLERABLE. .............................................................. 17

FUENTE: (REGLAMENTO DE LA UNIN EUROPEA N 105/2006.................... 18

4.3.6.

ABATIMIENTO DE LA OCRATOXINA A. ............................................... 18

4.3.6.1. SULFITADO DE VINOS........................................................................... 18

A) EL ANHDRIDO SULFUROSO O DIXIDO DE AZUFRE (SO2). .................. 18
4.3.7.

MTODOS DE ANLISIS DE OCRATOXINAS. ..................................... 19

V. OBJETIVOS. .................................................................................................. 23
5.1.

OBJETIVO GENERAL. ............................................................................... 23

5.2.

OBJETIVO ESPECFICO. ........................................................................... 23

VI.

HIPTESIS. ................................................................................................ 24

6.1.

HIPTESIS GENERAL. .............................................................................. 24

6.1.1.
VII.
7.1.1.

HIPTESIS ESPECFICAS. .................................................................... 24

MATERIALES Y METODOLOGA. ............................................................. 25
LUGAR DE EJECUCIN. ........................................................................ 25

7.2.

MATERIAL EXPERIMENTAL. .................................................................... 25

7.3.

MATERIALES Y EQUIPOS......................................................................... 25

7.3.1.

EQUIPOS. ................................................................................................ 25

7.3.2.

INSTRUMENTOS DE LABORATORIO. .................................................. 26

7.3.3.

REACTIVOS. ........................................................................................... 27

7.3.3.1. REACTIVOS PARA LA SEPARACIN DE LA OTA EN UNA COLUMNA

DE INMUNIDAD. ................................................................................................... 27

7.3.3.2. REACTIVOS PARA HPLC. ..................................................................... 27

7.3.3.3. REACTIVOS PARA EL SULFITADO. ..................................................... 27
7.3.3.4. PREPARAR SOLUCIONES. ................................................................... 27
7.3.3.5. OTA SOLUCIN MADRE. ....................................................................... 28
VIII. METODOLOGA EXPERIMENTAL. ........................................................... 30
8.2.

MUESTREO. ............................................................................................... 30

8.3.

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS. ...................................................... 32

8.4.

LA PURIFICACIN POR COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD. ................. 32

8.5.

EL ANLISIS POR HPLC ........................................................................... 35

8.6.

CUANTIFICACIN DE OCRATOXINA A (OTA) ........................................ 35

IX. ANLISIS ESTADSTICO. ............................................................................. 40

X. RESULTADOS. .............................................................................................. 40
XI. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES. ............................................................. 41
XII.

BIBLIOGRAFIA. .......................................................................................... 42

INDICE DE TABLAS.

Tabla 1: Lmites mximos permitidos (ug/kg) de ocratoxina A en diferentes

productos de vid. ................................................................................................... 17
Tabla 2: Lmites mximos permitidos (ug/kg) de ocratoxina A en diferentes
productos de vid. ................................................................................................... 31
Tabla 3: Diseo experimental de anlisis de las muestras de vino tinto ............... 38
Tabla 4: nivel de ocratoxina A en vino tinto. .......................................................... 40

INDICE DE FIGURAS.
Figura 1: Estructura qumica de la ocratoxina A ................................................... 12
Figura 2: Bayas de uva con presencia de ocratoxina A. ...................................... 15
Figura 3: extraccin con columnas de inmunoafinidad. ........................................ 20

EVALUACIN DE LA ADICION DE SO2 SOBRE EL CONTENIDO DE

OCRATOXINA EN LA ELABORACION DEL VINO TINTO.

I.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

El estudio de las micotoxinas en particular la ocratoxina A, debido a su alto
nivel

de

toxicidad,

efectos

nocivos,

cancergenos,

neurotxicos,

genotxicos, y teratognicos, constituye un riesgo importante para la salud

humana.
Siendo la ocratoxina A un metabolito secundario producido por hongos
filamentosos de los gneros Aspergillus y Penicillium que estn presentes
en el suelo, en materias orgnicas y de all se expanden y se desarrollan en
las uvas, motivo por el cual este ndice de contenido conlleva a repercutir
en daos a la salud a las personas que consumen este producto,
considerando que la regin Moquegua se encuentra dentro de las
principales zonas

productoras de vino del sur del Per es importante

realizar controles microbiolgicos en el vino y asegurar la calidad del

producto.
Siendo el vino una bebida que forma parte del hbito alimenticio de la
poblacin

por ser considerado un alimento beneficioso para la salud

demostrado por su composicin fenlica, contenido de resveratrol, que le

otorgan propiedades antioxidantes, antimutagenicas y antiagregantes, sin
embargo la presencia de ocratoxina afectara a todas estas propiedades y
el consumo del vino constituira un riesgo para la salud del consumidor, es
por ello que hay disposiciones dentro del mbito vitivincola que norman el
lmite mximo permisible de ocratoxina A en vinos con el fin de garantizar la
salud humana, las condiciones de produccin y comercializacin.

Por lo tanto en la investigacin nos planteamos lo siguiente:

Cul es el efecto de la aplicacin de dixido de azufre (SO2) en el
crecimiento de hongos de los gneros aspergillus y Penicillium causantes
de la Ocratoxina A en el mosto de vino tinto?
Los niveles

de ocratoxina A se encuentran dentro de los lmites

permisibles de las normas internacionales en el vino tinto producido por las

bodegas: Zapata, Mocho, Parras y Reyes, Campano de la regin
Moquegua?

II.

ANTECEDENTES.
Debido a su importancia toxicolgica la ocratoxina A, ha sido ampliamente
estudiada en diferentes cultivos alimentarios, la OTA es teratgenica,
genotxica y ha sido clasificada por la IARC (Agencia Internacional de
Investigacin del Cncer) como posible carcingeno en humanos,
perteneciente al grupo 2B (Galvis, Sanchez, Barros, & Delgadillo, 2008)
El estudio realizado por Garmendia & Vero (2011) determinaron que la
ocratoxina A (OTA) es una micotoxina que ha sido detectada en uvas y
vinos y que es producida por Aspergillus ochraceus,

Penicillium

verrucosum, Aspergillus carbonarius y especies pertenecientes al agregado

Aspergillus niger., Adems se optimiz la tcnica de PCR en tiempo real
para la deteccin y cuantificacin de esta especie en uvas de la variedad
Tannat.. Daz et al. (2009), partiendo de un 0.5 % de uvas contaminadas
con Aspergillus carbonarius se obtiene un vino con niveles de OTA que
superan el lmite mximo de contaminacin aceptado por la OIV.
En Chile, estudios

de (Alvarado, 2009) recientes han demostrado la

presencia de A. carbonarius en viedos de la zona central, siendo junto con

A. niger las principales especies ocratoxicognicas que contaminan la
produccin de uvas del pas tal como ocurre en las dems regiones del
mundo.
La presencia de OTA en vino, jugos de uva y pasas se descubri a
mediados de los aos 90 (Zimmerli & Dick, 1995) . Diversas metodologas
analticas han sido utilizadas para la determinacin de OTA en alimentos:
cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC) con deteccin por
fluorescencia (FLD) (Castellari et al, 2000) LC/espectrometra de masas
(MS) (Reinsch et al, 2007), cromatografa en capa fina (TLC)/FLD
(Dawlatana et al , 1996), electroforesis capilar (CE)/FLD (Corneli, Maragos,
& Agric, 1998), CE/UV (Gonzales, Peas, Leache, & Lopez, 2001) y
cromatografa de gas (GC)/MS (Soleas,& Agrid, 2001).
8

III.

JUSTIFICACIN.
Los estudios sobre micotoxinas tienen gran transcendencia a nivel mundial,
debido a los daos que stas causan a la salud de la poblacin, as como
las prdidas econmicas ocasionadas por los alimentos contaminados,
siendo ms de 1000 millones de toneladas al ao, la contaminacin de
aquellos productos susceptibles, ocurre como resultado de las condiciones
medio ambientales en el campo, as como tambin por las condiciones
inadecuadas en que son realizadas las operaciones de cosecha,
almacenamiento y procesamiento del producto (FAO, 2011).
La produccin de vino tinto en la regin Moquegua constituye un sector
relevante de la economa de la regin y el pas. Siendo adems el vino una
bebida que es parte del consumo habitual de la poblacin por ende este
producto debera garantizar calidad, inocuidad ya que actualmente se
pretende que en los alimentos garantice un alto grado de seguridad
alimentaria con la finalidad de recuperar y mantener la confianza de la
ciudadana en la calidad de los alimento.
Es importante evaluar los niveles de ocratoxina A en el vino tinto que se
produce en la regin Moquegua debido a que la produccin vitivincola es
unas de las principales actividades econmicas de la regin y es de suma
importancia contar con productos de calidad, que genere competitividad en
el mercado nacional, ofreciendo un producto que asegure el bienestar y la
salud humana.

IV.

MARCO TEORICO.

4.1. Vino.
Segn (Cueva, 2001) La definicin de vino es el producto resultante de la
fermentacin alcohlica total o parcial del jugo de uvas sanas y maduras,
con un contenido mnimo de 8,5% (v/v) de etanol. El vino es, por tanto, una
mezcla hidroalcohlica, los componentes ms abundantes son el agua, que
proviene de la uva y que se encuentra entorno al 80-85%, segn el tipo de
vino, y el etanol, que se encuentra normalmente en una proporcin del 9 al
20% en volumen (Fernandez , 2004).
Existen factores como el proceso de vinificacin, la variedad y el mtodo de
cultivo, que marcan diferencias en los atributos de un vino (Kennedy, 2008),
la tipicidad de la uva (Torres et al., 2006), lo cual se expresa en el contenido
de azcar, acidez, color y aroma, entre otros (Tonietto, 2007). En general,
la calidad de una vendimia est determinada por la interaccin del cultivar
con el suelo y el clima predominante en una regin (Ferrer et al., 2007).
Por otro lado, en el vino tambin se pueden encontrar coadyuvantes
tecnolgicos y aditivos de uso permitido y generalmente necesarios para su
elaboracin. Entre los compuestos aadidos exgenamente a la uva o al
mosto y al vino para favorecer la vinificacin, o prevenir la aparicin de
microorganismos indeseables o alteraciones, se incluyen sulfitos, enzimas
pectolticas y otros preparados enzimticos, y compuestos presentes en
cantidades traza como metales. (Goldner, Zamora, & Calvilo, 2008)

4.2. Micotoxinas.
Las micotoxinas son metabolitos secundarios txicos, producidos por
algunos gneros de mohos, las cuales pueden estar presentes en los
alimentos, tanto si son destinados para consumo humano, o en las materias
primas utilizadas para su manufactura (Adams & Moss, 2000).
10

Las micotoxinas son sustancias que tienen estructuras qumicas muy

diversas con un peso molecular relativamente bajo. Esta es la causa
principal de su elevada resistencia al calor (Mossel & Moreno, 2003).

4.2.1. Ocratoxina A.
La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina producida por hongos
filamentosos

superiores

de

los

gneros

Aspergillus

Penicillium

(principalmente A. ochraceus, P. verrucosum y A. carbonarium), que fue

descubierta por Van der Merwe en 1965 (Van der Merwe, 1965).
La molcula est formada por un anillo de isocumarina unido por medio de
su grupo carboxilo a travs de un enlace tipo amida, con una molcula de
L--fenilalanina. La OTA forma parte de una familia de compuestos con
estructura similar, algunos de los cuales son producidos por las mismas
especies fngicas (Xiao, 1996), el crecimiento fngico en el alimento no
implica necesariamente la presencia de la micotoxina, porque su
produccin est influenciada por diversos factores como la humedad, la
temperatura, el pH y la composicin del alimento, entre otros, y estas
condiciones influyen adems de manera diferente en cada especie
productora (Moss,1996)
Debido a su importancia toxicolgica, OTA ha sido ampliamente estudiada
en diferentes cultivos alimentarios. La Ocratoxina A es hepatoxica,
teratgenica, inmunotoxica, genotxica y ha sido clasificada por la IARC
(Agencia Internacional de Investigacin del Cncer) como posible
carcingeno en humanos, perteneciente al grupo 2B (Soriano, 2007).

4.2.1.1.

Propiedades fisicoqumicas de Ocratoxina A.

Fsicamente, OTA es un slido cristalino incoloro, altamente soluble en

solventes orgnicos como alcoholes, cetonas, benceno y cloroformo,
levemente soluble en agua y soluble en solucin acuosa de bicarbonato de
11

sodio. Es insoluble en teres de petrleo y en hidrocarburos saturados. Su

peso molecular corresponde a 403.82 g/mol. Sus puntos de fusin son 90 y
171C) (Villarroel, 2009).
Con respecto a la estabilidad, esta micotoxina es estable al calor y
resistente a procesos de esterilizacin y coccin aplicados en prcticas
culinarias (Sanchez., 2008). Es estable frente al tiempo. Soluciones
etanlicas refrigeradas de OTA son estables por ms de un ao.

FIGURA 1: Estructura qumica de la ocratoxina A

FUENTE: Antn & Lizaso (2001).

4.2.1.2.

Efecto toxicolgicos por Ocratoxina A.

a) Intoxicacin subcrnica.
Se ha reportado que OTA es nefrotxica, teratognica, inmunotxica,
genotxica en animales se ha comprobado la inmunotoxicidad de OTA en
varias

especies

de

mamferos

sus

propiedades

teratognicas,

mielotxicas y carcinognicas han sido estudiadas en ratas y ratones.

(Micotoxinas y micotoxicosis de importancia en la salud humana en
Colombia , 2009)

b) Neurotoxicidad.
12

Se ha demostrado que la OTA produce lesiones en el sistema nervioso

central (Belmadani et al. 1998a, Sava et al. 2006), tambin Sava et al.
(2006) mencionan la posibilidad de que un gran nmero de pequeas dosis
de OTA pueden inducir parkinsonismo a edades adultas.

c) Carcinogenicidad.

Ha sido establecida la carcinogenicidad de la OTA mediante estudios a

largo plazo con roedores, siendo el principal rgano afectado en cuanto a
formacin de tumores, el rin y el despus el hgado (Bendele et al. 1985)
Segn la Agencia Internacional para la Investigacin del Cncer, la OTA se
encuentra dentro del grupo 2B por ser posible carcinognica en humanos
(IARC 1993).

d) Genotoxicidad.
Algunos estudios han demostrado que la OTA es genotxica tanto in vitro
como in vivo, a pesar de que la OTA ofrece resultados negativos en
muchos de los tests para mutageneidad. En algunos trabajos realizados
para observar su posible capacidad de mutacin en bacterias los resultados
obtenidos han sido negativos (Hennig et al. 1991), mientras que en clulas
de mamferos algunos resultados han sido positivos (Groene et al. 1996) y
otros negativos (Bendele et al. 1985).

e) Inmunotoxicidad.

Son limitados las referencias acerca de los posibles efectos que tiene la
OTA sobre el sistema inmunolgico. A pesar de ello, algunos estudios in
vitro e in vivo sugieren que la OTA puede afectar a ambas respuestas
inmunes, tanto la celular como la humoral aunque estos efectos se ponen

13

de manifiesto cuando las cantidades de OTA ensayadas son muy altas.

(Adams, 2000)

4.2.1.3.

Especies productoras de OTA en vino.

En el vino los principales productores de OTA son miembros del gnero

Aspergillus seccin Nigri (A. niger, A. awamori, A. foetidus, A aculeatus, A.
japonicus), especialmente A. carbonarius, aunque en pases como Francia,
se ha detectado la presencia de algunas especies de Penicillium (P.
expansum, P. espinulosum, P. crustosum, entre otras) en uvas, pero en
menor porcentaje con respecto a Aspergillus (Araujo, 2009).

a) Aspergillus carbonarius.
Diversos estudios han demostrado que A. carbonarius es el principal
responsable de la contaminacin de uvas y vino con OTA (Anton, 2001). Se
report por primera vez la presencia de A. carbonarius en uvas podridas en
la India en el ao 1956 (Villarroel, 2009) A. carbonarius presenta un alto
poder de sntesis de OTA y se ha demostrado que la interaccin con otros
hongos puede influenciar la produccin de micotoxina (Abarca, 2000).

b) Penicillium.

De todas las especies analizadas, el gnero "Penicillium" ha aparecido en

cantidades insignificantes, menos del 3%. En las primeras etapas del ciclo
de la uva, los gneros que ms abundan son "Alternaria" y "Cladosporium",
y descienden su concentracin a medida que va madurando (Antn, 2001).

4.2.2. Factores involucrados en la presencia de OTA en vinos y uvas.

La presencia de OTA en vino, jugos de uva y pasas se descubri a
mediados de los aos 90 (Zimmerli & Dick, 1995). La aparicin de OTA en
14

el vino se debe a la presencia y difusin de los hongos productores en los

viedos. Los principales factores que afectan la propagacin de los hongos
son medioambientales y climticos, as como tambin las condiciones de
aireacin y humectacin de la uva, el estado sanitario de las mismas y las
heridas en las bayas, las cuales son los principales lugares de entrada de
los hongos ocratoxignicos (Araujo, 2009).

4.2.2.1.

Rotura de la piel de la uva: los principales hongos productores

de OTA.

A. Carbonarius y A. Niger, son saprfitos de las frutas y por lo tanto no

pueden penetrar en uvas sanas. Sin embargo, ante cualquier dao en las
bayas, ya sea de tipo mecnico, qumico o bien una accin por parte de
microorganismos, estos hongos pueden entrar en la uva y en el interior, el
pH, el alto contenido de azcar y en ocasiones, las altas temperaturas,
crean un ambiente ideal para estas especies (Sez et al. 2004). Algunos
factores asociados al dao en la piel de la uva son: la presencia del gusano
de la uva, Lobesia botrana y las prcticas de produccin vitivincola, entre
otros (Jornet et al. 2000).

Figura 2: Bayas de uva con presencia de ocratoxina A.

15

4.2.2.2.

Perodo de maduracin de la uva.

La cantidad de A. Carbonarius en las bayas aumenta con el perodo de

maduracin (perodo en que la uva comienza a colorearse) hasta la
cosecha de la uva. La produccin de OTA aumenta con la madurez de los
racimos de uva y alcanza su mximo al final de la cosecha. (Rotter et al.
1996).

4.2.2.3.

Proceso de elaboracin del vino.

El contenido de OTA vara naturalmente durante la produccin de vino. Las

concentraciones aumentan durante la maceracin por extraccin de la
micotoxina desde las bayas infectadas. Debido a ello, los vinos tintos son
ms susceptibles a este tipo de contaminacin que los blancos o ros. En el
caso del vino blanco, la uva es prensada inmediatamente despus de ser
recogida y luego se separa la piel del jugo, en cambio en vinos tintos y ros,
una vez que la uva es prensada, la mezcla de zumo y piel es macerada por
un periodo determinado de tiempo de acuerdo al tipo de vino a producir
(vinos tintos mayor perodo de maceracin). Durante esta fase se dan
condiciones aerbicas, no fermentativas, que probablemente favorecen el
crecimiento fngico. (Lopez, 2003)

4.2.2.4.

Zona geogrfica.

La OTA se presenta en todos los tipos de vino, en cada regin del mundo,
en los vinos tintos es ms frecuente encontrar grandes cantidades de OTA
que en los ros o blancos (Murillo, 2001). Por otro lado, algunos estudios
sugieren que en regiones como Europa y frica del Norte, los vinos del sur
contienen mayor cantidad de OTA que los provenientes del norte de esas
zonas Las principales diferencias han sido atribuidas a factores climticos,
diferencias en los cultivos, tcnicas de produccin del vino y condiciones de
almacenamiento. (Ravelo, Rubio, Gutierrez, & Torre, 2011)
16

4.2.3. Lmite mximo tolerable.

Con el objetivo de garantizar la seguridad del consumidor y conseguir que
no se superen los valores de ingesta diaria tolerable fijados, el reglamento
de la Comisin Europea N 1881/2006 relativo al contenido mximo de
determinados contaminantes en los productos alimenticios y el reglamento
N 105/2010 que modifica el anterior (Reglamento N 105/2006), establecen
los siguientes lmites mximos (gkg-1) para la ocratoxina A en algunos
alimentos.

Tabla 1: Lmites mximos permitidos (g/kg) de ocratoxina A en diferentes

productos de vid.
Alimento

(ug/Kg)

Vino (incluidos los vinos espumosos y excluidos

los vinos de licor y los vinos con un grado

alcohlico mnimo de 15% vol. Y vino de frutas.
vino aromatizado, bebidas aromatizadas a base

de vino y cocteles aromatizadas de productos

vitivincolas
Zumo de uva, zumo de uva concentrado
reconstituido, nctar de uva, mosto de uva y
mosto de uva reconstituido, destinados al
consumo humano directo.

17

Fuente: (Reglamento de la Unin Europea N 105/2006

4.2.4. Abatimiento de la ocratoxina A.

4.2.4.1.

Sulfitado de vinos.

a) El anhdrido sulfuroso o dixido de azufre (SO2).

Es el principal conservante utilizado durante la vinificacin para
proteger a los vinos de posibles alteraciones. Su uso como
conservante enolgico se conoce desde la antigedad, siendo ya
utilizado en tiempos de egipcios y romanos para la desinfeccin y
limpieza de bodegas (Frazier et al., 1978). Pero ha sido en las
ltimas dcadas cuando se han adquirido la mayor
conocimientos

cientficos

sobre

su

empleo

parte de los
en

enologa,

extendindose su uso en operaciones de pre-fermentacin durante la

vinificacin.
En los vinos, este compuesto tiene mltiples propiedades, entre las
que se pueden destacar su capacidad antimicrobiana y antioxidante.
El SO2 es un agente antisptico frente a levaduras y bacterias,
presentando un mayor poder antimicrobiano frente a BAL, que frente
a levaduras. El SO2 impide la oxidacin no enzimtica y enzimtica
del vino mediante un consumo lento del oxgeno e inhibicin de
enzimas oxidativas tales como las tirosinasas y lacasas. Adems, la
unin del SO2 con el etanol y otros compuestos similares protege los
aromas del vino. Por otra parte, tambin previene el pardeamiento de
los

vinos

mediante

la

inactivacin

de

enzimas

como

la

polifenoloxidasa, peroxidasa y proteasas, e inhibe la reaccin de

Maillard (Ribrau et al., 2006).

18

Generalmente, a las concentraciones en las que estn presentes los

sulfitos en el vino no existe riesgo para el consumidor. Sin embargo,
en los ltimos aos, existe una tendencia a reducir progresivamente
los niveles mximos de SO2 autorizados en los mostos y vinos,
debido al aumento de problemas para la salud humana, preferencias
de los consumidores, posibles alteraciones organolpticas en el
producto final (olores defectuosos producidos por el propio gas
sulfuroso, o por su reduccin a sulfhdrico y otros mercaptanos) y a
una legislacin cada vez ms estricta sobre los conservantes (Santos
et al., 2012). Aunque en la actualidad, ningn compuesto conocido
puede desplazar al SO2 en todas sus propiedades enolgicas, existe
un gran inters por la bsqueda de otros conservantes inocuos para
la salud que puedan sustituir o al menos complementar la accin del
SO2, permitiendo la reduccin de su nivel en los vinos ( Ruiz et
al.,2008)

4.2.5. Mtodos de anlisis de ocratoxinas.

4.2.5.1.

Tcnicas de extraccin y purificacin.

a) Extraccin con columnas de inmunoafinidad

El

procedimiento

de

purificacin

consiste

en

acondicionar

previamente la columna, para luego aadir el extracto objeto de

anlisis. La micotoxina problema se unir a los anticuerpos
monoclonales fijados en la columna de inmunoafinidad y mediante un
lquido de lavado podrn eliminarse los restos de la matriz. Por
ltimo, la elucin de la micotoxina por desnaturalizacin de los
anticuerpos permitir continuar el anlisis. Las columnas de
inmunoafinidad presentan el inconveniente de tener un alto coste,
fecha de

caducidad y en ocasiones la

reproducibilidad interlotes.

19

variabilidad de la

Actualmente dos empresas (R-Biopharm y Vicam) comercializan

columnas

de

inmunoafinidad

ocratoxina

A,

tambin

se

ha

desarrollado columnas de inmunoafinidad que permitan la extraccin

y purificacin simultnea de varias micotoxinas al mismo tiempo
como puede ser la OchraAflaprep para aflatoxinas y ocratoxina A.

Figura 3: extraccin con columnas de inmunoafinidad.

4.2.5.2.

Separacin, deteccin y cuantificacin.

a) Cromatografa liquida.
La primera publicacin sobre la aplicacin de la cromatografa liquida en
el anlisis de micotoxinas data de 1973 (Rao Anders, 1973), desde
entonces se ha aplicado cada vez ms a este cometido. Entre las
ventajas ms importantes que presenta la cromatografa liquida se
encuentra la posibilidad de separar sustancias termolbiles, no voltiles,
polares

apolares

con

aceptable

resolucin

entre

sustancias

qumicamente similares, de manera rpida y reproducible.

La cromatografa liquida en fase normal fue utilizada en un principio para
el anlisis aflatoxinas, pero ha sido relegada por los sistemas en fase
20

reversa (Sforza et al., 2006). La cromatografa lquida en fase reversa

usa fases estacionarias hidrocarbonadas y fases mviles acuoorgnicas; la interaccin entre las molculas del soluto y la fase
estacionaria depende en principio de las fuerzas de dispersin
(interacciones hidrfobas no especficas) separndose los compuestos
segn su hidrofobicidad, los componentes ms polares eluyen primero.
Las fases estacionarias apolares se preparan uniendo grupos octilo
(C8), octadecil (C18) o cadenas cortas de grupos fenilo, cianopropilo y
n-alquilo a la superficie del slice a travs de los grupos silanoles (SiOH).
La retencin de las sustancias est controlada principalmente por la fase
mvil, jugando en segundo plano la fase estacionaria; el ptimo en la
selectividad se alcanza combinando correctamente los componentes de
la fase mvil (Egmond et al., 1986). Los solventes orgnicos ms
empleados son el metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano en diferentes
combinaciones con agua destilada. La elucin isocrtica es til cuando
se estudian compuestos de estructura qumica y polaridad similar,
mientras que la elucin en gradientes es preferible en la separacin de
muestras que contienen micotoxinas de diferente polaridad. Las
muestras con compuestos ionizables se pueden analizar aadiendo
aditivos a la fase mvil de forma que podamos servirnos de dos
tcnicas: la supresin inica y el par inico, empleando el contrain
adecuado. Aadiendo a la fase mvil cido actico, cido fosfrico,
cido trifluoroactico (TFA, trifluoroacetic acid), trietilamina (TEA,
triethylamine), o soluciones tampn (fosfato, acetato, borato, etc.), se
puede controlar el pH de forma que se suprima la posible ionizacin de
las molculas de la muestra e incluso la de los grupos del relleno de la
columna. O bien se puede formar un par inico empleando el contrain
adecuado de signo opuesto a la sustancia problema, el complejo
resultante al no poseer carga elctrica y ser voluminoso interaccionar
ms fcilmente con la fase estacionaria apolar. Se suelen utilizar
alquilsulfonatos (heptanosulfonatosdico) para la separacin de bases
21

protonadas

bases

de

amonio

cuaternario

(hidrxido

de

tetrabutilamonio) para grupos carboxilo u otros aniones. Por ejemplo la

moniliformina (Shepherd et al., 1986) y el cido tenuazico (Lebrun et
al., 1989) han sido analizados usando la cromatografa de par inico.
El acoplamiento cromatografa lquida-espectrometra de masas no es
tan sencillo como en el caso de la cromatografa de gasesespectrometra de masas debido a que la transferencia de analitos debe
realizarse desde una fase lquida en lugar de una fase gaseosa. En la
prctica, las interfases ms difundidas son la termonebulizacin (TSP,
Thermospray) que nebuliza utilizando calor, la electronebulizacin (ES,
Electrospray) aplica un campo elctrico en el extremo de un capilar, y la
APCI, donde la nebulizacin se consigue con ayuda de una corriente de
nitrgeno a alta velocidad. Otra tcnica menos extendida es el haz de
partculas (PB, Particle Beam), en la cual se hacen llegar las molculas
neutras de la micotoxina hasta la fuente de ionizacin mediante una
difusin selectiva. (Goryacheva et al., 2007; Zollner et al., 2006).

22

V.

OBJETIVOS.

5.1. Objetivo general.

Evaluar el contenido de ocratoxina A en tres tipos de vino tinto (seco,

semi seco, dulce)

y el poder de abatimiento de tres antispticos

sobre la Ocratoxina A.

5.2. Objetivo especfico.

Evaluar el contenido de ocratoxina A en tres tipos de vino tinto (seco,

semi seco, dulce) a travs de los lmites permisibles de las normas
de la Unin Europea, Codex Alimentarius producido por las bodegas
Zapata, Parras y Reyes, El Mocho y Campano de la regin
Moquegua.

Evaluar el poder de abatimiento de tres antispticos en el

crecimiento de hongos del gnero Aspergillus y Penicillium
causantes de la ocratoxina A en el proceso de sulfitado.

23

VI.

HIPTESIS.

6.1. Hiptesis general.

El contenido de Ocratoxina A en tres tipos de vino tinto es mayor a

los estndares internacionales de calidad, la aplicacin de tres
antispticos en el proceso de sulfitado disminuyen su contenido en
diferente proporcin.

6.1.1. Hiptesis especficas.

La concentracin de Ocratoxina A presente en los diferentes tipos de

vino tinto (seco, semi seco, dulce) producido por las bodegas Zapata,
El Mocho, Parras, Reyes y Campano es mayor a los lmites
permisibles de las normas de la Unin Europea y el Codex
Alimentarius.

La aplicacin de tres antispticos en el proceso de sulfitado

disminuyen el crecimiento de hongos del genero Aspergillus y
Penicillium causantes de la Ocratoxina A.

24

VII.

MATERIALES Y METODOLOGA.

7.1.1. Lugar de ejecucin.

La investigacin se llevara a cabo en el laboratorio de qumica de la
Universidad Nacional de Moquegua, El departamento de Moquegua est
situado en el sur del Per, ubicada a 1410 m.s.n.m. sus coordenadas
geogrficas se sitan entre 1517 y 1723 de latitud sur. Limita por el norte
con los departamentos de Arequipa y Puno; por el este con Puno y Tacna;
por el sur con Tacna y por el oeste con el Ocano Pacfico y Arequipa.

7.2. Material experimental.

Se realizar la determinacin de la ocratoxina A en vino tinto de la regin
Moquegua, se empleara 36 L de vino para la determinacin de Ocratoxina
A, esta se obtiene de las Bodegas Zapata, El Mocho, Parras y Reyes,
Campano Ubicadas en la Ciudad de Moquegua.
Para

el

tratamiento

de

elaboracin

de

vino

tinto

diferentes

concentraciones de anhdrido sulfuroso, metabisulfito de sodio y bisulfito de

potasio se requerirn 100kg de uva de la variedad negra criolla que se
obtendr del fundo de Parras y Reyes.

7.3. Materiales y equipos.

Los equipos que se utilizaran para el estudio sern los siguientes.
7.3.1. Equipos.
7.3.1.1.

Equipos para determinacin de ocratoxina A.

Balanza analtica de capacidad de 220 g y precisin de 0.1 mg
(Shimadzu AUX220).

Evaporador de muestras.
25

Balanza de dos dgitos de capacidad para 4200 g y precisin 0.01 g

(Shimadzu UW4200H).

Bao Mara (Memmert).

Equipo de Extraccin en fase slida al vaco (Waters).

Agitador de Tubos (Maxi Mix II).

Bao Ultrasonido (Cole Parmer).

Equipo HPLC (Agilent 1200 series).

Licuadoras (Osterizer).

Bomba de vaco (GE-MOT-012).

Plancha Agitadora / calentadora (Cole Parmer).

Cronmetro digital (Thomas Scientific).

Espectrofotmetro UV-Visible (Shimadzu 2201).

7.3.2. Instrumentos de laboratorio.

Probetas de borosilicato de 10 mL a 1000 mL.

Balones volumtricos de 5 mL a 2000 mL.

Vasos de precipitacin de borosilicato de 10 mL a 1000 mL.

Embudos de filtracin de vidrio.

Pipetas volumtricas de 4 mL.

Vasos de vidrio para licuadora de 500 mL.

Tubos de ensayo de vidrio con punta cnica de 15 mL.

Sistema de extraccin al vaco.

Gradillas porta tubos de ensayo.

Esptula de metal.

Micropipeta automtica de 100 a 1000 L y de 10 a 100 L.

Puntas para micropipeta automtica.

Papel filtro de 12.5cm de dimetro Whatman 4 o equivalente.

Membrana HV (Durapore) EM PVDF, 0.45 m de poro, 47 mm de

dimetro, blanca lisa.

26

Membrana HV (Durapore) EM PVDF, 0.22 m de poro, 25 mm de

dimetro, blanca lisa.

Membrana de fibra de vidrio tipo APFB.

Jeringuillas de polipropileno de 10 mL y 60 mL desechables.

Columnas de inmunoafinidad para purificacin de OTA (recuperacin

90%).

7.3.3. Reactivos.
7.3.3.1.

Reactivos para la separacin de la OTA en una columna de

inmunidad.

Hidrogenofosfato de disodio dihidratado (Na2HPO42H2O)

Dihidrogenofosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4H2O).

Cloruro de sodio (NaCl).

Agua purificada para laboratorio.

Metanol (CH3OH).

7.3.3.2.

Reactivos para HPLC.

Acetonitrilo de calidad HPLC (CH3CN).

cido actico glacial (CH3COOH).

Tolueno (C6H5CH3).

7.3.3.3.

Reactivos para el sulfitado.

Anhdrido sulfuroso (SO2)

Metabisulfito de sodio (Na2S2O5)

Bisulfito de potasio (KHSO3)

7.3.3.4.

Preparar soluciones.
a) Tampn PB (solucin de dilucin).
27

Para la preparacin del tampn PB se disolver 60 g de

Na2HPO42H2O y 8,8 g de NaH2PO4H2O en 950 ml de agua y
enrasar a 1 litro con agua.

b) Tampn PBS (solucin de lavado).

Para la preparacin del tampn PBS se disolver 2.85 g de
Na2HPO42H2O, 0.55 g de NaH2PO4H2O y 8.7 g de NaCl en
950 ml de agua y enrasar a 1 litro con agua.
c) Fase mvil de la HPLC.( agua: acetonitrilo: cido actico
glacial, 99:99:2, v/v/v).
Para preparar la fase mvil de la HPLC, se mezclar 990 ml de
agua con 990 ml de acetonitrilo y 20 ml de cido actico glacial.
Si aparecieran compuestos sin disolver, se realizara un filtrado
con un filtro de 0.45 m.
d) preparacin de la solucin madre OTA.
Para preparar la solucin madre de OTA, se deber mezclar los
disolventes (tolueno: cido actico glacial, 99:1, v/v): la
proporcin de esta solucin ser de 99 partes en volumen de
tolueno con una parte en volumen de cido actico glacial.
7.3.3.5.

OTA solucin madre.

Disolver 1 mg de OTA o el mismo contenido en un bulbo, si se obtuvo la

OTA en la forma de la pelcula despus de la evaporacin, en la mezcla de
disolventes para obtener una solucin que contiene aproximadamente 20 a
30 g/ml de la OTA.
Para determinar la concentracin exacta, registrar el espectro de absorcin
entre 300 y 370 nm en un espacio de cuarzo con 1 cm de trayecto ptico,
mientras que usando el disolvente mezcla de como un espacio en blanco.

28

Identificar una mxima absorcin y calcular la concentracin de OTA (c) en

g/ml mediante el uso de la siguiente ecuacin:
Ecuacin 1

Dnde:

= Absorcin determinada por la ola mxima ms larga

(aproximadamente 333 nm).

M = masa molecular OTA = 403.8 g/mol.

= coeficiente de extincin de molaridad de la OTA de la mezcla de

de solvante (3,12) ( =544/moles)

= camino ptico (cm)

La solucin OTA estndar (2 mg / ml en tolueno: cido actico, 99:1, v / v)

Diluir la solucin madre con la mezcla de disolventes para obtener una
estndar.

29

VIII.

METODOLOGA EXPERIMENTAL.

8.1.

Anlisis de ocratoxina A.

Los anlisis de laboratorio se realizar tomando como referencia el mtodo

OIV-MA-AS315-10 que corresponde a la determinacin de Ocratoxina A en
vinos utilizando columnas de inmunoafinidad y Cromatografa Lquida de
Alto Rendimiento (HPLC).
El mtodo seleccionado est basado en la utilizacin de columnas de
inmunoafinidad tecnologa que es altamente especfica, sensible, rpida en
relacin a las tecnologas tradicionales de purificacin. En este mtodo la
OTA es extrada de la muestra con soluciones de metanol con bicarbonato
de sodio, la misma que es aplicada sobre la columna de inmunoafinidad
que atrapa a la toxina, la columna es lavada para eliminar todas las
interferencias, y la OTA es recuperada de la columna con una solucin
metanol, la toxina recuperada es cuantificada por Cromatografa Lquida de
Alta Resolucin (HPLC), en estado adverso con deteccin fluorimtrica.

8.2. Muestreo.
Para lograr un muestreo representativo es importante considerar los
factores que se establecen en el Reglamento C.E. N 401/2006
(E.C.D.2006): donde establece la forma adecuada del tratamiento de las
muestras, el nmero de muestras que se va a tomar de las bodegas es
segn la tabla N 2, donde especifica el nmero mnimo de muestras y el
volumen de la muestra.

30

Tabla 2: Muestreo de bebidas segn la C.E. 401/2006

forma de

volumen del

nmero

volumen

comercializacin

lote

mnimo de

de la

(expresado

muestras

muestra

en Litros)

(L)

50

50 a 500

500

10

botellas/envases de vino

50

botellas/envases de vino

50 a 500

botellas/envases de vino

500

a granel (zumos de fruta,

bebidas espirituosas,
sidra,vino)
botellas/envases (zumo de
fruta, bebidas espirituosas)
botellas/envases (zumo de
fruta, bebidas espirituosas,
sidra)
botellas/envases (zumo de
fruta, bebidas espirituosas,
sidra)

Fuente: Reglamento (CE) No 401/2006 de la comisin Europea

31

Figura 1. Diagrama de Muestreo de vinos de diferentes bodegas

Vino

Bodega Zapata

Bodega Parras y
Reyes

Bodega Campano

Bodega El Mocho

Vino seco

Vino seco

Vino seco

Vino seco

Vino semi seco

Vino semi seco

Vino semi seco

Vino semi seco

Vino dulce

Vino dulce

Vino dulce

Vino dulce

8.3. Preparacin de las muestras.

Para la preparacin de las muestras se deber verter 10 ml de vino en un
matraz cnico de 100 ml., Aadir 10 ml de la solucin de dilucin (tampn
B), Se deber mezclar vigorosamente, y filtrar a travs de filtro de fibra de
vidrio. La filtracin es necesaria para soluciones turbias o cuando hay
precipitacin despus de disolver.

8.4. La purificacin por columna de inmunoafinidad.

Para la purificacin en la columna de inmunoafinidad se deber configurar
la columna de inmunoafinidad a la bomba de vaco, y adjuntar el depsito
32

de columnas de imnunoafinidad. Se debe de Aadir 10 ml (equivalente a 5

ml de vino) de la solucin diluida en el depsito. Poner esta solucin a
travs de la columna de inmunoafinidad a un flujo de 1 gota por segundo.
La columna de inmunoafinidad no debe secarse. La columna de
inmunoafinidad deber lavarse con 5 ml de solucin de limpieza (Tampn
PBS) y luego con 5 ml de agua a un flujo de 1 a 2 gotas por segundo.
La solucin madre de OTA se deber diluir en un matraz de vidrio con 2 ml
de metanol a razn de 1 gota por segundo. Se evapora el eluato a
sequedad a 50 C con nitrgeno. Se disolver de nuevo inmediatamente en
250ul de la fase mvil de la HPLC y mantener a 4 C hasta que se realice
el anlisis por HPLC.

33

Figura 4: extraccin, purificacin, y cuantificacin de la

ocratoxina A

34

8.5. El anlisis por HPLC

Usando el circuito de inyeccin, se inyectar 100l de extracto reconstituido
(equivalente a 2 ml de vino) en la cromatografa.
Condiciones de funcionamiento

Flujo: 1 ml / min.

Fase mvil: acetonitrilo: agua: cido actico glacial (99:99:2, v / v / v)

Detector de fluorescencia: longitud de onda de excitacin = 333 nm

Longitud de onda que emite = 460 nm

Volumen de inyeccin: 100l

8.6. Cuantificacin de ocratoxina A (OTA)

La cuantificacin de la OTA deber calcularse midiendo el rea o la altura
de los picos en el tiempo de retencin OTA y en comparacin con la
calibracin curva.
8.6.1. Curva de calibracin.
Se preparar una curva de calibracin diaria (si el anlisis se realiza en
varios das) y cada vez que las condiciones cromatogrficas lo requiera.
Para ello se tendr que medir 0,5 ml de la solucin estndar de OTA a 2
mg/ ml en un matraz de vidrio y se evapora el disolvente usando nitrgeno.
Se disolver de nuevo en 10 ml en la fase mvil de HPLC, que fue
previamente filtrada utilizando un filtro de 0,45 m .Esto producir una OTA
de 100 ng/ml de solucin .luego se preparar 5 soluciones de calibracin de
HPLC en cinco matraces aforados de 5 ml. Inyectar 100 l de cada solucin
en la HPLC.
8.6.2. Clculos.
Calcular la concentracin de OTA (COTA).En ng/ml (equivalente a g/l)
mediante el uso la siguiente frmula:
35

Ecuacin 2
Dnde:
Es el volumen de la ocratoxina A (en ng) en la parte alcuota de la
plantilla inyectada en la columna y evaluado a partir de la curva de
calibracin.
F: es el factor de dilucin.
V1: es el volumen de la muestra a ser analizada (10 ml)
V2: el volumen de la solucin de prueba y se inyecta en la columna (100 l)
V3: es el volumen de la solucin para disolver el efluente seco (250 l).

8.7.

Metodologa de abatimiento de la Ocratoxina A.

8.7.1. Sulfitado.
Tratamiento de la materia prima.
La materia prima para elaborar vino tinto ser obtenida de la produccin
regional del fundo de propiedad Parras y Reyes de uva variedad negra
criolla la cantidad de 100kg.
Para poder evaluar el efecto del sulfitado se deber de realizar el
proceso de elaboracin de vino tinto a diferentes concentraciones de
anhdrido sulfuroso, metabisulfito de sodio y bisulfito de potasio las
cuales se realizar el sulfitado inmediantamente despus del proceso de
estrujado, tambin se evaluar en una muestra testigo sin tratamiento,
de tal manera que se va a evaluar el poder de abatimiento o reduccin
de la concentracin de ocratoxina A en vino tinto.

36

Diagrama N 2 .Proceso de sulfitado del mosto.

Uva

Recepcin de la uva

Despalillado- Estrujado

Raspon

sulfitado

SO2:0.05,0.08,0.1g/L

Na2S2O5:0.05,0.08,0.1g/L

S2O5K2:0.05,0.08,0.1g/L

muestreo

8.8.

Diseo experimental.
El diseo estadstico que se va a emplear es el de diseo de bloques
completo al azar para la determinacin de ocratoxina A segn la
variedad de vino y las cuatro bodegas de donde se obtendr las
muestras a analizar, siendo 36 las unidades experimentales.
Modelo aditivo lineal.

Ecuacin 3

37

Tabla 3: Diseo experimental de anlisis de las muestras de vino

tinto
BODEGAS
seco

semi seco

dulce

R1

R1

R1

R2

R2

R2

R3

R3

R3

R1

R1

R1

R2

R2

R2

R3

R3

R3

Parras y

R1

R1

R1

Reyes

R2

R2

R2

R3

R3

R3

R1

R1

R1

R2

R2

R2

R3

R3

R3

Zapata

El Mocho

Campano

8.9.

TIPOS DE VINO

Diseo experimental para muestras con tratamiento de sulfitado.

El diseo estadstico que se va a emplear un Diseo de Bloques al
Azar para la determinacin de ocratoxina A en el mosto segn los
tres tratamientos se sulfitado y se analizar una muestra testigo.

38

Tabla 4: Diseo experimental para evaluar el poder de abatimiento

de la ocratoxina A.
FUENTE

ADITIVO TRATAMIENTO

M1

SO2

REPETICIN

ST

R1

R2

R3

T1

R1

R2

R3

T2

R1

R2

R3

T3

R1

R2

R3

T1

R1

R2

R3

T2

R1

R2

R3

T3

R1

R2

R3

T1

R1

R2

R3

T2

R1

R2

R3

T3

R1

R2

R3

MOSTO

Na2S2O5

S2O5K2

39

IX.

ANLISIS ESTADSTICO.
Se realizara un anlisis de varianza ANVA, si se encuentra significancia en
los datos obtenidos, se proceder a realizar una prueba de comportamiento
mltiple de Tukey con = 0.05.

X.

RESULTADOS.

Tabla 4: nivel de ocratoxina A en vino tinto.

FUENTES

GRADOS

SUMA DE

CUADRADOS

VALOR

DE

DE

CUADRADOS

MEDIOS

VARIACION

LIBERTAD

TRAT
BLOQ
ERROR
TOTAL

40

XI.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.

Meses

Actividades
Revisin bibliogrfica
Formulacin de marco terico
Adquisicin de materiales e

1
x

x
x
X

Implementacin de laboratorio

Revisin de estrategia experimental

insumos

Anlisis de resultados

Redaccin de informe final

Ejecucin de experimentacin
Ordenamiento de resultados

41

XII.

BIBLIOGRAFIA.

Micotoxinas de importancia mundial. (Enero de 2008). Obtenido de

http://fao.org/docrep/005/y 1390s04.html
Aflotoxinas. (mayo de 2009). Recuperado el junio de 2013, de
http://www.umm.edu/esp_ency/article/002429fod.htm
Micotoxinas y micotoxicosis de importancia en la salud humana en
Colombia . (junio de 2009). Recuperado el Mayo de 2013, de www.wpsaaeca.com/img/informacion/05/06/54_micotoxinas.pdf
Abarca. (2000). Taxonomia e identificacion de especies implicadas en las
ASPERGILLUS NOSOCOMIAL . Micol.
Adams. (2000). Agentes no bacterianas de enfermedades transmitidas por
los alimentos. Londres: Royal Society.
Anton. (2001). Hongos y micotoxinas. Fundacion iberica para la seguridad
Alimentaria. Madrid.
Araujo, C. E. (2009). Validacion de un metodo de analisis para ocratoxina A
en cafe verde, utilizando columnas de inmunoafinidad y cromatografia
liquida de alta resolucion. Ecuador.
Berenger. (2000). Hongos en microbiologia alimentaria: Metodologia
analitica para alimentos y bebidas . Diaz de Santos.
COFENAC. (2004). Norma Tecnica Ecuatoriana para cafe verde de la
especie Arabico . Manta.
Coker, R. (1997). Analisis de control de micotoxinas: contradicciones y
oportunidades. Boletin 73.

42

Fernandez. (2005). Obtencion Carbones activados Micro porosos para la

purificacion de gases. Cuba.
Herlitz, E., Saelzer, R., Latorre, B., Tessini, C., Diaz, G., Torres, R., y otros.
(2007). Implementacion, validacion y estudio analitico diagnostico de
niveles de ocratoxina A en vinos producidos en Chile y difusion de medidas
de minimizacion para asegurar su inocuidad y fortalecer su competitividad.
Innovacion en la industria del vino en Chile, 43-45.
Jay. (2002). Microbiologia moderna de los alimentos . Espaa: Zaragoza.
Lopez, d. C. (2003). Ocratoxina A: Exposicion en Espaa y nuevos
aspectos sobre su toxidad. Redalyc.
Marin. (1998). Estado actual y tendencias de la industria del carbon
activado. Cuba: Consultoria Cuba.
Martinez, A. (2012). Desarrollo de carbones activados a partir de residuos
lignocelulosicos para la adsorcion y recuperacion de tolueno y n-hexano.
Espaa.
Moreno, M. y. (2003). Microbiologia de los alimentos . Espaa: Zaragoza.
Muoz Moreno, M. R., Rivas Gonzales del Rey, B. d., Rodriguez lopez, H.,
Reveron Pojan, I., Garcia Moruno, E., Doria, F., y otros. (2012). Patente n
ES 2373852 A 1. Espaa.
Murillo, Amesquita, Gonzales, Lopez, & Bello. (2001). Acerca de la posible
contaminacion por ocratoxina A en alimentos: presencia en vinos y Revision
de los metodos de analisis. Espaa.
Ravelo, A., Rubio, A., Gutierrez, & Torre, H. d. (2011). La ocratoxina A en
alimentos de consumo Humano. Nutricion Hospitalaria, 1215-1226.
Sanchez., G. (2008). Quimica Analitica. Ecuador.
Soriano. (2007). Micotoxinas en alimentos . Espaa: Dias de Santos.
43

Villarroel, M. E. (2009). Estudio de prevalencia de ocratoxina A en vinos

chilenos: importancia toxicologica de los niveles detectados. Chile.

44