AISALAMIENTO DE

ENTEROBACTERIAS
I.

OBJETIVO:
Aislar enterobacterias en medios adecuados y desarrollar la prueba de
IMVLC

II.

FUNDAMENTO:
La familia Enterobacteriaceae, est formada por bacterias patgenas y no
patgenas, su morfologa es en forma de pequeos bastones, son grannegativos y fermentan la glucosa. Las que tienen mayor importancia son las de
los gneros Escherichia, Shigella y Salmonella.
En el gnero Escherichia o coliformes se considera como indicador a E. coli de
origen fecal, por su frecuencia. Son lactosa positivos, crecen a 37C a pH=2-7, 4.
Las bacterias del gnero salmonella son lactosa negativas, crecen a 37C, a
pH=7, 2,6.
A 65C mueren en 15 min. Y a 100C en forma instantnea

III.

EQUIPOS Y MATERIALES
Estufa
Autoclave
mechero
bao mara
asas bacteriolgicas
Placas petri con medios de cultivo (EBM, BPLS, VRBA GLUCOSADO Y SS)
Tubos con caldos de enriquecimiento BRILLA y tetrationato inoculados.
Medios de cultivo para la prueba de IMVIC

IV.

PROCEDIMIENTOS:
-

Sembrar en estra del Caldo Brilla al VRBA y EBM

Sembrar en estria del caldo tetrationato al BPLS Y SS
De ambos caldos pueden sembrar al VRBA Glucosado
Luego de incubar a las temperaturas y tiempos adecuados realizar la prueba
de IMVIC para una colonia representativa de E. Coli

Prueba de Indol:
- Inocular en tubos con caldo peptonado o triptosa
- Incubar por 24 horas adicionar de 2 a 3 gotas de reactivo de Kovacs por las
paredes.
- Dejar los tubos en reposo y observar la formacin de un anillo de color rojo
para el resultado positivo, o anillo color amarillo para el negativo.

Prueba del rojo de metilo:

-

Inocular los tubos conteniendo caldo MR-VP

Incubar a los tubos por 72 horas a 37C
Despus de las 72 horas adicionar a 5 gotas de sol. Rojo de metilo y agitar,
Anotar como el rojo de metilo positivo, la aparicin de un color rojo, y
como negativo la aparicin de un color amarillo.

Prueba de Voges Proskauer:

-

Inocular los tubos de caldo MR VP

Incubar a 37C por 48 horas
A un ml de cultivo aadir 0,6ml de sol. De alfa naftol y 0,2ml de sol. KOH
40%
Reaccin positiva: Coloracin rosado a carmes

Prueba del Citrato:

-

Inocular los tubos de Citrato de Simmons.

Incubar a 37C por 24 horas
Anotar como positivo un crecimiento visible, acompaado de un cambio del
color verde al azul.

Pruebas del IMViC

5.1.
Produccin 5.1. Produccin de Indol (I):
de Indol (I)

a-Fundamento: Se determina si la bacteria posee una

enzima (triptofanasa). La triptofanasa hidroliza el
triptfano en indol y alanina. El indol se detecta
empleando un reactivo especfico (Reactivo de
Kovacs). El triptfano forma parte de las peptonas
del medio.
b- Materiales y reactivos: Agua
de peptona

5.1.c- Mtodo:

y Reactivo de Kovacs
c- Mtodo:
Inocular el medio de
cultivo (agua de peptona). Incubar a
37 oC durante 48 horas

Aadir unas gotas de reactivo de

Kovacs. Agitar y dejar reposar el
cultivo. El HCl proporciona el pH cido
que requiere la reaccin. El alcohol
amlico es, insoluble en agua y menos
denso
Un anillo rosa-rojizo en la superficie indica que se ha
5.1.d-Resultado:
Produccin
de formado un complejo coloreado entre el indol y el pdimetilamino
benzaldehdo.El
alcohol
amlico
Indol
concentra el complejo coloreado en la superficie
A la izquierda se observa un cultivo
de E. coli y a la derecha otro
de Salmonella spp

5.2.
Rojo
metilo (M)

5.2.c. Mtodo

de 5.2. Rojo de metilo (M)

5.2.a. Fundamento: Detecta la fermentacin cidomixta. Se acumulan cidos (actico, frmico, etc.),
relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta
4-5. Dicho cambio de pH se detecta aadiendo un
indicador (rojo de metilo) al cultivo
b. Materiales y reactivos: Medio de Clark-Lubs e
indicador de rojo de metilo
Inocular el medio de Clark-Lubs. Incubar a 37 oC
durante 48 horas.

Aadir unas gotas de rojo de metilo (rojo a pH 4-5;

amarillo a pH>6)

5.2.d.
Resultado.
Rojo de Metilo
A la izquierda un cultivo de E. coli y a
la derecha otro de Serratia

5.3.
Voges- Fundamento
Proskauer (V)

5.3.c. Mtodo

5.3.d.Resultado:
Voges-Proskauer

Detecta la fermentacin butanodilica. En esta

fermentacin se producen menor cantidad de cidos
que en la fermentacin cido-mixta, y una gran
cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfanaftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un
precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o
acetona). La acetoina en presencia de oxgeno se
oxida a diacetilo. El diacetilo oriigina una coloracin
roja al reaccionar con los restos guanidnicos de
algunos aminocidos de la peptona del medio (Ej.
Arginina).
b. Materiales y reactivos: El medio de cultivo, es el
mismo que en la prueba del rojo de metilo. Reactivos
:alfa-naftol
Inocular el medio de Clark-Lubs. Incubar a 37 oC
durante 48 hora
Aadir unas gotas alfa-naftol (0.6 ml). Agitar y
aadir KOH (0.2 ml).Agitar. Iincubar 1-2 horas a
37 oC

La acetona en contacto con el oxgeno y la potasa

origina diacetilo. El alfa naftol incrementa la
sensibilidad de la reaccin. El diacetilo origina un
compuesto de color rosado.La prueba ser positiva si
en 20 minutos aparece una coloracin roja. Los
cultivos negativos se incuban 1-2 horas a 37 oC en
posicin inclinada efectundose de nuevo la lectura.
(El contacto con el oxgeno y la elevada temperatura
favorecen la reaccin).

Y a la derecha de E. coli

Se determina la utilizacin del

5.4. Consumo de Fundamento:
citrato
como
nica
fuente
de carbono y energa. La
citratos (C)

prueba emplea un medio definido (Koser) con citrato

como nica fuente carbonada (se detecta turbidez).
Alternativamente se utiliza el medio de Simmons:
utiliza un medio slido con citrato sdico y un
indicador cido-base (azul de bromotimol). En este
caso se detecta la alcalinizacin del medio por el
consumo del citrato.
Materiales y reactivos: Medio de Koser o Medio de
Simmons
Inocular uno de los medios:El medio de Simmons es
5.4.c. Mtodo
slido, y se siembra por estra con asa de platino.
Incubar a 37 oC durante 48 horas
5.4.d.
Resultado: Detectar el crecimiento en el medio de Koser por
Crecimiento sobre turbidez. En el medio de Simmons por alcalinizacin
citrato como unica del cultivo (el indicador toma color azul)

fuente de carbono

Crecimiento en el medio de Simmons:

a
la
izquierda
cultivo
de Salmonella spp. y a la derecha
de E. coli. *Dado que la lectura del
medio de Koser se hace detectando la
turbidez del medio, es necesario
inocular con una pequea cantidad de
bacterias y comprobar que el tubo
permanece casi transparente tras la
inoculacin.

Medios de Cultivo:
EMB agar eosina azul de metileno lactosa sacarosa
Colonias
Transparentes, de color ambarino
Verdosas con un brillo metlico a la luz
reflejada, con el centro negro azulado a la
luz transmitida
Mas grandes que las de E. coli, mucosas,
confluentes, con el centro pardogrisceo a
la luz transmitida

Microorganismos
Salmonella y Shigella
Eschericha coli

Enterobacter, Klebsiella y otros

VRBA Agar violeta cristal rojo neutro bilis

Colonias

Microorganismos

Rojas con halo de precipitacin

Rojizo: de 1-2 mm de dimetro

Enteribatericeas factosa positivas:

coliformes, E. coli

Colonias como puntas de alfiler rosadas

Enterococos, eventualmente Klebsiella.

Incoloras

Enterobactericeas lactosa - negativas

BPLS Agar verde brillante rojo de fenol lactosa sacarosa

Colonias
Rojo rosadas con halo rojo
Verde amarillentas con halo verdeamarillento

Microorganismos
Lactosa negativos y sacarosa-negativos:
Salmonella y otros
Lactosa-positivos o sacarosa-positivos:
E.coli, Citrobacter. Proteus Vulagaris,
Klebsiella y otros. No obstante, a veces
inhibicin completa

SS Agar para salmonella y Shigella.

Colonias
Incoloras, transparentes
Transparentes, con centro negro
Rosadas hasta rojas
Mayores que las de E. coli rosadas hasta de
color cremoso blanquecinas opacas,
mucosas

Microorganismos
Shigella y la mayora de las salmonellas
Proteus y algunas Salmonellas
E. coli
Enterobacter aerogenes

V.

EXPERIMENTACION:
Para poder realizar el experimento se necesitara una semana para
poder realizar las pruebas determinadas.

PROCEDIMIENTO
Caldo brilla a 43C 48
horas
BPLS , SS , EBM 37C
24 horas
IMVIC prueba de indol
43C-24horas
Pruebas de :
CITRATTO :37c24horas
VP:37C-24horas
RM:37 C-24horas

FECHA
Mircoles 20/11/12

HORA
10.00am

Mircoles 21/11/12

11.00am

Jueves 21/11/12

2.00pm

Viernes 22/11/12

2.00pm

Primer da martes:
Se sembr la muestra en el caldo verde brilla k es de unas
caractersticas transparente y color verde oscuro de una
visualizacin brillante. Se deposita la muestra dentro del con el
asa de col y se lleva a la estufa.
Segundo da mircoles:
Del cultivo obtenido del verde brilla que
ahora se observa con un color turbio y perdi
su brillo; se siembra en agares determinados
BPLS, EBM, SS.
Se procede a tomar la muestra con el asa de
col y se siembra en los agares determinados
por el mtodo de estra, esta siembra se realiza en dos placas y se
deja una palca como testigo en cada caso de agar.
Estas placas conteniendo la siembra del cultivo se llevan a la
estufa por 24 horas y a 37 C

 Tercer da jueves:
Se observa el crecimiento de las bacterias y primero k anda se
observa k los testigos estn vicios (sin crecimiento).
BPLS: es un medio para enterobacterias, antes era un color
naranja fuerte, se observa el crecimiento de colonias
amarillas verdosas lo que nos dara como indicador la
presencia de lactosa (+) , pero en una palca creci una
colonia rosado fosforescente lo k tambin podra suponer
el crecimiento de una lactosa (-)

SS: es un agar muy especfico para las lactosas (-) y es de

color naranja marrn, se aprecia k no creci nada todas las
palcas estn limpias.

EBM: el agar es de color rojo oscuro (ladrillo) es una agar

especfico para E.coli y se aprecia k creo colonias de color
verde fosforescente a la luz, lo que nos da a entender la
presencia del E.coli.

 Prueba de indol: se saco la muestra de la palca del cultivo

EMB y lo coloca en el portaobjeto,
le aadi el cristal de violeta, lo
lavo y le aadi lugol para k
decolore, luego se lavo con
alcohol, le aade safranina se
espera y lo lleva al mechero para k
pueda secar, se le aade aceite de
cedro para poder observar en el
microscopio.
De las placas se siembra:
Del cultivo de la placa de EMB cultivo verde fosforescente
y del BPLS de la colonia rosada k creci en tubos de ensayo
para las pruebas, por mtodo de picadura en el agar y por
medio de aadidura en los caldos. Estos se llevan a la
estufa.

Cuarto da viernes:
Se observa los resultados y se realiza las pruebas de
IMVIC

VI.

RESULTADOS:
Se puede decir que como resultado se obtuvo las muestras de enterobacterias ,
la realizar los diferentes tcnicas de estas
En la presente tcnica, se obtuvo crecimiento en los medios de cultivo:
XLD(colonias tranparentes), EMB(colonias verdosas sobre un fondo verde
oscuro),S.S(colonias tranparentes sobre un fondo rojizo) y MC conque
y(colonias tranparentes), as como en a tincin de gram realizada obtuvimos
como resultado: bacilos gram negativos.

VII.

CONCLUSIN:
Se pudo aislar las entrobacterias en los medios de cultivo adecuados y se
logro el desarrollo de la prueba de IMVIC.
En esta prctica logramos identificar como el organismo que se desarrollo
en los medios de cultivo y las pruebas bioqumicas: Echerichia coli, ya que
es una bacteria mvil que es
capazde fermentar la glucosa y la lactosa adems del resultado en la tincin
de gram observamos: bacilos gram negativos(-)

VIII.

BIBLIOGRAFA:
http://www.slideshare.net/carloscevallos/aislamiento-eidentificacin-de-enterobacterias-presentes-en-la-conchanegra-andara-tuberculosa

http://es.scribd.com/doc/51434495/AISLAMIENTO-DEENTEROBACTERIAS.

Universidad Jorge Basadre Grohmann

FCAG/ESIA

LOS PRINCIPALES METODOS DE

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

NOMBRE DE LUMNO: ANNY VARGAS AQUINO

CODIGO:

2011-111010

NOMBRE DEL PROFESOR: Ing. Amelia Castro Gamero

CURSO: MICROBIOLOGIA GENERAL

TACNA-PERU
2012