UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO

CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS

DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA

Roteiro de Aula Prtica de Microbiologia

Aula 5: Preparaes Microscpicas Fixadas: Colorao de Gram
I- Introduo
A colorao de Gram foi desenvolvida, em 1884, pelo bacteriologista dinamarqus Hans Christian Gram. Ela um dos
procedimentos de colorao mais teis, pois classifica as bactrias em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas.
Na tcnica de colorao de Gram so utilizadas quatro solues, as quais so aplicadas sequencialmente ao
esfregao fixado a uma lmina. O primeiro corante, cristal violeta (CV), colore as clulas bacterianas de roxo escuro. Em
seguida, aplicada uma soluo de Iodo (I), denominada lugol. O lugol funciona como mordente, aumentando a interao
entre a clula bacteriana e o primeiro corante, formando um complexo insolvel, cristal violeta-iodo (CV-I). A terceira soluo,
lcool, ento aplicada brevemente e atua como descolorante. Esta etapa crtica da tcnica de colorao diferencial de
Gram. As bactrias Gram-negativas quando lavadas com o descolorante perdem rapidamente o complexo CV-I, ficando
incolores. Devido a diferenas de natureza qumica e estrutural da parede celular bacteriana, as bactrias Gram-positivas
resistem descolorao pelo lcool como removedor do complexo CV-I da clula, permanecendo roxas. A ao do lcool como
removedor do complexo CV-I depende da concentrao de lipdeos e da espessura da parede celular bacteriana. O ltimo
reagente utilizado na colorao de Gram o corante de contraste, safranina ou fucsina, que colore as bactrias Gramnegativas de rosa-avermelhado, mas no altera a cor roxa das bactrias Gram-positivas. Entre outras diferenas, as bactrias
Gram-positivas tm uma parede celular mais espessa de peptideoglicano que
as bactrias Gram-negativas. Alm disso, as bactrias Gram-negativas contm uma camada de lipopolissacardeo como parte
de sua parede celular. Quando aplicado a clulas Gram-positivas e Gram-negativas, o cristal violeta e o iodo penetram
rapidamente nas clulas, formando o complexo CV-I. Este complexo maior que a molcula de cristal violeta que penetrou na
clula e, devido ao seu tamanho, no pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das clulas Grampositivas pelo
lcool. Conseqentemente, as clulas Gram-positivas retm a cor do corante cristal violeta. Nas clulas Gram-negativas,
contudo, a lavagem com lcool rompe a camada externa de lipopolissacardeos, e os componentes CV-I so removidos atravs
da camada delgada de peptideoglicano. Como resultado, as clulas Gram-negativas permanecem incolores at serem
contracoradas com safranina, quando adquirem a cor rsea.
II Objetivo
1 Realizar a tcnica de colorao diferencial de Gram para observao ao microscpico ptico.
III Materiais
Culturas bacterianas: Escherichia coli e Staphylococcus aureus cultivados por aproximadamente 24 h em meio slido.
Equipamentos e utenslios: microscpio ptico composto, ala de repicagem, lminas, bico de Bunsen, bandejas e suportes
para lminas.
Solues e reagentes: cristal violeta, lugol (soluo de iodo), fucsina ou safranina, etanol 95%, gua destilada, leo de
imerso.
IV Procedimento
Colorao de Gram
1- Prepare esfregaos transferindo, ASSEPTICAMENTE, uma pequena poro das culturas bacterianas crescidas em meio
slido para lminas previamente limpas e flambadas, contendo uma pequena gota de gua destilada. Com movimentos
circulares, utilizando a ala de repicagem espalhe a suspenso, formando uma camada fina e uniforme na rea central da
lmina. Aguarde at o esfregao secar completamente ao ar.
2 Fixe o esfregao passando cada lmina duas a trs vezes sobre a chama do bico de Bunsen. Deixe a lmina esfriar ao
ambiente.
3 Inicie a colorao de Gram. Respeite o tempo indicado para cada reagente. Cubra o esfregao com o corante cristal
violeta por um minuto; em seguida, utilizando a piseta, lave o corante com gua destilada;
4 Cubra o esfregao com a soluo de lugol, por dois minutos;
5 Lave o excesso de lugol com gua destilada;
6- Lave a lmina com etanol 95%, rapidamente, at que no se desprenda mais corante da preparao;
7- Lave o excesso de lcool com gua destilada;
8- Cubra o esfregao com soluo de fucsina, durante 30 segundos;
9- Lave novamente a lmina com gua. Em seguida, deixe a preparao secar ao ar ou entre folhas de papel de filtro;
10 Focalize o material usando, seqencialmente, as objetivas de 4X, 10X e 40X;
11- Trave o microscpio; adicione uma gota de leo de imerso sobre o esfregao e observe com a objetiva de 100X,
ajustando o foco com o boto micromtrico;
13 Aps finalizar a observao, preencher os resultados, descartar o material nas bandejas contendo detergente, localizadas
nas bancadas laterais.