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Studente: Serena Cucinotta - Relatore: Prof.

Mario Pellegrino
Ruolo neuroprotettivo dell'attivazione dei recettori
per l'acetilcolina di tipo nicotinico
Introduzione
I recettori nicotinici (nAChR Nicotinic acetylcholine receptors ) sono recettori colinergici, che
formano canali cationici (Na+ Ca++ K+) attivati dal ligando, l'acetilcolina, i quali mediano la
trasmissione sinaptica veloce a livello della giunzione neuromuscolare, dei gangli autonomi e di
vari siti nel SNC. Qui sono coinvolti i neuroni di tre regioni specifiche: i neuroni del ponte
dorsolaterale, che hanno numerosi bersagli all'interno del SNC e sono coinvolti nel sonno REM; i
neuroni del Prosencefalo basale, la maggior fonte di innervazione colinergica di origine corticale,
coinvolti nell'apprendimento; i neuroni della regione mediale del setto pellucido, che proietta i suoi
assoni soprattutto verso il sistema limbico [1].
La struttura dei nAChR [2] consiste in un pentamero, nel quale le subunit sono disposte in modo
da circoscrivere un poro di 0,7 nm di diametro. Queste subunit (PM ~ 56 kDa) sono formate da
quattro domini transmembrana (denominati M1, M2, M3, M4), uniti tra loro da tre anse, due
intracellulari ed una extracellulare. I domini M2 di ogni subunit costituiscono il poro del recettore; il
dominio M4 quello pi lontano dal poro e interagisce maggiormente con il bilayer lipidico; i domini
M1 e M3 sono in posizioni opposte e disposti perpendicolarmente ai domini 2 e 4. La coda
amminoterminale e quella carbossiterminale si trovano
entrambe sul versante extracellulare. La catena che porta
la terminazione amminica contiene il dominio per il
legame dell'acetilcolina (LBD Ligand Binding Domain) vedi sezione Attivazione del recettore. Il legame con
l'acetilcolina porta ad una modifica del poro: in questa
conformazione, la molecola recettoriale in grado di far
passare, in maniera non selettiva, i cationi, senza liberarli
dalla loro bolla di solvatazione. Il dominio M2 funge da
gate: dei residui di leucina, uno per ogni subunit,
chiudono il poro; quando il recettore lega le molecole di
acetilcolina, i domini M2 di ogni subunit ruotano di 90
attorno al proprio asse, allontanando i gomiti di leucina
dal centro del poro, lasciando passare i cationi idrati. Il
filtro per gli anioni assicurato dalla presenza di tre
dischi con carica parzialmente negativa, formati da
residui che sporgono all'interno del poro.
Nei vertebrati si possono distinguere due gruppi di recettori, in base alla loro localizzazione: i
recettori nicotinici di tipo muscolare, formati da 4 subunit diverse (2 nel muscolo innervato
delladulto e 2 nel muscolo embrionale); i recettori nicotinici di tipo neuronale, omo- od
etero-pentameri formati da due differenti subunit (, con 8 sottotipi ( 2 9) e , con 4 sottotipi (2
- 5)). Le subunit possono unirsi a formare tantissime isoforme recettoriali: in questo modo la
risposta pu essere modulata in maniera specifica per ogni tessuto.
Nel SNC, il recettore maggiormente rappresentato omopentamero 7, che viene espresso in tutti
i tessuti nervosi, tranne nel talamo, caratterizzato dalla presenza esclusiva del recettore
eteromerico 42. Oltre a queste due isoforme recettoriali, sono state identificate differenti
combinazioni degli mRNA delle altre subunit del recettore nelle strutture del sistema nervoso
centrale e periferico, aventi differenti propriet fisiologiche e farmacologiche: questi sottotipi
presentano diverse affinit per il ligando e i siti di legame per lo stesso sono posizionati in maniera
diversa sulla molecola [3]. Questo tipo di diversit si riflette anche nella permeabilit del canale ai
cationi, che varia in base alle subunit che formano il recettore stato dimostrato che la
composizione del recettore influenza il grado di permeabilit dello stesso per il Ca 2+: i recettori
omomerici 7 hanno mostrato una corrente frazionaria per il calcio (ovvero la porzione della
corrente whole-cell portata dal calcio) molto pi alta dei recettori eteromerici [4]; questi valori di
permeabilit per il calcio, associati a sottotipi particolari di nAChR, rappresentano un'ulteriore
indicazione sul loro importante ruolo fisiologico.

Attivazione dei nAChR


L'acetilcolina
La molecola dell'acetilcolina (ACh) [Fig.1] interviene nella
trasmissione degli impulsi nervosi, detta appunto
trasmissione colinergica. E' un estere acetico della colina,
sintetizzato in alcuni neuroni (sia nel SNC che nel SNP),
tramite una reazione catalizzata dall'enzima Colina Acetiltransferasi (ChAT EC 2.3.1.6), che trasferisce un gruppo
Fig
acetile dal suo coenzima, l'Acetil-CoA, alla colina. La sintesi. 1: Struttura dell'acetilcolina
di questa molecola avviene nelle terminazioni nervose, dove l'acetilcolina viene depositata in
vescicole e quindi rilasciata nello spazio sinaptico. Qui raggiunge i recettori dando il via alle
risposte nella cellula post-sinaptica. Il sito di legame per l'acetilcolina situato tra una subunit e
la subunit adiacente: qui si forma una tasca aromatica idrofobica, all'interno della quale si
inserisce l'acetilcolina; si forma quindi un'interazione non covalente tra il catione e questo sistema
ricco di elettroni, che neutralizza la carica positiva del neurotrasmettitore.
Nella maggior parte dei recettori, troviamo pi di una subunit , quindi la molecola ha, nel suo
insieme, almeno un secondo sito di legame per l'acetilcolina, molto simile al primo, che agisce con
questo in maniera cooperativa: per l'attivazione del recettore necessario che tutti i siti per
l'acetilcolina siano occupati.
Con i recettori attivati, si verifica un rapido aumento della permeabilit della membrana
postsinaptica ai cationi, che determina una depolarizzazione della stessa. Nelle cellule nervose, se
la depolarizzazione mediata da trasmettitore (che viene chiamata potenziale post-sinaptico
eccitatorio veloce EPSP) sufficientemente grande, si genera un potenziale d'azione.
La nicotina
La nicotina un alcaloide che viene prodotto da alcune specie di vegetali come deterrente per gli
erbivori. Essa viene prodotta nelle radici, a partire da acido nicotinico e dal catione N-metil- 1pirrolinio, derivante da una molecola di ornitina. La nicotina
espleta la sua funzione tossica agendo come agonista
dell'acetilcolina, ovvero mima l'azione del neurotrasmettitore nel
legame con i suoi recettori. Essa infatti presenta un ammonio
parzialmente carico che interagisce con un residuo di triptofano
presente nel sito attivo, cos come accade per l'acetilcolina. Si
visto che la molecola di nicotina in grado di legarsi con alta
affinit ai recettori neuronali, ma con bassa affinit a quelli
muscolari. Questa differenza non deriva da caratteristiche
intrinseche del sito attivo, bens dai residui che si trovano al di Fig. 2: Struttura della nicotina
fuori di esso [5].
Risposte attivate: ruolo neuroprotettivo dei nAChR
Il sistema colinergico proietta gli assoni verso la maggior parte delle aree dell'encefalo, collegate
alle funzioni cognitive, mnemoniche e dell'apprendimento. L'indebolimento della trasmissione
colinergica e la degenerazione dei neuroni che fanno parte di questo sistema sono stati riscontrati
nella malattia di Alzheimer, la pi comune forma di demenza degenerativa. La malattia dovuta ad
una diffusa distruzione dei neuroni, causata dall'accumulo del -amiloide, un peptide derivante
dalla scissione dell'APP (Amyloid Precursor Protein), una proteina di membrana espressa in
diversi tipi di cellule. Dati sperimentali evidenziano che la -amiloide lega in maniera forte e
specifica i recettori 7, bloccando quindi le risposte che deriverebbero dall'attivazione di questi. La
conseguenza di ci quindi l'impossibilit per i neuroni di trasmettere gli impulsi nervosi e la
progressiva atrofia del cervello. Studi clinici ed epidemiologici hanno suggerito quindi che
l'attivazione dei recettori nicotinici, in particolare dei sottotipi 7 e 42, tramite la somministrazione
di molecole agoniste come la nicotina, potesse avere un ruolo neuroprotettivo nei confronti di
queste malattie degenerative. La nicotina stata un prototipo di agonista, ma sono state sviluppate
molecole pi efficaci e selettive nei confronti dei nAChR: l'epibatidina e il ABT-594 hanno
dimostrato una notevole attivit nicotinica, soprattutto per il sottotipo 42, ma si legano con bassa
affinit con i recettori 7; al contrario la molecola GTS-21 fortemente selettiva per questi ultimi e
ha una debolissima affinit con i primi [3].

Fig. 3: (A) Epibatidina; (B) ABT-594; (C) GTS-21


La generazione di segnali calcio-dipendenti e la regolazione dell'espressione di alcuni geni sono
state prese in considerazione come possibili meccanismi che potrebbero essere implicati negli
effetti neuroprotettivi dell'attivazione dei nAChR.
Risposte calcio-dipendenti e plasticit neuronale
I recettori nicotinici, una volta attivati, aumentano la permeabilit per il calcio della membrana postsinaptica, sia direttamente (essendo essi stessi canali) sia indirettamente (la depolarizzazione pu
attivare i canali calcio voltaggio-dipendenti VOCCs). Quest'aumento della concentrazione
intracellulare di Ca++, attiva una serie di meccanismi a cascata, tra i quali le cascate segnale
ERK/MAPK: la conseguente attivazione delle proteine nucleari CREB (cAMP Response ElementBinding proteins) di particolare interesse, in quanto implicata nel mantenimento della plasticit
neuronale [4]. Le proteine nucleari CREB sono infatti fattori di trascrizione che modulano
l'espressione di quei geni che contengono il CRE (cAMP Response Element) nel loro promotore,
come ad esempio il gene del fattore neurotrofico cerebrale, quello della tirosina idrossilasi e quelli
di molti neuropeptidi. Il trigger l'innalzamento del calcio intracellulare: l'attivazione dell'adenilato
ciclasi di questo, che causa un incremento di cAMP, porta all'attivazione della PKA (proteina
chinasi A) che fosforila e attiva queste proteine, che legano il promotore. Studi su vari organismi
(come Aplysia, Drosophyla e topi [6]) hanno evidenziato che la trascrizione dei geni dipendente
dalle proteine CREB fortemente correlata al mantenimento della memoria a lungo termine e in
altre forme di memoria, tra le quali la memoria spaziale.
E' stata evidenziata la necessit dei recettori 7 nell'induzione del fenomeno di Long term
potentiation (LTP) di tipo anti-Hebbian [7]. In campo neurobiologico, con il termine LTP, ci si
riferisce ad un'amplificazione a lungo termine della trasmissione del segnale, che si ottiene
stimolando due o pi neuroni in maniera sincrona: la stimolazione tetanica induce delle
modificazioni molecolari a livello delle giunzioni sinaptiche, che dipendono, nella fase tardiva dalla
trascrizione di particolari geni, coadiuvata dalle CREB, nella cellula post-sinaptica. Questo
meccanismo cellulare quindi alla base dei processi di apprendimento e memoria, in quanto
determina la capacit delle sinapsi chimiche di modificare la loro intensit di risposta (plasticit
sinaptica). Il tipo di LTP Anti-Hebbian richiede la depolarizzazione della membrana pre-sinaptica e
la simultanea iperpolarizzazione della membrana post-sinaptica; secondo gli studi suddetti, esso
dipende dall'attivazione dei recettori colinergici, in particolare del sottotipo 7. Questi studi sono
stati effettuati su sezioni ippocampali (prelevati da topi transgenici 7-/- ), contenenti per il 50%
cellule O/A (interneuroni che mediano l'inibizione anterograda e retrograda delle cellule piramidali,
le quali non presentano recettori nicotinici). noto, da studi precedenti, che queste cellule
esprimono, sia in sede presinaptica che in quella postsinaptica, un notevole numero di nAChR di
tipo 7. Nel caso dei topi transgenici 7-/-, la stimolazione ad alta frequenza delle fibre colinergiche
dell'ippocampo non produce una corrente eccitatoria post-sinaptica (EPSC) e, di conseguenza,
non viene indotto il LTP; questo sottolinea l'importanza cruciale di questi recettori in questa forma
di plasticit sinaptica.
L'attivazione dei nAChR e l'espressione genica
L'espressione di geni, mediata dall'attivazione dei nAChR, di centrale importanza nel
mantenimento del SNC: tra le molecole codificate troviamo ad esempio l'enzima Tirosina
idrossilasi (TH) e i fattori neurotrofici.

La tirosina idrossilasi un enzima appartenente alla famiglia delle ossidoreduttasi (E.C.1.14.16.2)


che catalizza la reazione che porta alla formazione della L-3,4-diidrossifenilalanina (L-DOPA), il
precursore della dopamina. L'enzima viene finemente regolato tramite fosforilazione: il dominio di
regolazione presente sulla coda N-terminale della proteina, comprende quattro siti di fosforilazione,
corrispondenti a quattro serine, sui quali agiscono diverse chinasi dipendenti dalle proteine 14-3-3
[8]. In particolare la fosforilazione della Ser19, ad opera di una chinasi calcio-calmodulina
dipendente, aumenta il grado di fosforilazione della Ser40, da parte di una chinasi cAMPdipendente, portando ad un incremento dell'attivit enzimatica. Le catecolammine agiscono a
feedback negativo, legandosi al sito attivo, impedendo la riduzione del Fe(III).
La reazione catalizzata dalla TH la tappa limitante della sintesi delle catecolammine e, dal punto
di vista clinico, le alterazioni dell'attivit di questo enzima potrebbero essere coinvolte nello
sviluppo di alcune malattie degenerative, come lo stesso Alzheimer: nei soggetti colpiti da questa
malattia, l'attivit enzimatica della TH risulta notevoltmente ridotta. Un trattamento a lungo termine
con nicotina aumenta la concentrazione dell'mRNA dell'enzima e, conseguentemente, anche la
sua attivit, sia in vivo che in un preparato di cellule cromaffini [9]. Questo risultato evidenzia
innanzitutto il collegamento tra l'espressione del gene della TH e l'attivazione dei nAChR e, non
meno importante, quello tra questi recettori e le risposte dipendenti dalla concentrazione di calcio
intracellulare.
Nel SNC, molte popolazioni cellulari necessitano della presenza dei fattori neurotrofici per la
sopravvivenza e per il mantenimento delle loro funzionalit. Il depauperamento di simili molecole
pu causare un'atrofia neuronale, come accade nei normali processi di invecchiamento e che
diviene patologica nei malati di Alzheimer e di Parkinson. La ricerca sta cercando di determinare
quale di questi fattori potrebbe avere potenzialmente un ruolo nella prevenzione e nella riduzione
della perdita di cellule nervose. Anche in questo caso, l'attivazione dei recettori nicotinici potrebbe
avere un ruolo chiave. Alcuni studiosi hanno focalizzato l'attenzione sulla famiglia dei fattori di
crescita dei fibroblasti (FGF Fibroblast Growth Factor), in particolare, nello studio preso in esame
in questo testo [3], il FGF-2; questo fattore implicato nella promozione della mitosi e
differenziazione dei neuroblasti e nella sopravvivenza e nell'allungamento assonico dei neuroni di
svariate zone del cervello, tra le quali la corteccia cerebrale, l'ippocampo, il setto pellucido e il
mesencefalo.

Fig. 4: Analisi
dell'espressione dell'mRNA di FGF-2, tramite ibridazione in situ - sezione coronale del cervello
attraverso la substatia nigra. (Scale bar = 3.3mm) [3]

Tramite ibridazione in situ, sono stati valutati gli effetti della nicotina sui livelli di mRNA del FGF-2 in
diverse zone del cervello di ratto: sono stati effettuati trattamenti intermittenti di nicotina ad alte
concentrazioni (quattro iniezioni ad intervalli di 30 minuti 1mg/kg) che hanno portato ad un
aumento sostanziale dell'mRNA nella corteccia celebrale, nell'ippocampo, nello striato e nel
mesencefalo ventrale. Un trattamento simile stato effettuato con altri agonisti dei nAChR

(Epibatidina 50g/kg; ABT-594 84g/kg) e il risultato quello mostrato in [Fig.4]: l'espressione


dell'mRNA di FGF-2 viene indotta dall'attivazione dei recettori nicotinici in varie zone del cervello
ed sempre accompagnata dall'incremento della concentrazione della proteina; il grado di questa
espressione maggiore nei trattamenti con epibatidina, di media intensit nei trattamenti con ABT594, mentre di bassa entit nei campioni trattati con nicotina; si evidenza inoltre una selettivit da
parte del ABT-594 per i recettori 42 l'ibridazione in situ ha mostrato una maggior espressione
dell'mRNA nella sezione frontoparietale della corteccia celebrale e nelle cellule non neuronali e
questo suggerisce che questo sottotipo possa essere implicato preferenzialmente nell'attivazione
del gene per il FGF-2. Quest'ultima considerazione trova alcune evidenze sperimentali, se
vengono effettuati sui ratti dei pretrattamenti sia con metil-licaconitina (MLA), un antagonista
preferenziale dei nAChR di sottotipo 7, sia con diidro--eritroidina (DhE), antagonista
preferenziale del sottotipo 42, prima dei trattamenti con nicotina: nel primo caso non si verifica
alcuna modifica sull'effetto della nicotina, ovvero l'espressione dell'mRNA viene comunque
aumentata; al contrario, nel secondo caso si ha un blocco quasi completo degli effetti della nicotina
sui livelli di FGF-2, fatta eccezione per le cellule del giro dentato, dove si verifica un incremento di
trascritto. Da qui si deduce che l'attivazione del gene di FGF-2 sia indotta principalmente dai
recettori di tipo 42 tranne nell'ippocampo, dove si pensa sia coinvolto anche il sottotipo 7 che in
questa regione maggiormente espresso.
Conclusioni
Nello scenario complesso della trasmissione neuronale, i recettori nicotinici sembrano ricoprire un
ruolo pi importante di semplici canali: le intrigate vie intracellulari attivate da questi recettori
potrebbero essere invece alla base dell'elaborazione dei complessi segnali nervosi e del
mantenimento della rete neuronale. Lo studio di questi meccanismi molecolari potrebbe essere un
valido punto di partenza per lo sviluppo di nuove forme terapeutiche, mirate alla prevenzione nei
confronti di malattie degenerative come il morbo di Alzheimer o di Parkinson. Inoltre, l'importanza
delle complesse vie calcio-dipendenti e della loro fine regolazione, nell'insieme dei processi vitali
della cellula, rende questi recettori, intensamente implicati in queste vie, ancora pi interessanti dal
punto di vista puramente scientifico.
Riferimenti Bibliografici

1. Ganong, Fisiologia medica, Piccin Ed. Padova, Cap. 4 pp. 51-53, Cap. 13, pp. 149-150
2. Neuronal nicotinic receptors: from structure to pathology C. Gotti, F. Clementi* - Prog.
Neurobiol.74 (2004) 363396

3. Central nicotinic receptors, neurotrophic factors and neuroprotection Natale Belluardo,


4.
5.
6.
7.
8.
9.

Giuseppa Mud, Mariann Blum, Kjell Fuxe Behav. Brain Res. 113 (2000) 21 34
Nicotinic acetylcholine receptors and the regulation of neuronal signalling Federico
Dajas-Bailador and Susan Wonnacott - TRENDS in Pharmacological Sciences Vol.25 No.6
June 2004
Nicotine Binding to Brain Receptors Requires a Strong Cation- Interaction X. Xiu*, N. L.
Puskar*, J. A. P. Shanata, H. A. Lester, and D. A. Dougherty - Nature, 2009, 458, 534-537
CREB and memory Alcino J. Silva, Jeffrey H. Kogan, Paul W. Frankland and Satoshi
Kida - Annu. Rev. Neurosci. 1998. 21:12748
In Hippocampal Oriens Interneurons Anti-Hebbian Long-Term Potentiation Requires
Cholinergic Signaling via 7 Nicotinic Acetylcholine Receptors Marilena Griguoli, Giada
Cellot, and Enrico Cherubini - J. Neurosci. 16 January 2013, 33(3): 1044-1049
14-3-3 proteins in neurodegeneration Petra Steinacker, Alastair Aitken, Markus Otto Seminars in Cell & Developmental Biology, Volume 22, Issue 7, Pages 696-704
Differing temporal roles of Ca2+ and cAMP in nicotine-elicited elevation of tyrosine
hydroxylase mRNA Volodia D. Gueorguiev , Richard J. Zeman , Bhargava Hiremagalur ,
Ana Menezes , Esther L. Sabban APJ - Cell Physiology 1999 Vol. 276 no. C54-C65