UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUMICA Y BIOLOGIA

QUIMICA EXPERIMENTAL

Cromatografa liquida de alta resolucin

(HPLC).

Nombre: Catalina Constanzo Snchez.

Profesor: Nicolas Arancibia.
Fecha de Realizacin: 29 de septiembre 2014
Fecha de Entrega: 13 de Octubre 2014
Muestra Problema: T comercial.

Resumen
En este presente informe se presentaran los resultados obtenidos de la
experiencia de cromatografia liquida de alta resolucin HPLC, Practico n 2
realizado en el laboratorio de analisis instrumental, en las proximas paginas se
mostraran los metodos realizados, resultados y manejos de estos, y por ultimo las
distintas discusiones y conclusiones de este practico.

Introduccin
La cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC, es un mtodo de separacin de
mezclas de analitos en el cual la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una
columna de dimensiones reducidas, utilizando una bomba de alta presin para esta
funcin.
La separacin se relaciona principalmente con el coeficiente de reparto de los analitos
entre las fases mvil y estacionaria.
La cromatografa liquida de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin ms
ampliamente utilizada en la actualidad debido a su sensibilidad, a su adecuacin para
realizar determinaciones cuantitativas exactas y a su gran aplicabilidad a diferentes
tipos de sustancias.
Un equipo de HPLC, consiste esencialmente de un sistema de inyeccin, un reservorio
para el disolvente, una bomba peristltica, una columna, un detector y un aparato de
registro.
La separacin se relaciona principalmente con el coeficiente de reparto de los analitos
entre las fases mvil y estacionaria.

Figura 1. Equipo HPLC con sus partes

Objetivos de esta experiencia:

Conocer el manejo de un Cromatgrafo Lquido

Determinar la concentracin de cafena bebida energtica.

Materiales
-Matraces aforados de 100 y 50 ml.
- Pirinolas
-Jeringa
-Agua destilada
-Solucin patrn de cafena 100 ppm
-Bolsas de t
-Micropipetas
-Vasos precipitados
-Agua hirviendo
-Equipo HPLC; con fase estacionaria de y fase mvil de.

Mtodo Experimental.
1. Preparacin de soluciones acuosas de cafena, o patrones de
calibracin de concentracin con 0-10- 30- 40- 60- 80 y 100 ppm
(mg/L)

Matraz aforado de 100 ml.

Calcular volumenes de alcuota

de cafena a utilizar en cada
solucion
Agregar alcuota y enrazar hasta
100 ml

Llevar soluciones al equipo de

cromarografia liquida de alta resolucion

Inyectar muestra y esperar 10 min

aproximadamente para que detecte los
compuestos del t
Identificar rea de la cafena y realizar
curva de calibracion.

Curva de calibracin rea v/s

concentracin

2. Clculo del porcentaje de humedad

Bolsitas de t

Masar vaso
precipitado vacio
Romper bolsita de t y masar un 1
gramo de este.
Colocar vaso precipitado con
1 gramo de t en la estufa,
durante 2 horas.

Conectar electrodos al potenciometro.

Luego de las dos horas secandose en la

estufa, se masa el vaso con t
Calcular masa de t que hay en
el vaso precipitado

Calcular porcentaje de humedad

T seco.

3. Preparacin soluciones de t

Matraz aforado de 50 ml.

Agregar 10 ml de infusion de
t.

Enrazar hasta 50 ml

Inyectar muestra y esperar 10 min

aproximadamente para que detecte los
compuestos del t

Llevar soluciones al equipo de

cromarografia liquida de alta resolucion

Identificar tiempo de retencion y rea de

la cafena
Reemplazar rea en ecuacion de
calibracion

Concentracin de cafena

Resultados
Clculo del porcentaje de humedad
En la Tabla 1. se presentan los datos obtenidos:
Tabla 1:
Masa vaso pp vaco

48.1729g

Masa de T antes de secar

Masa vaso + T despus de
secar
Masa de t seco
Masa Humedad

1.0011g
49,1058g
0.9329 g
0,0682

Utilizando el dato de la masa de humedad obtenida mediante los datos de la tabla 1 se

obtuvo un porcentaje de humedad de 6,813 %.
Tratamiento de datos obtenidos a partir de las soluciones diluidas
Para obtener las soluciones diluidas a partir de la solucin patrn, se calcul primero
el volumen de la alcuota que se deba tomar (Anexo 2). Estos volmenes, se
encuentran reunidos en la Tabla 2. :
Tabla 2:
Solucin
1
2
3
4
5
6
7

Concentracin
(ppm)
0
10
30
40
60
80
100

Volumen de solucin patrn

(mL)
0
0.5
1.5
2
3
4
5

A continuacin, en la Tabla 3. , se adjuntan los datos que arroj el cromatograma para

cada solucin:

Tabla 3:
Solucin

Concentracin
(ppm)
0
10
30
40
60
80
100

1
2
3
4
5
6
7

rea de la
seal
15671
274705
710057
881071
1232543
1808128
2072478

Tiempo de retencin (s)

5.54
4.46
4.42
4.46
4.45
4.44
4.44

Con los datos de la Tabla 3. , se obtuvo la curva de calibracin de la cafena.

Curva de calibracin de la cafena

2500000

rea

2000000
rea de la seal

1500000

y = 20747x + 50782
R2 = 0,9944

1000000
500000
0
0

50

100

150

Concentracin (ppm)

Grfico 1: Curva de calibracin de la cafena

Lineal (rea de la
seal)

Determinacin de la concentracin de cafena

Los resultados obtenidos tras el anlisis de HPLC del t comercial, se pueden apreciar
en la Tabla 4. :
Tabla 4:

Solucin del t

rea

Tiempo de retencin (s)

Muestra

688164

4.44

Contra muestra

809233

4.44

Para calcular la concentracin de cafena que contiene nuestra muestra problema,

ocuparemos la ecuacin de la recta obtenida en el Grfico 1:
Y = 20747x + 50782
Donde Y = rea
X = Concentracin
Ahora, reemplazando los datos de la Tabla 4. , en la ecuacin y realizando los clculos
pertinentes (anexo 3) se obtuvieron las siguientes concentraciones:

Concentracin muestra:

30,72 ppm mg/L

15360 mg/kg
1,58 x 10-4 moles/ L

Concentracin contramuestra:

36,557 ppm mg/L

18278,5 mg/kg
1,88 x 10-4 moles/L

Discusiones

Segn lo arrojado en los respectivos estudios de HPLC se pudo

llegar a la conclusion que el t entregado tendria un contenido de cafena
promedio de 33,639 mg/L, por lo que se observa que este t contiene una
alta cantidad de cafena ya que el promedio de tena por cada 180 ml de t
negro es de 3,6 mg y en este caso este t tendria 6,055 mg en promedio
por cada 180 ml de t o cual es elevado.
En cuanto al porcentaje de humedad, se observa que tiene un 6,813
% de humedad.

Conclusiones
Este practico se llev a cabo siguiendo todas las instrucciones tanto
del profesor, ayudante como tambien del profesional que estaba a cargo
del equipo de cromatografia liquida, percatandose de seguir todos los
procedimientos de seguridad para que este practico saliera bien en todos
los aspectos.
Si se presentasen errores en algunos resultados se deberia a una
mala manipulacion de parte de la estudiante o al la calibracion de algun
equipo utilizado

Biblografa.
-

Fundamentos de qumica analtica, Volumen 2, Douglas A. Skoog, Donald M.

West,F, James Holler.

Qumica analtica moderna, W. F. Pickering.

Guia practico n 1 Analisis instrumental.

Anexos
1.- Clculo porcentaje de humedad
1,0011 100 %
0,0682 x %
x= 6,813 %

2.-Clculo volumen de alicuota de cafena

3.- Clculo concentraciones cafeina muestra y contramuestra

Muestra
688164= 20747x + 50782
688164-50782=20747x
637382 = 20747x
x= 30,72 ppm
Contra Muestra
809233= 20747x +50782
809233 -50782 = 20747x
758451= 20747x
x= 36,557 ppm

30,72 2g
x 1000g
x= 15360 mg/kg
36,557 2 g
x 1000 g
x= 18278,5 mg/kg

Masa molar cafena: 194,19 g/mol

30,72 mg/L 0,03072 g/L
1 mol 194,19 g
x mol 0,03072 g

x= 1,58 x 10-4 moles/ L

36,557 mg/L 0,036557 g/L
1mol 194,19 g
x mol 0,036557
x= 1,88 x 10-4 moles/L

4.- imgenes de cromatogramas

Cromatograma 1.- Blanco

Cromatograma 2.- 10 ppm

Cromatograma 3.- 30 ppm

Cromatograma 4.- 40 ppm

Cromatograma 5.- 60 ppm

Cromatograma 6.- 80 ppm

Cromatograma 7.- 100 ppm

Cromatograma 8.- Muestra problema

Cromatograma 9.- Contra muestra