20/03/2012

INTRODUO

Western Blot (Immunoblot)

Tcnicas sorolgicas e de biologia molecular no diagnstico de agentes infecciosos

Dr. Carlos Prudencio

Conceito: tcnica analtica

Reagentes comerciais
Areas de bnol, bioqumica e imunologia
Relacionado tecnicas de ELISA e IF
Western blot, Southern blot, Northern blot

MV, MSc, DSc Gentica

Ps-doutorado Biotecnologia
Ps-doc FMVZ/USP

VANTAGENS

DESVANTAGENS

Alta sensibilidade e especificidade;

Reconhecimento de antgenos individuais em
um extrato;
Realizao de perfil de reconhecimento de
antgenos
Cintica de expresso de protenas celulares
Determinao de protenas imunodominantes;

Custo mdio a alto;

procedimento longo e propenso a erros em
diversos pontos;
dependendo do sistema de revelao, pode-se
ter problemas de segurana.

ETAPAS PARA EXECUO DA TCNICA

1 - PREPARAO DE AMOSTRAS

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Amostras
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
Transferncia (Blotting)
Marcao
Deteco
Imagens
Anlises de Imagens

Be gentle! Stay
cool!

Sonicao ou
fora mecnica

Aula do Prof. Joo

Quantificao

20/03/2012

EXTRAO DE PROTENAS

Detergentes
Lise por congelamento e descongelamento
Shock osmtico
Ultrasonicao
Mtodos mecnicos
Digesto enzimtica
Tampes de lise e kits de preparao de amostras
Proteo de amostras
Limpeza de amostras (Sample clean up)
Quantificao

ELETROFORESE

2 - ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)

TAMANHO FORMA E/OU CARGA.

Mr >5000 AT<200 000.

ETAPA 2

GEIS DE POLIACRILAMIDA

ACRILAMIDA
(UNIDADE
MONOMRICA)

BISACRILAMIDA
CROSS LINK

ETAPA 2

CH2= CH
|
C=O

...- CH2 - CH - CH2- CH - CH2 - CH -...

|
|
|
|
C=O
C=O
C=O
NH2
|
|
|
Acrilamida
NH2
NH
NH2
|
CH2
|
NH
|
CH2= CH
C=O
|
C=O
|
...-CH -CH2-CH - CH2 - CH -...
|
NH
|
|
|
C=O
C=O
CH2
|
|
|
NH
NH2
NH2
|

TAMANHO DO PORO
[ monmeros] determina
tamanho dos poros

C=O
|
CH2=CH

Metileno
bisacrila
mida

POLIACRILAMIDA (30% acrilamida; 0,8% N,N-metilenobisacrilamida, 1 00ML)

T- concentrao total de acrilamida

T= (a+b) x 100 = (30+0,8) X 100 = 30%
V
100mL
C - porcentagem de crosslinker POLI
C = b x 100 = 0.8 X 100 = 2,6%
a+b
30.8
Soluo estoque de Acrilamida e Bisacrilamida
30% T; 2,6% C

(30% acrilamida; 0,8% N,N-metilenobisacrilamida, 100ML)

(30 % acrilamida (29 acrilamida: 1 bisacrilamida))

(30% acrilamida; 1% N,N-metilenobisacrilamida, 100ML)

(49% acrilamida; 0,5% N,N-metilenobisacrilamida, 100ML)

TAMANHO DO PORO

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PREPARAO DE AMOSTRAS

Eletroforese

SDS -

Desnaturante
Separao por peso molecular
No redutora
Redutora
Pontes S-S

Amostra

SDS
DTT
BMERCAPTANOL

No desnaturante (Nativa)
Separao por carga, peso e
forma

DTTbM
Preparo tampo da amostra

ACRILAMIDA

PREPARACAO DO GEL

Sistema descontinuo

TAMPES

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PROCESSO

3 - TRANSFERNCIA (BLOTTING)

FIXAR AMPERAGEM
NO FIXAR VOLTAGEM

Transferncia em Tanque

ELETRO-TRANSFERNCIA: Semi-dry- SEMI SECO

Transferncia

Membranas

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Controle de transferncia

4 - IMUNOMARCAO

Passos: Bloqueiro >>>>Anticorpo Primrio >>>>Anticorpo secundrio

A) Bloqueio: Protenas

Bloqueio: Detergentes como agentes de bloqueio

EVITAR REAES INESPECFICAS

EVITAR REAES INESPECFICAS

AUMENTAR ESTRINGNCIA
BLOQUEIO E LAVAGENS

Anticorpos Primrios

Anticorpos Secundrios

Anti - Anticorpos
Tipos de anticorpos
Monoclonais
Policlonais

Enzimas Conjugadas

SOROLOGIA: AMOSTRAS A SEREM TESTADAS

Antgeno

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Enzimas

AP e HRP = Amplificao/Sensibilidade

Alkaline phosphatase (AP)

Horseradish peroxidase (HRP).
Fluorophores
Biotinylated secondary antibodies:
Gold-conjugated antibodies:
Radioisotopes:

Amplificao: Biotina/Estreptavidina

Etapas de incubao/lavagens

AUMENTA SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE

5 - DETECO

MECANISMO QUMICO DE DETECO

DAB /HRP
NBT/BCIP/AP

LUMINOL

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Mechanism of detection chemistries

Colorimetric AP Systems

Colorimetric HRP systems

Colorimetric detection systems

6 - IMAGENS

7 - ANLISES DE IMAGENS

Digital imaging
Chemiluminescence detection using film
Autoradiography
ImageQuant LAS
4000. Sistema de
Imagem
Multifuncional

Typhoon FLA 9500

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3/10/2011

DETERMINACAO DE UMA PROTEI

NA DE INTERESSE
SDS-PAGE

ANLISES
DE IMAGENS
SDS-PAGEdesnaturante
e redutor

-Determinao do PM de uma protena de interesse

Visualizao: AgNO3, azul de Comassie

SDS-PAGE

No distingue um monmero de um dmero de cadeias de

PM igual ou prximo unidos por pontes -S-SNormalizao com controle constitutivo

SDS-PAGE- desnaturante e redutor

e uma protena de interesse

zul de Comassie

No distingue um monmero de um dmero de cadeias de

PM igual ou prximo unidos por pontes -S-S-

o de protenas
o de protenas (Western blot)
nlise por MS
AUGUSTO 2011

-Acompanhar
purificao
de protenas
-Acompanhar
purificao
de protenas
-Acompanhar
expresso
de protenas
(Western
blot)
-Acompanhar
expresso
de protenas
(Western
blot)
-Isolar
protenas
para
anlise
-Isolar
protenas
para
anlise
porpor
MSMS
AUGUSTO 2011

AUGUSTO 2011

AUGUSTO 2011

COLORIMETRIC DETECTION

S-PAGE-EXPERIMENTAL

rado e aplicar as amostras

Gel de empilhamento (4%)densitometry (how

intense the stain- is) or spectrophotometry.
Mobilidade seria

e secas so adicionados 20 uL de tampo

cerol + SDS + Azul de bromofenol (corante
beta-mercaptoetanol). Incuba-se 5 min em
a ao gel.

bandas estreitas de PSDS antes de

entrarem no gel de separao
_

Glicinato- < P-SDS -< ClpI~6,0

HCOOHCOONH3+
NH2

Boa resoluo = bandas estreitas

Permite que protenas migrem

livremente formando uma
pequena pilha

4%
10-15%

10-20 %

LUNINOL

Espcies ajustam [ ]
p/ mesma mobilidade
Cl- > P
P-SDS
SDS - > glicinato-

4%

Gel de aplicao empilhamento

diferente ((mais p
poroso e < p
pH))
do que gel de separao.
4%

Chemiluminescent detection

SDS-PAGE-EXPERIMENTAL

SENSIBILIDADE
ALTO CUSTO
REAPROVEITVEL

Muito baixa-concentrao
fica como banda estreita
na interface entre os
outros anions

Gel separao pH>

SDS-PAGE-EXPERIMENTAL
Gilicinato e Cl migram
-

SDS-PAGE-EXPERIMENTAL

livremente
poros
-Receber o gel preparado e aplicar
aspelos
amostras
AUGUSTO 2011

AUGUSTO 2011

-s amostras dialisadas e secas so adicionados 20 uL de tampo

de amostra (tampo+ glicerol + SDS + Azul de bromofenol (corante
de acompanhamento) + beta-mercaptoetanol). Incuba-se 5 min em
gua fervente e se aplica ao gel.

Gel de empilhamento (4%)bandas estreitas de PSDS- antes de

entrarem no gel de separao
_

Boa resoluo = bandas estreitas

4%

Permite que protenas migrem

3
livremente formando
uma
pequena pilha

4%
10-15%

10-20 %

Anticorpos Fluorescentes: Multiplex

AUGUSTO 2011

pI~6,0
HCOOHCOONH3+
NH2

Espcies ajustam [ ]
p/ mesma mobilidade
Cl- > P
P-SDS
SDS- > glicinato-

4%

Gel de aplicao empilhamento

diferente ((mais p
poroso e < p
pH))
do que gel de separao.

Mobilidade seria
Glicinato- < P-SDS -< Cl-

Muito baixa-concentrao
fica como banda estreita
na interface entre os
outros anions
Gel separao pH>
Gilicinato- e Cl- migram
livremente pelos poros
AUGUSTO 2011

is less sensitive than chemiluminescence.

HIV
Multiplos Ags
Mesmoo MW
Pts de alta e baixa abundancia

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A western blot is also used as the definitive test for Bovine spongiform
encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow disease').

Some forms of Lyme disease testing employ western blotting.

Borrelia burgdorferi

CDC

Lyme disease reactive Western blot

Description of lanes:
Lane 1 - molecular weight marker
Lane 2 - positive patient sample
Lane 3 - positive patient sample
Lane 4 - monoclonal antibodies for 39
and 41kD bands
Lane 5 - monoclonal antibodies for 41kD
band
Lane 6 - monoclonal antibodies for 39
and 41kD bands
Lane 7 - monoclonal antibodies for 31
and 34kD bands
Lane 8 - positive control pool

Western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis

B infection.

In veterinary medicine, western blot is sometimes used to confirm

FIV+ status in cats.
Feline immunodeficiency virus

Cirrhosis of the liver as a result of

Hepatitis B infection
Western blot - Hepatitis B Virus pre S2 Antigen antibody
[S26]

CRPRUDENCIO@USP.BR

MUITO OBRIGADO!!