1.

CLONACIN DEL ADN

1.1 DEFINICION
Clonar es hacer copias idnticas de unos organismos, clulas, virus o
molculas de ADN derivadas de la replicacin de un nico progenitor
gentico. Mediante la clonacin se puede disponer de cantidades
suficientes de un nico tipo de clulas.
La clonacin de un gen o un fragmento de ADN implica la separacin del
resto del genoma, la unin a una molcula portadora y la insercin en un
organismo

para

poder

amplificarlo

muchas

veces.

Con

este

procedimiento se pueden obtener miles e incluso millones de copias del

gen o fragmento de ADN inicial.
1.2 APLICACIONES
La mayora de los mtodos que permiten clonar fragmentos de ADN en
el laboratorio comparten algunas caractersticas generales. Un sistema
comn es utilizar bacterias (generalmente, Escherichia coli) y sus
plsmidos. Para clonar genes u otros fragmentos de ADN en el
laboratorio, primero se asla un plsmido de una clula bacteriana y
luego se introduce el ADN extrao. El plsmido resultante se convierte
en una molcula de ADN recombinante, que contiene ADN procedente
de dos fuentes distintas. Se vuelve a introducir el plsmido en la clula
bacteriana para obtener una bacteria recombinante, que se reproduce
formando un clon de clulas idnticas. Debido a que las bacterias en
procesos de divisin replican el plsmido recombinante y lo transfieren a
sus descendientes, el gen extrao es clonado al mismo tiempo; es
decir, el clon de clulas contiene muchas copias del gen. Los genes
clonados se emplean con dos propsitos principales; crear muchas
copias de un gen especfico y producir una protena. Los investigadores
pueden aislar copias de un gen clonado creadas por bacterias para
usarlas en investigacin bsica o para proporcionarle a un organismo
una nueva capacidad metablica, como, por ejemplo, la resistencia
contra una enfermedad.

A modo de ejemplo, se puede clonar un gen de resistencia presente en

una especie de cultivo para transferirlo a las plantas de otra especie.
Por otra parte, se pueden sintetizar grandes cantidades de una protena
de uso mdico, como, por ejemplo, la hormona de crecimiento humana,
a partir de cultivos bacterianos que contienen el gen clonado del que
deriva la protena.
La mayora de los genes que codifican protenas solo presentan una
copia por genoma que representa alrededor de una parte por milln de
ADN de manera que la capacidad de clonar fragmentos de ADN tan
escasos es muy til.

1.3 U
T
I
L
I
Z
A
C
I

N
D
E
L
A
S
E
N
Z
I
M
A
S
D
E
R
E

STRICCIN PARA PRODUCIR ADN RECOMBINANTE

La clonacin de genes y la ingeniera gentica fueron posibles gracias al
descubrimiento de enzimas que cortan molculas de ADN en una
cantidad limitada de ubicaciones especficas.
Estas enzimas denominadas endonucleasas de restriccin o enzimas de
restriccin, se descubrieron a finales de la dcada de 1960 cuando los
investigadores estudiaban las bacterias. En el estado natural, estas
enzimas protegen a la clula bacteriana contra la entrada de ADN de
otros microorganismos, como, por ejemplo, lagos u otras especies de
bacterias. Estas enzimas cortan el ADN extrao mediante un proceso
denominado restriccin.
Se han identificado y aislado cientos de enzimas de restriccin
diferentes. Cada enzima de restriccin es muy especfica y reconoce una
secuencia de ADN corta determinada, que se denomina sitio de
restriccin, para luego cortar ambas cadenas de ADN en puntos
especficos dentro de este sitio. El ADN de una clula bacteriana se
protege de las enzimas de restriccin propias agregando grupos metilo (CH) a las adeninas o las citosinas dentro de las secuencias reconocidas
por las enzimas.
1.4 CLONACIN DE UN GEN EUCARIONTE EN UN PLSMIDO
BACTERIANO
El plsmido original se denomina vector de clonacin, que se define
como una molcula de ADN que puede transportar ADN extrao a una
clula y replicarse dentro de ella. Los plsmidos bacterianos se emplean
en forma universal como vectores de clonacin debido a dos razones.
En primer lugar, pueden aislarse con facilidad de las bacterias y
manipularse para formar plsmidos recombinantes mediante la insercin
de ADN extrao in vitro, y luego volver a introducirse en las clulas
bacterianas. En segundo lugar, las clulas bacterianas se reproducen
con rapidez y en el proceso multiplican todo el ADN extrao que
albergan.

a) PRODUCCIN DE CLONES EN CELULAS

En la figura se detalla un mtodo de clonacin de un gen humano

especfico o un gen de alguna otra especie eucarionte a travs de
un vector de clonacin representado por un plsmido bacteriano.
1. Se comienza con el aislamiento del plsmido bacteriano de
las clulas de E. coli y del ADN que contiene el gen en
cuestin de clulas humanas cultivadas en el laboratorio. El
plsmido ha sido sometido a ingeniera gentica para portar
dos genes que ms adelante sern tiles.
2. La misma enzima de restriccin digiere tanto el plsmido
como el ADN humano y produce extremos cohesivos. La
enzima corta el ADN del plsmido en el nico sitio de
restriccin dentro del gen lacZ, pero tambin corta el ADN
humano en mltiples sitios, generando varios miles de
fragmentos. Uno de los fragmentos del ADN humano
transporta el gen de inters.
3. Luego se mezclan los fragmentos de ADN humano con
plsmidos cortados para permitir la formacin de pares de
bases entre los extremos cohesivos complementarios.
4. El ADN preparado en el paso 3 se mezcla con bacterias
portadoras de una mutacin en su propio gen lacZ, que las
incapacita para hidrolizar la lactosa. Bajo condiciones
experimentales adecuadas, las clulas adquieren el ADN
extrao por transformacin. Algunas clulas obtienen un
plsmido recombinante portador del gen en cuestin.
5. En este caso la clonacin, las bacterias se siembran en un
medio solido de nutrientes (agar) que contiene ampicilina y
x-gal, que es una molcula similar a la lactosa. El uso de
este medio permite identificar los clones de clulas
transformadas con un plsmido recombinante.

2. SECUENCIACIN DEL ADN

Si se dispone de un preparado puro de muchas copias de un fragmento de
ADN de hasta 800 pares de bases de longitud, se puede determinar la
secuencia del fragmento en una mquina de secuenciacin. El cientfico
britnico Frederick sanger desarrollo la tcnica de secuenciacin sistemtica
que se describe en la figura; es la que se denomina con frecuencia mtodo
de terminacin de la cadena por didesoxirribonucleotidos. Incluso con la
automatizacin la secuenciacin, los 2900 millones de pares de bases de un
conjunto haploide de cromosomas humanos representan un desafo
formidable.
Se han determinado la secuencia de numerosos genes y segmentos de ADN
adyacentes pertenecientes a bacterias, virus y plantas, as como al ser
humano. La secuenciacin de una molcula de ADN de gran tamao
empieza por la introduccin de cortes en el ADN con endonucleasas de
restriccin adecuadas que dan lugar a segmentos de tamao ms
manejable. Los productos de restriccin dan lugar an mapa de restriccin
caracterstico para cada ADN. Un protocolo se basa en la generacin de
productos de restriccin parciales, en los que el ADN se encuentra marcado
en un extremo.
En los ltimos aos se han desarrollado varios mtodos para la
secuenciacin rpida de cadenas polidesoxirribonucleotidos largas. Estos
mtodos son muy exactos. Las digestiones con distintos enzima de
restriccin producen una coleccin de fragmentos con regiones solapadas,
de secuencias nucleoticas. Adems, la exactitud de estos mtodos aumenta
si se secuencia la cadena complementaria. Estos procedimientos tambin se
pueden emplear para secuenciar molculas de ARN di previamente se
convierte la secuencia de ARN en una de ADN complementaria, mediante el
enzima transcriptasa inversa. Es posible realizar secuenciaciones de hasta
500 nucletidos seguido en una nica operacin automtica pudiendo
determinarse rutinariamente secuencias de 10000 pb, que equivalen a la
longitud media de un gen.

2.1. IDENTIFICACIN DE LOS GENES QUE CODIFICAN PROTENAS

EN LAS SECUENCIAS DE ADN
Las secuencias de ADN se renen en bancos de datos en la
memoria de un ordenador para estar disponibles para los
investigadores de todo el mundo a travs de internet. Cuando los
cientficos desean identificar genes que codifican protenas aun no
conocidas, emplean programas para escanear estas secuencias
almacenadas en busca de seales de inicio y de detencin de la
transcripcin y la traduccin, sitios de corte y empalme del ARN y
otros signos presentes en los genes que codifican protenas.