Aspectos da qualidade da tetraciclina em

preparaes farmacuticas slidas.

Correlao entre os mtodos de dosagem p
cromatografia lquida de alta eficincia e
turbidimtrico

CLIA HITOMI YAMAMOTO

Tese para obteno do grau de

DOUTOR
Orientadora:
Prota. Titular Terezinha J. Andreoli Pint

Slo Paulo
1999

COMISSO JULGADORA

--------------------------------------------\-~-~1---------------------------------------------

Profl Titular TEREZINHA 'QE ";JeSUS ANDREOLl PINTO

"-.

Orientadora presidente

Profl Titular MARIA INS ROCHA M. SANTORO _1 8 Examinadora

Profl Titular RlKA ROSA MARIA KEDOR - 28 Examinadora

ProfB Ora JULlANA M. M. HERNANDEZ - 38 Examinadora

Prot. Dr. OSWALDO DE FREITAS - 5 Examinador

So Paulo, 26 de maro de 1

"ep!A ep o~elue!JO a o~eWJOl e 'opaJ~ o 'epUvlS!Xa e OAap wanb V

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01U!d !loaJpUV snsar ap equ!zaJa.L JelnJ!.l elOJd 'fi

 Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior - CAPES pela concess

da bolsa de estudo.

Profl Miriam Aparecida Pinto Vi/ela, Diretora da Faculdade de Farmcia e Bioqumica d

Universidade Federal de Juiz de Fora no perodo de 1994 a 1998, pelo apoio, orienta
incentivo e grande empenho na transposio de inmeras dificuldades, que fora
fundamentais durante todo o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Lcio Guedes Barra, Diretor da Faculdade de Farmcia e Bioqumica d

Universidade Federal de Juiz de Fora pelo incentivo e interesse demonstrado.

Ao Departamento Farmacutico da Faculdade de Farmcia e Bioqumica da Universidad

Federal de Juiz de Fora.

Aos laboratrios farmacuticos BRISTOL-MYERS-SQUIBB do BRASIL SA e PFIZER LTO

pela doao das substncias qumicas de referncia.

Profl ora Ugia Maria Moreira Campos, responsvel pela disciplina de Controle d
Qualidade Fsico-Qumico do Departamento de Produtos Farmacuticos da Faculdade d
Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais, pela orientao relacionada com
aplicao do mtodo de cromatografia liquida de alta eficincia.

s Profls oras. Mitsuko Taba Ohara e TeIma Mary Sakuda pela amizade e contribuies n
desenvolvimento deste trabalho.

Aos Profs. Titular Joo Fernandes Magalhes e Dr. Jorge Luiz S. Martins pelo constan
estmulo e interesse demonstrado.

Aos funcionrios do Laboratrio de Controle de Qualidade do Departamento de Farmcia d

Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo (CONFAR
representados pelas farmacuticas Rosa Noriko Yamamoto e Janice de Azevedo Campos.

Aos colegas lrene Satiko Kikuchi, Maria Si/vana Alves, Alson da Luz Andr de Arajo, Mar
da Penha Henriques do Amaral, Vaneida Maria Meurer, Lourdes Kiyomi Oshiro e Jos d
Jesus Ribeiro de Pinho pela inestimvel amizade e apoio.

Ao funcionrio Jos de Souza Sobrinho do laboratrio da disciplina de Controle d

Qualidade Biolgico da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de sa
Paulo.
bibliotecria Adriana Ba1T8iros pela orientao e reviso das referncias bibliogrficas.
A todos que de diferentes maneiras apoiaram e colaboraram na execuo deste trabalho.

2.1.4.3. Cloridrato de oxitetracidina

2.1.4.4. Cloridrato de doxicidina
2.1.5. Farmacologia e uso teraputico das tetracidinas
2.2. Estabilidade
2.3. Dissoluo de frmacos a partir de preparaes farmacuticas slidas
2.3.1. Dissoluo de cpsulas e comprimidos
2.3.2.. Dissoluo de preparaes farmacuticas contendo tetracidina
2.3.3. Metodologias desenvolvidas para o ensaio de dissoluo in vitro
2.4. Consideraes gerais sobre os fundamentos da validao
2.4.1. Validao do mtodo analtico
2.4.1.1. Validao do mtodo de cromatografia liquida de alta eficincia
2.5. Determinao quantitativa de antibiticos
2.5.1. Mtodos microbiolgicos
2.5.1.1. Mtodo de diluio seriada
2.5.1.2. Mtodo turbidimtrico
2.5.1.3. Consideraes gerais sobre os mtodos de difuso em gel..
2.6. Determinao quantitativa das tetracidinas
2.6.1. Mtodos microbiolgicos desenvolvidos
2.6.2. Mtodos microbiolgicos oficiais
2.6.2.1. Cloridrato e fosfato de tetraciclina
2.6.2.2. Cloridrato de doxicidina
2.6.2.3. Cloridrato de oxitetracidina
2.6.3.
Determinao
da
tetracidina
cromatogrficos

atravs

de

mtodos

fsico-qu

3. OBJETiVOS.........................................

4. MATERIAL E MTODOS..................
4.1. MATERIAL
4.1.1. Substncias qumicas de referncia
4.1.2. Amostras de especialidades farmacuticas
4.1.3. Microrganismo-teste como revelador biolgico
4.1.4. Equipamentos e material auxiliar...
4.2. MTODOS
4.2.1. Amostragem
4.2.2. Determinao do peso mdio das cpsulas de gelatina dura e drgeas
4.2.3. Descrio do material de embalagem primria
4.2.4. Aparncia das amostras

4.2.7. Estudo do mtodo de cromatografia lquida de alta eficincia para determinao d

9
tetraciclina em amostras comerciais na forma de cpsulas
4.2.7.1. Preparao dos diluentes e solues-teste
9
4.2.7.1.1. Preparao do solvente diluente (51) de acordo com o procedimento d
Farmacopia Americana
9

4.2.7.1.2. Preparao da soluo-teste da substncia qumica de referncia de c1oridra

de tetraciclina de 1000 Ilg/mL de acordo com o procedimento da Farmacop
Britnica
9
4.2.7.1.3. Preparao da soluo-teste da substncia qumica de referncia de c1oridra
4-epianidrotetraciclina de acordo com o procedimento da Farmacop
Americana
9

4.2.7.1.4. Preparao das solues-teste da substncia qumica de referncia de c1oridra

de tetraciclina de acordo com o procedimento da Farmacopia Americana 9

4.2.7.1.5. Preparao das solues-teste da amostra

9
4.2.7.1.6. Preparao da fase mvel segundo procedimento da Farmacopia Britnica d
1993 (BPI)
10
4.2.7.1.7. Preparao da fase mvel segundo procedimento da Farmacopia Britnica d
1993 (BPII)
10

4.2.7.1.8. Preparao da fase mvel segundo procedimento da Farmacopia American

23 edio
10
4.2.7.1.9. Preparao da fase mvel modificada

10

4.2.7.2. Estudo comparativo dos mtodos da Farmacopia Britnica e Americana

4.2.7.2.1. Estudo preliminar.
4.2.7.2.1.1. Mtodo da Farmacopia Britnica

10
10
10

4.2.7.2.1.2. Mtodo da Farmacopia Americana

10
4.2.7.3. Estudo de adequao dos parmetros do mtodo cromatogrfico de fase revers
para a determinao da tetraciclina empregando o mtodo da Farmacop
Americana
10
4.2.7.4. Procedimento do ensaio para o estudo do mtodo para a determinao d
cloridrato de tetraciclina e cloridrato de 4-epianidrotetraciclina
10

4.2.7.5. Validao da metodologia

10
4.2.7.5.1. Construo da curva de calibrao
10
4.2.7.5.2. Estudo da reprodutibilidade de resposta quando empregados diferente
10
nmeros de lote da coluna 5YMMETRyr~

4.2.7.5.3. Padronizao das solues-teste do padro e amostra empregados n

determinao quantitativa do cloridrato de tetraciclina em amostra
comerciais
10

4.2.7.5.3.1. Determinao quantitativa do princpio ativo, empregando a curva padro co

cinco concentraes e uma soluo-teste da amostra
10

4.2.7.6.4. Estudo da alterao da eficincia da coluna aps frequentes injees d

solues-teste e fase mvel...
11

4.2.7.7. Comparao das duas metodologias

11
4.2.8. Doseamento do teor de c1oridrato e fosfato de tetraciclina em prepara
farmacuticas comerciais na forma de cpsulas de 500 mg empregando mtod
da Farmacopia Americana
11
4.2.9.
Estudo
para
a
determinao
de
c1oridrato
d
4-epianidrotetraciclina
11
4.2.9.1.

Construo
da
curva
4-epianidrotetraciclina

de

calibrao

do

c1oridrato

11

4.2.9.2. Limite de deteco do c1oridrato de 4-epianidrotetraciclina

11
4.2.10. Quantificao do c1oridrato de 4-epianidrotetaciclina na substncia qumica d
referncia de c1oridrato de tetraciclina
11

4.2.11. Dosagem do c1oridrato de 4-epianidrotetraciclina em amostras comerciais

11
4.2.12. Anlise estatstica
11
4.2.12.1. Procedimento para o estudo comparativo dos mtodos de CLAE e microbiolgi
1
aplicado cpsula de de tetraciclina de 500 mg

4.2.12.2. Determinao da preciso do mtodo

11
4.2.12.3. Averiguao da influncia do erro analtico na aprovao ou reprovao
lote
11

4.2.12.4. Comparao dos resultados de teor obtidos atravs dos mtodos cromatogrfi
e microbiolgico empregando o teste-L.
11

4.2.1.2.5. Comparao dos mtodos cromatogrfico e microbiolgico pelo coeficiente d

correlao
d
Pearson
11
4.2.12.6.

Determinao da porcentagem de resultados fora do limite d

especificao
1
5. RESULTADOS..............................................................................................................12
5.1. Caractersticas da aparncia e do material de embalagem
5.2. Determinao do peso mdio das preparaes farmacuticas

12
12

5.3. Ensaio de dissoluo in vitro

12
5.4. Estudo da determinao do mtodo CLAE para a quantificao da tetraciclina e
12
amostra comerciais na forma de cpsula
5.4.1. Comparao entre os mtodos descritos na Farmacopia Americana
Britnica
1
5.5. Validao do mtodo CLAE descrito na Farmacopia Americana
5.5.1. Construo da curva de calibrao do c1oridrato de tetraciclina

13
13

5.9.1. Quantificao do doridrato de 4-epianidrotetraciclina presente no padro

cloridrato de tetracidina com potncia de 994 Ilg/mg
5.9.2. Dosagem do cloridrato do 4-epianidrotetracidina em amostras comerciais
5.10. Estudo da adequao do mtodo CLAE para as condies estabelecidas

5.11. Determinao da resoluo dos picos de 4-epianidrotetracicJina e do desconhe

eludo imediatamente antes
5.12.

Determinao da resoluo dos picos (R) da tetraciclina e

4-epianidrotetracidina e seletividade ou fator de separao (a.) a partir de
soluo-teste de mistura dos 2 padres segundo procedimento da Farmaco
Americana ::08, modificado

5.13. Determinao da assimetria do pico

5.14. Estudo da alterao da eficincia (N) da coluna aps vrias injees das solu
testes e fase mvel.
5.15. Recursos do programa MILLENIUM'" para anlise dos cromatogramas
5.16. Anlise estatstica
6. DiSCUSSO
7. CONCLUSES
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFiCAS
9. RESUMO
10. SUMMARy

FIGURA 10
FIGURA 11
FIGURA 12
FIGURA 13
FIGURA 14
FIGURA 15
FIGURA 16
FIGURA 17
FIGURA 18
FIGURA 19
FIGURA 20
FIGURA 21
FIGURA 22
FIGURA 23
FIGURA 24
FIGURA 25
FIGURA 26
FIGURA 27
FIGURA 28
FIGURA 29
QUADRO 1
TABELA 1
TABELA 2
TABELA 3
TABELA 4
TABELA 5
TABELA 6
TABELA 7
TABELA 8
TABELA 9
TABELA 10
TABELA 11
TABELA 12
TABELA 13
TABELA 14
TABELA 15

"

TABELA 28
TABELA 29
TABELA 30
TABELA 31
TABELA 32
TABELA 33
TABELA 34
TABELA 35
TABELA 36
TABELA 37
TABELA 38
TABELA 39
TABELA 40
TABELA 41

ov~naO~.lNI

pneumonia e e Mycoplasma pneumoniae. Indicadas com frequncia no tratame

auxiliar da clera e diarria e, topicamente no tratamento de acne e roscea.

Tendo como referncia o Dicionrio de Especialidades Farmacutic

(DEF)45, as preparaes farmacuticas comerciais contendo tetracidina s

produzidas por diversos laboratrios e se apresentam, em sua maioria, na for

de cpsula, sendo substncia ativa nica.

Para que os medicamentos produzam a atividade teraputica deseja

procedimentos

adequados

relacionados

com

produo,

contro

armazenamento e distribuio devem ser implantados.

Assim, dentro deste contexto, fatos como falhas do sistema de qualida

na indstria farmacutica ou fiscalizao inadequada dos produtos colocados

mercado, podem tomar possvel o consumo de medicamentos com a

teraputica comprometida ou totalmente ausente ou que induzam a efei

nocivos inesperados. Assim, no sentido preventivo, imprescindvel estabele

polticas e procedimentos para a garantia da qualidade do produto, envolven

todos os setores direta ou indiretamente relacionados com a produo. ain

imperativa a prevalncia de Sistema de Vigilncia Sanitria atuante e conscien

com aes que balizem no sentido de uma Poltica Nacional de Sa

abrangendo os medicamentos.

As formas farmacuticas obrigatoriamente devem contemplar entre out

caractersticas, uma formulao que permita a liberao da substncia ativa
quantidade adequada para o meio onde ser absorvido.

Mas, por outro lado, apresentam como mrito permitir a determinao

atividade biolgica do antibitico.
Dentre os mtodos fsico-qumcos conhecidos, a cromatografia lquida

alta eficincia apresenta, alm da rapidez, caractersticas adicionais que justifica

a sua crescente aplicao nos laboratrios analticos. Contudo, mesmo quan

oficialmente estabelecido, o mtodo cromatogrfico exige modificaes q

podem influir na confiabilidade dos resultados obtidos, tomando necessri

novas validaes e,
microbiolgico.

inclusive, estudos de equivalncia com o mto

FARMOQuMICA

MYERS-

BRASMDICA

SQUIBB

BUNKER

ARISTON

DOVALE

FARIA

ELOFAR

CAZI

CALBOA

CIBRAN

EUROFARMA

HERALD'S DO

UNIO QUMICA

BRASIL

INFABRA

NEOQuMICA

NEOVITA

WINSDON

PROPOTTI

DELTA

GILTON

MEDIC

LUPER

ENDOTERPICA

USMED

Equivalentes tannacuticos adquiridos no mercado e no relacionados no DEf="5:

DINAFARMA. EMS, SINTERPICO. MEDQuMICA. ORTOOuMICA, INAF.

wnJ."~3J.ll

"0 O"SIJ\3~
-

alimentos como aditivos. Nove tetraciclinas esto disponveis no comrcio, den

as quais a clortetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, metaciclina, minocicl

oxitetraciclina, rolitetraciclina e tetracidina sendo permitidas para uso human0 15

2.1.1. Histrico

o primeiro

antibitico dos derivados da tetraciclina a ser conhecido fo

c1ortetraciclina, obtida em 1948 aps triagem sistemtica de amostras de s

colhidas para pesquisa de microrganismos produtores de antibiticos. Ap

comprovao da atividade antimicrobiana atravs de estudos in vitro e in vivo,

tetracidinas passaram a ser amplamente empregadas a partir da dcada de 50

2.1.2 Sintese

A tetraciclina foi obtida inicialmente por via fermentativa, sendo

c10rtetraciclina produzida pelo Streptomyces aureofaciens144,2OO. A tetraciclin

produzida por espcies de Streptomyces inoculadas em meio nutrie

adequadoro e por via semi-sinttica atravs da remoo do cloro

clortetraciclina por hidrogenaoro.2OO. A oxitetraciclina produzida entre out

cepas, por Streptomyces rimosus 1431!iS em meio nutriente adequado. A doxicic

obtida atravs da hidrogenao cataltica de uma suspenso ou dissoluo

outro derivado, a metaciclina, em solvente inerte, como metanol, seguido

hidrogenao sob a influncia de metais nobres (rdio e paldio), o que con

BIBliOTECA
Faculdade de Cincias Farrr.;,cuticas
Universidade de So Paulo

lIiIi;,;,;""

R3

R2

o
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I

N(CH )
,
3 2

H
,

--

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-

II

OH

OH

UH

.OH

COtJ-~R

11

Frmaco

R1

R2

Ra

Ra

Tetraciclina

CH 3

OH

Oxitetraciclina

OH

CH 3

OH

Doxiciclina

OH

CH 3

Clortetraciclina

CH 3

Cf

OH

FIGURA 1 - Frmulas estruturais das tetraciclinas

Os anis so identificados pelas letras de A a O da direita para a esquerda

e a numerao, nesta figura, inicia-se na parte inferior do anel AS,65,96,125,193,211.

moderadamente higroscpico90,144 e estvel quando em contato com o ar.

entanto, quando exposta a luz intensa e umidade, ocorre o escurecimento

p90. Em pH abaixo de 2 ou em solues de hidrxidos alcalinos, a tetracicJin
rapidamente degradada. O pH da soluo a 1 % est entre 1,8 a 2,8902a3 . Par
soluo injetvel reconstituda a especificao do pH de 2 a 3:!l,2a3.

Menos solvel em gua que a oxitetraciclina, 1 9 do cloridrato

tetraciclina dissolve em 10 mL desta e em cerca de 100 mL de lcool 5890,113.144

A soluo aquosa se turva quando em repouso por determinado tempo, devid

formao da tetraciclina base por hidrlise58,90.143. praticamente insolvel

tere,90113.144 e clorofrmio58,90.144. Muito pouco solvel em acetona58,144 e sol

em metanoI 149.

2.1.4.2. Fosfato de tetraciclina

Tem frmula molecular C22 H24N 20a HP03.% NaP03 e peso molecular

544,80. Sua potncia de no menos que 750 Ilg de cloridrato de tetraciclina

mg, calculada na base anidra. um p amarelo e inodoro149. A suspen

aquosa a 1 % tem pH de 2 a 4 144. A soluo injetvel reconstituda possui pH d

a 32m . Apresenta solubilidade em gua de 1 g para 31 mL, e de 1 g para 130

de lcool etlico. levemente solvel em gua149, metanol e muito pouco sol

em acetona144.

Quando exposto a intensa luz solar ou a temperatura superior a 90C e umid

ocorre o escurecimento do p, sem perda significativa da potncia. Em pH aba

de 2 a soluo de oxitetraciclina perde rapidamente a potncia, sendo tamb

degradada em solues de hidrxidos alcalinas90144. O pH de soluo a 1 % e

na faixa de 1 a 390 ou de 2,3 a 2,9~, enquanto que a Farmacopia American

especifica pH entre 2 a 3 para solues em geral e de 1,8 a 2,8 para a solu

injetvel de 2,5 %.

O cloridrato de oxitetraciclina muito solvel

gua58.90.113.144,149, sendo que 1 9 dissolve em 2 mL90 tomando a soluo turva

opaca devido formao de tetraciclina base58,90.144,149. A solubilizao em lc

etlico baixa90144, sendo de 19 para 35 mL90. pouco solvel em lcool et
anidro e insolvel em ter e clorofrmio90,113.144.

2.1.4.4. Cloridrato de doxiciclina

A sua frmula molecular C22H24N20a. HCI 1/2 C2HeH20 e seu p

molecular 512,9. A sua potncia situa-se na faixa de 800 a 920 Ilg de doxicic

por mg90206 ou de 880 menos que 940 Ilg por mg, sendo na base anidra e l

de substncias alcolicas~. O hiclato de doxiciclina, formado pela cristalizao

cloridrato de doxicicJina com 0,5 moi de gua e 0,5 moi de etanol, um

cristalino de cor amarela58,90.113.144, inodoro e de sabor amargo90. Solvel em

e solues de hidrxidos e carbonatos alcalinos, levemente solvel em lc

etlico e praticamente insolvel em ter e clorofrmio58.90.113,144,2CI!. muito sol

em metanol58.113,144. Em soluo aquosa de 1 % o pH medido de 2 a

O mecanismo de ao destes antibiticos envolve a ligao da tetraciclina com

subunidade 30-S do ribossomo, evitando a ligao do RNA-t, inibindo a snt

protica e, consequentemente, o crescimento celula~,200.

Quando empregadas isoladamente constituem-se em frmacos de esco

no tratamento da clera, febre recorrente, granuloma inguinal e infec

causadas por vrias bactrias Gram-positivas e Gram-negativas, aerbias

anaerbias e, em particular, por micobactrias, micoplasmas, treponem

leptospiras, riqutsias, actinomicetos, coxielas, clamdias, e espiroquetas e, ain

por protozorios como plasmdios.

Juntamente com a eritromicina, a tetraciclina tambm frmaco de esco

no tratamento contra Mycoplasma pneumoniaeOO,144,200, resultando em me

durao da febre, da tosse, do mal estar, da fadiga, dos estertores pulmonare

das alteraes radiolgicas dos pulmes. A doxiciclina duas vezes mais pote

que a tetraciclina em relao s bactrias Gram-positivas, sendo que par

Streptococcus viridans dez vezes mais ativa atuando. ainda, sobre

Enterococcus faecalis resistente tetraciclina, embora a sua atividade con

bactrias Gram-negativas seja duas vezes menor que a da tetraciclina.

freqentemente empregada no tratamento da "diarria dos viajantes", caus

por vrios microrganismosoo. No estudo de correlao realizado

MALMBORG '43 , foi comprovado que a doxiciclina poderia substituir c

vantagem o seu sal, que apresenta efeito ulcerativo na mucosa do estma

quando o tratamento se d por via oral, por serem farmacologicame

equivalentes.

Em associao com outros frmacos a tetraciclina empregada p

tratamento de infeces causadas por Pseudomonas pseudomallei. No caso

apresenta, como reao adversa quando do uso oral, a toxicidade intestin

Outros efeitos como azia, dificuldade epigstrica, nusea, vmito, diarr

raramente ocorre ulcerao esofageal oo.144, alm de boca seca, descolorao

lngua, estomatite e disfagia 144. Devido ao seu amplo espectro de a

alteraes pronunciadas na flora intestinal podem induzir a multiplica

exagerada dos microrganismos causando superinfecesoo.144,200. Dentre estas

candidase a mais comum OO,144. Assim, a vulvovaginite 144 por Candida e aque

causadas por estafilococos, enterococos, Proteus, Pseudomonas ou Clostridi

difficile podem aparecer. Quando decorrente de estafilococos pode ser fatal e

intestino, ocasiona principalmente a diarriaoo devido resistncia de coliform

como Proteus e de Pseudomonas Sp144. No entanto, em pacientes debilitados

com baixo nmero de monilia no intestino, as leveduras podem passar para

corrente sangunea e disseminar pelo corpooo.

Reaes de hipersensibilidade como urticria, asma ou edema fac

ocorrem de maneira incomumoo,144.

As preparaes de tetraciclinas envelhecidas ou fora do prazo de validad

com indcios de deteriorao, podem causar hepatotoxicidade severaOO144,200, c

reaes reversveis que caracterizam a sndrome do tipo Falconi, como poliur

polidipsia com nusea, glicosria, aminoacidria, hipofosfatemia, hipocalcem

acidose e proteinria sendo particularmente atribudas 4-epianidrotetraciclin

um produto de degradao do antibitico 144.

As tetraciclinas so depositadas nos dentes durante sua forma

causando pigmentao irreversvel. Podem provocar deficincia na formao
tecido sseo devido complexao com sais presentes no mesmo e fixao

tolerada por via oral. Doses administradas a adultos por via intravenosa, quand
acima de 19 por dia, podem decorrer em bito do pacienteoo. Na inje

intramuscular, ocorre dor local muito intensa, devendo ser incorporado u

anestsico local para possibilitar a aplicao

A absoro gastrointestinal pode ser de 58 a 100 %00 ou 60 a 80 %144. E

funo da complexao das tetraciclinas com ons metlicos divalentes

trivalentes, a absoro muito prejudicada quando administrada simultaneamen

com outros medicamentos como anti-cidos que contm clcio, magnsio

alumnio. Preparaes contendo ferro bem como leite e outros alimento

consumidos no dia a dia devem ser evitados, ou os horrios de administrao do

mesmos devem diferi~144. O fosfato aumenta a absoro da tetraciclin

provavelmente devido complexao com o clciooo.

Todas as tetraciclinas se ligam s protenas do plasma na faixa de 35

91 %. A sua meia vida de no mximo 17 horas em indivduos normais, ma

pode ser de 12 a 108 horas quando h falha renal oo. Em relao aos derivados,

meia vida para clortetraciclina de cerca de 6 horas, para oxitetraciclina d

aproximadamente 9 horas, para tetraciclina cerca de 8 horas e para doxiciclina d

16 a 18 horas 144. A excreo renaI 00.144 e fecal 144 so as principais vias d

eliminao, exceto para a minociclina que excretada na bile e a doxiciclina qu

metabolizada ou excretada em mais de 50 % no clon. A tetraciclina penet

facilmente nos tecidos e fludos corpreos, mas sua passagem para o flud

cerebroespinhal baixa quando administrada por via oral. Por questo d

toxicidade, a concentrao srica no deve ultrapassar a 15 J.1g1ml. O pico d

concentrao plasmtica ocorre de uma a trs horas aps a ingesto. Es

concentrao plasmtica depende do grau de absoro. Administrao oral d

ocorrer com antibiticos como sulfato de amicacina, benzilpenicilina, carbenicil

sdica, cefalotina sdica, ampicilina sdica, polimixina 8 144, cloranfenic

succinato de sdio, sais de eritromicina e outros. Frmacos como sulfonami

isoniazidaoo.144, clorotiazida, clorpromazina, heparina sdica, hidrocortizo

aminofilina e vitaminas do complexo 8 no devem ser administrados em conju

com a tetraciclina144.

2.3. Estabilidade

o estudo da estabilidade da tetraciclina permite conhecer os produtos

degradao e os fatores que podem influenci-Ia. Este estudo importante

deve ser desenvolvido em condies analticas que permitam obteno

resultados confiveis. As tetraciclinas so conhecidas por possurem ba

estabilidade em soluo aquosa. Particularmente, condies anormais

armazenamento e formulao inadequada do produto so referidas em vr

trabalhos como as principais causas para desencadear a formao de produ

de degradao. Sob condies drsticas de calor, pH e umidade a tetracicl

sofre epimerizao, reao de primeira ordem, reversvel, no C4, originan

mistura

de

4-epitetraciclina,

anidrotetraciclina,

4-epianidrotetraciclina

tetracicJina5.OO,103,144,182.193.211 ,219. Dentre estas substncias, a 4-epitetraciclina

4-epianidrotetraciclina possuem pouca atividade biolgica, da ordem de 2 a 5

da atividade da tetraciclina123. Segundo SOKOLOSKI e colaboradores193,

4-epitetraciclina pode sofrer uma reao de desidratao levando formao

4-epianidrotetraciclina, um produto de degradao que apresenta nefrotoxicida

tetraciclina

.J, H+
anidrotetraciclina

epitetraciclina

.J,w
~

epianidrotetraciclina

Estudo da cintica das reaes de degradao em diferentes condies

pH sob temperatura de cerca de 60 C foi realizado por VEJ-HAN5EN

211
colaboradores . As determinaes quantitativas das substncias foram fe

empregando-se os mtodos espectrofotomtrico UV e CLAE. Os auto

constataram que a reao de epimerizao da tetraciclina formando

4-epitetraciclina ocorria de forma reversvel, atingindo o equilbrio quando
concentraes de 62 % para tetraciclina e para a do epmero de 38

Verificaram, ainda, que a cintica de degradao seria dependente tambm

pH, sendo que a cada intervalo de pH ocorria determinada reao de degrada

em diferentes nveis. Estas reaes em solues cidas e alcalinas produzira

respectivamente, anidrotetraciclina e a isotetraciclina, enquanto que a reao

epimerizao que levou formao da 4-epitetraciclina foi predominante em

entre 2,5 a 6. A estabilidade mxima ocorreu em pH prximo de 3, sendo qu

pH entre 3,5 e 10 a taxa de degradao se manteve estvel quando na ausn

de tampo. No entanto, quando na presena de solues-tampo fosfato, bor

e acetato, forte catlise cido-base foi observada. Da mesma forma, REMMER

colaboradores182, em 1963, observaram que a presena de ons fosfato e citr

1,5, sob quatro diferentes temperaturas e utilizando metodologia CLA

verificaram que uma epimerizao significativa podia ocorrer em pH menor q

trs. Confirmando este resultado, TSUJI e ROBERTSON 196 verificaram que ne

tampo a 0,01 Me pH 4,5, nenhuma epimerizao ocorreu em 6 horas.

Quando se considerou somente a variao da temperatura, REMMERS

colaboradores 182 verificaram que, temperatura de 56 C, a constante
velocidade de reao foi cerca de 400 vezes maior que a 4 oCo
Em preparaes alcolicas a estabilidade da tetraciclina foi estudada
VANCAILLE e colaboradores21o comparando amostras de obteno comercial

seu diluente correspondente e mistura simulada de tetraciclina e 4-epitetracicl

(44:56) diluda, tanto em soluo alcolica a 40 % como em soluo com

mesma concentrao alcolica acrescida de tampo acetato, sob diferen

valores de pH. Nenhuma diferena na estabilidade foi constatada entre
amostras testadas.

Para a soluo contendo somente a tetraciclina,

epimerizao ocorreu mais rapidamente, sendo que a 20 C a atividade caiu p

90 % em poucos dias. A 50 C a proporo de tetraciclina e 4-epianidrotetracicl

no foi alterada, mas a quantidade total de ambas as substncias diminuiu. Ap

cerca de 10 dias foi determinado 85 % da quantidade inicial da mistura, sen

que aps 50 dias foi encontrado apenas 50 %. Do total de produto degrada

10 % foi transformado em anidrotetraciclina e 4-epianidrotetraciclina, enqua

que o restante formou substncias no detectadas pelo mtodo CLAE emprega

na determinao quantitativa. Nas solues tamponadas, o equilbrio en

tetraciclina e 4-epianidrotetraciclina foi estabelecido mais rapidamente quan

comparado com a soluo alcolica de tetraciclina.

too. s temperaturas de 37 e 50C no foi detectada degradao significa

sendo o mesmo resultado encontrado por DIHUIDI e colaboradores 46 em est

semelhante por perodo de cerca de 2 anos. O too determinado para tempera

de 50C foi de 10 anos, enquanto que para 20C foi de 50 anos, podendo
extrapolado para 350 anos46 ,124.

No trabalho de OZOL 1~, o estudo de estabilidade da doxicidina

realizado isoladamente ou na presena de excipientes em diferentes condi

de umidade. Para isto, ambientes com umidades relativas de 40, 60 e 85 % fo

obtidos em

dessecadores contendo

soluo

de cloreto

de clcio

concentraes de 39,62, 31,73 e 19,03 %, respectivamente. A quantificao

realizada atravs do mtodo espectrofotomtrico, aps separao prvia

doxiciclina por cromatografia em camada delgada. Os resultados mostraram

em condies de umidade relativa elevada, de 85 %, o hiclato de doxiciclina a

78 semanas perdeu 13,27 % da potncia. Comparativamente a degradao

doxiciclina foi semelhante em umidades relativas de 40, 60 e 85 % ap

respectivamente, 78, 68 e 20 semanas. Portanto, quanto maior a umidade rela

mais rpida a degradao da doxiciclina. Na presena de excipientes ocorreu

ligeiro aumento da perda da doxiciclina em cpsulas de gelatina dura.

O comportamento adequado quanto dissoluo do princpio ativo a p

de uma preparao farmacutica slida um importante parmetro fs

qumico, devendo manter-se durante todo o prazo de validade estabelecido pa

produto. MURTHY e GHEBRE-SELLASSIE 153determinaram que mudanas

perfil da liberao in vitro durante perodo de armazenamento, ocasionadas

alteraes das caractersticas fsico-qumicas do produto, poderiam interferi

produto as diversas possveis condies de armazenamento e transporte.

Outro estudo de estabilidade, combinando a cromatografia lquida de a

eficincia

o ensaio

de

dissoluo

foi

realizado

por

SCHAFER

colaboradores 187, para cpsulas de gelatina dura de c1oridrato de tetraciclina e

produtos

de

degradao

4-epianidrotetraciclina,

4-epitetracicli

anidrotetraciclina, bem como a clortetraciclina, uma impureza de sntese.

estudo realizado, os autores consideraram a duas metodologias complementar

possibilitando anlises confiveis e garantindo a liberao para o consumo
produtos com alto grau de segurana, eficcia e qualidade. Para amostras

cpsulas de tetraciclina estocadas por 6 a 10 anos, os resultados encontrados

teor e dissoluo estavam de acordo com a especificao estabelecida p

Farmacopia Americana XXI 205. Estudo comparativo com cpsulas de doxicic

indicaram estabilidade superior para a doxiciclina.

2.3. Dissoluo de frmacos a partir de preparaes farmacutic

slidas

A dissoluo de preparaes farmacuticas slidas orais envolve

conjunto de processos que ocorre quando esta entra em contato com u

soluo. Para a fase de desenvolvimento do produto, tanto os ensaios in v

como in vivo devem ser realizados. Apesar de existirem estudos bem sucedi

da correlao entre os resultados obtidos in vitro e in vivo, o ensaio de dissolu

in vitro no permite determinar a biodisponibilidade ou bioequivalncia

frmaco 1E. Por outro lado, permite obter informaes sobre a prov

como custo, tempo de ensaio, qualificao do quadro tcnico, precis

discriminao entre produtos, permanecendo em pauta a necessidade
correlao entre os ensaios realizados em voluntrios doentes e sadios 1n.

o ensaio de dissoluo in vitro deve fornecer dados para vrias etapas

desenvolvimento de um produto e deve ser realizado: na fase de estudo
frmula e do processo de produo, no estudo de estabilidade, na rotina
controle de qualidade e quando h alterao nas condies padronizadas

produ01n. Segundo MATOS e colaboradores 1<5, dois tipos de estudos pod

ser realizados. O primeiro o ensaio limite no qual, ao final de um determina

perodo, se determina o teor de princpio ativo dissolvido e, aps, o valor obtido

comparado com a especificao estabelecida. No segundo, realizado um estu

da cintica de dissoluo, que permite uma avaliao mais profunda do perfil
dissoluo de uma determinada forma farmacutica.

2.3.1. Dissoluo de cpsulas e comprimidos

Segundo REES 1n, o ensaio de dissoluo tem como objetivo

confirmao de que a quantidade total do princpio ativo liberado to prxi

quanto possvel do contedo total da cpsula ou comprimido, sendo a taxa

liberao reprodutvel e correspondente da preparao padro submetida a

ensaios de biodisponibilidade e clnicos.

Concluses de SAMYN e JUNG 185 em trabalho realizado em 1970 sobre

dissoluo das preparaes farmacuticas na forma de cpsula revelam que e

SELLASSIE

em 1993 publicaram trabalhos de reviso comparando

metodologias oficiais. CHOWDARY e RAJYALAKSHMI 37 discutiram a teoria

dissoluo e ensaios de dissoluo descritos nas Farmacopias American

Internacional. Estes pesquisadores concluram que a dissoluo adequada

decorrente no apenas das caractersticas das partculas desintegradas da for

slida mas tambm da intacta. No trabalho dos autores citados, ficou evide
que a velocidade de dissoluo podia ser relacionada com a absoro

princpio ativo no local de absoro, principalmente para frmacos pouco solv

no meio aquoso de dissoluo e no pH fisiolgico.

COHEN e colaboradores39 publicaram extenso trabalho de reviso sobre

padres de dissoluo e liberao dos princpios ativos constando

Farmacopia Americana desde a primeira publicao do teste de desintegra

em 1950 que, no incio, foi indiretamente relacionado com a biodisponibilidade
ao do medicamento. Como o conhecimento da dissoluo do princpio ativo

necessrio para correlacionar com a sua absoro foi recomendado, em 1962

incluso da dissoluo de todas as cpsulas e comprimidos na Farmacop

Contudo, em 1965, apenas um teste de dissoluo foi adotado. Em 1970, na U

XVIll 202 , 12 monografias apresentaram o teste de dissoluo empregando

aparelho com cesto. Em 1975203 , vrias outras monografias incluram o teste

dissoluo. O mtodo com as ps foi oficializado em 1978 e apresentou vantag

em relao ao teste de desintegrao. O uso de comprimido padro para

calibrao foi adotado aps 1978, empregando os comprimidos de prednisolo

como desintegrante e o comprimido de cido saliclico como no-desintegran

Em

1976,

foram

regulamentados

os

requisitos

de

dissoluo.

For

recomendados os mtodos I (cesto) e " (p) para ensaio de dissoluo, com

45 minutos. Em 1980, a Farmacopia Americana204 incluiu 60 monografias c

exigncia para teste de dissoluo. O dispositivo com a p a 50 rpm
recomendado para formas slidas em que a caracterstica de solubilidade
permitia o uso do cesto. Na edio de 19852CE foi includo um total de
monografias com teste de dissoluo e em 1990, no segundo suplemento,
monografias em que constam este teste.

O perfil de dissoluo de um slido em um solvente complexo e mu

fatores podem afetar a cintica do processo de dissoluo. MATOS

colaboradores 144 e CARTWRIGHT33 definiram duas fases no processo

dissoluo das cpsulas. Para MATOS e colaboradores 144 na primeira fase oco

a abertura das cpsulas liberando o contedo. O perodo anterior abertura

cpsula conhecido como tempo lag e, nesta fase, a prpria cpsula de gela

dura um fator determinante na dissoluo. Na fase seguinte, ocorre a disper

do contedo das cpsulas no meio de dissoluo. No trabalho mencion

imediatamente antes, verificou-se que quanto mais rpida a desintegrao

cpsulas, maior a velocidade de dissoluo. Produto com baixa granulome

favorece a dissoluo devido elevada rea superficial em contato com o m

de dissoluo.

Para CARTWRIGHr:E,

as cpsulas de gelatina dura

comprimidos apresentaram perfil de dissoluo diferenciados. O autor estudo

dissoluo das cpsulas de oxitetraciclina e observou inicialmente, uma fase

lenta desintegrao seguida da fase de rpida dissoluo. Esta fase deveu-s

formao de pequenas partculas que, sob agitao, favoreceram a liberao

frmaco. Ao estudar comprimidos de tolbutamida, foi constatada uma rp

dissoluo na fase de desintegrao, seguida de uma fase de dissoluo le

Presumiu-se que este perfil de dissoluo ocorreu devido permanncia

entumescimento e dissoluo mais rpidos neste pH do que em neutro. Ou

caractersticas relacionadas com os constituintes da forma farmacutica po

afetar a velocidade de dissoluo. Os mesmos autores anteriormente citad

constataram que a presena do hidrxido de alumnio nas cpsulas ocasion

baixa desintegrao e, consequentemente, lenta dissoluo e absoro

princpio ativo. Isto devido provvel interao deste componente com a pa

da

cpsula

de gelatina,

propiciando

a formao

de

gel.

DIGENIS

colaboradores 47 verificaram que sob condies inadequadas, a cpsula

gelatina pode sofrer alteraes em sua estrutura molecular atravs de liga

cruzadas. Este fenmeno pode ocorrer em situao de stress como

temperatura e elevada umidade. Cpsulas de gelatina dura com liga

cruzadas causam mudanas significativas no perfil de dissoluo in vitro devi

formao de uma membrana intumescida, com consistncia de borrach

insolvel em gua, durante o teste de dissolu 0 47,183. Esta pelcula cria restr
liberao do frmaco.

Os fatores que afetam a rea superficial disponvel para a dissoluo

cpsulas consistem em tamanho, forma e densidade das partculas ou tend

de

formar

aglomerados,

conforme

descrito

por

REES 1n.

MATOS

colaboradores 145 observaram que a presena de aglomerados menos dispers

implicava em menor velocidade de dissoluo. Outros fatores, como

propriedades dos constituintes no ativos da formulao devem ser considera

na dissoluo. Esto relacionados, ainda, com a quantidade e tipo de excipie

como diluentes, desintegrantes, surlactantes, agregantes, lubrificantes, co

modo de incorpor-los ao princpio ativo, com o processo produtivo, tamanho

dissoluo, a desintegrao, facilita a liberao do princpio ativo pelo aumento

,,'

rea da superfcie exposta ao meio de dissoluo. No entanto, no forne

segurana quanto sua liberao da formulao. A fase de dissoluo no m

permite avaliar se a forma farmacutica slida libera o princpio ativo quan

colocado em ambiente aquoso do trato gastrointestinal

,n.

Para frmacos muito solveis, o principal fator que influi no processo

liberao e absoro do princpio ativo a tcnica de formulao do produto.
I

Os excipientes presentes na formulao do p contido nas cpsulas

gelatina dura influenciam, de vrias maneiras, a velocidade de dissoluo
princpio ativo. GOODHART e colaboradores84 verificaram que cpsulas

gelatina dura de cloridrato de fenilpropanolamina, pouco solveis em g

,

quando formuladas com grande quantidade do lubrificante estearato de magns

mostraram liberao lenta do princpio ativo em gua destilada, tanto in v

H-I,

quanto in vivo. Isto ocorreu em decorrncia do aumento significativo do tempo

desintegrao e da baixa moihabilidade pois, o estearato de magnsio

extremamente hidrfobo, no permitindo que o p seja umedecido. Foi verifica

que a adio de agentes tensioativos, como o lauril sulfato de sdio e o empre

de partculas do frmaco de menor tamanho melhoravam a capacidade
,I

umedecimento do p, aumentando a velocidade de dissoluo em suco gstr

artificial sem enzimas, mas permanecendo lenta a dissoluo em gua. Agen

desintegrantes como amido ou celulose microcristalina tambm diminuem

tempo de dissoluo, segundo MIVAZAKI e colaboradores 151 devido a u

desintegrao mais eficiente dos grnulos das partculas

primrias

comprimidos e, consequentemente, uma maior superfcie de contato com o me

"

JUNG

demonstraram que os excipientes como o lubrificante estearato

magnsio e os inertes, lactose ou fosfato de clcio, que formavam misturas

ps em diferentes propores, influenciavam grandemente a desintegrao

cpsulas. A dissoluo foi nula para a mistura composta por fosfato de clci

5 % de estearato de magnsio, pois no houve a desintegrao do grumo

consequentemente, a liberao do princpio ativo. Foi constatado que e

lubrificante retirava a gua do meio tornando-o viscoso, o que reduziu

velocidade de dissoluo devido diminuio do contato entre o p e o me

Alm disso, o fosfato de clcio colaborou com esta baixa dissoluo por

insolvel em gua. NEWTON e RAZO 1~ alm de MIYAZAKI e colaboradore

verificaram que a mistura de lauril sulfato de sdio e estearato de magnsio

preparaes de comprimidos retardava a liberao do princpio ativo. No traba

de MIYAZAKI e colaboradores 151 foi observado que a presena de ambos

excipientes a 1 % na formulao no alterou o tempo de desintegrao, m

interrompeu a dissoluo. Neste caso, no houve a correlao entre o tempo

desintegrao e a velocidade de dissoluo. Outros excipientes estudados co

a gelatina, goma accia e PEG 6000 aumentaram o tempo de desintegra

devido diminuio do contato com o meio.

CARTWRIGHT33, atravs do estudo colaborativo para o teste de dissolu

de comprimidos de tolbutamida e cpsulas de oxitetraciclina, envolvendo

laboratrios, demonstrou que o nvel de vibrao provocado pelo aparelho sobr

frasco de dissoluo tambm causava a variao na caracterstica de dissolu

do frmaco. Isto foi observado para um dos laboratrios envolvidos no estudo,

qual a alta velocidade de dissoluo foi parcialmente relacionada aos efeitos

vibrao ocasionada pela agitao.

obtidos revelaram diferena na biodisponibilidade do princpio ativo para

diferentes preparaes da oxitetraciclina e tetraciclina. Dentre sete amostr

sendo cinco produtores de oxitetraciclina e duas tetraciclinas, duas apresentar

nvel srico abaixo dos valores encontrados para as outras amostras.

preparaes das tetraciclinas resultaram em concentraes sricas superiores

da oxitetraciclina. Estes autores sugeriram tempo de desintegrao de cpsu

de 10 minutos como limite que mais se aproximava da realidade, enqua

GOODHART e colaboradores84 consideraram tempo de 15 minutos.

SANDELL e colaboradores 186 no estudo de correlao entre os testes

desintegrao e dissoluo verificaram que preparaes comerciais de cpsu

de tetraciclina apresentaram desintegrao incompleta. Duas entre trs amos

no desintegraram em 10 minutos sendo que uma delas, mesmo a

30

minutos,

teve

uma

desintegrao

incompleta

apresentara

simultaneamente, uma baixa velocidade de dissoluo. Isto foi associado

formao de um gel a partir da cpsula de gelatina dura no processo

desintegrao que encobria o p do medicamento, no permitindo a dissoluo

MIYAZAKI e colaboradores 151 realizaram um extenso trabalho sobre o p

[',

de dissoluo de trs tetracilinas em formulaes, com diferentes aditivos par

preparao de comprimidos. Os resultados encontrados foram semelhan

queles constatados por outros pesquisadores, em trabalhos relacionados com

influncia dos excipientes na dissoluo de cpsulas e comprimidos84,185,155

, biodisponibilidade a partir da forma farmacutica sofre influncia da interao c

a tetraciclina, como a formao do complexo com ctions bi ou trivalentes q

impede a liberao do princpio ativo, sendo esta complexao muito aumenta

em formulaes com mltiplos componentes. Quando agentes ligantes co

BOGARDUS e BLACKWOOD 18 observaram que o cloridrato diidratado dissolv

i.

quatro vezes menos em cido clordrico 0,1 N do que em gua e tampo pH 4

7. Este resultado foi coerente com a solubilidade deste sal, que influencia

pelos ons cloro, diminuindo a sua dissoluo no meio. A dissoluo do hiclat

da base livre no foi influenciada pela presena do on cloro. Isto significa

para as preparaes de uso oral, considerando a alta concentrao de on cl

no suco gstrico. Quando a pH 4, a base dissolveu 100 vezes mais lentame

que a pH 7,0. A forma cloridrato diidratado dissolveu rapidamente em gua e s

tampo pH 4,0 e 7,0.

2.3.3. Metodologias desenvolvidas para o ensaio de dissoluo

vifro

Muitas tcnicas in vitro para a avaliao do perfil de liberao do frmac

partir de preparaes slidas esto descritas na literatura31 ,33,84,88,136,161,16:l,1n.

Em 1960, PERNAROWSKI e SEARL161 desenvolveram equipame

i'"

automtico de fluxo contnuo para determinar a dissoluo. O equipame

apresentava um cesto de ao inox com malha de 10 mesh, acoplado a uma ha

giratria e um bquer de um litro. O meio de dissoluo era agitado a u

velocidade constante e a amostragem feita automaticamente pela transfern

do meio para um frasco coletor, para a dosagem do princpio ativo empregand

mtodo espectrofotomtrico. Atravs da inspeo visual, os autores verificar

que por este mtodo, comprimidos e cpsulas eram submetidos a menor abras

do que no teste de desintegrao da Farmacopia Americana. Os resultad

empregando cpsulas de cloranfenicol. O aparelho de desintegrao sem

discos foi o empregado. O volume da soluo de suco gstrico recomendado

de 800 mL temperatura de 37 0,5 oCo A metodologia da Farmacop

Americana 201 sem modificao foi realizada em paralelo. No primeiro mto

apenas uma cpsula foi colocada no aparelho enquanto que no segundo s

foram colocadas em cada tubo cilndrico do aparelho. Alquotas do meio

desintegrao foram colhidas em determinados intervalos de tempo, seguindo

a determinao da quantidade de princpio ativo. A concentrao do cloranfen

no meio de dissoluo mostrou melhor resultado no mtodo de cpsula simp

Isto pode ser devido saturao do meio de dissoluo, tanto com o ingredie

ativo como devido gelatina da cpsula ou aos excipientes, no caso em que

seis cpsulas foram simultaneamente testadas.
SANDELL e colaboradores 186 compararam resultados dos testes

desintegrao e dissoluo de cpsulas e comprimidos. O teste de desintegra

adaptado para relacionar o nmero e o tamanho das partculas com a dissolu

foi realizado com aparelho consistindo de trs pequenas peneiras superpost

com a abertura da malha em tamanhos decrescentes de cima para ba

mergulhadas e mantidas firmes no meio de desintegrao por meio de um fio.

procedimento do ensaio, a cpsula ou comprimido foram colocados na pene

superior de menor abertura da malhas e mergulhadas em bquer contendo

litro de gua a 37 oCo Foi aplicada agitao uniforme s peneiras. Aps interv

de tempo de 10 a 30 minutos, as peneiras foram retiradas e o resduo coloca

para secar e pesado. O teste de dissoluo foi realizado em recipiente conten

gua a 37 0,5 C, com agitao do meio atravs de p com rotao de 50 rp

Alquotas

do

meio

de dissoluo foram

retiradas

e quantificadas

inox, ps com agitao vigorosa, suporte de plstico com agitao suave, ce

de ao inox com agitao vigorosa, ensaio de desintegrao e o mtodo oficia

USP XVII (cesto), foram aplicados para amostras de cpsulas de frmacos a

diabticos e diurticos. Os autores demonstraram que o mtodo oficia

apresentava desvantagens em decorrncia da impossibilidade de observao

cpsulas, durante a desintegrao, impedida pelo cesto de arame. Tamb

observaram que o cesto com malha de 40 mesh poderia reter os grumos

bloquear a sada de partculas, sendo por isso sugerido malha de 8 mesh. O p

de dissoluo obtido atravs das sete tcnicas estudadas para amostras

cpsulas foram comparveis, mas os autores expressaram preferncia quant

simplicidade e versatilidade do mtodo USP desde que os cestos foss

fabricados com malha entre 8 e 40 mesh.

Tendo por meta a melhoria metodolgica, GOODHART e colaboradore

desenvolveram aparelho de dissoluo que permitia a observao visual

desintegrao da cpsula de gelatina dura sem o emprego do cesto. Consistia

bquer apresentando pequenas concavidades no fundo onde as cpsula

comprimidos eram encaixados para serem testados. As cpsulas foram coloca

na posio vertical, sendo que sua parte superior se dissolveu em 2 ou 3 minu

liberando o ar presente no seu interior. A rpida liberao de bolhas de ar indi

o imediato umedecimento do p seguido de completa dissoluo sendo, porta

um mtodo rpido e adequado para os testes de desintegrao e dissoluo

todas as formas slidas.

BURGER e NASH 31 estudaram aparelho de dissoluo, consistindo de

recipiente de plstico na forma de "V" que oscilava em relao ao seu centro c

uma frequncia controlada. Previa sistema automtico de coleta do meio

dissoluo a 50 rpm normalmente produzia a melhor correlao com as condi

in vivo. Mas, nesta velocidade de rotao, a mistura do meio de dissoluo

ineficiente e poderia introduzir o erro analtico na amostragem sendo, portan

comumente empregada velocidade de 100 rpm.

POSTI e SALONEN

compararam a influncia da velocidade da rotao do agitador a 75 e 100 rp

paralelamente variao da posio do agitador a 2,5 e 4,5 cm em relao

fundo do frasco de dissoluo, empregando os mtodos I e " do teste

dissoluo da USP XX204, Os autores concluram que o mtodo I, do cesto, so

menor influncia da variao na altura e que o da p era mais sens

especialmente a velocidades de rotao maiores. No trabalho de HARDWIDG

colaboradores88 , trs aparelhos de dissoluo obtidos comercialmente for

avaliados quanto s condies de agitao e o pH do meio de dissolu

Quando estas condies eram

mantidas constantes,

os trs aparel

proporcionaram resultados de dissoluo equivalentes entre si, e correlaciona

com o nvel srico quando do estudo in vivo em ces.

CARlWRIGHT33 publicou em 1979, resultado de um estudo colabora

realizado para determinar a robustez do ensaio em relao ao procediment

equipamento. Os autores consideraram para reprodutibilidade a comparao

resultados obtidos entre diferentes laboratrios, e para repetibilidade, diferen

intra-laborat6rio.

Foi

constatado

que

para

cpsula

de oxitetraciclina,

reprodutibilidade teve maior variao que a repetibilidade. Outros fatores co

variao de temperatura, meio de dissoluo, ar dissolvido no meio, adsor

pelo filtro, liberao de substncias interferentes do filtro, variao na velocid

do motor, dimenses do cesto e diferentes tipos de cesto tambm podem cau

as variaes inter e intra-laborat6rios.

Mtodo in vitro para avaliar a desintegrao da formulao em fase

desenvolvimento foi delineado por HANNULA e colaboradores86 , empregando

bquer imvel e um dispositivo para fotografar. A seqncia de desintegrao d

cpsulas foi detalhadamente documentada atravs das fotografias, permitindo

estudo da dissoluo e ruptura do invlucro de gelatina, a formao de bolhas

gs e a sada das partculas do p das cpsulas. Este mtodo correlacionou

dado de desintegrao obtido com a taxa de absoro in vivo do princpio ati

indicando que as condies fsicas simuladas eram semelhantes estomacal.
fotografias, com o auxlio de corantes, permitiram observar a penetrao
lquido no p.

2.4. Consideraes gerais sobre os fundamentos da validao

Os mtodos analticos tm por objetivo fornecer informaes confiv

quanto a natureza e a composio dos materiais submetidos a anlise. Sabeentretanto, que um certo grau de variabilidade est atrelado a todas
avaliaes. Portanto, um dos objetivos de garantia de qualidade manter
patamar mnimo esta variabilidade.

A validao parte importante do programa de garantia de qualida

sendo os procedimentos includos nas normas de Boas Prticas de Fabrica

(BPF) exigidas pela Food and Orug Administration (FOA) dos Estados Unidos

aplicada nas indstrias farmacuticas americanas desde 1978154 deven

considerao fatores como a sua adequao substncia analisada, e

determinado substrato ou matriz.

A preciso,

exatido,

sensibilidade

especificidade so caractersticas fundamentais de um mtodo analtico, por

outras como a disponibilidade de instrumentos e equipamentos, rapidez, cus

reduzido,

simplicidade

baixo

risco

ocupacional

devem

ser

tamb

considerados.

2.4.1. Validao do mtodo analtico

A validao envolve no apenas os procedimentos do processo produtiv

mas todos os mtodos empregados no controle de qualidade, incluindo

comparao do mtodo estudado com o mtodo oficial ou outro mto

anteriormente validado. Os erros analticos podem ocorrer, mas devem s

evitados com treinamento de pessoal, com auxlio de documentao na qu

constam todos os procedimentos e especificaes e, ainda a anlise d

resultados obtidos. Os mtodos analticos apresentam variaes que decorrem

todas as medidas obtidas. Esta variabilidade aumenta quando as determina

so realizadas por diferentes analistas em diferentes laboratrios. Um tratado q

apresenta e discute com pertinncia os erros operacionais normalmen

encontrados nos laboratrios foi elaborado por GARFIEL081 .

Para minimizar os erros, OUX51 enfatiza a necessidade de que os mtod

de anlise sejam descritos de forma objetiva, simples e clara, de modo q

mesmo o profissional pouco treinado possa realizar os ensaios corretamen

Alterao mo deve ser introduzida sem a expressa autorizao do supervisor

outra

WILLlG e STROKER215 recomendam para a validao do mtodo

avaliao de atributos como exatido, desvio, linearidade, preciso, sensibilid

e especificidade. Outro atributo, a robustez, definida como a capacidade de

processo analtico fornecer resultados equivalentes quando realizado

diferentes analistas, equipamentos ou laboratrios e, tambm, deve fazer parte

processo de validao4,:J),81,113, permitindo reduo da variabilidade analtica81 .

Uma das primeiras etapas da validao a calibrao de equipamen

para assegurar que estejam operando corretamente e no se constituam em fo

de erro para o ensaio. A calibrao deve ser peridica, de acordo com o tipo
freqncia de utilizao.

As farmacopias USP XXI I1200 e Japonesa, 13a edio 113 fazem refernc

validao analtica de forma destacada, incluindo a definio dos termo

parmetros analticos envolvidos nos ensaios de validao. Os atributos

mtodo analtico ou parmetros de validao esto descritos em inme

publicaes20,51,81,113,116,2OO,215.

O procedimento de validao depende do tipo de metodologia anal

utilizada. Os mtodos analticos so classificados por tipo ou categoria, ou s

categoria I (quantificao), 11 (teste para determinao de impurezas ou prod

de degradao) e 11I (determina a caracterstica de desempenho). Par

categoria I, atributos como preciso, exatido, especificidade, linearida

intervalo de quantificao e robustez devem ser estudados na validao

categoria 11 envolve ensaios de quantificao e ensaios-limite e, alm

caractersticas descritas para categoria I, deve incluir, tambm, o limite

que consiste em adicionar soluo-teste uma quantidade conhecida

substncia padro acima e abaixo daquela esperada na amostra81 ,208,215. Ne

caso, a exatido calculada pela diferena da concentrao entre a solu

adicionada do padro e da amostra sem adio do padro, em rela

quantidade da substncia adicionada amostra. O objetivo deste teste

determinar a influncia do procedimento ou modificao na amostra e da ma

no resultado da anlise realizada nas mesmas condies, com os mesm

reagentes, equipamentos e tcnicas 79. Dois procedimentos diferentes fo

descritos por GARFIELD81 . No primeiro, inicialmente a amostra de interess

analisada em duplicata para assegurar a preciso. Em seguida, uma quantid

exatamente medida e correspondente metade da quantidade da subst

presente na amostra original adicionada a uma poro desta amostra, send

porcentagem recuperada calculada atravs dos resultados obtidos. No segu

procedimento, diferentes quantidades da substncia so adicionadas s por

da amostra-teste e analisadas. Aps a obteno dos resultados, a curva

calibrao construda. Se a concentrao calculada aps a anlise aprese

funo linear em relao substncia analisada, o mtodo adequado. E

curva de calibrao, FUNK e colaboradores 79 denominaram de curva
recuperao.

O teste de recuperao permite, alm da determinao da exatido

mtodo, verificar a interferncia dos componentes da matriz quando n

possvel omit-Ios da formulao, ou quando no se conhece a composio de

formulao.

Outro importante atributo, a preciso do mtodo, definida como a med

da proximidade dos resultados do ensaio, obtidos individualmente de v

tempo nas mesmas condies operacionais. Quando consideradas varia

entre dias, a preciso intermediria est relacionada com anlises realizadas

diferentes dias, analistas, instrumentos e reagentes, mas com o mes

procedimento operacional. No estudo da preciso intermediria do mtodo,

teste de repetibilidade deve ser realizado em dois, trs ou pelo menos 10 d

diferentes81 . Comparativamente, a preciso intermediria expressa a preciso d

resultados obtidos em condies analticas com pequenas alteraes, m

realizadas no mesmo laboratrio e a reprodutibilidade significa a preciso
resultados

obtidos

em

diferentes

laboratrios4,81,113.2CE.

Portanto,

reprodutibilidade est relacionada com procedimentos realizados por dois ou m

laboratrios como ocorre no estudo colaborativo. Assim, FUNK e colaboradore

consideraram a repetibilidade como os ensaios realizados em condi

repetidas, enquanto que a reprodutibilidade em condies comparativas.

Na linguagem farmacopica, a preciso entendida como a concordn

entre os valores de uma srie, obtida de anlises mltiplas da mesma amos

homognea sob as condies de ensaio estabelecidas. A preciso reflete

capacidade de reproduzir o mesmo mtodo, mas no necessariamente

resultado correto ou o esperado, toda vez em que seja realizado conform

padronizad081 ,116. Portanto, o mtodo analtico adequado deve apresen

exatido e preciso.

A especificidade se constitui em um atributo relacionado com a capacida

de um procedimento analtico para quantificar especificamente a substncia pa

a qual foi desenvolvido, mesmo quando presentes, na amostra, interferen

como os excipientes ou compostos de estrutura qumica semelhantes2CE .

ou quantidade que pode ser determinada pelo mtodo, considerado quando

coeficiente de variao entre as respostas for menor que 10 %113.
O procedimento de validao engloba tambm a construo da curva
calibrao e a verificao de sua linearidade. Atravs da linearidade pode

comprovado que o mtodo analtico produz resposta diretamente relacionada c

a quantidade ou concentrao da substncia analisada2re . O intervalo

linearidade definido como o intervalo entre a concentrao mais baixa e m

alta em que o mtodo analtico apresenta exatido, preciso e linearidade. E

linearidade precisa ser determinada na faixa de concentrao em que se

realizado o ensaio.

JENKE 116 apresenta em seu trabalho de reviso, definies, procedimen

e critrios de aceitao que foram publicados na literatura farmacutica e, colo

na forma de tabelas, um resumo comparativo com os parmetros de valida

mais frequentemente estudados.

2.4.1.1. Validao do mtodo de cromatografia liquida de a

eficincia

A validao dos mtodos cromatogrficos tem sido amplamente discutid

e inmeros trabalhos tm sido publicados na literatura49B ,114,116.150,212. Dentre

mtodos cromatogrficos, a aomatografia lquida de alta eficincia empregan

fase reversa, tem sido extensivamente aplicada para a determinao de vr

antibiticos.

A avaliao da robustez de um mtodo cromatogrfico envolve o estudo

diferentes condies do ensaio como alterao da composio e velocidade

fluxo da fase mvel, condies e fornecedor da coluna cromatogrf

comprimento de onda do detector, procedimento de preparao do padr

amostra e temperatura de ensaio. As variaes das condies acima cita

podem ser analisadas por meio de valores de fator de capacidade
resolu o20,114.

Aps a validao, testes de adequao das condies do siste

cromatogrfico devem ser periodicamente realizados, para garantir que o mt

mantenha o mesmo desempenho analtico. Estes procedimentos para adequa

das condies analticas so considerados como parte fundamental do proce

de desenvolvimento e aplicao dos mtodos cromatogrficos, e envolvem

determinao dos parmetros de adequao do sistema cromatogrfico, com

resoluo dos picos, fator de alargamento do pico, nmero de pratos teric

tempo de reteno, preciso, fator de capacidade, assimetria do pico e a rela

sinal/rud04.eo.115.

Dentre os parmetros, JENKE 116 considerou a resoluo (R), como

ferramenta mais importante para testar o desempenho cromatogrfico, uma

que est relacionada com a eficincia (N), seletividade (a) e fator de capacid

(K'). A resoluo indica a eficincia de separao de dois componentes

mistura4.20.:D.5B.1a5.113.2OB. A determinao da resoluo no cromatograma

realizada pela comparao da distncia de dois picos vizinhos, calcul

empregando o tempo de reteno e a largura dos picos. Os picos no

completamente separados quando a resoluo igual a 1, que indica pi

o nmero de

pratos tericos (N) a medida da eficincia da coluna

aumento deste nmero indica que o material de empacotamento o m

indicado, a coluna possui comprimento suficientemente longo e a condio

fluxo da fase mvel adequada l50.

O fator de resposta (f) no faz parte dos parmetros de adequao

obtido pelo quociente da altura ou da rea do pico e da quantidade

concentrao da substncia injetada correspondente rea do pico20, sendo

no estudo de adequao de outros parmetros, por meio de comparao
respostas obtidas para diferentes concentraes da amostra.
A relao sinal/rudo calculada pelo quociente da altura do

correspondente amostra e da altura do pico obtido do rudo a uma c

distncia entre os picos, e determina o limite de deteco do mtodo20:D.

Outro parmetro, o tempo de reteno (tr), o tempo de eluio do pic

mxima altura do mesmo, medido a partir da injeo da soluo-teste, sendo u

funo da velocidade de fluxo da fase mvel e do comprimento da colu

Quando o tempo de reteno maior, significa que a substncia analisada f

mais retida na fase estacionria e demorou mais para ser eluda l50. Mto

cromatogrficos com tempo de reteno menor apresentam vantagem p

rapidez na obteno do resultado.

O fator de separao (a.) permite caracterizar a distncia de separao

dois picos consecutivos. Este fator calculado a partir da comparao do fato

capacidade das duas substncias presentes na amostra. O fator de capacid

(K') a medida do grau de afinidade que a coluna e a fase mvel apresen

para com a substnci a:D113.150.2a!.

adequao das condies do ensaio, e esto relacionados ao material

empacotamento, o qual influencia a afinidade entre as molculas da amostra
coluna.

Para os testes de adequao, no existe regra para fixar limites, os qu

podero ser definidos durante o desenvolvimento ou validao da metodologia

o deslocamento da linha de base durante o ensaio uma variao le

que pode alterar o resultado do teste, e a sua influncia no ensaio deve
estudada2099.19).

2.5. Detenninao quantitativa de antibiticos

Mtodos qumicos e biolgicos foram constantemente pesquisados ap

descoberta da penicirina. Dentre as linhas metodolgicas citadas, caracterst

como sensibilidade e especificidade tomaram o mtodo biolgico como

escolha, desde que mantenha a exatido e a preciso. No entanto, m

recentemente o mtodo de cromatografia lquida vem se tomando uma alterna

ao

microbiolgico,

por

apresentar

caractersticas

como

sensibilidade

especificidade e, particularmente, devido a rapidez na obteno dos resultados

2.5.1. Mtodos microbiolgicos

A potncia do antibitico pode ser constatada pelo seu efeito inibit

sobre microrganismos sensveis, em condies adequadas. A comparao e

contendo o microrganismo-teste. Aps a incubao dos tubos por determin

perodo, dados referentes a leitura por exemplo turbidimtrica, permitem

construo da curva dose-resposta relacionando a concentrao do antibi

com o parmetro de leitura.
RAMMELKAMp 172

ressaltou,

em

1942,

desvantagem

do

mt

turbidimtrico quanto necessidade da amostra em soluo, fator limitante

determinao de antibitico em amostras de fluidos biolgicos e exsuda

Assim, props teste de diluio utilizando Streptococcus hemo/iticus (pyogen

do grupo A, considerado quatro a 16 vezes mais sensvel que o Staphy/ococ

aureus. Este ensaio, cujo princpio se fundamenta na intensidade de heml

exige cerca de 18 horas para sua execuo. Foram empregados 0,2 a 0,9 mL

amostra para o teste, com teor de penicilina de cerca de 0,0039 unidades Flo

HOBBY e colaboradores 102 realizaram estudo comparativo deste mtodo com

de difuso Oxford, tendo-se encontrado erro semelhante para ambos.

apresentada como desvantagem do mtodo em placas a variao da espessu

o ressecamento do meio de cultura, sendo o tamanho dos halos de inibio

crescimento limitado pelo tempo da fase /ag de crescimento do microrganis

Mtodo de diluio em meio slido foi tambm descrito, misturando solues

penicilina de diferentes concentraes em meio fundido e distribuindo o gel

placas de Petri. Aps solidificao foram semeados um ou mais microrganism

com repiques em estrias.

Na determinao do cido asperglico, o teste convencional de diluio

tubos, utilizando o Streptococcus pyogenes cepa C-203, exigiu para execu

cerca de 18 horas. Este foi substitudo por mtodo rpido desenvolvido por RA

Mtodo titulomtrico, com tcnica de diluio foi descrito por FlEMING

em 1942, tendo sido utilizada a glicose no meio de cultura para compatibiliza

crescimento do Staphy/ococcus aureus na presena de indicador de Andrade.

viragem deste indicador foi devida presena de cido. O autor sugeriu

emprego de meio de cultura de composio uniforme e inculo proveniente

mesma cepa para se obter resultados comparveis e constantes em diferen

laboratrios.

O mesmo autor72, em 1943, descreveu micromtodo com finalidade pa

determinao da atividade da penicilina em amostras sanguneas provenientes

pacientes e disponveis em quantidades mnimas, utilizando lmina com

dispositivo para contato da amostra com o Staphy/ococcus aureus. No entan

em 1944, o prprio FlEMING 71 publicou trabalho substituindo tal microrganism

por Streptococcus hemoliticus, e utilizando o sangue como indicador
crescimento, sendo que o crescimento microbiano foi detectado pela presena

hemlise; este procedimento forneceu ponto final mais definido. Outra altera
foi proposta, tambm por FlEMINGoo, que empregou tubo capilar, evitando
trabalho de preparao das lminas. O meio de cultura constou de mistura

glicose, vermelho fenol e soro, que aps incubao, possibilitou detectar

crescimento do estreptococo pelo aparecimento de precipitado de cor amar

intensa. A diferenciao entre capilares com ausncia ou presena

crescimento foi feita pela cor, sendo que onde o crescimento foi ausente, o m

de cultura apresentou-se vermelho ou vermelho-violeta. Alm de amost

sangneas, fludo cerebrospinal e urina foram ensaiados pelo mtodo desc

por FIELDING66. O procedimento envolveu a fermentao da glicose em meio

a penicilina, eram mais ativas em meio cido, e que substncias alcalinas, com

estreptomicina, em meio alcalino. Assim, no mtodo de diluio, a formao

cido durante a incubao tomou a penicilina mais ativa, provocando a virag

pouco ntida. Por outro lado, a estreptomicina tomou-se menos ativa em m

cido, proporcionando ponto final de viragem ntida.

Na avaliao quantitativa da estreptomicina, MAY e colaboradores 146,

1947, estudaram a influncia do meio de cultura, das condies atmosfricas

natureza do microrganismo e do tamanho do inculo na definio do ponto

do teste de diluio em tubos. Foi recomendado mtodo de ensaio atravs

meio de cultura adicionado de 1 % de glicose e vermelho fenol emprega

Klebsella 41. O trabalho mostrou a influncia da condio de anaerobiose

resposta do microrganismo. Klebsella 41, Eschericha col e Staphylococcus,

ensaio da estreptomicina, quando em condio de anaerobiose exigem
concentrao de estreptomicina para inibio do crescimento, oposto
Streptococcus que no sofre influncia da condio de anaerobiose.

Diferentes meios de cultura lquido foram testados com estreptoco

hemoltico, Staphylococcus, Klebsella, bacilo de Friedlander e outros; fo

observadas diferenas marcantes, sendo que resultados favorveis fo

conseguidos com soro aquoso contendo glicose e vermelho de fenol. O meio

soro ou caldo diludo dez vezes em gua proporcionou resultados adequad

quando comparado com os no diludos, inoculados com carga microbiana

quantidade considervel, sendo que nestes a reduo do inculo tornou

resultados irregulares. O trabalho envolveu estudo em condio de anaerobio

quando ocorre a exigncia de concentraes maiores de estreptomicina p

B'8110TEC~
Faculdade de Cin(;ias Far:r,;;c'Jticas
Universidade de So Paulo

VALENTINE e JOHN2m . O vermelho de fenol, presente no meio de cultura, pa

para colorao amarela quando o pH atinge valor da ordem de 8,3.

Mtodo rpido com meio contendo azul de metileno foi desenvolv

inicialmente com a finalidade de deteco qualitativa de microrganismos no le

o qual foi usado a seguir por REID e BREWER 181 para ensaios quantitativos
penicilina e estreptomicina.

HIRSH 101 , em 1950, escolheu o mtodo rpido de diluio com o mes

meio para a determinao da nisina, devido baixa difusibilidade do antibi

em meio slido. Para isto, Streptococcus cremoris, microrganismo de crescime

rpido, foi empregado possibilitando encerramento do teste em cerca

15 minutos. A inibio de crescimento do microrganismo foi distinguida devido

azul de metileno adicionado ao meio de cultura, indicando o crescimento o

ocorreu a viragem da colorao do indicador de azul para incolor. Num segu

mtodo descrito, a contagem do nmero de clulas viveis de Streptococ

agalactiae e sua relao com concentrao de nisina permitiu a determinao

sua atividade biolgica. Para isto, suspenso com cerca de 800.000 UFC/mL

empregada. A curva dose-resposta resultava da relao dos valores do logari

do nmero de sobreviventes contra concentrao de nisina. Neste trabalho

observado que com aumento do tempo de incubao havia diminuio

atividade da nisina, falseando o resultado. Assim, foi sugerido relacionar o tem

requerido para o microrganismo iniciar seu crescimento com a concentrao

antibitico. No entanto, a aplicao rotineira de medida do tempo no foi vi

sendo ento utilizada satisfatoriamente a medida de pH para relacionar o tem

quando ocorre o inicio do crescimento do microrganismo. O mtodo

meios de cultura, distribudos rapidamente com mquina de enchimento

ampolas, operada manualmente e possibilitaram o preparo de sete dilui

seriadas, cada conjunto, na razo de um conjunto por minuto.

FAL~, em 1953, descreveu procedimentos para laboratrios da r

oficial de sade, objetivando colaborar no diagnstico de doenas infecciosa

no estudo da terapia adequada, com vrios antibiticos rotineiramente utiliza

em setores da sade pblica. O ensaio de escolha foi o mtodo de diluio

tubos, por permitir resultados mais exatos e com distino entre nv

bacteriosttico e bactericida. O autor recomendou controle dos meios de cultu

avaliao quanto condio de esterilidade de cada lote, a capacidade

crescimento dos microrganismos-teste nos mesmos e conhecimento de
sensibilidade ao antibitico em questo.

2.5.1.2. Mtodo turbidimtrico

O primeiro mtodo turbidimtrico considerado preciso, descrito

FOSTER 73 em 1942, tratava-se de um procedimento para o ensaio da penic

empregando Staphylococcus aureus cepa denominada Oxford, colocada

caldo nutriente. O ensaio foi realizado com quantidades crescentes da penic

que produziram inibio de crescimento do microrganismo proporciona

concentrao, permitindo realizar determinaes quantitativas. O procedime

envolveu a comparao em paralelo quanto inibio de crescimento microbi

de vrias diluies da amostra desconhecida com vrias diluies do padro

causariam desvios na turbidimetria, tanto para Staphylococcus como para v

outros microrganismos, sendo tambm confirmado por FOSTER e WlLKER 7

inativao ou modificao da molcula de penicilina, quando colocada

presena da glicose antes da inoculao ou mesmo a interferncia no mecanis

de inibio normal da penicilina podem favorecer a obteno da curva de inibi

de crescimento anormal. Porm, resultados conflitantes foram obtidos por BO

e DAVIES 19, em que apesar da glicose, a curva de crescimento se mant

regular. Ainda sobre a tcnica de 4 horas, foi de grande importncia par

determinao da penicilina em caldos de fermentao durante o proce

produtivo quando a quantidade mxima do antibitico era atingida. A cultura

Penicillium notatum mantinha a potncia da penicilina no caldo por curto per

de tempo. Desta forma, alta concentrao do microrganismo era empregada p

acelerar a visualizao do crescimento microbiano, ocasionando a diminuio

sensibilidade da metodologia. FOSTER e WlLKER74 aperfeioaram o mt

empregando

Bacillus

adhaerans,

devido

ao

seu

rpido

crescimento

sensibilidade penicilina semelhante do Staphylococcus aureus cepa

acrescentando procedimento de agitao do meio de cultura durante a incuba

para agilizar a obteno dos resultados. Com tal procedimento o tempo

incubao foi reduzido de 16 para 3 a 5 horas. As variaes que pod

influenciar nos resultados de leitura turbidimtrica foram aqueles relaciona

com a diferena no tamanho dos tubos de ensaio e no ciclo de crescimento e

dos microrganismos. Amostras de penicilina possuam bactrias contaminan

provenientes do caldo de fermentao e ocasionavam interferncia no ens

Assim, foi verificado a necessidade de eliminar os contaminantes atravs

tcnica de filtrao ou pasteurizao das amostras, desde que amostra e pad

considerada satisfatria para o final da incubao e construo da cu

dose-resposta foi de 0,27 a 0,34.

LEE e colaboradores 1:D substituram o Staphy/ococcus aureus p

Streptococcus aga/actiae do grupo B de Lancefield empregando tambm cult

em grande concentrao com incubao por no mximo 90 minutos. Ne

trabalho, o autor recomendou o emprego de formoI para cessar o crescime

microbiano e evitar a variao da turbidimetria que poderia ocorrer durant

etapa de leitura da turbidez. Foi feita a comparao entre a substncia padro

desconhecido empregando-se 6 tubos para cada padro e amostra desconhec

em srie de concentraes de 0,01 a 0,2 Unidades de penicilina por

Tambm, RAKE e JONES 174 propuseram mtodo turbidimtrico utilizando

Streptococcus com possibilidade de leitura em cerca de 3 a 4 horas.

O estudo relacionado com a influncia do pH em diferentes concentra

da penicilina no meio de cultura, realizado por FOSTER e WILKER 74, mostrou q

a variao do pH no alterava a inibio de crescimento microbiano quan

mantido o pH do meio entre 4,8 a 7,9, faixa em que a penicilina perman

estvel, sendo rapidamente inativada fora deste intervalo. O pH de mx

estabilidade foi 5,8.

Em 1944, MAcMAHAN l48 descreveu um mtodo turbidimtrico semelha

ao de FOSTER 73, empregado para o controle de qualidade de rotina na inds

de produo da penicilina. O meio de cultura utilizado foi o caldo nutrie

acrescido de 0,4 % de extrato de levedura que auxilia na obteno da curva do

resposta mais adequada. O procedimento tcnico envolveu srie de tubos

duplicata com at 0,12 mL de uma soluo estoque do padro com concentra

agitao durante a incubao dos tubos 19,148. Um dispositivo automtico pa

esvaziar por suco a clula onde feita a leitura foi desenvolvido para agiliza

leitura no aparelho fotomtrico. O mtodo foi comparado com o de dilui

seriada e de cilindro em placas. Detectou-se que o tempo dispendido
semelhante ao mtodo do cilindro em placas, sendo que a preciso maior.

mtodo de diluio seriada foi mais rpido que os anteriores, porm requeren

maior nmero de repeties do teste para obter a mesma preciso. Consis

portanto em mtodo mais trabalhoso. Outro procedimento para economizar tem

operacional, foi introduzido por JOSLYN 118 consistindo do emprego de tub

contendo o meio de cultura que so colocados diretamente no aparelho de leitu

MAcMAHAN 147 props a utilizao de pipetas especiais com medida exata

rpida das solues-teste. O mtodo turbidimtrico foi adaptado para
determinao de outros antibiticos. No caso de doseamento da penicilina
sangue pelo mtodo de MAcMAHAN 147, ocorreram limitaes, mas a preciso
suficiente tendo grande sensibilidade. A curva padro foi linear na faixa

concentrao de 0,001 a 0,01 U/mL aps 4 horas de incubao empregan

Streptococcus haemoliticus.

A exatido do ensaio turbidimtrico foi estudada em 1948 por BOND

DAVIES 19. Retas paralelas foram obtidas atravs da metodologia empregan

Staphylococcus aureus cepa Oxford e a cepa americana NRRL 313. Nes

trabalho, foram utilizadas trs concentraes do padro e da amost

Relacionando-se a resposta medida de turvao com

o logaritmo

concentrao do antibitico a linearidade da reta foi observada. No estu

comparativo realizado pelos autores, o erro padro para os ensaios de dilui

em tubos, de cilindros em placas e turbidimtrico foram respectivamente, 10, 4

potncia de antibiticos em preparaes analticas, JOSLYN e GALBRAIT

estudaram curvas de crescimento de vrias bactrias patognicas em dive

condies experimentais. No incio do estudo, resultados mostraram que ap

perodo de incubao de 4 horas, o crescimento atinge um mximo e come

decair. No entanto, na presena de um antibitico, o crescimento foi re

quando na presena de concentraes crescentes da substncia antimicrob

Quando a concentrao foi muito elevada o crescimento se tomou m

ordenado. Em prosseguimento ao estudo foi determinada vantagem da supre

da fase lag de crescimento, empregando um inculo jovem. O ponto fina

ensaio foi determinado como sendo aquele que inibe o crescimento microb
em 50 % em relao ao tubo controle.

GAVIN83 publicou extensa reviso relacionada com o mtodo turbidim

aplicado a antibiticos e vitaminas,

destacando as

suas

vantagen

desvantagens. Fatores que influenciam o mtodo turbidimtrico e a sua prec

bem como o procedimento para a leitura da turvao foram relatados. O a

classificou o ensaio turbidimtrico em duas categorias, tendo como base o tip

resposta. A primeira envolvia a resposta tudo ou nada, do tipo qualitativo

segunda a resposta gradual, mtodo quantitativo.

Outra extensa reviso foi publicada por LOY e WRIGHT141 , em 1

incluindo as vantagens e desvantagens do ensaio turbidimtrico. Todas as et

de desenvolvimento e aplicao da metodologia foram abordadas no ref

estudo. .Procedimentos referentes utilizao adequada dos padres

referncia, os microrganismos, os meios de cultura, a preparao da solu

teste, englobando tambm a preparao dos tubos, a medida da respost

O mtodo turbidimtrico automtico para deteco do dixido de carb

segundo PLATT e colaboradores 166 apresenta limitao por ter seu uso re

somente queles microrganismos capazes de produzir alta taxa de dixid

carbono sob as condies de anlise. O ensaio foi estabelecido para v

antibiticos com exceo dos antibiticos resistentes ao microrganismo-teste

necessrio um perodo de 24 horas para o ensaio de 50 amostras, sendo

8 horas foram despendidas com a execuo tcnico-operacional e 16 h

restantes para encerrar o ensaio.
Mtodo

turbidimtrico

automtico

semelhante

desenvolvido

Di CUOLLO e colaboradores 46 , cujo equipamento foi denominado Autoanal

introduz continuamente o inculo, meio de cultura e amostras diludas

aparelho. A metodologia envolveu a diluio contnua das amostras, atrav

retirada de volume a fluxo variado e adio de diluente a taxa equivalent

mistura com meio inoculado permaneceu incubada por 1 hora, e o crescimen

automaticamente medido em potencimetro. O ensaio em Autoanalize~

empregado para a determinao da tetraciclina e neomicina, atravs

construo da curva dose-resposta.

Em 1965, McMAHAN 147 estabeleceu as etapas bsicas do en

turbidimtrico de antibiticos e vitaminas, tendo como finalidade a transfer

de trabalho altamente repetitivo a mquinas, diminuindo erros, bem como a fa

e monotonia inerentes ao procedimento analtico. Foi obtida uma economi

mo de obra em cerca de 30 % com capacidade para 50 testes por hora.

KAVANAGH 121 demonstrou que a automao nas etapas crticas do en

turbidimtrico resultou em aumento significativo da preciso e exatidAo

O conhecimento de que os mtodos de dosagem microbiolgica s

menos precisos que os ensaios qumicos, levaram BERTANI e colaboradore

em 1979, a verificar a grandeza desta menor preciso. Para isto, os auto

realizaram ensaios em oito diferentes laboratrios de matrias-primas de vitam

812 e tetraciclina. Na dosagem da tetraciclina foram obtidos resultados de qua

diferentes laboratrios empregando os mtodos turbidimtrico e de difuso
placas. O mtodo turbidimtrico mostrou-se mais preciso que o mtodo
placas. Na determinao de B12, foram encontrados diferenas na preciso
ensaios realizados por diferentes laboratrios.

2.5.1.3. Consideraes gerais sobre os mtodos de difuso em gel

Este mtodo emprega meio de cultura slido inoculado, distribudo

placas, em sistema de mono ou bicamada, atravs do qual a substncia-teste

difunde. A soluo-teste aplicada sobre a superfcie do meio, em uma

restrita, e as placas so ento incubadas. O crescimento do microrganismo oco

respeitando, porm, reas onde tenha ocorrido a difuso do antibitico, geran

contraste e resultando a chamada zona de inibio de crescimento. Tal fenme

originou toda a teoria que embasa o mtodo de difuso.

A necessidade de monitorar caldos de fermentao de penicilinas indu

CHAIN e colaboradores34, em 1940, busca de metodologias menos exigentes

fim de medir o halo das zonas de inibio de crescimento, provocado p

amostra, comparativamente ao padro do antibitico. Este trabalho foi o incio

uma srie de experimentos, como o de ABRAHAM e colaboradores3 , que um a

WOODRUFF 75 , pois em vez de derramar a suspenso aquosa do microrgan

sobre o meio j solidificado, efetuava a inoculao do germe no gel ainda f

para posterior transferncia placa de Petri. Os mesmos autores 75 sugerir

substituio do Staphylococcus aureus cepa H por Bacillus subtilis, uma vez

o primeiro, na presena de penicilina apresentava lise espontnea, ocasion

pouco contraste na zona de inibio de crescimento. Outra vantagem resid

fato de permitir a inoculao dos esporos na temperatura que evitas

solidificao rpida do meio de cultura. Por sua vez, como envolve germina

esporos, a distncia de difuso do antibitico era maior no caso

Staphylococcus aureus, resultando tambm em halos maiores.

Em relao ao mecanismo de dispensao do antibitico, simultaneam

VINCENT

e VINCENT211

SHERWOOD,

colaboradores 189 e

BEE

SHERWOOD 14 propuseram, no mtodo de difuso em gel, a substituio

pequenos cilindros por discos de papel de. filtro. Estes eram saturados
soluo de penicilina, como reservatrio de antibitico a ser difundido no

inoculado, reduzindo o trabalho e tempo envolvidos no teste, alm de facil

manipulao das placas.
A determinao quantitativa da estreptomicina com o Bacillus subtilis

microrganismo-teste, descrita por LOO e colaboradores 14) em 1945, evide

vantagens da tcnica com discos de papel, em comparao com cilindros,

das citadas anteriormente. Permitiu a aplicao da tcnica em amostras dilu

em solvente orgnico e a manipulao das placas sem precaues especiais

entanto, os autores determinaram um ponto crtico para o uso dos disco

papel, que foi a necessidade de aplicao rpida e em quantidade constante

de ensaio de rotina, sendo que a mdia de distribuio das solues-teste

oito discos por minuto.
Dentre

muitas

respectivamente

em

publicaes,
1944

SCHIMIDT
1945,

MOYER188 e

descreveram

HA

detalhadamen

procedimentos analticos da tcnica de cilindros em placas, relacionan

fatores que afetam o uso do dispositivo de REEVES e SCHIMIDT 178. No tr

de HAYES92, destaque foi dado ao estudo da influncia da espessura da c

de gar na definio e clareza dos halos de inibio de crescimento. SN

LEWlS 192 em 1959, alertaram quanto ao cuidado na utilizao de cilindros

inox, indicados no mtodo oficial da Food and Drug Administration (FDA).

dos sete antibiticos testados mostraram perda da potncia resultante do c

das solues-teste com cilindros de ao inox.

No trabalho de PRATI e DUFRENOy170, foram citadas a ultiliza

microrganismos na fase logartmica de crescimento devido a maior sensibili

penicilina. Para isto, foi sugerida a pr-incubao das placas semead

3 horas e 2 horas, respectivamente, para Staphylococcus aureus e B

subtilis antes de colocar as solues, seguida de reincubao das placa

mesmo tempo.

Os estudos envolvendo ensaio de difuso para antibiticos

inicialmente restritos, no permitindo extrapolaes abrangentes aos

antibitiocos que surgiam. Assim, justificava a investigao dos fator

interferncia sobre zonas de inibio e tratamento terico quanto inclina

curvas dose-resposta. Este enfoque iniciou-se com COOPER e WOODMAN

1946, que estudando a teoria de difuso em gar utilizaram soluo de

direta entre volume da soluo no cilindro e a distncia de difuso, quando

considera uma determinada concentrao. Foi includa na equao o termo q

explicaria a influncia da espessura da camada de gar.

No estudo de HUMPHREY e L1GHTBOWN 1re, considerou-se a difuso

antibitico em placas de Petri, a partir de recipientes colocados na superfcie

meio de cultura, bem como a espessura da camada de gar. A concentrao

antibitico ao redor da fonte, onde colocado, pode ser expressa teoricamente

equao envolvendo a concentrao inicial a uma dada distncia, a espessura

camada de gar, a constante de difuso e o tempo envolvido. Os auto

mostraram que a distncia de difuso ao quadrado estava relacionada com

logartmo da espessura do gar. Quando camadas do meio com espessura me

que 1 cm foram utilizadas, o tamanho das zonas de inibio de crescime

apresentava menor sensibilidade a variaes deste elemento. A validade de

equao foi confirmada pela medida constante de difuso da penicili

estreptomicina e aureomicina e da concentrao crtica dessas substncias p

inibir os microrganismos-teste; foram determinados, tambm, os valores

tamanho do halo de inibio de crescimento aps variar o perodo de difuso

fator determinante na inclinao da curva dose-resposta a constante de difus

do antibitico, bem como o tempo, pois quando prolongado, poderia aumenta

inclinao.
COOPER e WOODMAN.J, com a equao proposta para estudo

difuso; relacionaram o dimetro da zona de inibio a certos parmetros usad

para estudar a influncia das variaes tcnicas dos ensaios. Estudaram o tem

de pr-difuso, densidade do inculo em relao sua influncia sobre

relao concentrao mnima inibitria.

O tempo crtico, isto , o tempo de incubao no qual o tamanho dos ha

definido, depende da fase lag de crescimento e do tempo de gerao

microrganismo sendo, portanto, dependente tambm da temperatura e
tamanho do inculo inicial. Por outro lado, a concentrao do antibitico
interfere no tempo crtico HX>. Assim, concentrao crtica e populao crtica

decisivas na definio da posio do limite da zona de inibio de crescime

Esta zona, ento, influenciada pela difuso do antibitico ou pelo tem

necessrio para alcanar a populao crtica.

A necessidade do dimensionamento das zonas de inibio condu

exigncia de inculo com populao microbiana homognea, proporciona

populao crtica constante definida e sem tendncia lise. Assim, atravs

equao

estabelecida

foi

possvel,

embora

com

exatido

reduzida,

determinao terica dos valores de dimetro para diferentes concentraes

antibitico, assim como do tempo de difuso envolvido e clculo da constante

difuso.

Num estudo similar ao de COOPER e WOODMAN 40, BRADY e KAT

consideraram a constituio do meio, volume do cilindro, espessura do ga

temperatura de incubao como sendo fatores que determinam a otimizao

ensaio. Utilizando clortetraciclina e Bacillus cereus, quando a temperatura

incubao e nvel de nutrientes no meio de cultura foram inferiores

normalmente utilizados, as zonas de inibio foram maiores. A espessura do

foi o fator que mais influenciou a variabilidade da resposta, pois quanto mais

Tambm destacou a influncia da qualidade do gar e da sua origem, bem co

a sua concentrao sobre o resultado do ensaio.

LEES e TOOTILL 132 verificaram que o microrganismo tem como exign

bsica, o pH da soluo-teste, cujo valor da faixa adequada favorvel, tamb

para a atividade e estabilidade das substncias testadas. Assim, foi recomenda

a utilizao de soluo-teste com pH prximo quele de crescimento timo
microrganismo como condio ideal, embora o tamanho das zonas de inibio
crescimento variem com o pH. Este autor estabeleceu que a condio tima

pH das solues-teste e do meio de cultura deve ser definida empiricamente pa

cada caso. Em relao temperatura de incubao, os mesmos auto

estabeleceram que deve haver uma combinao entre tempo e temperatura
incubao. A substncia a ser testada pode requerer uma temperatura

incubao especfica, sendo que o tempo pode variar de 3 a 30 hor

dependendo do microrganismo-teste.

HEATLEy94 verificou que o Bacillus subtilis mostra resultados satisfatr

em 3,5 horas para temperatura de incubao de 37C ou em 18 horas

incubao entre 25 a 28C. Sendo a velocidade de difuso da substncia no g

determinante do tamanho da zona de inibio, GAVIN82 considerou que some

aps a difuso da substncia testada, antes da multiplicao microbiana, ocorr

formao do halo de inibio de crescimento. Assim, zonas de inibio maio

podem ser obtidas alterando a fase lag do crescimento atravs da refrigera

das placas ou mantendo as placas a temperatura ambiente aps a colocao d

solues-teste.

penicilina. Na determinao da potncia de cada um dos antibiticos compo

por neomicina e polimixina S, THOMAS e THOMPSON 195 verificaram que, apes

de no ser recomendada pelas autoridades oficiais, bem como envolver pesqu

dispendiosa, a utilizao de padres em mistura na determinao da atividade e

amostras contendo mais de um antibitico a tcnica de escolha.
DiCUOLLO

colaboradores 46

descreveram

mtodo

microbiolg

automatizado para determinao da penicilina, utilizando placas grandes em q

96 amostras foram testadas simultaneamente. Para maior rapidez do ensaio,

amostra foram inclusive diludas automaticamente. Aps incubao, as plac

foram fotografadas em filme polaride, seguida de revelao e os dimetro

medidos atravs de aparelho com capacidade de aumentar em 20 vezes

imagem dos halos de inibio. Os dados foram impressos e a potncia calcula

manualmente. Dentre as vantagens do mtodo esto a economia de tempo

custo material em aproximadamente dois teros, uniformidade na aplicao d

amostras e diminuio da possibilidade de erro humano. No trabalho, os autor

utilizaram soluo de cloreto de trfeniltetrazlio a 0,04 %, adicionado ao m

superfcie inoculado com o microrganismo-teste. As zonas de inibio

crescimento foram facilmente visualizadas pelo contraste devido a cor verme

originada pela reduo do corante, formando uma substncia insolvel,

formazano. As fotografias foram feitas empregando filtro azul que aumentava

contraste de cor devido reduo do corante, cuja documentao apresentou

vantagem de manter o registro dos resultados do ensaio, disponveis pa

referncia futura. Empregando o mesmo corante YAMAMOTO e PINT0

padronizaram mtodo rpido de difuso em placas para a determinao

potncia da neomicina em preparaes farmacuticas. As placas em bicama

no tempo de incubao, sendo comprovada pela anlise estatstica

resultados.

KABAy120 em 1971, props um mtodo de ensaio rpido, tendo s

testados

14

antibioticos

com

mesmo.

As

placas

com

Baci

stearothermophy/us e cilindros foram incubadas por 4 horas a 65C; os ha

foram facilmente medidos a olho n. O autor comparou este novo mtodo com

convencional recomendado pelo Cade of Federal Regulation (CFR), tendo s

detectada diferena na preciso entre os dois; o coeficiente de variao p

rplicas de testes foi menor que 2 % para ambas.

Dentre os fatores que influenciam o ensaio microbiolgico est o meio

cultura. Assim, FREEMAN e colaboradores n estudaram cerca de 1.000 libras

meio de cultura, perfazendo o total de 100.000 amostras testadas anualmen

Para isto, cada lote, antes de sua liberao ao mercado, foi submetido a srie

triagens para investigar a obedincia s exigncias estabelecidas quanto a

fatores biolgicos e fsicos, em paralelo aos meios de cultura controle. O estu

envolveu procedimentos iniciando com registros do nmero do lote do meio, da

da preparao, pesagens e medidas efetuadas, tempo e temperatura

autoclavao e condies de armazenamento. Foram anotados, tambm, o tem

de incubao das placas, tamanho dos halos de inibio de crescimento, grau

turvao, inclinao da reta-padro, diluies das solues-teste, tcnicas
diluio com a manuteno e calibrao dos equipamentos.

O meio de cultura considerado ideal deve ter cor padronizada, ser de f

manipulao e no apresentar formao de espuma. De 1973 a 1976 for

testados 31 lotes de meio de cultura. Destes, apenas 15 foram aceitveis, sen

contraste das zonas de inibio de crescimento, atravs da triagem

aminoglicosdeos.

Assim,

foram

considerados

sensibilidade

microrganismo-teste para o antibitico, a variao dos meios de cultura, o pH

meio, o volume ou espessura do meio, a concentrao do inculo, o volume

solues-teste contidos nos reservatrios, o tempo e temperatura de incuba

Em relao ao meio de cultura, os autores indicaram que em pH 7,9

microrganismos apresentavam maior atividade. Diferentes recursos de aplica

da soluo-teste, como discos de papel de filtro, reservatrios em formas de c

e de swab, apresentaram resultados semelhantes na distncia de difuso. M

de cultura em espessura menor, leva a maiores halos de inibio de crescime

Por sua vez,

de forma antagnica,

aminoglicosdeos apresentam co

caracterstica a baixa difusibilidade 127, para se valorizar o aumento

sensibilidade provocado pelo primeiro; recurso adicional portanto o da redu

de carga microbiana, que tambm conduz a maiores halos de inibio

crescimento. Objetivando aperfeioamento dos mtodos de difuso apresenta

nos compndios oficiais, por serem trabalhosos e morosos, BRADY e KAT

propuseram alternativas baseando-se no conceito de que o padro e

desconhecido podem se constituir em ensaio de duas placas, com precis

exatido equivalentes ao mtodo oficial da Association of Official Analy

Chemists (AOAC)9. Fizeram testes para bacitracina, clortetraciclina, oxitetracic

e estreptomicina e os resultados obtidos com o mtodo simplificado mostraram

favorveis quando confrontados com o ensaio da AOAC9 com relao prec

e exatido, tendo sido o coeficiente de variao para 10 rplicas de 2,5 a 6,8

com mdia de 4,3 %.

para antibiticos no associados ou que, quando em mistura, eram previam

separados. O pH do meio de dosagem aps esterilizao foi estabelecido c

7,0 a 7,1. A suspenso do microrganismo foi padronizada atravs de colorm

para 40 % de transmitncia em 650 nm. Aps a preparao das solue

padro em cido clordrico 0,01 N para a construo da curva de calibrao
amostra, foi feita a transferncia para os tubos, seguida da adio do

inoculado com Escherichia coli. Imediatamente todos os tubos foram colocad

37 C por 3 a 4 horas em banho de gua. No final do tempo de incuba

adicionado a cada tubo formaldedo para cessar o crescimento microbiolgic

leitura da turvao foi em espectrofotmetro a 530 nm. A determina

potncia envolveu a construo da reta de melhor ajuste atravs do clculo

pontos mais baixo (L) e mais alto (H) desta reta, empregando os valore

transmitncia obtidos e as concentraes correspondentes das solues-tes

padro, conforme descrito no CFR3B. A determinao da concentrao da am

foi feita atravs da extrapolao da resposta obtida para a amostra nesta ret
calibrao.

Os mtodos microbiolgicos para determinao da tetraciclina f

empregados para amostras que no apresentaram resultados confiveis atr

de ensaios fsico-qumicos. Foram descritos mtodos de diluio em meio lq

turbidimtrico e de difuso em placas com recursos e modificaes para agili

obteno do resultado.

VIOLA e colaboradores214 em 1970, compararam os mtodos empreg

Escherichia co/i e Bacillus cereus ATCC 9634. O estudo foi realizado por m

turbidimtrico

automtico

para

a tetraciclina

em

mistura.

dificul

metodologias. A comparao atravs da anlise estatstica dos mto

comprovaram a validade do mtodo turbidimtrico automatizado, que possibil

agilizao na obteno dos resultados com economia de tempo de an

mantendo a preciso e exatido. Da mesma forma, a comparao entre

mtodos em placa e o turbidimtrico automatizado mostraram resulta

equivalentes.
ARRET e colaboradores7 apresentaram em 1971, trabalho de reviso

mtodos microbiolgicos de ensaio de antibiticos, tanto de mtodos novos c

modificados. Em relao ao ensaio de difuso em placas para a determina

doxiciclina, Bacllus cereus varo mycoides ATCC 11778 era recomendado c

microrganismo-teste, com meio em dupla camada e curva padro entre 0,06

0,156 IlglmL preparados em cido clordrico 0,1 N. O mesmo mtodo

pequenas alteraes foi descrito para o ensaio de oxitetraciclina e tetracic

sendo a curva-padro de 0,64 a 1,56 llg/mL para ambas. No ensaio turbidim

recomendou-se o Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, com uma curva-pad

para a doxiciclina de 0,064 a 0,156 llg/mL, enquanto que para a oxitetraciclin

tetraciclina a concentrao era de 0,64 a 1,56 IlglmL. Os autores colocaram

tabelas, os dados referentes aos mtodos de anlise, incluindo o emprego

meio em dupla camada com volumes de 21 e 4 mL, para as camadas bas

superfcie, respectivamente. No ensaio turbidimtrico, o volume de meio inocu

transferido para cada tudo foi estabelecido para 9 mL, sendo 1 mL da amo

Indicaram o procedimento para a preparao da soluo estoque do antibitic

que se refere concentrao final para a construo da curva de calibrao.

valores sugeridos so aqueles recomendados pela FDA, que adotou por sua

microbiana a uma quantidade que possa ser detectada exija um tempo

incubao de cerca de 16 horas, mudana da atividade metablica, no enta

pode ser detectada antes que o crescimento celular possa ser observado.
mtodo mostrou-se mais sensvel

para a determinao da tetracid

comparativamente ao mtodo respiromtrico 191 .

Os mtodos de difuso para a determinao da tetracidina recomend

em compndios oficiais como AOAC 10 ou CFR38 e USp200 so laborios

demorados, devido principalmente necessidade de preparao de gra

quantidade de placas para minimizar as variaes das respostas obtidas

diferentes placas. Neste sentido, mtodo de anlise desenvolvido para redu

nmero de placas necessrio dosagem de antibiticos por tcnica de difus

desenvolvido por BRADY e KATZ22 . A oxitetracidina foi doseada com Bac

cereus ATCC 11778 atravs do mtodo de difuso em placas, modificado. T

as solues do padro para a obteno da curva de calibrao e da amo

foram colocados na mesma placa. Portanto, cada placa consistiu em um en

independente. Estudo comparativo deste mtodo simplificado empregando p

nica ou rplicas de duas e trs placas, com o mtodo convencional foi reali

pelos pesquisadores. Resultados de coeficiente de variao e do teste

recuperao mostraram vantagem do ensaio em duplicata. Este mtodo mini

procedimentos analticos e os custos sem a perda da exatido, sensibilidad

repetibilidade, quando comparado com a metodologia convencional.

atBtfOTEC/.l
Faculdade de Cincias Fai'''acb!ticas
UniverSidade de So PaUlo

2.6.2.1. Cloridrato e fosfato de tetraciclina

A Farmacopia Americana publicou em 1955164 o primeiro mt

microbiolgico para a determinao do c1oridrato de tetraciclina. Observa

referente comparao dos mtodos microbiolgicos com os fsico-qum

recomenda o emprego do primeiro, quando existe a necessidade de determin

perda da atividade do antibitico. A tcnica turbidimtrica recomendada n

edio, empregava como substncia de referncia, o cloridrato de tetraciclina

intervalo de concentrao de 0,04 a 0,4

~gltubo

e 0,24

~g/tubo

da quantid

terica da amostra em soluo-tampo fosfato pH 4,5. O microrganismo-t

recomendado foi o Micrococcus pyogenes varo aureus PCI n 209-P

ATCC 6538-P, cuja suspenso era preparada em caldo peptona e padroniz

em espeetrofotmetro para obter transmitncia de 85 % a 650 nm. D

suspenso, 4 a 5 % era transferida para o meio de dosagem especfico, o c

peptona. A temperatura de incubao recomendada foi de 37 0,5 C, com

tubos mergulhados em banho de gua, por 3 a 4 horas. Para o controle

crescimento foi estabelecida a preparao de 20 tubos,

sendo met

correspondente ao branco da leitura espeetrofotomtrica e outra metade

tubos contendo meio inoculado e a soluo do padro de concentrao media

A interrupo do crescimento microbiano aps a incubao, realizada atravs

adio de 0,5 mL de formaldedo diludo foi recomendada, seguida de leitu

580 nm. A potncia mnima exigida foi de 85 % do teor declarado. A determina

da potncia foi pela construo da reta de melhor ajuste atravs da obteno

pontos mais baixo (L) e mais alto (H) desta reta, conforme descrito no CF

inoculao da suspenso a 2 %. Foi estabelecido no mtodo, a preparao

substncia padro nas concentraes de 0,146 a 0,395 IlglmL em solu

tampo fosfato 0,1 M a pH 4,5 a partir de uma soluo-estoque de 1000 Ilgl

preparada pela diluio cido clordrico 0,1 N, que poderia ser utilizada

intervalo de uma semana, quando armazenada sob refrigerao. Os clculos p

determinao da potncia do antibitico, descritos na edio anterior

permanecem inalterados.

Na sua XVII edio201 a Farmacopia Americana resumiu os parmetros

determinao quantitativa em tabelas, mantendo a descrio do procedime

geral. A partir desta edio, no houve diferena metodolgica significati

Ocorreu alterao do tempo de armazenamento da soluo-estoque do antibit

em geladeira para um dia. A concentrao do inculo no meio de dosag

passou a ser de 0,2 a 0,6 %. Nas edies da USP XVIll 202 e XIX203, indicou-s
padronizao da suspenso microbiana atravs do espectrofotmetro a 580

para obter transmitncia de 25 %. Desta suspenso, foi estabelecido

transferncia de volume entre 0,1 a 2,0 mL para cada 100 mL do meio

dosagem. Nas edies seguintes2042Cl)206206, recomendou-se inculo de 0,1 %

suspenso, permitindo alterao desta concentrao quando necessrio p

obter uma relao dose-resposta mais adequada. O microrganismo-te

recomendado para o ensaio turbidimtrico partir da 20a edio204 foi

Staphy/ococcus aureus ATCC 29737.

A especificao do teor foi de 90 a 120 %, presente na USP XIX203 , e 9

125 % nas edies seguintes2042Cl5206206 .

constatada na metodologia em relao temperatura de incubao que

especificada entre 36 e 37,5 oCo No terceiro suplemento da USP XXIII207

temperatura de incubao recomendada foi de 37 oCo

procedimento para a determinao da potncia do c1oridrato

tetraciclina constou pela primeira vez na Farmacopia Britnica em 195824, se

descrito o mtodo de difuso em placa ou em bandeja. O meio de cult

inoculado com Bacillus pumilus NCTC 8241 a 1 % foi recomendado. Diluente
pH de 5,8 e substncia padro no intervalo de concentrao de trabalho de

20 U/mL, e incubao das placas entre 37 a 39 C, foram estabelecidos par

metodologia. Nas edies seguintes, o mtodo de difuso permaneceu inaltera

exceto, a partir de 197327 quando a temperatura de incubao sugerida passo

faixa de 30 a 37 oCo A partir desta edio27 tambm o mtodo turbidimtrico

includo. Neste mtodo, foi estabelecido Staphylococcus aureus NCTC 67

como microrganismo-teste, soluo de trabalho do antibitico no intervalo

0,015 a 0,04 Ul/mL, com incubao dos tubos entre 35 e 37 C por 3 a 4 horas.

A especificao do teor da parte ativa foi inicialmente de 80 a 120 %

Farmacopia Britnica de 196325 , sendo alterada nas edies seguintes26.27.28.2

para 95 a 105 %.

Em 1971, a Farmacopia Europia~ apresentou as duas metodolog

difuso em placas e turbidimetria, empregando Bacillus pumilus NCTC 82

soluo do antibitico entre 2 e 20 UllmL e temperatura de incubao entre 3

37 0 C e tambm Bacillus cereus ATCC 11778, soluo do antibitico entre

4 UllmL e temperatura de incubao entre 35 a 37 0 C para o ensaio de difus

Na turbidimetria, a metodologia recomendada empregava Staphylococcus aur

NCTC 6571 e ATCC 6538-P, com soluo do antibitico diludo em tampo

de incubao recomendada de 35 a 37C.

As farmacopias, Europia58 e Internacional 1re apresentam some

monografia da matria-prima de cloridrato de tetraciclina. Alteraes mnimas

procedimentos apresentados nas duas farmacopias foram constatadas.

Farmacopia Internacional de 19791re, os microrganismos recomendados fo

Bacillus pumilus ATCC 14884 e NCTC 8241 e Bacillus cereus ATCC 117

constando apenas o mtodo de difuso em placas. As solues-teste diludas

soluo-tampo fosfato com pH 4,5, nos intervalos de concentrao de

20 UllmL e 0,5 a 2 UllmL e temperaturas de incubao de 37 a 39C e 3

33 C foram determinadas, respectivamente, para Bacillus pumilus e Bac

cereus. Em 1981 e 1988, a Farmacopia Internacional107.1re publicou monogr

contendo metodologias de dosagens microbiolgicas idnticas s descritas

edio de 19791re.

A metodologia que consta da Farmacopia dos Estados Unidos do Br

28

edio63,

emprega

como

microrganismo-teste

Sarcina

se

lutea,

recomendados dois delineamentos. A tcnica de duas doses com concentra

das solues do antibitico de 10 e 20

~g/mL

e 5 e 20

~g1mL,

e tcnicas da cu

padro empregando solues-teste com concentraes de 8 a 36

~g1mL

fo

descritas. A 38 edi 0 61, de 1977, apresenta a monografia da matria-prima

cloridrato de tetraciclina, mas exclui a metodologia de determinao quantitat

Na edio de 198862 a Farmacopia Brasileira no incluiu a monografia

tetraciclina,

porm

descreve os

procedimentos

gerais para os

ensa

microbiolgicos quantitativos. Para a tetraciclina foi recomendado o mt

turbidimtrico empregando o Staphylococcus aureus ATCC 6538-P com

0,25 a 4 J,tg/mL e in6culo de Bacillus cereus e varo mycoides ATCC 9634 for

sugeridos para a dosagem. O mtodo turbidimtrico foi apresentado emprega

a mesma soluo-estoque anterior, e solues-teste nas concentraes de 0

0,04; 0,03 e 0,02 ou de 0,08 a 0,015 J,tg/mL para curva padro de cinco ponto

0,08; 0,04 e 0,03 J,tg/mL para a amostra, com in6culo de Staphylococcus aur
ATCC 6538-P foram sugeridos.

2.6.2.2. Cloridrato de doxiciclina

O procedimento metodolgico para doxiciclina semelhante ao

tetraciclina, sendo que a doxiciclina constou inicialmente na Farmacop

Americana na edio de 1975200. O ensaio turbidimtrico empregando

microrganismo-teste, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, foi recomendado

procedimento metodolgico envolvia a preparao da suspenso microbiana c

a padronizao em espectrofotmetro a 650 nm e 25 % de transmitncia, segu

de transferncia para meio de dosagem na proporo de 0,1 a 2,

%.

procedimento da preparao de soluo-estoque de 1000 J,tglmL em c

clordrico 0,1 N foi descrito, sendo recomendado seu armazenamento por 5 d

em geladeira. Para a preparao das solues-teste cuja concentrao era

0,1 J,tglmL o diluente recomendado foi a soluo-tampo fosfato 0,1 M a pH 7,5

especificao exigida para a cpsula de doxiciclina foi de 90 a 120 %. N

edies seguintes pequenas alteraes foram realizadas nos procedimen

descritos.

cereus NCTC 10320 como microrganismo-teste, solues-teste na concentra

de 0,2 a 2,0 UllmL, sendo a incubao de 30 a 37 oCo Outro mtodo sugerid

turbidimtrico,

tinha

como

microrganismo-teste

Staphylococcus

aure

NCTC 7447, solues-teste de 0,003 a 0,010 UI/mL e temperatura de incuba

de 35 a 37 oCo Nas edies seguintes2B29.~ a metodologia no foi alterada, send

que a forma farmacutica drgea no foi descrita nas edies desta Farmacopi

Nas Farmacopias Internacional 1oo e Europia57 as metodologias de ensa

microbiolgico diferenciavam-se muito pouco. O procedimento recomendado,

mtodo de difuso em placas, envolvia emprego de Bacillus cereus NCTC 103

ou ATCC 11778100 ou CIP 645257 , com intervalo de concentrao da solu

teste entre 0,2 a 2 JlglmL 100 e temperatura de incubao de 35 a 39 C se

apresentar o intervalo de concentrao do antibitico57 .

dos mtodos microbiolgicos que inclui o mtodo turbidimtrico para

determinao da doxiciclina empregando o Staphy/ococcus aureus ATCC 6538-

O procedimento foi semelhante ao descrito pela Farmacopia Americana 2

edio200.

2.6.2.3. Cloridrato de oxitetraciclina

cloridrato de oxitetraciclina constou inicialmente na Farmacop

Americana 1S4 em 1955, na forma farmacutica de cpsula. Nesta edio, o ni

mtodo de quantificao recomendado foi o fisico-qumico espectrofotomtrico.

especificao recomendada para este mtodo foi de mais que 90 %

quantidade declarada no rtulo. Em todas as publicaes seguintes des

Farmacopia, a metodologia de dosagem para a oxitetraciclina foi semelhante

da tetraciclina, diferenciando-se basicamente na concentrao da soluo-tes

do antibitico.

Nas edies de 1960165 e 1965201 a oxitetraciclina no foi descrita com

monografia, voltando a constar na edio de 1970202 . Nesta ltima edi 0 202,
descrita a soluo-estoque de oxitetraciclina preparada em cido clordrico 0,1

a qual poderia ser empregada no intervalo de at quatro dias quando armazena

sob refrigerao. Desta soluo recomendou-se a diluio das solues-teste e

tampo-fosfato 0,1 M a pH 4,5. A soluo-teste com concentrao mediana
0,24

J.1g1mL foi

estabelecida,

da

mesma forma

que a

suspenso

microrganismo-teste Staphy/ococcus aureus ATCC 6538-P em meio de dosage

metodologia de determinao microbiolgica por difuso para a determinao

oxitetraciclina. Esta tcnica analtica apresenta procedimentos semelhantes

da tetraciclina em todas as suas edies24.25.26.27,28.29,:D. Em 1973, foi incorpor

o mtodo turbidimtrico. Os limites de especificao dos ensaios para o clorid

de oxitetraciclina apresentadas nas edies de 1958 at 1993, sofre

modificaes, constando teor de cloridrato de oxitetraciclina de mais que 94 %

valor declarad024 e mais que 92,5 %25 para a matria-prima, e de 95 a 105 %
edies seguintes26.27.28,29.:D para cpsulas de cloridrato de oxitetraciclina.
Nas

Farmacopias

InternacionaI 107,108,

Europia55.57

Brasileirall3

metodologias so semelhantes quelas j descritas para o cloridrato

tetraciclina. Na 3" edio da Farmacopia Brasileira61 , no foi includa

monografia do cloridrato de oxitetraciclina. Na sua 4" edio&2, o mt

recomendado foi semelhante ao descrito para a tetraciclina, conforme relat

acima.

2.6.3. Determinao da tetraciclina atravs de mtodos fisi

qumicos cromatogrficos

Muitos trabalhos envolvendo a determinao das tetraciclinas e de s

produtos de degradao qumica ou fisiolgica, por cromatografia lquida de

eficincia, tm sido publicados6,8,11.13.32,35,64,65.91,96,96.112.196,197,196. A determina

por mtodos microbiolgicos ou espectrofotomtricos no permite a identifica

ou diferenciao entre as prprias tetraciclinas, bem como de seus produtos

degradao, apresentando baixa sensilidadde e seletividade para detectar es

empregadas 145. As formas anidro que possuem dois anis aromticos, so m

fortemente retidas em relao tetracicfina e 4-epitetracicfina, com apenas
anel aromtico.
Mtodos

cromatogrficos

em

camada

delgada

foram

inicialme

desenvolvidos no processo de separao das tetraciclinas por FERNANDEZ

colaboradores ffi e DIJKHUIS e BROMMEn&> por volta de 1970. Mto

espectrofotomtricos foram empregados para a determinao da 4-epitetracicli

mas no conseguiram determinar pequenas quantidades da substncia
amostras

comerciais,

principalmente

devido

interferncia

4-epianidrotetraciclina. Assim, DIJKHUIS e BROMMEro descreveram mtodo

cromatografia em camada delgada empregando Kieselghur impregnado c

soluo de tampo citrato-fosfato a pH 5,5, contendo 10 % de glicerina com

finalidade de quantificar a 4-epitetracicfina e clortetraciclina presentes

amostras comerciais. Aps a separao detectada pela formao das manc

nas placas cromatogrficas, a poro correspondente mancha foi retira

quantitativamente e eluda em cido clordrico 0,1 N. A leitura foi efetuada

espectrofotmetro e f1uormetro, respectivamente, para a 4-epianidrotetraciclin

a clortetracicfina. O mtodo apresentado permitiu obter boa separao e manc

com zonas bem definidas, podendo ser aplicado para determinar impurezas

outras tetracicfinas. O mesmo suporte, Kieselghur, impregnado com ED

(etilenodiaminotetractico) a pH 7,5 e fase mvel contendo acetato de e

acetona-gua (10:20:3) e a pH 9 e fase mvel contendo gua-acetona (1:1

empregados para a determinao quantitativa de tetraciclina, 4-epitetracicfi

anidrotetraciclina e 4-epianidrotetracicfina presentes em amostras de tetracic

amostras de xarope de tetraciclina. As fraes coletadas correspondentes a

compostos pesquisados foram diludas em clorofrmio e a leitura da absorbn

foi obtida a 366 nm. O teste de recuperao realizado para a mistura sinttica

tetraciclinas resultou em recuperao de 98 a 102 % para as quatro substnci

mostrando ser um mtodo exato. Esta mistura apresentava 10 %, tanto

anidrotetraciclina como da 4-epianidrotetraciclina. Para amostras comerciais q

possuem quantidades de impurezas em dcimos de porcentagem, a separa

no foi precisa, tendo sido necessrio um procedimento prvio de concentra

Com esta finalidade, FIKE e BRAKE67 modificaram o mtodo anterior empregan

duas pores separadas da amostra. Uma das pores foi empregada pa

anlise da tetraciclina e 4-epitetraciclina e a outra, para os derivados anidros.

condies cromatogrficas foram as mesmas para as duas pores. A leitu

espectrofotomtrica da primeira poro ocorreu em 366 nm empregando clula

1 cm. Porm, esta leitura no foi possvel na frao 2, sendo necessrio

emprego da clula de 5 em em 435 nm para um ensaio exato. A preciso
mtodo foi de 0,5 % para a determinao de amostras de tetraciclina.

LODI e colaboradores 13}, considerando mais importante a determina

quantitativa da 4-epianidrotetraciclina em relao 4-epitetraciclina propuser

em 1969, mtodo de cromatografia em camada delgada empregando a celulo

microcristalina em soluo de cloreto de amnio a 0,05 % e corrida da fase m

bidimensional, sendo as fases mveis de soluo de EDTA 0,1 M com cloreto

amnio 0,1 % e de soluo de clorofrmio saturado com EDTA 0,1 M com clor

de amnio 0,1 %. Aps o tempo de corrida, a rea correspondente s manch

foram removidas das placas, e eludas em cido clordrico metanlico 0,1 N.

forneceu uma avaliao quantitativa e qualitativa sensvel para a determinao

derivados anidros da tetraciclina em formulaes complexas da tetraciclina.

Os mtodos cromatogrficos descritos, no entanto, so muito demorados

trabalhosos, no sendo suficientemente sensveis para a deteco de pequen

quantidades de impurezas com boa preciso quando comparados com outr

mtodos cromatogrficos.

A aplicao dos mtodos CLAE para a determinao das tetraciclinas te

sido preferida dentre todos os mtodos, como pode ser constatado pelo gran

nmero de publicaes descritas na literatura. Numa destas publicaes, TSUJI

ROBERTSON '96,

em

1974,

relataram

trabalho

relacionado

com

desenvolvimento de mtodo cromatogrfico para a determinao de vri

tetraciclinas, empregando coluna polimrica com comprimento de um metro,

duas fases mveis, a primeira contendo metanol e EDTA 0,001 M em ci

fosfrico 0,01 M e fosfato dibsico de sdio 0,02 M, e a segunda composta p

acetonitrila em EDTA 0,001 M e cido fosfrico 0,01 M e fosfato dibsico de sd

0,02 M, ambas a pH 2,5, modificando-se a concentrao dos solventes atravs

eluio gradiente. A leitura aps a eluio foi a 280 nm, sendo empregado com

padro interno, a prednisolona. A separao da tetraciclina, anidrotetraciclin

4-epitetraciclina, 4-epianidrotetraciclina, c10rtetraciclina e doxiciclina foi possv

em menos que 30 minutos, embora tenha ocorrido resoluo pobre entre os pic
da

tetraciclina

4-epitetraciclina

entre

anidrotetraciclina

4-epianidrotetraciclina. O melhor sistema cromatogrfico empregou fase mv

com metanol na concentrao de 13 %, fluxo de 0,85 mUminuto. A determina

da preciso do mtodo, considerando oito rplicas de injeo da soluo-teste

ocorria devido epimerizao nos dois ltimos mtodos mencionados.

constatado, tambm, que a epimerizao pode ocorrer durante e aps

preparao da soluo-teste da tetraciclina em diferentes solventes, sen

recomendado a dissoluo da amostra imediatamente antes da anlise.
Com o objetivo de reduzir o tempo de anlise e melhorar a separao

tetraciclinas do mtodo descrito, TSUJI e ROBERTSON 197 trocaram a colu

polimrica por outra de 30 cm contendo octadecilsilano (005) ligado partcu

de slica, mantendo a monitorao com UV a 280 nm. A fase mvel com flu

gradiente de acetonitrila de 10 a 60 % e tampo-fosfato 0,02 M a pH 2,5 e flu

de 1 mUminuto por 11 minutos foi empregada com presso resultante

1000 psi. Foram analisadas amostras de cpsulas, comprimidos revestid

xarope e suspenso oral. Pela comparao deste mtodo com o anteriorme

descrito, a resoluo entre 4-epitetraciclina e tetraciclina aumentou de 0,93 p

2,29 e entre 4-epianidrotetraciclina e anidrotetraciclina passou de 0,43 para 1,

tempo de anlise total, de cerca de 25 minutos foi reduzido p

aproximadamente 16 minutos. A sensibilidade do mtodo permaneceu a mesm

10 ng. O coeficiente de variao com 7 rplicas foi de 0,66 % e a recuperao

4-epianidrotetraciclina adicionada tetraciclina apresentou faixa de regress

linear de 0,3 a 100 %. Em relao tetraciclina em xarope e cpsulas de gelati

a recuperao foi de 99,6 e 99,9 %, respectivamente. O mtodo apresen

coeficiente de variao de 1,1 %, quando empregadas oito rplicas no ensaio

cpsulas. Devido excelente separao de produtos de degradao e

sensibilidade do mtodo CLAE, os autores recomendaram este mtodo para

estudo de estabilidade de preparaes contendo tetraciclina

durante o ensaio. Foi empregado sistema formado por coluna contendo octilsila
(Ca), detector UV a 280 nm e fase mvel preparada com fosfato monobsico

sdio 0,1 M ou O,OS M com pH 8,0 ou 8,2, os contra-ons, tripropilamina e N

dimetiloctilamina, e diferentes quantidades de acetonitrila. O N,N-dimetiloctilami

proporcionou melhor eficincia de separao, simetria dos picos e permitiu alte

o fator de capacidade pela modificao da concentrao deste contra-on.

concentrao mais adequada da acetonitrila para separar as tetraciclinas de su

impurezas, foi de 30 % na fase mvel.

CHAPPELL e colaboradores3S em 1986, descreveram mtodo em fa

reversa semelhante, para a determinao de oxitetraciclinas em produt

veterinrios. A fase mvel empregada consistiu de acetonitrila, tampo-fosfa

0,1 M preparado com fosfato monobsico de sdio, EDTA 0,006 M

N,N-dimetiloctilamina a pH 8. A coluna foi a Ca. que mostrou eficiente separa

da oxitetraciclina de outras tetraciclinas como 4-epioxitetraciclina, tetraciclina

clortetraciclina. O tempo de reteno esteve entre 1,S a S minutos. Os autor

compararam este mtodo com o microbiolgico, encontrando boa correla

entre ambos. A preciso do mtodo determinada entre dias e no mesmo dia e
coeficientes de variao foram, respectivamente, 4,9 e 7,9.

Mtodo empregando fase mvel contendo tampo-fosfato a pH 2,2

acetonitrila em sistema gradiente de 12 a 22 % com coluna fenlica foi descrito e

1980 por MUHAMMAD e BODNAR 152, para a determinao da tetraciclina e d

suas impurezas. O tempo total de anlise foi de 22 minutos. Os valores

coeficiente de variao obtidos com seis ensaios foi de no mximo 7,60 % para
clortetraciclina,

anidrotetraciclina,

4-epianidrotetraciclina

4-epitetracicli

No pH de 6,6 nenhuma reao de epimerizao ocorreu durante o perodo

anlise. Este mtodo foi aplicado s preparaes comerciais para quantif

pequenas quantidades de 4-epitetraciclina em preparaes de tetracicl

demeclociclina em minociclina e tetraciclina em clortetraciclina. Na separao

tetraciclina e 4-epitetraciclina, fase mvel com 18 % de metanol com fluxo

1 mUminuto fomeceu tempo de reteno de 10,4 e 7,2 minutos para tetraciclin

4-epitetraciclina, respectivamente. a desvio-padro empregando seis rplicas

injees foi de 0,3 %. No caso da minociclina, a fase mvel mais adequada

aquela com concentrao de metanol de 25 %, sendo o fluxo de 2,3 mUminuto

tempo de reteno da minociclina foi de 3,2 minutos, apresentando boa resolu

com o pico da demeclociclina. Para a determinao da c10rtetraciclina condi

cromatogrfica com fase mvel contendo 20 % de metanoI e fluxo

2,5 mUminuto foi estabelecida. a desvio padro para o ensaio quantitativo

menor que 1 %.
KNaX

JURAND 126

empregaram,

para

determinao

4-epitetraciclina, anidrotetraciclina, clortetraciclina e 4-epianidrotetraciclina, v

tipos de material suporte. Dois destes materiais foram detalhadamente estudad

a primeiro foi aOS-slica, tratado com grupos trialquilsilil para substituir grupos

silanis residuais. a segundo foi uma amostra de slica gel, que teve a m

parte dos grupos silanis substitudos por grupos Si-Q-SiRJ. em que

corresponde a grupos alquila de cadeia curta. No trabalho preliminar,

resultados obtidos mostraram que os mtodos clssicos apresentaram resolu

pobre das tetraciclinas. Com a cromatografia de troca inica usando ZIPAX S

(trocador de ction), a eluio foi realizada em meio de solvente alcalino, ne

formas epi e normal foi pobre. Ao trabalhar com cromatografia de partio lquid

lquido, empregando CORASIL com PEG 400, foi obtido pico com melhor simet

mas o tempo de reteno no foi reprodutivel. Picos muito largos corresponden

a compostos anidro foram obtidos quando coluna de aOS-Slica e solu

aquosas contendo acetonitrila e cido perclrico foram empregados, devido

forte reteno dos compostos. A separao da 4-epitetraciclina e clortetracicli

da tetraciclina foi eficiente em meio com baixa porcentagen de acetonitrila. Nes

estudo preliminar, os autores concluram que o formato inadequado do pico obti

em coluna de troca inica, adsoro e cromatografia Iquido-Iquido es

associado com o silanol livre na superfcie do suporte. Mesmo na presena

gua que muito adsorvida pelo suporte, aparentemente existe um peque

nmero de stios de silanis livres, em que a tetraciclinas podem trocar com

gua e ficar fortemente adsorvida. Esta reteno, mesmo que pequena, prod

picos com formao de cauda acentuado. Com acetonitrila 20 % em gua,

tetraciclina mais fortemente retida por grupos com hidrocarbonetos que p

grupos silanis. Quando estes silanis foram eliminados atravs de reaes

silanizao com grupos trialquilas, o formato do pico tomou-se adequado, be

como a reteno. A forte reteno pela fase hidrocarboneto era inesperad

devido baixa solubilidade da tetraciclina na forma de base ou sal em solvent

de hidrocarbonetos.

Os resultados

deste trabalho mostraram que fa

estacionria com hidrocarbonetos ligados pode ser empregada com eficincia

cromatografia de partio de on-par de fase reversa para anlise de bas

fortemente hidroflicas como a tetraciclina. A fase estacionria composta p

Partisil silanizada, para substituir todos os grupos silanis com grupos

trisilialquil de cadeias curtas (SC-TAS-slica) apresentou grande eficincia pa

REEUWIJK e TJADEN 179 estudaram o emprego de coluna no ionognica para

cromatografia da tetraciclina e seus produtos de degradao. Quando compara

com a coluna de slica, a curva de calibrao apresentou melhor linearidad

mesmo em quantidade de nanogramas. Coluna de resina de Amberlite XAD

PRP-1, materiais fortemente hidrofbicos, foram preparadas com polmero
estireno divinilbenzeno.

Ensaios CLAE para determinao de oxitetraciclina contida em plasm

necessitavam longo pr-tratamento, que se tornava crtico no monitoramento d

concentraes plasmticas. Desta forma, UENO e colaboradores 199 propuseram

emprego do mtodo CLAE com a injeo direta do plasma, empregando colu

polimrica ligada slica e fase mvel contendo metanol-cido oxlico 0,2

(10:90) a pH 7,0. O detector empregado foi o espectrofotomtrico a 360 nm.

coeficiente de variao para ensaios
o

inter~ias

intra~ia

(n=5) foi menor que 3 %

(mais de seis dias) foi de no mximo 4,7 % dependendo da amost

Este mtodo mostrou-se rpido e no comprometeu a coluna cromatogrf

mesmo aps mais de 1000 injees.

Mtodo CLAE com injeo direta de amostras de urina para monitoramen

das tetraciclinas foi desenvolvido por KNOX e JURAND 125. O procedimen

envolveu o emprego de colunas C18 e

C1

com duas diferentes fases mve

compostas por gua e os modificadores orgnicos em cada fase, acetonitrila

dimetilformamida. Foi estabelecido que a coluna C1 a pH de 3 a 5 apresentou a

eficincia de separao das tetraciclinas. Nesta faixa de pH foi necess

adicionar EDTA 0,001 M. O modificador orgnico que proporcionou pic

simtricos foi a dimetilformamida na concentrao entre 1 a 25 %. Os autor

constitudas de clorofrmio, metano e EDTA 5 % e de metanol, acetonitrila e c

oxlico 0,5 M, respectivamente. A combinao destas duas metodologias perm

a identificao das oito tetraciclinas separadas. No mtodo CLAE a separao

possvel empregando coluna Ca e fase mvel composta por metanol-acetonitr

cido oxlico 0,01 Ma pH 3,0. A desvantagem do mtodo CLAE a necessida

do equipamento especial.

O mtodo cromatogrfico empregado no trabalho desenvolvido por RAY

HARRI5

176

foi comparado com o ensaio microbiolgico da Farmacopia Britn

de 198829. O sistema cromatogrfico consistia em detector a 280 nm, integrad

computadorizado, fomo a 40

ac,

volume de injeo de 1

J,1L, e coluna 00

(5 J,1m) com dimenses de 250 x 4,6 mm. A fase mvel composta por oxalato

amnio 0,2 M, EDTA 0,1 Me dimetilformamida (55:20:25 v/v/v) foi bombeada pa

a coluna com fluxo de 1 mUminuto. O coeficiente de correlao entre

quantidade de tetraciclina medida e os valores de integrao das reas foi

0,99. O coeficiente de correlao entre os resultados obtidos pelo mtodo CLAE

o mtodo microbiolgico foi de 0,96. A rplica dos seis valores para cada amos
apresentou coeficiente de correlao menor que 4 %, com exceo
clortetraciclina, em que foi de 7 %. A temperatura da coluna foi mantida a 40
para evitar a possvel precipitao do tampo oxalato e melhorar a resoluo

pico. Concluiu-se que o mtodo cromatogrfico pode ser facilmente adapta

para uso em diferentes colunas disponveis no comrcio, por ajustes mnimos n

condies do teste como a velocidade do fluxo ou a temperatura.

HOU e WANG 104 desenvolveram mtodo de cromatografia lquida co

deteco eletroqumica para a determinao das tetraciclinas. Esta tcn

de 2,5. A separao e quantificao da oxitetraciclina, doxiciclina, c10rtetracicli

e tetraciclina foram satisfatrias. O mtodo desenvolvido provou ser, alm

sensvel, tambm seletivo, sendo duas vezes mais sensvel que a deteco p

espectrofotometria. O limite de deteco foi de 0,2 ng para a oxitetraciclina

tetraciclina, 1,2 ng para a clortetraciclina e 4 ng para a doxiciclina. Embora ten

apresentado grande seletividade na deteco, os detectores eletroqumicos s

pouco empregados, comparativamente aos detectores espectrofotomtricos
fluorimtricos.
Acrescentando

experincias,

mtodo

CLAE

com

deteco

fluorescncia, rpido e preciso para a determinao das tetraciclinas present

em preparaes farmacuticas e tecidos de peixe, foi desenvolvido por IWAKI

colaboradores 111. No entanto, os autores verificaram que quelao da tetracicli

com traos de ons de metais presentes no material de empacotamento e

superfcie da coluna produziam picos assimtricos e aumentavam a interao d

tetraciclinas com o grupos silanis residuais, consequentemente diminuindo

sensibilidade do mtodo. Para solucionar este problema, foram adicionad

cloreto de clcio e EOTA fase mvel neutra, tendo sido empregado material
empacotamento C18 livre de ons metlicos, resultando em intensidade

fluorescncia maior na presena dos dois compostos na fase mvel. A fa

mvel, alm do cloreto de clcio e EOTA, continha tampo acetato 0,1 M

metano/. Foi empregado detector com comprimento de onda de extino

emisso de 390 e 512 nm, respectivamente. Em pH entre 6,5 e 7,5

fluorescncia foi constante para todas as tetraciclinas, sendo que em pH m

baixo a intensidade foi tambm menor. Os coeficientes de variao para

tetraciclina, oxitetraciclina e c1ortetraciclina, obtidos pela anlise dos dados d

tetraciclina, oxitetraciclina e clortetraciclina. A recuperao foi constante p

vrias concentraes e resultou em valores de 100,1 a 102,9 % pa

oxitetraciclina, 99,5 a 100,3 % para tetraciclina e 94,3 a 101,2 % p

clortetraciclina. A preciso deste mtodo aplicado determinao de tetracicl

no soro foi de no mximo 2,31 % em termos de coeficiente de variao.

Mtodo cromatogrfico empregando coluna trocadora de ction e tamp

de EDTA 0,3 M em pH neutro foi desenvolvido por L1NDAUER e colaboradores

para a determinao de anidrotetraciclina e 4-epianidrotetraciclina. A resposta

linear para as duas substncias testadas e o limite de deteco foi de 12 ng

anidrotetraciclina e 7 ng de 4-epianidrotetraciclina, a 429 nm. A recupera

destes compostos quando adicionados tetraciclina resultaram em 99,4 %

101 ,O % de teor e o coeficiente de variao para a determinao quantitativa

de 0,7 e 1,4 %, respectivamente, para anidrotetraciclina e 4-epianidrotetraciclin

Em relao ao procedimento tcnico empregando coluna polimrica, a fase m

foi otimizada, atravs do estudo da infuncia do aumento da concentrao
EDTA, de 0,005 M para 0,3 M. Com este aumento, ocorreram a diminuio

fator capacidade da 4-epitetraciclina, 4-epianidrotetraciclina e anidrotetraciclina

aumento da seletividade e a melhora da linha de base a 254 nm. TSUJI

ROBERTSON 197 empregando tambm coluna polimrica, verificaram que o ED

minimizava o aparecimento do cauda e no interferia com a forma do pico.

entanto, concentraes de EDTA maiores que 0,001 M na fase mvel pod

interferir com a anlise em virtude da alta absoro UV das solues

tetraciclina. Outra varivel estudada por L1NDAUER e colaboradores 137 em 19

a temperatura do ensaio, mostrou-se adequada a 35C. A seleo

comprimento de onda variou de acordo com vrios fatores, incluindo

29 preparaes de cpsulas, comprimidos e drgeas. Colunas empacotadas co

material octadecilsilano (OOS), fases mveis com gua, cido perclrico

acetonitrila com diferentes propores de acetonitrila e gua, sendo a detec

UV a 254 nm foram empregadas. Com menor quantidade de acetonitrila (22 %

eficiente separao da tetraciclina e 4-epitetraciclina foi conseguida. Os derivad

anidros s puderam ser separados da tetraciclina em fase mvel rica e

acetonitrila (37 %).

Das amostras, trs apresentaram concentraes

4-epitetraciclina significativamente mais altas, sendo que duas com diminui

correspondente do teor de tetraciclina. Os autores provaram que este mto

apresentou suficiente preciso e sensibilidade, alta resoluo, rapidez e b

correlao com o mtodo microbiolgico. A influncia da concentrao

acetonitrila na fase mvel sobre a separao das tetraciclinas, tambm em colu

OOS, foi estudado por HOU e WANG 104, os quais verificaram que o aumen

gradual da acetonitrila aumentava o fator de capacidade (K') da c10rtetraciclina e

diminuia para a doxiciclina, enquanto que para o oxitetraciclina e tetraciclina

alterao foi pouco significativa.

ALI e STRITTMATTER6 em 1978 publicaram trabalho de determina

das tetraciclinas e seus produtos de degradao para anlises de amostras

comprimidos, drgeas e cpsulas de gelatina dura e mole, empregando mto

idntico ao de STEINBACK e STRITTMATTER194. Os valores de fator

capacidade encontrados na separao da tetraciclina e 4-epitetraciclina e

fase mvel contendo 22 % de acetonitrila foram de 1,69 e 2,5, enquanto

separao da tetraciclina, 4-epianidrotetraciclina e anidrotetraciclina em fa

mvel com 37 % de acetonitrila, foram de 0,55, 1,91 e 2,64, respectivamente.

sobre a reteno das tetraciclinas foi estudada por EKSBORG e EKQVIS

Foram empregadas nove diferentes colunas. Os autores verificaram que o fa

de

capacidade

das tetraciclinas

concentrao de acetonitrila,

apresentavam

forte

dependncia

sendo maior com o aumento desta.

seletividade, ao contrrio, diminuiu com o aumento da concentrao

acetonitrila. Grande diferena na reteno das tetraciclinas foi observ

empregando colunas de diferentes fornecedores. Quando se empre

concentrao de 30 % de acetonitrila, as colunas LiChrosorb e ZORBAX

apresentaram K' 15 vezes maior que a coluna com Nucleosil, apesar de to

se caracterizarem pelo mesmo tamanho de cadeia alqulica. No enta

quando a composio da fase mvel foi mantida constante, apenas peque

variaes na seletividade foram observadas para diferentes suportes alqulic

A adio de compostos de amnio na fase mvel resultou em diminui

significativa da reteno das tetraciclinas, embora a seletividade no tenha s

alterada.
BARNES e colaboradores 13 verificaram que a determinao

oxitetraciclina por CLAE, conforme recomendado pela Farmacopia Britnic

requeria coluna trocadora de ction no disponvel no mercado, tendo que

preparada no prprio laboratrio. Para contornar este problema, os auto

optaram pelo estudo da determinao da oxitetraciclina empregando o mes

mtodo descrito para a monociclina da USP XXI2a). Coluna Ca e fase m

contendo oxalato de amnio 0,2 M, EOTA dissdico 0,1 M e dimetilformam

foram empregados. Na comparao dos resultados obtidos pelos mto

descritos nas duas farmacopias,

o mtodo da USP XXI

adapt

deste ltimo mais rpida. Os valores de pratos tericos do mtodo

Farmacopia Britnica foi de 63321minuto e do mtodo da USP XXI

29687/minuto, indicando resoluo superior do mtodos de fase reversa

USP XXI. Assim como constatado por CHAPPEll e colaboradores:!),

comparao entre o mtodo da Farmacopia Americana e o microbiol

empregando o Bacillus pumilus NCTC 8241, os resultados encontrados

BARNES e colaboradores 13 mostraram boa correlao entre as d

metodologias.
Vrios trabalhos de reviso para determinao das tetraciclinas tm
constantemente

publicados 114,142.1&>.

lUN 142

reuniu

vrios

procedimen

analticos desenvolvidos de 1980 a 1996, com descrio das metodologias

possibilitam a sua reproduo no laboratrio. Mtodos de cromatografia lquida

alta eficincia para as tetraciclinas e derivados foram tambm descritos.

Tanto os mtodos microbiolgicos como as tcnicas fluorimtr

mostraram ser poucos eletivos na determinao de doxiciclina em amos

biolgicas. O mtodo de cromatografia gs-lquido, devido ao considervel p

molecular e a elevada polaridade da doxiciclina tambm apresentou dificuld

na sua execuo. Por isso, um mtodo CLAE de fase reversa combinado

deteco UV foi desenvolvido por lEENHEER e NElIS 131 em 1977, com co

C18.

A fase mvel consistiu de soluo-tampo cido e acetonitrila ou met

injetada por gradiente. Alm da doxiciclina, separao de oxitetracic

dimetilclortetraciclina e tetraciclina foi obtida com fase mvel contendo no mn

4 % de acetonitrila.

colocadas nas placas, ento reveladas atravs de lmpada fluorescente, se

que para aquelas radioativas foi empregado o scanner radiocromatogrfico.

possvel determinar a quantidade relativa da tetraciclina e os principais produ

de degradao, a 4-epitetraciclina, 4-epianidrotetraciclina e anidrotetraciclina.

OKA e UNO 157 em 1984 desenvolveram mtodo de cromatografia lqu

de alta eficincia com sistema isocrtico usando fase mvel contendo meta

acetonitrila e soluo de cido oxlico, colunas C8 e C18 e detector a 360 nm

concentrao do cido foi de 0,01 M para as tetraciclinas e 0,2 M para

impurezas da tetraciclina,

proporcionando separao adequada para

substncias testadas e, pela influncia na resoluo e assimetria dos pi

indicaram a adequao da metodologia. As resolues e assimetrias dos picos

tetraciclina dependem do pH da soluo de cido oxlico, sendo o pH timo ig

a2.
Determinao

das

tetraciclinas

em

preparaes

farmacuticas

matria-prima foi descrita por KAZEMIFARD e MOORE 123. A separao foi

meio de coluna C111 com fase mvel composta por tampo fosfato dibsico

potssio 0,005 M, a pH 2,5 e acetonitrila, e a deteco foi por eletrodo de vi

carbono. A tcnica se baseou na oxidao de grupos fenlicos na posio 10 e

substituinte dimetilamino na posio 4 destes compostos e os contaminan

medidos atravs deste eletrodo a 1,2 V. O procedimento de extrao foi simple

permitiu a separao das tetraciclinas dos produtos de degradao. O limite

deteco foi de 0,1 a 1,0 ngllll e a recuperao foi de 99,1 a 100,4 % para to
as amostras. No foi observada interferncia de excipientes presentes

formulaes farmacuticas. A preciso foi determinada para o tempo de reten

No estudo da estabilidade de cloridrato de tetraciclina na forma sli

DIHUIDI e colaboradores 48 descreveram mtodo CLAE empregando colu

fenlica, fase mvel em sistema de gradiente e deteco a 280 nm. As fa

mveis foram metanol, gua e cido fosfrico 1 M com misturas de (5:90:5

(75:20:5).

Os

coeficientes

de

correlao

obtidos

para

tetracicli

4-epitetraciclina, anidrotetraciclina e 4-epianidrotetraciclina foram entre 0,996

0,999. Quando a amostra foi analisada seis vezes no mesmo dia, o coeficiente

variao foi quatro vezes menor que quando analisada em sete dias diferentes

vantagem do uso da coluna fenlica em relao C8 ou C18 foi a possibilidade

empregar fase mvel com metano!. A vantagem da escolha do comprimento

onda a 280 nm foi a obteno de picos bem definidos em relao linha de ba

pois a interferncia do modificador orgnico menor em comprimentos de on

maiores.

Mtodo CLAE isocrtico desenvolvido por DIHUIDI e colaboradores

empregando coluna de copolmero de estireno-divilbenzeno a 60 C, c

deteco a 254 nm permitiu separar a oxitetraciclina, 4,6-epidoxicicli

4-epidoxiciclina, metaciclina, 6-epidoxiciclina e doxiciclina para a anlise

preparaes farmacuticas cpsulas, comprimidos e suspenses de doxicic

bem como a matria-prima. A fase mvel foi preparada pela mistura

tetrahidrofurano, tampo fosfato 0,2 M a pH 8,0, tetrabutilamnio 0,2 M a pH 8

EDTA 0,1 M com pH 8,

e gua. O fluxo foi de 1mUminuto, e 40 J-lg da amos

foi injetada no cromatogrfo. Quando a amostra foi analisada 22 vezes por

dias, o coeficiente de variao para a doxiciclina foi de 0,6 %. A vida til da colu

foi superior a seis meses devido a boa estabilidade sob condies extremas
pH.

similares, 2-acetil-2-carboxamido-oxitetraciclina, foi incompleta. No enta

empregando a eluio em gradiente, tanto a separao como o limite de detec

foram mais adequados. Modificadores orgnicos como acetonitrila, metano

dimetil sulfxido foram testados, mas a separao mais adequada ocorreu co

emprego de butanol e tetrahidrofurano

HA5AN e COOPERMAN 91 desenvolveram um mtodo CLAE de f

reversa empregando fase mvel voltil para a separao das tetraciclina

fotoprodutos. Coluna C 8, detector a 280 nm e fase mvel em 2 sistem

'
gradientes, o primeiro contendo 1o-aO % de acetonitrila e 90-20 % de
contendo

0,1

de

cido

trifluoractico

(1)

e o

segundo,

conte

respectivamente, 24-50 %, 76-50 % e 0,1 % (2). Outra coluna fenlica c

sistema isocrtico e fase mvel contendo metanol e gua (40:60) com 0,1 %

cido trifluoractico (3) foi usada. A minociclina foi separada de seus precurso

sintticos nas condies de gradiente (1), a 9-aminno 6-demetil-6-deoxitetracic

e seus precusores nas condies de gradiente (2) e a tetraciclina e clortetracic

nas condies cromatogrficas (3). Este mtodo foi adequado para separa
de preparaes em semi-micro ou micro escala. A recuperao foi de 75 a 90

Outro trabalho para a determinao de impurezas presentes em cps

comprimidos, xaropes, ps e medicamentos de uso veterinrio foi desenvol

por OKA e SUZUK'58 em 1984, e envolveu a comparao de mto

estabelecidos aplicados s amostras, como a cromatografia lquida de

eficincia (1), cromatografia lquida de fase reversa em camada delgada segu

de densitometria (2), cromatografia lquida de fase reversa em camada delg

seguida de deteco por reagentes em nebulizador (3) e cromatografia em s

de vrias misturas de tetraciclinas, a eletrocromatografia capilar e a eletrofor

capilar de alta eficincia, comparando os resultados obtidos entre as d

metodologias e tambm com o mtodo CLAE. As tcnicas inovadoras abrangi

neste trabalho, envolveram o emprego de tubos capilares, preenchidos com

fase estacionria e a separao dos compostos, transportados por uma f

mvel por processos de mobilidade eletrofortica ou de eletroosmose.
amostras

comerciais

de

oxitetraciclina

possuem

como

impurezas,

4-epioxitetraciclina, a-apo-oxitretraciclina e tetraciclina. Nas amostras comerci

as impurezas presentes estudadas foram a metaciclina e a oxitetraciclina.

autores concluram que anlises efetuadas pelos mtodos CEC e EC

apresentaram resultados semelhantes ou melhores que o mtodo CLAE,

coluna mono-oi ou dio!. Da mesma forma, quando a comparao foi com

mtodo CLAE empregando colunas polimricas, comprovadamente um

procedimentos mais eficientes, a separao foi igualou melhor, geralme

acompanhada tambm de um tempo de reteno menor. O limite de deteco

5-10 llglmL para o mtodo CEC comparvel para os mtodos CLAE e EC

Devido simplicidade do sistema instrumental, e considerando o baixo consu

de solvente, os dois mtodos pesquisados apresentam-se como alternativas p

o mtodo CLAE na determinao de mistura de tetraciclinas.

II

:b

,
III

SOAI.l3raO

98

doxiciclina adquiridas no mercado, no que se refere aos aspectos fsico

atendimento s exigncias legais, determinao da dissoluo e teor d

princpios ativos e do produto de degradao.
Objetivou-se,

tambm,

estudo

de correlao entre o mtodo

cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e o mtodo microbiolg

turbidimtrico aplicado s amostras comerciais de tetraciclina. Para is

procedeu-se ao estudo dos parmetros envolvidos na validao e adequao d

condies analticas do mtodo cromatogrfico.

MATERIAL E MTODOS

amostras comerciais de especialidades farmacuticas da tetraciclina. Os dem

reagentes

empregados

foram

de

grau

analtico,

espectrofotomtrico

cromatogrfico, procedentes da MERCK e EM SCIENCE.

4.1.1. Substncias qumicas de referncia

As substncias qumicas de referncia empregadas apresentavam

seguintes potncia e origens:
P1-C/oridrato de tetracic/ina, 994 ~glmg, cedido pelo Laboratrio BRIST
MYERS-SQUIBB do BRASIL SA, lote: 9505000456.
P2-Cloridrato

de

oxitetraciclina

(Terramicina),

potncia

901

~gl

fornecido pelo Laboratrios PFIZER LTOA, lote: L-Q4-53QCQS-435.

P3-Cloridrato de doxiciclina (Vibramicina), potncia 866

~glmg,

fornec

pelo Laboratrios PFIZER LTDA, lote: L-C4-58QCQS-433.

Foi empregada tambm a substncia qumica de referncia de c1oridrato

4-epianidrotetraciclina, potncia 830 ~glmg, adquirida da UNITED STATES
PHARMACOPEIAL CONVENTION, lote: 1, cat n 23650.

laboratrio produtor (A).

Cpsulas de c1oridrato de tetraciclina 500 mg, de um a quatro
provenientes de 10 laboratrios produtores (B, C, D, E, F, G, H, I, J, K).

Cpsulas de fosfato de tetraciclina 500 mg, quatro lotes proveniente

um laboratrio produtor (L).

4.1.3. Microrganismo-teste como revelador biolgico

Staphylococcus aureus ATCC* 29737.

ATCC-American Type Culture Collection.

4.1.4. Equipamentos e material auxiliar

Alm dos recursos empregados rotineiramente em laboratrio de con

de qualidade de matrias-primas e medicamentos, destacam-se equipamento

- Balana analtica METILER TOLEDO AG 204

- Aparelho de dissoluo HANSSON RESEARCH - Modelo 6454 S

FLO

rllcUldadeBIBLtOiel"'tt
de C
lenc/as Faro':);{ceuf
UrJ/versldade de S - p
ao dUJo
o

..

- Aparelho

de

ultrafiltrao

TW

SYSTEM da MILLlPORE

MILLI-Q

PLUS-ULTRA-PURE

WA

TW

- Aparelho de banho de gua ultrassnico da marca BRANSON 2210R- Dispositivo de filtrao HPLC GELMAN SCIENCES

TW

- Potencimetro ORION 900 A

4.2. MTODOS

4.2.1. Amostragem

As amostras de especialidades farmacuticas foram adquiridas

comrcio em vrios locais da cidade de So Paulo, exceo de uma amo

proveniente de um laboratrio farmacutico da cidade de Juiz de Fora-M

Gerais que foi adquirida nesta cidade.

4.2.2. Determinao do peso mdio das cpsulas de gelatina du

drgeas

Conforme procedimento descrito na Farmacopia Brasileira 1VS2.

Constatao por inspeo visual de caractersticas fsicas que diferis

de especificao ou que se mostrassem divergentes do conjunto das amostra

descrita.

4.2.5. Ensaio in vitro de dissoluo dos antibiticos208

4.2.5.1. Preparao das solues-teste das substncias qumica

referncia

A soluo-teste da substncia qumica de referncia de cloridrato

tetraciclina foi preparada inicialmente atravs da obteno de quanti

exatamente pesada de 30,0 mg do princpio ativo presente na substncia qu

de referncia de cloridrato de tetraciclina e a transferncia para um b

volumtrico de 100 mL. Em seguida, completou-se ao volume com o dilu

agitando a fim de homogeneizar a soluo. Desta, 2,0 mL foram diludos em b

volumtrico de 50 mL empregando o mesmo diluente, obtendo-se soluo
12,0 J.1g1mL.

Para a determinao do cloridrato de tetraciclina empregou-se c

diluente a gua destilada, e para o fosfato de tetraciclina foi utilizado o

clordrico 0,1 N.
A soluo-teste de cloridrato de doxiciclina foi prerarada a partir de

soluo-estoque obtida pela pesagem analtica equivalente a cerca de 25,0 m

referncia. Sua transferncia quantitativa para balo volumtrico de 100 m

realizada com o auxlio de gua destilada, completando-se em seguida o vol

Desta soluo transferiu-se alquota de 2,0 mL para balo volumtrico de 50
completou-se o volume com gua destilada.

4.2.5.2. Preparao das solues-teste das amostras

Para as amostras na forma de cpsula, aps o perodo de dissoluo

cada cuba, volume de cerca de 30 mL foi filtrado, desprezando-se os prim

10 mL. Do filtrado, alquota de 1,0 mL foi transferida para balo volumtric

50 mL. Em seguida, foram efetuadas diluies ao volume com gua destila

cido clordrico 0,1 N, respectivamente, para o cloridrato de tetraciclin

oxitetraciclina, e para o fosfato de tetraciclina, obtendo-se solues
concentrao estimada de 11,1 J.lg/mL.

Para as amostras na forma de drgea, o procedimento foi conform

descrito para cpsulas, sendo a alquota de filtrado de 1,0 mL e o diluente, o

clordrico 0,1 N.

4.2.5.3. Condies experimentais do ensaio

As condies para execuo do ensaio de dissoluo de cpsula

cloridrato de oxitetraciclina, cloridrato de tetraciclina e fosfato de tetracic

foram conforme descrito na Farmacopia Americana 200 . Para amostras

4.2.6. Mtodo de doseamento microbiolgico turbidimtrico208

4.2.6.1. Preparao dos meios de cultura

meios complexos desidratados (Difco) destinados manuteno

cultura estoque do microrganismo e ao doseamento dos antibiticos fo

reconstitudos em gua destilada e esterilizados de acordo com o procedim

recomendado pelo fabricante.

4.2.6.2. Padronizao da suspenso de Staphylococcus au

ATCC 29737

microrganismo-teste,

Staphylococcus

aureus,

foi

semanalm

repicado, em estrias, sobre superfcie inclinada do meio de cultura para dosa

de antibiticos nmero 1, contido em tubo de ensaio, seguido de incuba

36

1 C por cerca de 18 horas. No dia do ensaio, com o auxlio de 5 m

soluo fisiolgica estril e agitao, foi recolhida a massa celular resultan

esta suspenso foi transferida para recipiente esterilizado.

Atravs da diluio da suspenso microbiana concentrada com sol

fisiolgica estril, foi ajustada a transmitncia para 25 %, em espectrofotme

580 nm para leitura e como branco, soluo fisiolgica estril.

meio de cultura estril.

4.2.6.4. Preparao das solues-teste de antibiticos

A substncia qumica de referncia de doridrato de tetraciclina

potncia de 994 Ilg/mg foi empregada para a preparao da soluo-estoq

1000 Ilg/mL. Para isto, pesou-se analiticamente cerca de 50,0 mg do pr

ativo presente na substncia qumica de referncia. Seguiu-se a transfe

quantitativa para balo volumtrico de 50 mL, com o auxlio de cido do

0,1

N estril,

completando ao

volume

com

mesma

soluo.

soluo-estoque foi mantida em refrigerador e usada por um dia. A partir des

solues-teste foram preparadas no dia do ensaio, empregando gua de

estril como diluente a fim de obter concentraes de 0,16; 0,20; 0,25;
0,39 J.lglmL.

A soluo-estoque de cloridrato de oxitetraciclina foi preparada utiliz

se o substncia qumica de referncia de cloridrato de oxitetraciclina com po

de 901 J.lglmg, pesando-se quantidade suficiente para corresponder a 50,0

diluindo-se cido clordrico 0,1 N estril. A soluo-estoque com concentra

1000 Ilg/mL foi mantida em refrigerador e utilizada durante quatro di

procedimento subsequente foi semelhante ao descrito no item anterior.

Para o cloridrato de doxiciclina a soluo-estoque foi preparada pes

se quantidade exatamente correspondente a 50,0 mg do princpio ativo a pa

uma substncia qumica de referncia de potncia 866 Ilg/mg e transferin

4.2.6.5. Preparao das solues-teste da amostra

Quantidade da amostra de cpsulas de cloridrato e fosfato de tetrac

correspondente a 100,0 mg de cloridrato de tetraciclina, exatamente pesad

transferida para balo volumtrico de 100 mL e diluda ao volume com

clordrico 0,1 N estril. Seguiu-se filtrao e diluio em gua destilada e

para obteno da soluo-teste na concentrao de O,251lg/mL.

Para a preparao das solues-teste das amostras de cpsula

cloridrato de oxitetraciclina-500 mg procedeu-se conforme descrito no
anterior.

Para as amostras de drgeas de cloridrato de doxiciclina-100

determinou-se o peso mdio de cada lote. As drgeas foram trituradas a p

transferindo-se o equivalente a 100,0 mg de cloridrato de doxiciclina exatam

pesado para um balo volumtrico de 100 mL com o auxlio de cido clordric

N estril. Completou-se ao volume com o mesmo diluente. A soluo-tes

preparada empregando-se a gua destilada estril como diluente para
soluo com 0,1 IlglmL.

4.2.6.6. Procedimento para o ensaio

No dia do ensaio, alquotas de 1, mL de cada diluio das soluesda substncia qumica de referncia e da amostra foram transferidas para

um de trs tubos de ensaio previamente esterilizados. A seguir, f

transmitncia foi medida em espectrofotmetro a 530 nm, empregando

branco uma soluo contendo 1, O mL de diluente e 9 mL de meio de cultura

inoculado.

Para calcular a potncia foi inicialmente construda a curva dose-resp

Para isto, as mdias aritmticas dos dados experimentais de cada concentr

da soluo da substncia qumica de referncia e da amostra da srie de

tubos foram determinadas. A partir destes valores, foram calculados os pon

(Low) e H (High) de acordo com a frmula apresentada pela FDA:3S. A c

padro de melhor ajuste foi construda em papel semi-logartmico. O valo

mdia aritmtica da amostra foi interpolada na reta, obtendo-se a concentr

do desconhecido. Esta, multiplicada pelo fator de diluio correspond

forneceu a potncia do antibitico na amostra.

4.2.7. Estudo do mtodo de cromatografia lquida de alta efici

para determinao de tetraciclina em amostras comerciais na form

cpsulas

4.2.7.1. Preparao dos diluentes e solues-teste

A preparao do cido clordrico metanlico 0,01 M, cido oxlico 0,1

oxalato de amnio 0,1 M, foi conforme procedimentos de diluio estabele

na Farmacopia Britnica34. A preparao das solues de oxalato de am

0,1 M foram misturados com 270 mL de dimetilformamida, grau analtico

enasio espectrofotomtrico.

4.2.7.1.2. Preparao da soluo-teste da substncia quimica

referncia de cloridrato de tetraciclina de 1000 J.1g1mL de acordo co

procedimento da Farmacopia Britnica30

Uma tomada de ensaio equivalente a 25,0 mg do cloridrato de tetrac

foi pesada e transferida quantitativamente para balo volumtrico de 25

Cerca de 20 mL de cido clordrico metanlico 0,01 M foi adicionado e

agitao, o volume foi completado com o mesmo solvente, obtendo-se so

com concentrao de 1000 J.1g1mL. A soluo obtida foi filtrada atrav

membrana PVOF HPLC de 0,2 J.1m de poro e 25 mm de dimetro da GEL

SCIENCE5e .

4.2.7.1.3. Preparao da soluo-teste da substncia quimica

referncia

de

cloridrato

4-epianidrotetraciclina

de

acordo

com

procedimento da Farmacopia Americana208

Cerca 10 mg da substncia qumica de referncia de c1oridrat

4-epianidrotetraciclina de potncia de 830 J.1g1mg foi quantitativamente transf

para balo volumtrico de 1 mL e diludo ao volume com 51 obtendo-se

Da substncia qumica de referncia de cloridrato de tetraciclina

potncia 994

~gJmg,

pesou-se exatamente uma quantidade equivalente

50,0 mg do princpio ativo. Transferiu-se para balo volumtrico de 50 m

seguido de diluio no 5" obtendo-se soluo com concentrao de 1000

~g1m

Alquotas desta soluo foram diluidas no mesmo 5, de modo a se obter

seguintes concentraes

(~g/mL):

de 0.005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,10; 0.25; 0,5; 1

5.0; 10,0; 25.0; 50,0; 100,0; 100.0; 200.0; 250,0 e 500,0.

4.2.7.1.5. Preparao das solues-teste da amostra.

procedimento envolveu inicialmente a pesagem analtica do p

amostra, equivalente a 100.0 mg do cloridrato de tetraciclina. Este

quantitativamente transferido para balo volumtrico com auxlio do solven

diluente 5,. Aps agitao do p em cerca de 50 mL do 5, o volume

completado para 100 mL com o mesmo diluente. A soluo obtida foi filtrada
solues nas concentraes de 25 e 100
segundo o item 4.2.7.1.2.

~g/mL

foram preparadas e filtrad

realizada pelo procedimento paralelo de filtrao empregando bomba vcu

agitao em banho de gua com ultrassom

4.2.7.1.7. Preparao da fase mvel segundo procedimento

Farmacopia Britnica de 1993 (BPII)

Misturou-se 100 ml de dimetilformamida, 120 mL de acetonitrila e 780

de cido oxlico 0,1 M. Aps a homogeneizao, acertou-se o pH para 3,9 c

trietilamina. O procedimento de filtrao e desgazeificao foi de acordo com

descrito no item anterior.

4.2.7.1.8. Preparao da fase mvel segundo procedimento

Farmacopia Americana 23 edio208

Foram misturados sequencialmente, 680 mL de oxalato de amnio 0,1

270 mL de dimetilformamida e 50 mL de fosfato dibsico de amnio 0,2 M. A

agitar e esfriar a soluo, acertou-se o pH entre 7,6 a 7,7 com cido fosfrico

ou hidrxido de potssio 3 N, quando necessrio. Em seguida, procedeu-s

filtrao e desgazeificao conforme o item 4.2.7.1.6.

4.2.7.2. Estudo comparativo dos mtodos da Farmacopia BritAn

e Americana 208

4.2.7.2.1. Estudo preliminar

Para este estudo as condies cromatogrficas foram determin

empregando uma soluo-teste dos padres de cloridrato de tetraciclina
4-epianidrotetraciclina.

4.2.7.2.1.1. Mtodo da Farmacopia Britnica30

Procedimento do ensaio para o estudo do mtodo para o cloridra

tetraciclina e c1oridrato de 4-epianidrotetraciclina

Condio do sistema cromatogrfico:

Coluna:

~-Bondapak

C18

Fluxo da fase mvel: 2 mUminuto

Temperatura da coluna: 40 C
Detector UV: 280 nm

Americana:

Coluna cromatogrfica de fase reversa SYMMETRYn.t Cal 2S0

partculas de silica de S 11m.

Pr-coluna SYMMETRYn.t Cal 30

4,6 mm, partculas de slica de 10

Fase mvel: descrita no item 4.2.7.1.8.

Fluxo: 2,0 mUminuto
Detector UV: 280 nm
Solues-teste do padro e da amostra com concentrao de

soa

foram recomendadas para serem injetadas no cromatogrfo a fim rea

determinao quantitativa.

4.2.7.3.

Estudo

de

adequao

dos

parmetros

do

cromatogrfico de fase reversa para a determinao da tetra

empregando o mtodo da Farmacopia Americana201

A presso na condio do sistema cromatogrfico estabelecid

Farmacopia Americana 2a5 foi determinada para a velocidade do fluxo d

mvel atravs da coluna com o seu aumento gradual at atingir a p

mxima de 4000 psi.

A velocidade do fluxo da fase mvel empregando uma soluo-te

padro de c1oridrato de tetraciclina e a determinao do tempo de reten

das fases eluentes permaneceram constantes, alterando-se a concentrao

solues do oxalato de amnio e fosfato dibsico de amnio, de acordo c

Tabela 1.

Experimentalmente as concentraes das solues aquosas foram dimin

para 80, 90 e 95 % em relao s solues recomendas na metodologia ofic

pH foi mantido entre 7,6 e 7,7.

TABELA 1

Composio da fase mvel destinada ao estudo da influnc

concentrao do oxalato de amnio e fosfato dibsico de am

presentes na fase mvel, sem alterao da proporo de
componente

Concentrao (molar)

Concentra
relativa (%

Oxalato de amnio

Fosfato dibsico de
amnio

Sem alterao (USP)

0,1

0,2

100

Fase mvel I

0,095

0,19

95

Fase mvel 11

0,09

0,18

90

Fase mvel 111

0,08

0,16

80

Concentrao (%)

=concentrao das solues em relao quela sem alterao

recomendadas na metodologia oficial, mantendo o volume final constante.

volumes da dimetilformamida foram aumentados em 10, 25 e 50 mL, confo

Tabela 2.
O pH permaneceu entre 7,6 a 7,7.

TABELA 2

Composio da fase

mvel

com

aumento

da

proporo

dimetilformamida e diminuio das solues de oxalato de am

0,1 M e fosfato dibsico de amnio 0,2 M

Fase mvel

Proporlo (mL)

Volume adi
(mLl

Oxalato de
amnio 0,1 M

Dimetilformamida

Fosfato dibsico
de amnio 0,2 M

Sem alterao

680

270

50

IV

670

280

45

10

667,5

295

37,5

25

VI

655

320

25

50

Da soluo-teste do padro de 250

~g1mL,

Dimetilform

trs rplicas de 20

~L

fo

injetadas no cromatgrafo para cada fase mvel estudada. Procedeu-se o en

a diferentes velocidade do fluxo da fase mvel: 0,8, 1,0 e 1,2 mL. O temp

dimetilformamida e da diminuio da proporo e concentrao

solues de oxalato de amnio e fosfato dibsico de amnio

Proporlo (mL)
Oxalato de
amnio

Volume adicion

Dimetilformamida

Fosfato
dibscio de
amnio

0,18 M 0,2M

Dimetilforma

Fase mvel

O,09M

0,1 M

Sem
alterao

680

270

50

VII

630

320

50

50

VIII

639

320

47

50

Nas duas fases testadas o volume da dimetilformamida foi aumentad

50 mL. Na fase mvel VII, aumentou-se o volume do oxalato de amnio 0

mantendo-se inalterada a proporo da soluo de fosfato dibsico de am

0,2 M. A fase mvel VIII teve o volume de dimetilformamida aumentado de 50

sendo proporcionalmente diminudo o volume das duas solues aquosas,

concentrao foi aquela com 90 % em relao recomendada no mtodo o

O pH foi acertado para valor entre 7,6 a 7,7.

Foram realizadas rplicas de cinco injees de 20 J,1L da soluo de

J,1g/mL de cloridrato de tetraciclina, no cromat6grafo, mantendo-se o fluxo da

Aps a adequao do sistema cromatogrfico, volumes de 20 JlL das

solues-teste das substncias qumicas de referncia de cloridrato de tetrac

e cloridrato de 4-epianidrotetraciclina nas concentraes de 500 e 100 J

respectivamente, foram injetados no cromatgrafo e obtidos os cromatogra

correspondentes.

4.2.7.5. Validao da metodologia

4.2.7.5.1. Construo da curva de calibrao

A condio do sistema cromatografico foi:

Coluna cromatogrfica de fase reversa SYMMETRYTM Ca, 250 x 4,6

partculas de silica de 5 Ilm.

Pr-coluna SYMMETRYTM Ca, 30 x 4,6 mm, partculas de slica de 10 I

Fase mvel: descrita no item 4.2.7.1.9.
Fluxo: 1,2 mUminuto
Detector UV: 280 nm
Volume de injeo: 20 IlL
A coluna foi mantida temperatura controlada de 30 C

Para cada concentrao da soluo-teste nas concentraes de 0,5;

5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 100,0; 100,0; 200,0; 250,0 e 500,0 IlglmL foram realiz

cinco injees no cromatgrafo. Os cromatogramas foram registrados e os d

analisados pelo programa MILLENIUM

A curva de calibrao foi obtida a

Procedeu-se

determinao dos valores

de rea

do

pico

concentraes de 10, 50 e 100 Ilg/ml com 3 colunas SYMMETRYTM de difere

nmeros de lote. De cada concentrao foram realizadas cinco injees. A

dos picos foram obtidas atravs do registro e clculo empregando o prog

MlllENIUMn.t. A comparao foi realizada pela anlise da variao da resp

entre as colunas. Para isto, determinaram-se os valores do coeficiente

variao em relao ao fator de anlise

4.2.7.5.3. Padronizao das solues-teste do padro e amo

empregados na determinao quantitativa do cloridrato de tetraciclina

amostras comerciais

Para estabelecer as solues-teste do padro e amostra empregados

ensaios, foram efetuados doseamentos em que se variou as solues do pa

frente s solues da amostra.

das solues da amostra de 25 e 100

~glmL

foram efetuadas. Os cromatogra

foram obtidos, e as reas do pico determinadas.

Atravs dos cromatogramas obtidos foi construda a curva de calibra

empregando os valores de rea do pico e as concentraes correspondente

clculo para a quantificao do teor nas amostras foi individualmente reali

para cada concentrao testada da amostra frente curva de calibrao.
A variao dos resultados para todas as injees foi analisada

obten

o valor do coeficiente de variao a fim de verificar a repetibilidade

resultados.

4.2.7.5.3.2. Determinao quantitativa do cloridrato de tetraciclina

amostra de concentrao nica frente a diferentes solues-teste do pad

Solues do padro nas concentraes de 25, 50 e 100

amostra de 50

~g/mL

~g/mL

foram empregadas nesta etapa do trabalho.

Foram realizadas seqencialmente cinco injees da soluo da amos

cinco injeces da soluo padro na concentrao de 25

~glmL.

Em seguid

mesmo procedimento foi repetido empregando as solues de 25 e 50

~glmL

solues de 25, 50 e 100 ~glmL do padro.

Cada

conjunto

de solues

do

padro

e da

amostra

injet

seguidamente foi considerado um ensaio individual. Calculou-se o teo

cloridrato de tetraciclina, comparando-se os valores de rea do pico do con

50 Ilg/mL. Para o estudo, trs amostras diferentes foram determinadas.

O teor foi calculado pela comparao dos resultados do cromatograma

padro e amostra. Nos dois ensaios anteriores, o teor foi calculado considera

a resposta para as solues empregadas em cada ensaio. Os resultados dos d

ensaios realizados para este estudo foram comparados em relao varia

entre os dados das trs amostras, atravs da determinao do coeficiente

variao.

4.2.7.5.4. Determinao do limite de deteco para o cloridrato

tetraciclina

As solues-teste preparadas nas concentraes de 0,5; 0,25; 0,1; 0

0,025; 0,01 e 0,005 IlgJmL foram injetadas no cromatgrafo nas mesm

condies do sistema cromatogrfico apresentadas no item 4.2.7.2.1.2. Fo

injetadas cinco rplicas para cada soluo. Os cromatogramas foram registrad

e o limite de deteco determinado pela anlise do cromatograma. Este limi

definido como aquele que produz uma resposta soluo do padro duas ve
maior que o rudo observado no cromatograma.

injees foram efetuadas para cada soluo-teste.

Aps a obteno da rea do pico de cada cromatograma da amos

fator de anlise foi calculado. O coeficiente de variao em relao ao fa
anlise e o teor encontrados para cada lote de amostra analisado
calculados.

4.2.7.5.6. Teste de recuperao

As solues-teste do padro e amostra foram preparadas na concent

de 500 IlglmL.

As solues para o teste de recuperao, obtidas pela mistura das

solues anteriores em balo volumtrico de 50 mL e diludas ao volume c

solvente diluente 8 1, foram preparadas segundo a descrio apresentad

Tabela 4.
Neste estudo, 10 ensaios de amostras foram realizados. Para isto,

injetadas no cromatgrafo, rplicas de cinco injees para cada mistura estu

das amostras.

5.0

5,0

50,0

10.0

5,0

50,0

quantidade

porcentagem

de

recuperao

para

cromatogrfico nas condies estabelecidas foi calculada segundo as frmula

Quantidade recuperada
% de recuperao

= OIS
% F =01Sx100
F

=concentrao do cloridrato de tetraciclina encontrada na soluo para o

de recuperao em que a amostra foi adicionada da substncia qum

referncia
O

=concentrao da amostra sem a adio da substncia qumica de refer

= concentrao da substncia qumica de referncia

4.2.7.6. Determinao da adequao do mtodo cromatogrfico p

doseamento de tetraclcllna para a metodologia aplicada

4.2.7.6.1. Determinao da resoluo (R) entre os picos

determinao

da

resoluo

dos

picos

(R)

4-epianidrotetraciclina e do desconhecido eluido imediatamente ante

V1

=Volume de reteno do primeiro pico

V2 = Volume de reteno do segundo pico

W1 = Largura do primeiro pico fonnado pela tangente traada no pico
W2 = Largura do segundo pico fonnado pela tangente traada no pico

A determinao da resoluo dos picos (R) obtidos da solu

substncia qumica de referncia de cloridrato de tetraciclina adicionad

substncia

qumica

de

referncia

de

cJoridrato

4-epianidrotetraciclina foi realizada a partir das solues das subst

qumicas de referncia de cJoridrato de tetracicJina de 500 JlglmL e cloridra

4-epianidrotetraciclina de 50 JlglmL, foram tomadas alquotas e diluda

mesmo balo volumtrico com solvente diluente (item 4.2.7.1.1.) para obt

concentraes de 12,5 Jlg/mL do cloridrato de tetraciclina substncia qumic

referncia e 50 J,!g/mL do cloridrato de tetraciclina em mistura.

Os cromatogramas obtidos de cinco injees da soluo de resolu

cromatgrafo, nas condies experimentais definidas foram empregadas p

clculo da resoluo.

4.2.7.6.2. Determinao da seletividade ou fator de separao (a)

a tetraciclina e 4-epianidrotetraciclina.

Empregando os cromatogramas obtidos no ensaio anterior, a seletiv

(a) foi calculada como segue:

4.2.7.&.3. Oetenninao da assimetria do pico (T)

A determinao da assimetria do pico permite verificar a adequa

condies do sistema cromatogrfico. Para isto, calculou-se a parti

cromatogramas da tetraciclina a assimetria do pico (T) determinada 5
altura total do pico:

Fator assimetria

bo,(5
2 x ao,OS

ao,os

(2

=a distncia entre o incio do pico e a metade do pico medido a altura 0

bo,os = a distncia entre a metade do pico e o final do pico medido a 0,05 h

h = altura do pico

Cromatogramas obtidos da soluo de 50

~glmL

foram empregados

esta determinao. A mdia de cinco determinaes para cada concen

testada forneceu o valor de assimetria do pico (T).

cromatogramas de injees das solues-teste da substncia qumica

referncia de cloridrato de tetraciclina nas concentraes de 50 e 100 J,lglmL

incio e final da utilizao da coluna, aps cerca de 1000 injees. As mdia

cinco determinaes

para cada

concentrao foram

obtidas para

determinao.
O fator de capacidade indica a reteno da amostra pela coluna

calculado empregando.se o tempo de reteno para o pico da tetraciclina

volume morto da coluna.

Fator de capacidade

K'

= V1 -

VQ

Vo

(15

Vo = Volume morto da coluna, obtido com a injeo de solvente no retido

coluna, o metanol
V1 = Volume de eluio do pico

Tambm foi determinada a eficincia (N) da coluna aps uso frequen

eficincia ou nmero de pratos tericos (N) foi calculado para os cromatogra

da soluo.teste da substncia qumica de referncia de cloridrato de tetraci

na concentrao de 50 e 100 J,lglmL. Foi obtida a mdia do valor de eficin

partir de cinco valores de eficincia para cada concentrao. Os cromatogra

estudados foram obtidos no incio de utilizao da coluna e no final, aps cerc

1000 injees das solues-teste.

~.5h

=largura do pico meia altura do pico

4.2.7.7. Comparao das duas metodologias

A comparao foi feita atravs da anlise dos cromatogramas obtidos

as solues dos padres de cloridrato

de tetraciclina

e c1oridrato

4-epianidrotetraciclina. Tempo de reteno e observao do pico f

considerados na escolha do mtodo.

4.2.8. Doseamento do teor de cloridrato e fosfato de tetraciclin

preparaes farmacuticas comerciais na forma de cpsulas de 500

empregando mtodo da Farmacopia Americana 208

Inicialmente foi realizada a determinao do peso mdio do contedo

cpsulas, sendo o p colocado em um gral e triturado para homogeneizar. D

tomou-se uma quantidade exatamente pesada de cerca de 100,0 mg equiva

ao cloridrato de tetraciclina e transferiu-se quantitativamente para

volumtrico, com o auxlio do solvente diluente (item 4.2.7.1.1). Da soluo o

foi preparada uma outra com concentrao de 50 JlglmL, no mesmo sol

anterior,

tomando-se

para

tanto

alquota

de

1,O

mL

volumetricamente para 10 mL. A soluo-teste da amostra foi filtrada.

diluin

4.2.9.

Estudo

para

detenninaAo

de

cloridrato

4~pianidrotetraciclina

Neste estudo o cloridrato de 4-epianidrotetraciclina foi determinado qu

obteno e anlise da curva de calibrao, dosagem do produto, limit

deteco e determinao da resoluo em relao ao produto de degrada

desconhecido, detectado no cromatograma imediatamente antes da elui

4-epianidrotetraciclina.

4.2.9.1. ConstruAo da curva de calibraAo do cloridrato

4~pianidrotetraciclina

Para esta etapa do trabalho, uma soluo com 500 llg/ml foi prepa

tomado-se o equivalente a 12,5 mg, exatamente pesada do cforidrat

4-epianidrotetraciclina presente na substncia qumica de referncia e diluind

em solvente diluente (item 4.2.7.1.1.). Desta, alquotas foram pipetadas e dil

volumetricamente para obter solues com concentraes de: 0,0025; 0

0,01; 0,025; 0,05; 0,10; 0,25; 0,50; 1,00; 2,50; 5,00; 10,0; 25,0 e 50,0 llg/ml

As condies do sistema cromatogrfico foram idnticas s desaita

item (4.2.7.2.1.2). Todas as solues preparadas foram injetadas em rplica

cromatogramas foram obtidos e registrados pelo programa MlllENIUM

O procedimento para este ensaio foi realizado conforme o item 4.2

com a finalidade de obter a menor concentrao que pode ser detectada por

metodologia nas condies do ensaio estabelecido. Este limite foi determi

para a concentrao que apresentou resposta duas vezes superior ao
observado no cromatograma.

4.2.10. Quantificao do cloridrato de 4-epianidrotetaciclina

substncia qumica de referncia de cloridrato de tetraciclina

Duas concentraes da soluo de cloridrato de tetraciclina f

preparadas, sendo de 50 e 100 Ilg/mL e tambm outras com 0,1; 0,25 e 0,5 Il
de c1oridrato de 4-epianidrotetraciclina.

As solues-teste da substncia qumica de referncia e da amostra f

injetadas no cromatgrafo. Rplicas de 5 injees para cada soluo-teste f

realizadas.

Os

cromatogramas

foram

obtidos

os

clculos

da 4-epianidrotetraciclina realizados no programa MILLENIUM

IW

de

O teo

determinado em Ilg da 4-epianidrotetraciclina por mg da substncia qumic

referncia da tetraciclina.

tetraciclina, empregando o programa MILLENIUM

O teor em porcentagem

cpsula foi obtido empregando o valor de peso mdio do contedo da cpsula

4.2.12. Anlise estatstica

4.2.12.1. Procedimento para o estudo comparativo dos mtodo

CLAE e microbiolgico aplicado cpsula de de tetraciclina de 500 mg

Para comparar os mtodos de CLAE e microbiolgico na determina

contedo de tetraciclina, sendo o valor terico de 500 mg, o procediment

anlise estatstica foi de acordo com a descrio a seguir.

Para cada laboratrio foram avaliados de um a quatro lotes, com an

em um a seis dias diferentes de acordo com cada lote testado, e no mesm

foram realizadas entre 3 a 13 repeties da anlise. Os resultados
determinaes de teor obtidos para amostras de 11

laboratrios f

considerados neste estudo.

A anlise estatstica efetuada a partir dos dados de teor de tetracidina

amostras de cpsula envolveu estudos de determinao da preciso e err

anlise, ilustrados na forma de grficos de controle para os mtodos de CL

microbiolgico turbidimtrico.

A relao entre o desvio da anlise e o desvio do processo produtiv

calculada, e comparada com as probabilidade de aceitao ou rejeio do
atravs do grfico de aceitao/rejeio52.

4.2.12.4. Comparao dos resultados de teor obtidos atravs

mtodos cromatogrfico e microbiolgico empregando o teste-t

A diferena entre as mdias dos teores dos dois mtodos foi determi

atravs do clculo do valor f, que foi comparado com a tabela de f (p < 0,001 )6

4.2.1.2.5. Comparao dos mtodos cromatogrfico e microbiol

pelo coeficiente de correlao de Pearson

o coeficiente de correlao de Pearson68 foi

calculado a partir dos va

das mdias do teor, obtidos pelos mtodos cromatogrfico e microbiolgico,

verificar se ocorre uma associao linear entre as duas metodologias.

BIBLIOTECA

Faculdade de Cincias F3rmacrutica

Universidade de So Paulo

porcentagens de resultados acima e abaixo do limite.

SOa"1.1nS3~

In

esperadas. Para as amostras analisadas, estas caractersticas foram observa

e descritas na Tabela 5.

TABELA 5

Descrio das caractersticas fsicas de aparncia do invlucro

cpsula de gelatina dura e do seu contedo, que diferem em rela

ao total das amostras de cpsulas observadas

Laboratrio

Substncia ativa

Lote

Caractersticas de destaque

Inscries TETRA 500 e PFIZER impre

tampa e no corpo da cpsula, respectivamen

Cloridrato de
oxitetracilina

1,2,3

Cloridrato de
tetraciclina
Idem ao anterior

Cpsulas levemente impregnadas de p.

Envelope contendo uma cpsula e metade

aberta embaladas juntas.

2
3

Cpsulas impregnadas de p.

Idem ao anterior

3
E

Idem ao anterior

Cpsulas no completamente encaixa

impregnadas de p.
P fino amarelo pardo, com presena de
com granulometria maior, de cor amarelo can
Cpsulas impregnadas com corante a
embalagem (blister de alumnio azul).

P no homogneo de cor amarelo pard

presena de grumos maiores, quase bran
difcil triturao.
Cpsulas impregnadas de p.
Cpsulas de cor vinho.

Idem ao anterior

Idem ao anterior

1,2,3,4

Inscrio LUPER impressa na tampa e c

c~ula.

tetraciclina
Cpsula
Idem ao anterior

individualmente embaladas.

1
2,3

Idem ao anterior

3
E

Idem ao anterior

1,2,3,4

Idem ao anterior

Idem ao anterior

1,2

3
H

Idem ao anterior

1,2,3,4

Idem ao anterior

1,2

Com nmero de lote. Slister com 4 u

embaladas separadamente.
Sem nmero de lote. Envelope c
individualmente embaladas.
Sem nmero de lote. Slister com 4 u
embaladas individualmente.
Com nmero de lote. Slister com 4 u
embaladas
individualmente
aprese
rebarbas.
Com nmero de lote. Slister com 4 u
embaladas individualmente.
Com nmero de lote. Envelope com 4 u
embaladas 2 a 2.

Com nmero de lote. Envelope com 4 u

embaladas individualmente.
Sem nmero de lote. Slister com
embaladas individualmente.
Com nmero de lote. Slister com
individualmente embaladas.
Com nmero de lote. Envelope com
embaladas 2 a 2.
Com nmero de lote. Slister com
embaladas individualmente.
Com nmero de lote. Envelope com
embaladas individualmente.

4 u

4 u

4 u

4 u

4 u

Idem ao anterior

Sem nmero de lote. Slister com 4 u

embaladas individualmente.

Idem ao anterior

1,2

Com nmero de lote. Envelope com 4 u

embaladas juntas.
Sem nmero de lote. Envelope conte
unidades colabadas.

3
L

Fosfato de
tetraciclina
CE!ula

1,2,3,4

Com nmero de lote. Envelope com 4 u

embaladas juntas.

Na Tabela 7, apresentada na pgina a seguir, esto demonstrado

valores de peso mdio obtidos para os diferentes lotes de produtos, determin

atravs da mdia de 10 a 20 valores individuais.

5.3. Ensaio de dissoluo in vitro

Fator adicional de influncia sobre a qualidade e a eficcia teraputic

medicamento consiste na dissoluo do princpio ativo, imprescindvel para

absoro. Para investigar se as formulaes permitiam a liberao adequada

produtos,

procedeu-se aos ensaios de dissoluo, conforme exigido

compndios farmacuticos para as preparaes farmacuticas slidas ou

apresentem pouca solubilidade em meio aquoso. Neste estudo, os resultado

ensaio de dissoluo de preparaes farmacuticas das tetraciclinas e

apresentadas nas Tabelas 8 e 9.

Para a interpretao dos resultados, quando o valor de teor foi menor q

limite mnimo (Q) estabelecido, aplicou-se o critrio de aceitao da metodo

geral para o teste de dissoluo, descrita na Farmacopia Americana207.208.

Tabelas 10, 11 e 12, esto descritos os critrios de aceitao aplicados

cpsulas de cloridrato de tetraciclina, fosfato de tetraciclina e drgea de c1or

de doxiciclina.

Cloridrato de
tetraciclina
Cpsula

1
2
3

547,2
538,4
581,4

5,8
3,1
3,8

10
Zero
Zero

Idem ao anterior

1
2
3

557,0
516,0
520,5

1,9
3,1
1,7

Zero
Zero
Zero

Idem ao anterior

1
2
3

513,1
468,6
544,4

6,8
2,2
3,5

20
Zero
Zero

Idem ao anterior

1
2
3
4

544,5
551,7
560,2
548,2

1,4
3,0
5,4
5,7

Zero
Zero
Zero
18

Idem ao anterior

547,3

2,9

Zero

Idem ao anterior

1
2
3

527,4
513,8
530,8

3,9
2,3
6,6

8,3
Zero
10

Idem ao anterior

1
2
3
4

526,78
525,24
529,0
542,1

2,1
3,2
3,5
4,5

Zero
Zero
Zero
10

Idem ao anterior

1
2
3

507,8
512,2
522,3

3,8
4,4
5,8

Zero
5
18

Idem ao anterior

526,8

1,2

Zero

Idem ao anterior

1
2
3

519.17
487,9
530,3

2,7
4,6
3,1

Zero
10
Zero

Fosfato de
tetraciclina
Cpsula

1
2
3
4

668,7
654,3
665,1
686,2

2,0
1,2
1,8
2,0

Zero
Zero
Zero
Zero

CV

=Coeficiente de variao

1; 2; 3

44,0; 93,2; 57,5

6; 0;6

4,2; 4,7; 4,2

1; 2; 3; 4

87,5; 90,7; 90,0; 91,2

o; 0;0;0

4,8; 4,0; 5,6; 7,

95,3

5,2

1; 2; 3

101,7; 92,3; 104,3

O; 0;0

4,5; 7,6; 2,8

1; 2; 3; 4

98,7; 91,5; 96,1; 95,2

o; O; O

3,9; 8,5; 5,1; 4,

1; 2; 3

92,0; 95,5; 96,0

0;0;0

3,1; 4,7; 2,5

94,6

4,7

1; 2; 3

92,6; 91,1; 88,3

o; O; O

3,6; 4,2; 4,7

1; 2; 3

90,6; 89,2; 96,1

O;

o; O

4,5; 3,7; 3,4

Aa, Ab = Drgeas de cloridrato de doxiciclina e cpsulas de oxiteraciclina do laboratrio A, respectvam

B-K = Cpsulas de ctoridrato de tetraciclina; L
variao; E1 = Estgio 1 do teste

TABELA

Laboratrio

= Cpsulas

de fosfato de tetraciclina; CV

= Coeficie

Resultados da mdia da porcentagem de dissoluo de amostras

retestadas, de acordo com o critrio de aceitao da Farmacopia
Americana208
Lote

Teor(%)
Reteste

CV(%)
Nmero de unidades com
teor abaixo do valor Q - 15 %

Mdia do
teor (0.4)
(E2)

Aa

91,8

7,0

93,2

1; 2

106,9; 107,4

o; O

8,0; 3,0

98,4; 103,7

1; 3

43,9; 56,5

12; 12

4,4; 3,4

44,0; 57,0

Aa = Drgeas de c1oridrato de doxiciclina do laboratrio A; B e D = Cpsulas de c1oridrato de tetracicl

=Coeficiente de variao; E2 =Estgio 2 do teste

TABELA 10 Critrio de aceitao para a cpsula de cloridratO de tetracicli

oxitetraciclina, segundo a farmacopia Americana-

Estgio do
ensaio

Nmero de cpsulas
testadas

E,

Critrio de aceitao

Cada unidade testada deve apresentar teor m

que 85 % (O + 5 %).
Se uma unidade testada ou mais apresentar
menor que 85 %, seguir para o estgio 2 (E 2)

=12

E2

6 (E 1) + 6

E3

12 (E 1 + E2) + 12

=24

A mdia das 12 unidades testadas deve ser

ou maior 80 % (O) e nenhuma unidade
apresentar teor menor 65 % (O - 15 %).
Se uma das unidades testadas ou
apresentar teor menor que 65 %, segue-s
estgio 3.
A mdia das 24 unidades testadas (E 1 +

ao

E3) deve ser igualou maior que

%e
mais que 2 unidades devem apresentar
menor que 65 %.

O = Umite mnimo de teor de cloridrato de tetraciclina em porcentagem estabelecid

monografia

ou maior 75 % (O) e nenhuma unidade d

apresentar teor menor 60 % (O - 15 %).
Se uma das unidades testadas ou
apresentar teor menor que 60%, segue-s
estgio 3.

E3

12 (E 1 + E2) + 12 = 24

A mdia das 24 unidades testadas (E1 +

E3) deve ser igualou maior que 75 % e
mais que 2 unidades devem apresentar
menor que 60 %.

O = Umite mnimo de teor de fosfato de tetraciclina em porcentagem estabelecid

monografia.

TABELA 12 Critrio de aceitao para o ensaio de dissoluo empregad

interpretao do resultado para drgea de cloridrato de doxici

segundo a Farmacopia Americana 2D8

Estgio do
ensaio

Nmero de cpsula
testado

E1

Cada unidade testada deve apresentar teor m

que 90 % (O + 5 %).
Se uma unidades testada ou mais aprese
teor menor que 90%, seguir para o estgio 2

E2

6 (E 1) + 6 = 12

A mdia das 12 unidades testadas deve ser

ou maior 85 % (O) e nenhuma unidade d
apresentar teor menor 70 % (O - 15 %).
Se uma das unidades testadas ou
apresentar teor menor que 70 %, segue-s
estgio 3.

E3

12 (E 1 + Eu + 12 = 24

A mdia das 24 unidades testadas (E 1 + E2 +

deve ser igualou maior que 85 % e no mais
2 unidades devem apresentar teor menor qu
%.

Critrio de aceitao

O = Umite mnimo de teor de c1oridrato de doxiciclina em porcentagem estabelecid

monografia

Britnica:D e Farmacopia Americana 2CJ5 , um ensaio preliminar foi realizado

confirmar a adequao da condio do sistema cromatogrfico estabelecido.

Empregando

ensaio

descrito

na

Farmacopia

Britnica:D

cromatrogramas obtidos para a 4-epianidrotetracidina e tetraciclina

representados nas Figuras 2 e 3, respectivamente. O valor de fator de capac

para a 4-epianidrotetraciclina foi determinado como 5,5 e para a tetracidina
10,5. A presso nas condies do ensaio foi de 2282 psi.

Para o mtodo da Farmacopia Americana2CJ5 , a variabilidade

parmetros determinados na metodologia oficial foi inicialmente pesquisada

a averiguao da influncia da velocidade de fluxo da fase mvel sobre a pr

no

sistema.

Aplicou-se

aumentos

sucessivos

da

velocidade

de

determinando-se a presso observada at um mximo de 4000 psi,

apresentada na Tabela 13.

:;
0.0600
0.0400
0.0200
::!
iC

o 0000 I

Cloridrato de 4-epianidrotetrack:lina

...

11'jP--r1SY

-0.020
-0.040
-0.060
-0.0&0

10.00

20.00
Minutos

FIGURA 2 Cromatograma

referente

ao

padro

de

cloridrato

4-epianidrotetraciclina na concentrao de 100 J.LglmL obtido

mtodo cromatogrfico descrito na Fannacopia Britnica 30, s

condio do sistema cromatogrfico: coluna I-L-Bondapak C1s-125

J.Lm-3,9 x 300 mm, temperatura de 40 C, fluxo de 1,5 mUmi

deteco a 280 nm, volume de injeo de 20 J.LL e fase m

dimetilfonnamida: acetonitrila: cido oxlico 0,1 M (10:12:78).

0.400-.1

Cloridrato de tetraciclillll
o

...o
0.200-

N
N

:/\

~
o

O.ooo--t-i
I

I'r

-0.20~

--r

/ -

"-

_--_Co~T

/
0

, ,
,
I

10.00

20.00

.unutas

FIGURA 3

Cromatograma referente ao padro de cloridrato de tetraciclin

concentrao de 1000

~gJmL

obtido pelo ensaio cromatotogr

descrito na Fannacopia Britnica30, sob a condio do sist

coluna ~-Bondapak C1r125 A-10 ~m-3,9 x 300 mm, temperatur

40 oC, fluxo de 1,5 mUminuto, deteco a 280 nm, volume de inj

de 20

~L

e fase mvel: Dimetilformamida: cido oxlico 0,1 M (5:9

da fase mvel (mUminuto)

(psi)

0,8

1788

0,9

2071
2400
2682
2918
3200

1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5

1,6

3435

3694
Ultrapassou 4000
(Mxima)

Uma vez determinado o comportamento da presso aplicada no sis

em relao velocidade do fluxo da fase mvel, estudou-se o tempo de rete

e a presso aplicada coluna com velocidade de fluxo de 0,8, 1

1,2 mUminuto. Os resultados podem ser observados na Tabela 14.

Velocidade de fluxo da
fase mvel (mUminuto)

Presso

Tempo de reteno

(psi)

(minuto)

Mdia
(minuto

13,0
0,8

1989

13,3
13,0

13,1

9,0
1,0

2400

9,1
9,0

9,0

8,2
1,2

2941

7,7

7,8

7,6

Na Tabela 15, foram apresentados resultados de presso e temp

reteno quando da variao da concentrao das solues aquosas do ox

de amnio e fosfato dibsico de amnio, frente velocidade do fluxo da

mvel de 0,8, 1,0 e 1,2 mUminuto.

1929

15,2

1929

15,2

1929

15,2

2471

12,2

2471

11,7

2988

11,6

1988

10,1

2988

10,1

2988

10,4

1906

15,3

1906

13,6

1859

13,4

2400
2376
2400

10,7
10,7
10,7

10,5

2918
2918
2918

8,9
8,9
8,9

8,9

1,2

1859
1859
1859

14,2
14,2
14,1

14,2

0,8

2424
2424
2424

11,4
11,4
11,4

11,3

2918
2941
2918

9,5
9,5
9,5

9,5

1,2

0,8

1,2

0,8

11

11I

15,2

11,8

10,2

14,2

dibsico 0,2 M, mantendo o volume final

Fase
mvel

IV

VI

Velocidade de fluxo
da fase mvel
(mUminuto)

Presso (psi)

Tempo de reteno
(minuto)

0,8

2188
2188
2141

14,5
14,2
14,1

14

1,0

2729
2706
2682

11,3
11,2
11,2

11

1,2

3082
3129
3224

9,0
9,1
9,3

9,1

0,8

2329
2353
2353

13,4
12,7
12,7

13

3012
3012
3012

10,3
10,3
10,3

10

1,2

3647
3647
3647

8,6
8,6
8,6

8,

Precipitou
temperatura
ambiente

Md
(min

injetado no cromatogrfo lquido de alta eficincia

Fase mvel

Pressa (Psi)

VII

Precipitou temperatura
ambiente inferior a 25C

VIII

Tempo de reteno (min

2988

9,1

2988

9,1

2988

9,1

2988

9,1

2988

9,0

Portanto, a fase mvel modificada (VIII) composta por oxalato de am

0,09 M, dimetilformamida e fosfato dibsico de amno 0,18 M na propor

63,9:32,0:4,7

foi

estabelecida

para

os

ensaios,

aps

obteno

cromatogramas do cloridrato de tetraciclina e c1oridrato de 4-epianidrotetracic

N

tendo as condies de coluna SYMMETRy Ca-250 x 4,6 mm-partculas de 5

detector a 280 nm, temperatura a 30C. As Figuras 4 e 5 mos

respectivamente,

os

cromatogramas

com

4-epianidrotetraciclina e cloridrato de tetraciclina.

os

picos

do

cloridrato

calibrao foi construda conforme ilustrada na Figura 6. O coeficient

correlao foi 0,9996 e o coeficiente de variao entre os valores do fato

anlise foi 3,9 %.

Os resultados de coeficiente de variao entre as injees foram men

que 2 %, valor recomendado como limite pela Farmacopia Americana 20s ,

ensaios com cinco injees. Sabendo-se que a saturao de colun

conseqente diminuio de sua vida til, depende tambm da concentra

substncia testada, a curva de calibrao da tetraciclina foi obtida

concentraes inferiores de 0,5 at 25 Ilg/mL, como representado na Figu

resultando no coeficiente de correlao de 0,9990.

Na Figura 8 est apresentado o cromatograma obtido da injeo de

soluo de 100 IlglmL do padro de cloridrato de tetraciclina.

Concentrao

Mdia da rea do pico

Fator de anlise

CV(%)

0,5

13159

26318

1,3

28681

28681

6,7

139345

27869

0,5

10

308720

30872

3,5

25

698908

27996

0,5

50

1414984

28300

0,3

100

2846615

28466

0,4

200

5601890

28009

0,5

250

7072055

28288

0,1

500

14280021

28560

0,2

(~gJmL)

--

3,9
CV (%)

0,9999

R =Valor da correlao da curva de calibr

=Coeficiente de variao
Fator de anlise =rea do pico/concentrao correspondente
CV

TABELA 19 Reprodutibilidade dos resultados exper

de cloridrato de tetraciclina (10, 50 e 1

nmero de lote, empregadas no ensaio

Solulo-teste
Concentralo (J.1gJmL)

Area do
pico

1
Fator de
anlise

10

284384
283083
291190
297034
287324

28438
28308
29119
29703
28732

2,0

50

1495636
1493340
1495793
1481510
1500698

29913
29867
29916
29630
30014

0,6

100

3020806
3023581
3020723
3028728
3015510

30208
30236
30207
30287
30155

0,2

CV(%)

2,3

CV(%)
Reprodutlbilidade entre
colunas CV (%)
CV

=Coeficiente de va

.
Fator de anlise:

\li

0.(00-

'ii

~ I.n

0.300-

~
o

0.200-

~
-8

.1:

0.100-

,-1

'.'00 l
T

2.00

~.

6.00

4.00
M:LDutoa

FIGURA 4

Cromatograma do padro de cloridrato de 4-epianidrotetraciclin

obtido de soluo a 100 J,1g1mL, com picos com tempo de reten

de

5,3

minutos.

Condies

do

Fannacopia Americana, modificadas

sistema
208

cromatogrfico

coluna SYMMETRY" Ca-25

x 4,6 mm-partculas de slica de 5 J,1m, detector a 280 nm, volume d

injeo: 20 JlL, temperatura a 30 C, fluxo: 1,2 mUminuto e fas

mvel:

oxalato de amnio 0,09 M: dimetilfonnamida: fosfa

dibsico de amnio 0,18 M (63,9:32,0:4,7)

--,
I

1..,
-1

0.600-1

..t.
o

0.400

...
~

0.200,

0.000

on

on

'

4.00

2.00

FIGURA 5

..
...

...on

T '

/.::-

6.00
Minuta.

8.00

...-:. _ _ -

-'-

!
10.00

Cromatograma obtido da soluo padro de cloridrato de tetracicli

a SOO

J.1g/mL,

nas

condies

do

sistema

cromatogrfico

Farmacopia Americana, modificadas208 : coluna SYMMETRY" Cs-2

x 4,6 mm-partculas de slica de 5 J.1m, detector a 280 nm, volume

injeo: 20 J.1L, temperatura a 30 C, fluxo: 1,2 mUminuto e fa

mvel: oxalato de amnio 0,09 M, dimetilformamida, fosfato dibsi

de amnio 0,18 M (63,9:32,0:4,7)

- - - - - - - - - - -- - - - --- - - -- - - - - - - - - - - - - - -- --- - - - -

1.400.+07

~
I

-~
I

- --- - - - - -

1.200. .07

----------------------~-----------------------~-~------I

I
I
I

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -: - - - - - - - - - - - - - - - - - / - - - - -,- - - - - - - - - I

1.000. .07

I
I

,
I

.9.000.+06

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - I - - - - - - - - -

&

I
-

-1-

I
I
I

! 6.000. .06

-----------------------~

4.000"06

---------------------~--------I
I
I

_______________

JI

1I

I
I

-------r--------------~-----------------------~-------I
I

2.000. .06

I
I

I
I

----------------------~-----------------------~---------

0.000"00

0.20

0.40
AIIlount

FIGURA 6

Curva de calibrao do cloridrato de tetraciclina para o ensa

cromatogrfico.

As

solu6es-teste

concentraes no intervalo de O,S a SOO

reas

dos

picos

determinadas

nas

injetadas
~g/mL

representara

de tetraciclina e

condies

do

sistem

cromatogrfico da Farmacopia Americana, modificadas208 : colu

SYMMETRY" Cs-2S0 x 4,6 mm-partculas de S ~m, detector a 280 n

temperatura a 30 C e fase mvel: oxalato de amnio 0,09
dimetilformamida, fosfato dibsico de amnio 0,18 M (63,9:32,0:4,7)

Tetraciclina Calibration Curve

7.000.-+05

6.000.-+05
I
I

-----,---------I

5.000.-+05

-- -- - -- -

-------V:- - -7/:------------\- ---------

_________ -i-

____
__

3.000e+05

----

-----

-,-

-..-..

t- -

I
I

- -- r- _ _

_ _ _ _ I:

-----

-:- - - - - - - - - - - -;- - - - - - - - - I

~-----------~-----------

I
-

-- -

2.000e+05

1.000.-+05

~/

-:- - - - _ :
I

.4.000.-+05

-1- -

-, -

-. -

-1- -

-,- -

I
I

I
I
I

0.000.-+00

-,- -

0.005

I
-

-,- -

0.010

0.015

0.020

Amo\mt

FIGURA 7

Curva de calibrao obtida para o cloridrato de tetraciclina a partir

solues-teste nas concentraes de 0,5 a 25 J.1g1mL segundo

mtodo cromatogrfico recomendado pela Farmacopia American

nas condies do sistema cromatogrfico modificadas: colu

SYMMETRY" Cr 250 x 4,6 mm-partculas de 5 J.1m, detector a 280 n

temperatura a 30 C e fase mvel: oxalato de amnio 0,09
dimetilformamida, fosfato dibsico de amnio 0,18 M (63,9:32:4,7)

p
(

0.08000.06000.0400-='
0.0200-='

O.OOOO-

.....

1/.._..\..

S.OO

1.0.00
Minutoe

FIGURA 8

Cromatograma do padro de cloridrato de tetracilina na concentra

de 100 J.1g/mL com tempo de reteno de 7,2 minutos e condio

sistema cromatogrfico modificado, estabelecido a partir do mto

da Farmacopia Americana 208 : coluna SYMMETRY'" Cr 2S0 x 4,6 m

partculas de 5 J.1m, detector a 280 nm, temperatura a 30 DC e fa

mvel: oxalato de amOnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dibs

de amnio 0,18 M (63,9:32:47)

5.5.2. Estudo de reprodutibilidade de resposta quando empregad

diferentes nmeros de lote da coluna SYMMETRYJ'M

A reprodutibidade do ensaio cromatogrfico quando a coluna

diferentes nmeros de lote foi verificada atravs do ensaio com trs colun

contendo mesmo material (Ce), de diferentes nmeros de lote, testada n

mesmas condies. Na Tabela 19, esto registrados os valores de coeficiente

variao do conjunto de ensaios obtidos da mesma concentrao da solu

padro, bem como do conjunto de ensaios para cada coluna e para o conju
total de respostas, obtidos atravs dos valores de fator de resposta.

TABELA 20 Teor de cloridrato de tetraciclina detenninado frente a curva

calibrao do padrlo, na faixa de concentrao de 10 a 500

~gl

empregando duas solues da amostra nas concentraes de 2

100 ~glmL

Teor (mg/cpsula)
Soluo-teste da amostra (J.1g/mL)
25

100

465,7
463,1
462,0
461,0
460,4

454,1
453,6
453,6
453,5
453,0

CV(%)

0,5

0,1

Mdia (J.1QIrnL)
Mdia (%)

462,4

453,5

92,5

90,7

Repetibilidade do ensaio
CV~
CV = Coeficiente de variao
A correlao (R) para a cUlVa de calibrao foi de 0,9999

1,1

25 e 50; e 25, 50 e 100

~glmL,

aplicado a amostra come

empregando a cromatografia lquida de alta eficincia nas condi

estabelecidas na Farmacopia Americana-, modificadas

Teor (mg/cpsula)

Concentrao da soluo-teste da substncia de refernc

(J,lg/mL)

CV(%)
Repetibilidade do ensaio
CV(%)
CV

25

25,50

25,50 e 100

525,3
526,5
527,0
526,9
527,7

513,0
514,2
514,7
514,5
514,4

517,7
519,0
519,4
519,3
520,1

0,2

0,2

0,2

1,0

=Coeficiente de variao

o mtodo foi aplicado a trs diferentes amostras, empregando dois ens

cuja diferenciao ocorre no nmero de solues-teste da amostra. Para o en

1, uma nica concentrao empregada, sendo de 50 IlglmL, enquanto qu

ensaio 2 so empregadas duas concentraes, 50 e 100 Ilglml. Nos

ensaios, a determinao foi frente a duas concentraes da soluo do pad

de 50 e 100 IlglmL, com resultados expressos na Tabela 22.

Ensaio

CV (%)
Repetibilidade
ou CV (%)

Ensaio
2

Ensaio
1

Ensaio
2

Ensaio

1
498,7

501,8

530,2

531,2

501,4

497,8

501,8

530,5

530,3

501,7

50
50

497,3

501,4

530,2

529,6

497,6

501,6

530,3

529,5

501,4
501,4

50
50

498,0

503,0

530,3

529,6

501,3

50

0,1

0,9

0,0

0,2

0,0

0,4

En

0,1

0,9

=Coeficiente de variao
Ensaio 1 =Soluo da amostra na concentrao de 50 J.lQ/mL
Ensaio 2 =Solues da amostra nas concentraes de 50 e 100 J.1QImL

CV

5.5.4.

Construo

da

curva

de

calibrao

do

cloridrato

4-epianidrotetraciclina

A Tabela 23 apresenta os dados referentes aos picos das soluce

cloridrato de 4-epianidrotetraciclina na faixa de 0,005 a 50 J.1g1mL, graficam

representados na Figura 9. Cada resultado apresentado de rea do pico, fat

anlise e coeficiente de variao proveniente da mdia de cinco determina

O coeficiente de correlao encontrado foi igual a 0,9999.

0,005

No detectado

0,01

5,1

828

82500

3,1

0,025

5,1

1277

51080

4,2

0,05

5,1

2534

50680

9,5

0,10

5,1

5195

51950

1,1

0,25

5,1

12083

48332

1,7

0,50

5,1

24972

49944

1,8

1,00

5,1

50086

50086

0,8

2,50

5,1

124450

49780

0,8

5,00

5,1

527837

51567

0,8

10,00

5,1

498139

49813

0,3

25,00

5,1

1218594

48744

0,2

50,00

5,1

2487736

49755

0,6

R
CV = Coeficiente de variao
R = Valor da correlao da curva de calibrao

0,9999

2.600.+06 -+

4-epianidrotetraciclina Calibration Curve

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -, - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - I

2.400.+06

---------------------------------------------T--------I

2.200.+06

----------------------~-----------------------.----~---,
I
I

2.000.+06

----------------------------------------------~--------I
I

1.800.+06

----------------------~------------------~---~---------

1.600.+06

----------------------~---------------------~-------I
I

.1.400.+06

----------------------,--------- -------------T---------

~1.200.+06

I
I

----------------------~---I

-----------------r---------

1.000.+06

----------------------~----------------------~--------I
I

8.000.+05

------------------~---~-----------------------T------- -I

6.000.+05

-------------~--------------------------------~--------

4.000.+05

________

2.000.+05

~-------------~---------------

---~------------------I-----------------------T--------I

0.000.+00

----------------------------------------------.--------I

0.00

20.00

40.00
AIDl:nmt

FIGURA 9

Representao grfica dos resultados obtidos para a construo

curva de calibrao da 4-epianidrotetracilina no intervalo de 0,00

50 V-g/mL, nas condies do sistema cromatogrfico, modifica

recomendado pela Fannacopia Amercana 208 Resultados fornecid

pelo programa MILLENIUM'" da WATERS'"

-f

-""
-

0.'00l -

-1)-

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-a,
'"

ao

0.300

'"c

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II
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6
~
c

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0.2001)-

1i

...
.
1

0.1001)-

l_
-. -

"!

...-c.

.....

0.000J-

20.00

10.00
Minuto.

FIGURA 10

Cromatograma obtido a partir de uma soluo padro de 100 J.1

do

cloridrato

de

4-epianidrotetracilina

nas

condies

sist

cromatogrfico da Farmacopia Americana 2Oll, modificado: co

SYMMETRY" Ce-250 x 4,6 mm-partculas de 5 J.1m, detector a 280

temperatura a 30C e fase mvel: oxalato de amnio 0,09

dimetilformamida: fosfato dibsico de amnio 0,18 M (63,9:32

apresentando um pico desconhecido (2) eluido aps 21,5 minutos.

4-epianidrotetraciclina.

Os

cromatogramas

do

c1oridrato

de

tetrac

apresentaram resposta semelhante.

As Figuras 11 e 12 referem-se aos cromatogramas do cloridrato

4-epianidrotetraciclina obtidos de solues com concentraes de 0,0

0,005 JlglmL, sobrepostos, sendo respectivamente, representados pela cor

e azul. A Figura 11 mostra os picos registrados tendo como referncia o pic

diluente. Para visualizar os picos da substncia estudada, a atenua

diminuida, possibilitando diferencia-los do rudo, conforme a Figura 12,
mostra os mesmos cromatogramas da Figura 11.

0.0012-

0.0010-

0.0008-

0.0006-

0.0004-

.!

~~

il

~!
8.51
1i

0.0002-

0.0000_'V-~"---_~~_~~

-0.0002-

0.'00

. 1.'00

. 2.'00

3.'00 '

4.'00 '

5.'00 '

,6

Minutos

FIGURA 11

Sobreposio dos cromatogramas

referentes

ao

cloridrato

4-epianidrotetraciclina nas concentraes de 0,01 e 0,005 J.1gJm

apresentando o pico no tempo de reteno de 5,0 minuto

Cromatogramas na cor preta e azul correspondem s concentrae

respectivamente citadas. Condies: coluna SYMMETRyTJ( Ca-250 x 4

mm-partculas de 5 J.1m, detector a 280 nm, temperatura a 30 C e fas

mvel: oxalato de amnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dibsic

de amnio 0,18 M (63,9:32:47)

I'
~.!

-0.00004-

-0.00006-

~
-0.00008-

!/\~

1\ i

.}~ ~\I.\
.1' \JV\I
I

('J\~' /\11\~l:
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.

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\/
I

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-0.00010-

',

l'l \,
J

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I,

-0.00014-

-0.000160.'00

1.'00 .

. 2.'00

. 3.'00

. 4.'00

5.'00

Minut~s

FIGURA 12

Sobreposio dos cromatogramas

referentes

ao

cloridrato

4-epianidrotetraciclina nas concentraes de 0,01 e 0,005 ).1g1m

apresentando o pico no tempo de reteno de 5,0 minuto

Cromatogramas na cor preta e azul correspondem s concentra

respectivamente citadas, com atenuao diminuida

valores resultantes de teor apresentados nas Tabelas 25 e 26.

TABELA 24

Teor de doxiciclina em drgeas de 100 mg e oxitetraciclina

cpsulas de 500 mg, produzidos pelo laboratrio A, analisado
mtodo
microbiolgico
turbidimtrico
empreg
Staphy/ococcus aureus ATCC 29737, recomendado
Farmacopia Americana 208

Princpio ativo

Lote

Teor-mglunidade (%)

Cloridrato de
doxiciclina

106,9 (106,9)

107,0 (107,0)

107,5 (107,5)

515,0 (103,0)

547,2 (109,4)

534,1 (106,8)

Cloridrato de
oxitetraciclina

Cloridrato de
tetraciclina

Cloridrato de
tetraciclina

Cloridrato de
tetraciclina

Cloridrato de
tetraciclina
Cloridrato de
tetracclina

Cloridrato de
tetraciclina

CV

=Coeficiente de variao

547,2 (109,4)

0.4

594,9 (119,0)

548,2 (109,6)

1.9

557,8 (11,6)

507,7 (101,5)

1.5

561,0 (112,6)

501,5 (100,3)

0.3

520,6 (104,1)

243,6 (48,7)

3.1

277,6 (55,5)

460,1 (92,0)

3.9

525,5 (105,1)

317,0 (63,4)

3.4

347,7 (68,7)

486,4 (97,3)

0.5

533,2 (106,6)

479,3 (95,9)

3.1

518,2 (103,6)

517,6 (103,5)

2,3

571,3 (114,6)

479,1 (95,8)

0,8

510,4 (102,1)

514,0 (102,8)

1,0

556,3 (111,2)

520,9 (104,1)

1,7

594,2 (118,8)

524,0 (104,8)

2,3

569,2 (113,8)

507,5 (101,5)

0,3

521,8 (104,4)

526,5 (105,3)

0,5

562,3 (112,5)

513,6 (102,7)

1,9

571,1 (114,2)

517,6 (103,5)

1,2

566,8 (113,4)

531,0 (106,2)

2,9

563,6 (112,7)

Cloridrato de
tetraciclina
Cloridrato de
tetraciclina

Fosfato de
tetraciclina

504,3 (100,9)

2,7

546,2 (109,2)

511,6 (102,3)

2,1

585,9 (117,2)

466,9 (93,4)

4,0

506,5 (101,3)

513,2 (102,6)

4,6

588,1 (117,6)

485,3 (97,1)

1,4

554,3 (110,9)

487,2 (97,4)

2,0

555,4 (111,1)

498,5 (99,7)

0,7

553,5 (110,7)

516,5 (98,2)

5,3

582,9 (116,6)

498,3 (99,7)

2,4

553,4 (110,7)

483,8 (96,8)

1,6

524,8 (105,0)

CV = Coeficiente de variao

5.7. Avaliao da preciso do mtodo CLAE de determin

quantitativa da tetraciclina em amostras comerciais

o teste para verificao de preciso do ensaio cromatogrfico foi

apl

a cinco amostras, estando os resultados apresentados individualmente

amostra, nas Tabelas 27, 28, 29, 30 e 31. O coeficiente de correlao empre

para avaliar a repetibilidade entre os resultados de cada ensaio e entr

diferentes ensaios, empregando diferentes solues padro e amostra,
representado em cada tabela.

padro soluo da amostra, de 50

~g1mL.

A exatido e especificidad

mtodo CLAE, podem ser avaliadas pelos valores em porcentagem de tetrac

recuperada a partir de cada soluo-teste.

5.9. Quantificao do cloridrato de 4-epianidrotetraciclina

5.9.1. Quantificao do cloridrato de 4-epianidrotetraciclina pres

no padro de cloridrato de tetraciclina com potncia de 994

~g1mg

Os valores de teor do cloridrato de 4-epianidrotetraciclina na subst

padro com potncia de 994

~g1mg,

determinados pelo mtodo CLAE

condies estabelecidas, esto apresentados na Tabela 33.

531,2
530,8
529,6
530,2
530,5
530,2
530,3
530,3

501,6
501,5
501,7
502,7
503,6

0,2

546,6
545,0
548,0
545,9
548,0

0,2

453,3
451,6
451,9
451,4
456,4

0,5

519,1
518,7
519,7
520,1
518,0

0,2

CV (%) Repetibilidade entre dias

CV

0,0

=Coeficiente de variao

5,2

507,9
507,6
59,03
508,4

512,8
512,9
513,0
510,5
510,7

0,3

493,0
490,4
491,5
492,0
495,8

0,4

517,6
515,5
517,1
516,2
518,6
517,3
516,9

0,2

CV (%) Repetibilidade entre

dias

1,9

CV = Coeficiente de variao

529,0
528,5
528,6
429,7

513,2
512,6
511,7
512,2
513,0

0,1

496,9
496,5
495,9
497,6
498,3

0,2

516,4
515,8
515,1
513,9
515,3

0,2

511,4
509,8
509,9
509,9
510,6

0,1

CV (%) Repetibilidade entre dias

1,9

CV

=Coeficiente de variao

534,0
532,2
538,6
530,4
534,4

0,6

511,6
513,0
511,4
511,8
512,6

0,1

504,4
504,2
503,7
504,8
505,7

0,1

536,4
535,0
535,0
534,1
535,0

0,2

CV (0/0) Repetibilidade entre dias

2,5

CV = Coeficiente de variao

538,3
537,1
2

541,6
543,7
544,6
544,0
543,5

0,2

548,7
547,7
547,3
547,6
547,2

0,1

508,2
507,7
508,0
508,8
508,7

0,1

516,7
516,7
517,5
516,4
517,6

0,1

CV (%) Repetibilidade entre dias

CV

=Coeficiente de variao

2,8

Quantidade recuperada (JoLglmL)

Quantidade recuperada (%)

30,4

50,4

98,5

101,4

100,8

98,

29,7

50,8

101,0

98,8

101,7

101

30,7

51,0

101,5

102,3

102,0

101

30,6

51,4

98,6

102,0

102,7

98,

30,8

50,0

101,1

102,7

100,2

101

29,5

50,2

100,3

98,2

100,3

100

30,1

49,7

100,4

100,3

99,4

100

29,2

49,20

99,4

97,3

98,4

99,

29,3

50,4

100,5

97,7

100,8

100

10

28,7

48,2

97,9

95,5

96,5

97,

amnio 0,09 M, dimetilformamida, fosfato dibsico de amnio 0,0

(63,9:32,0:4,7). Resultados fornecidos pelo programa MILLENIUM

WATERS"

Ensaio

CV(%)

Teor
(~/mg)

(%)

2,2
2,3
2,0
2,2

0,2
0,2
0,2
0,2

5,8

2,2
2,3
2,2
2,0
2,2

0,2
0,2
0,2
0,2
0,2

5,4

2,4
2,5
2,5
2,6
2,4
2,4

0,2
0,2
0,3
0,3
0,2
0,2

3,2

2,6
2,4
2,5
2,4
2,6
2,4

0,3
0,2
0,2
0,2
0,3
0,2

3,1

Mdia

2,3

0,2

CV(%)
Repetibilidade entre os ensaios

8,0

CV

=Coeficiente de variao

lote de amostra.

5.10. Estudo da adequao do mtodo CLAE para as condi

estabelecidas

5.11. Determinao da resoluo dos picos de 4-epianidrotetracic

e do desconhecido eludo imediatamente antes

A Figura 13, representa o cromatograma de uma soluo-teste do pa

de

c1oridrato

de

tetraciclina

100

~g1mL,

que

mostra

os

picos

4-epianidrotetraciclina e de desconhecido, com altura do pico maior e tempo

reteno menor. A resoluo dos picos

(R) foi

calculada atravs

cromatogramas obtidos, e os valores expressos na Tabela 36, permitem veri

a interferncia do pico desconhecido (1) no ensaio da 4-epianidrotetraciclina.

(mg)

(%)

1,7

0,3

1,9

0,4

0,9

0,2

1,4

0,3

1,2

0,2

0,9

0,2

1,4

0,3

0,8

0,2

1,4

0,5

1,7

0,3

1,5

0,3

1,2

0,2

1,7

0,3

1,9

0,3

1,5

0,3

1,9

0,4

1,3

0,2

CV

=Coeficiente de variao

1,7

0,3

9,1

1,6

0,3

2,7

2,0

0,4

1,9

2,3

0,4

3,1

1,9

0,4

1,0

1,9

0,4

2,2

4,0

0,7

2,5

1,6

0,3

3,3

1,8

0,4

2,0

1,1

0,2

1,3

1,8

0,3

4,6

2,0
0,8

0,1

2,9

0,1

1,0

0,1

13,2

0,1

6,0

2
0,8
3
0,9
4
CV = Coeficiente de variao

:>
o(

t!

0.0018-1

II

0.0016-1

II

0.0014~1

II

0.0012-1

I I

0. 0010

I I

.3
..,.~

C>

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C
O

0.0008-

0.0006-

0.0004-

0.0002- ~~
0.0000-

-0.0002-

-0.0004-

0.'50

1.'00

1.'50

2.'00

2.'50

3.'00

3.'50

4.'00

4.'50

5.'

Minuto..

FIGURA 13

Cromatograma de soluo de padro de cloridrato de tetraciclina

concentrao de 100 J.1g1mL, sendo as condies do sist

cromatogrfico modificado coluna SYMMETRYN CS-250 x 4,6
partculas de 5 J.1m, detector a 280 nm, temperatura a 30 C e

mvel: oxalato de amnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dib

de amnio 0,18 M (63,9:32:47),
Americana 208

recomendado pela Farmaco

100

1,5

R = Resoluo

o grau de separao ou resoluo (R) foi calculado como descrito no

4.2.7.6.1.

5.12. Determinao da resoluo dos picos (R) da tetraciclina e

4-epianidrotetraciclina e seletividade ou fator de separao (a) a parti

uma soluo-teste de mistura dos 2 padres segundo procedimento

Farmacopia Americana201, modificado

A resoluo (R) e seletividade (a) indicam o grau de separao entre

picos eludos. Na determinao de resoluo mede-se a distncia entre dois p

vizinhos, enquanto que a determinao da seletividade indica o grau

separao relacionado com o fator de capacidade. Na Tabela 37, fo

colocados os valores de resoluo (R) e seletividade (a), calculados part

cromatograma da mistura de padres.

cromatograma obtido da mistura dos dois padres est ilustrado

Figura 14.

Cromatograma

Resoluo (R )

Seletividade (a)

1
3
4
5

3,67
3,67
3,67
3,4
3,9

1,5
1,5
1,5
1,5
1,5

Mdia

3,7

1,5

R = Resoluo

a = Seletividade

A seletividade (a.) foi calculada segundo o item 5.12.

0.0600

Jt-

...
o

1ft

0.0400
~

~. I~~

1
~

0.0200

Ao

'~y

0.0000

!t \
I

..

:
~/) :..

.\ " ,

./

1 - - - - - - -""

2.00

4.00

6.00

Minutos

FIGURA 14

Cromatograma referente soluo mistura de resoluo com 50 J,LglmL d

cloridrato

de

tetraciclina

12,5

J,LglmL

do

cloridrato

de

epianidrotetraciclina, solues-padro nas condies modificadas, colun

SYMMETRY" Ca-250 x 4,6 mm-particulas de 5 J,Lm, detector a 280 nm

temperatura a 30C e

fase

mvel:

oxalato

de

amnio

0,09

dimetilformamida: fosfato dibsico de amnio 0,18 M (63,9:32:47), d

Farmacopia Americana 208

dos picos da tetracilina da soluo padro de 50 Ilg/ml, estando apresent

na Tabela 38.

TABELA 38 Valores

de assimetria

do

pico

(T),

calculados

parti

cromatogramas referentes a soluo de padro de cloridrat

tetraciclina 50

~gJmL.

Os resultados apresentados representam

valores resultantes de cromatogramas obtidos de cinco injees

Cromatrograma

Assimetria do pico (T)

1,1
1,2
1,1
1,0
1,0

Mdia

1,1

2
3
4

T = Assimetria do pico

A assimteria do pico (T) foi calculada segundo o item 5.13.

estudo envolveu a verificao da condio da coluna no incio de sua utiliza

aps cerca de 1000 injees.

TABELA 39 Resultados obtidos de fator de capacidade (K') e de eficincia

calculados a partir de cromatogramas de solues do padrlo

cloridrato de tetraciclina 50 e 100 J.LglmL. Os valores resultaram

cromatogramas registrados no inicio e no final da utilizao

coluna, aps cerca de 1000 injees de 20 J.LI no cromatgrafo. Fo

realizadas mdias de cinco determinaes para cada concentralo

Utilizao da
coluna

Concentrao da soluo padro (tlglmL)

100

50

K'

K'

Incio

3,4
3,4
3,34
3,4
3,4

6630
6898
5852
5281
5814

3,4
3,4
3,4
3,4
3,4

6122
5238
5501
5786
6457

Mdia dos valores

3,4

6095

3,4

5582

Final

2,7
2,6
2,7
2,7
2,7

2977
2869
2783
2659
2309

2,7
2,7
2,7
2,7

3032
3059
3816
2816
2816

Mdia dos valores

2,7

2877

2,7

2951

K' = Fator capacidade

N = Eficincia

os dados referentes aos cromatogramas e possui alm de outros recur

procedimento que permite sobrepor os cromatogramas de interesse. Nas F

15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21, os cromatogramas foram sobrepostos c

finalidade de estudar a semelhana ou diferena no tamanho e tempo de ret

dos picos.

0.20-

0.18-

0.16::>

rc(

0.14-

I~
0.12-

0.10-

O.

as-

'\

!\

0.06-

lr (

~'l

0.04-

tIll/L .

0.02-

0.00-

2.'00

4.'00

6.'00

8.'00

10:00

12:

MinutlOS

FIGURA 15 Sobreposio de cromatogramas obtidos partir de solues

padro de cloridrato de tetraciclina nas concentraes de 5, 10,

50, 100 e 200 J,1g/mL, provenientes de uma curva de calibra

Condies: coluna SYMMETRy Ca-250 x 4,6 mm-partculas de 5 ~

detector a 280 nm, temperatura a 30 C e fase mvel: oxalato

amnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dibsico de amnio 0,18

(63,9:32:47)

'C

.,g
U
0.10-1

I
1

I
I

-I

:>

cC

0.08-

0.06-

0.04-

0.02-

O.OO-r

0.00

. . . - . .!~

_.

1.'00

2.'00

3.'00

4.'00

5.'00

Minut~

FIGURA 16

Sobreposio de cromatogramas, obtidos para a determinao d

curva de calibrao da 4-epianidrotetraciclina, formados pelos pico

J.lg/m

das solues com concentraes no intervalo de 0,025 a 1

TII

Condies: coluna SYMMETRy Ca-250 x 4,6 mm-partculas de 5 Jlm

detector a 280 nm, temperatura a 30 C e fase mvel: oxa'lato d

amnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dibsico de amnio 0,18
(63,9:32:47)

0.045-

f
i

0.040-

~
0.035-

.~

6I

~
(\)

0.030-1

"'t:l

'c
..9

0.025-

U
0.020-

0.015-

0.010-

0.005-

0.000-

'4.'00'

'4.'50'

'5.'00'

'5.'50'

'6.'00'

'6.'50'

'7.'00'

'7.'

Minutos

FIGURA 17 Sobreposio

dos

cromatogramas

obtidos

de

solues

epianidrotetraciclina a 12,5 J.lg/mL (Azul) e da soluo mistura d

padres de cloridrato de tetracilina a 50 J.lg/mL e cloridrato d

4-epianidrotetraciclina a 12,5 J.lg/mL (Preta), preparados para o ensa

TII

de resoluo. Condies: coluna SYMMETRy

Cs-250 x 4,6 mm

partculas de 5 J.lm, detector a 280 nm, temperatura a 30 C e fas

mvel: oxalato de amnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dibsic

de amnio 0,18 M (63,9:32:47)

.~

Q)

"O

:2

Q.

Q)

0.10-1

Q)

"O

:g

.s
~
:g

.2

;;:
0.08-

0.06-

0.04-

j
I

0.02-

L\
0.00-1

0.'00

'1.'00'

'2.'00'

'3.'00'

's .'00'

'4.'00'

'6.'00'

'7.'00'

Minutos

FIGURA 18

Sobreposio de cromatogramas obtidos da soluo de cloridrato

tetraciclina a 50 J.1g/mL (Azul) e da soluo de cloridrato

4-epianidrotetraciclina 50 J.1g/mL (Preta), representados na mesm

TU

escala. Condies: coluna SYMMETRY Ca-250 x 4,6 mm-partculas

5 Jlm, detector a 280 nm, temperatura a 30C e fase mvel: oxalato

amnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dibsico de amnio 0,18

(63,9:32:47)

0.0020O.OOlS-

.S
]

0.0016-

f!

0.0014-

.~

.~

0.0012-

-8
O

.s

0.0010-

'C
..2

O.OOOS-

/~~

0.00060.00040.0002-0.0000_ _o

_ _ _ _- - - -

_ _- - - - - -

_ _ ---.-

-0.0002-0.0004-0.0006. 4.'20

4.'40

4.'60

4.'SO

5.'00

5.'20

5.'4

MinutGs

FIGURA 19

Sobreposio de cromatogramas

de

uma

soluo

padro

4-epianidrotetraciclina a 0,05 ~g/mL (Azul) e outra de cloridrato

tetraciclina na concentrao de 50 ~g/mL (Preta), representados

mesma escala. Condies: coluna SYMMETRy Ca-250 x 4,6
partculas de 5 ~m, detector a 280 nm, temperatura a 30 C e

mvel: oxalato de amnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dib

de amnio 0,18 M (63,9:32:47)

0.0006-

0.0004-

0.0002'- -

4.'00 '

. 4.'20'

. 4.'40

, 4 .'60'

. 4 .'8 O.

. 5.'0 O'

. 5 .'20

. 5.'40

--

--.

--

. 5.'60'

Minutos

FIGURA 20

Sobreposio

de

cromatogramas

da

soluo

padro

4-epianidrotetraciclina a 0,25 f.1g/mL (Preta) e da soluo d

tetraciclina a 50 f.1g/mL (Azul), representados na mesma escala

Condies: coluna SYMMETRY1'JI Cs-250 x 4,6 mm-partculas de 5 J.Lm

detector a 280 nm, temperatura a 30C e fase mvel: oxalato d

amnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dibsico de amnio 0,18 M

(63,9:32:47)

fI

-~
~

1c!

o. 0020~1

0.0015-

0.0010-

/j
tl/

)'~

0.0005-

_,

V \,j '--V~/\

.~

/
//

\1

'LJ

4.'40

4.'60

4.'80

5.'00

5.'20

5.

Minut03

FIGURA 21

Sobreposio dos cromatogramas obtidos da solues dos padre

do cloridrato de tetraciclina a 50 Jlg/mL (Preto) e do cloridrato d

4-epianidrotetraciclina a 0,025 Jlg/mL (Azul), sem considerar a escala

mostrando o pico do desconhecido (1) e da 4-epianidrotetraciclina

Condies: coluna SYMMETRyTJ( Ca-250 x 4,6 mm-partculas de 5 Jlm

detector a 280 nm, temperatura a 30C e fase mvel: oxalato d

amnio 0,09 M: dimetilformamida: fosfato dibsico de amnio 0,18 M

(63,9:32:47)

TABELA 40 Mdias das anlises cromatogrfica e microbiolgica por laborat

empregando os dados de teor por cpsula. Os resultados individ

foram centrados na mdia de cada Laboratriollote/data

Laboratrio

Ensaio

Mdia do
teor

DP

Minimo

Mximo

B
B
C
C

Cromatogrtico
Microbiolgico
Cromatogrfico
Microbiolgico
Cromatogrfico
Microbiolgico
Cromatogrfico
Microbiolgico
Cromatogrfico
Microbiolgico
Cromatogrfico
Microbiolgico
Cromatogrfico
Microbiolgico
Cromatogrfico
Microbiolgico
Cromatogrfico
Microbiolgico
Cromatogrfico
Microbiolgico
Cromatogrtico
Microbiolgico

60
14
34
19
40
30
53
20
8
4
54
13
71
26
53
12
23
3
45
36
78
14

535,6
592,8
513,1
544,9
337,9
390,4
492,4
551,9
515,1
548,9
521,2
560,7
520,4
573,0
504,7
563,7
466,5
516,4
499,5
566,0
504,5
554,7

12,7
23,6
21,6
25,7
89,7
122,5
17,3
28,6
4,9
9,6
11,7
35,5
12,1
26,1
11,5
33,8
10,1
0,0
16,8
33,1
24,0
21,8

507,7
558,8
486,2
474,2
237,1
264,6
468,3
503,5
508,4
538,4
503,7
506,8
495,9
528,0
487,6
532,4
445,0
516,4
470,6
519,5
451,4
510,9

549,5
637,1
558,4
574,6
472,6
555,2
523,1
592,6
519,5
560,4
538,6
642,1
552,9
624,9
527,0
646,2
479,9
516,4
530,1
651,9
548,0
586,9

O
O

E
E
F
F
G
G

H
H
I
I
J
J
K
K
L
L

n = Nmero de rplicas do ensaio

DP = Desvio padro

U 25

"3

li)

a.

'CU

.Q

20

15

o
o

10

'lU

tU

C)

lo::

C,
o
E

~
li)

'S:

rr....l ..1..

....................................+

................................+

-5
-10
-15

li)
Q)

o -20

~:::::r:::~~::r::::::::F::~:F::::::T:::::~::

-25
B

laboratriolLotelData

FIGURA 22

Ilustrao da variabilidade da anlise por laboratrio, lote e

data a partir dos dados da Tabela 40

o
-30

-20

-10

10

20

Desvios Anlise cromatogrfico

Figura 23

Histograma dos erros de anlise

A partir da variabilidade interna para as combinaes laboratriollote/da

foi estimada a preciso da anlise. O desvio padro estimado foi de 4,

mg/cpsula.
Na Figura 24 ilustrou-se o efeito que os erros da anlise podem produzir

avaliar um lote como conforme ou no conforme. Neste caso, apresentou-se um

situao com limites de especificao simtricos em torno do valor mdio

especificao. No presente estudo os limites de especificao so de 450 a 6

mg/cpsula. Na Figura 25 foram calculadas as probabilidades de:
1.

aceitar um produto no conforme e a relao aJap para distint

posicionamentos dos limites de especificao, corrigidos pelo erro da anlise

2. rejeitar um produto conforme e a relao aa/ap para distintos posicionament

dos limites de especificao corrigidos pelo erro da anlise.

LEi LECi

=
=

LEi Limite inferior de especificao

LEs Limite superior de especificao

FIGURA 24

LECs LEs

LECi
LECs

=Limite inferior de especificao corrigido

=Limite superior de especificao corrigido

O erro da anlise nos extremos do limite de especifica

segundo a distribuio normal

0.16% I

, : : :

I 24%

0.14%

21%

ars.

18%

Q; ~ 0.12%

.... It=

.( '

E
;:,
"-

cu
.~
~

~ 0.10%

I-=---- 15%

Q) (J)
"OQ)

~ ~ 0.08%

zr;:..

,=

120/0

cu cu

"O

.- "o
:3
~ 0.06%

9%

cu~
.o
;:,

Q)

Q) c:
"O o
Q) o
"O o
cu ....
"O "O
;:,
._

==
.o o"-

cu c.

~ ~ 0.04%

.i,/Z ~

ny
:s'!!fl!.:litf

c.

?"T
6%
""

~~~~~3%

0.02%

=Z~~.....,..---~

0.00%
0.0

FIGURA 25

.o

a..

0%

1.0

Ilustrao dos erros cometidos ao aprovar um lote em

decorrncia do erro analtico

Na mesma figura, cra representa o desvio padro da anlise e crp represen

o desvio padro do processo produtivo (um sexto da largura da especificao

Exemplifica-se situao em que o valor estimado de cralcrp foi de 4/[(625-450)/6

acU\d ade

1SL10 TECA ~ .
~ "C;-'" f " ;- Cllut
de ,...
.. It,,,
,,",v
"

'versidade 1"

S- PaU\o
ao

I ~~~f~~~~~~~~~~I~I~~~~-l~
8
Ii=

'~
O>

10

50

+- Alvo

+-

45

LEi

40

J ~~~~~~~f~~~~~~J[~~~-~-~~~~I~~~f~~~~~~~~~~~
200

Laboratrio/Lote/Data

=
=
=

LEs Limite superior da especificao

Alvo Valor mdio
LEi Limite inferior da especificao

FIGURA 26

Resultados individuais cromatogrficos por laboratrio

Na

27

Figura

foram

representados

os

resultados

das

anlis

cromatogrficas e microbiolgicas, e na Figura 28 diagramas de disperso d

resultados

cromatogrficos

microbiolgicos,

representando

os

valo

individuais por cada combinao Laboratrio/Lote/Data, e tambm as mdias

cada combinao. Nos grficos das Figuras 27 e 28 observa-se que os valo

obtidos pelo mtodo microbiolgico foram superiores aos obtidos pelo mto

cromatogrfico. A mdia da anlise microbiolgica foi de 537,8 mg/cpsula con

497, 1 mg/cpsula para a anlise cromatogrfica.

Para quantificar a importncia da correlao entre as mdias das anlis

microbiolgicas e cromatogrficas foi calculado o coeficiente de correlao
Pearson, o qual foi elevado e significativo: 0,9491 (p < 0,001

Tambm foi feito um teste t de Student de amostras dependentes p

verificar se a diferena mdia entre os mtodos microbiolgico e cromatogrf

:5
(/)
o-

-tU
(,)

>

450

-S

o
C1>

r-

Laboratrio/Lote/Data

FIGURA 27

Resultados cromatogrficos e microbiolgicos

As Figuras 27, 28 e 29 so representaes grficas dos resultados

ensaio cromatogrfico comparado com o microbiolgico.

200 ,
200

~
I

~
I

~
I

300

400

500

600

700

Teor cromatogrfico (mglcpsula)

700

!__Tr:~T
i

;m

500

~L

.L

]i

eo

400

CD

.!!!

:(ij
l::

'
'G)
~

300
200

,~~.~~I~~:~r~:.

200

300

400

500

600

700

Mdias Anlise Cromatogrfico (mgIcpsula)

FIGURA 28 Relao entre os resultados cromatogrficos e microbiolgic

Para avaliar as diferenas entre os laboratrios foi estimada a proporo

resultados fugindo especificao para amostras de cada laboratrio. Na Tab

41, encontra-se a porcentagem de resultados abaixo do limite inferior para os d

mtodos, e a porcentagem de resultados fora de especificao para o mto

microbiolgico. O mtodo cromatogrfico no apresentou resultados acima
limite

F
G
H
I

O
O
O
O

J
K
L

8
54
71
53
23
45
78

0,0
0,0
0,0
0,0
4,4
0,0
0,0

O
O
Anlise microbiolgica: abaixo do limite inferior

Laboratrio

Pontos abaixo

0,4

B
C
O
E
F
G
H
I

O
O

14
19
30
20
4
13

0,0
0,0
60,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0

18

O
O
O
O
O
O
J
K
O
O
L
Anlise microbiolgica: acima
Laboratrio
Pontos acima
1
B
C
O
O
O
O
E
F
O
G
1
H
O

26

12
3
36

14
do limite superior
n

14
19
30
20
4
13
26
12
3

K
L

36

14

0,4

7,14
0,00
0,00
0,00
0,00
7,69
0,00
8,33
0,00
5,56
0,00

 Microbiolgico (Li)

i;::::

.~

Q.

70%

Microbiolgico (Ls)

(/)

Q)

...

60%

40%

(/)

Q)

"O

.2

50%

30%

(/)

Q)

.~

20%

;(ij

o~

10%
0%
B

Laboratrios

Limite inferior: 450 mg/cpsula

FIGURA 29

Limite superior: 625 mg/cpsula

Porcentagens de anlises fora dos limites de especificao corrigid

pelo erro analtico

Na Figura 29 as porcentagens de resultados de teor obtidas do en

individual das amostras de cada laboratrio, com limite fora de especificao p

os mtodos cromatogrfico e microbiolgico foram representadas por mero

histograma.

o"ssn~sla

161

qualidade do produto somente possvel atravs da implantao de um a

programa de garantia de qualidade, objetivando um produto que contemp

exigncias do consumidor final.
Esta preocupao com a qualidade deve ser de responsabilidade de

os segmentos da empresa e faz parte dos princpios gerais do contro

/

qualidade total. As falhas no sistema de qualidade no setor de produo

controle de qualidade farmacutico podem representar srios riscos sad

usurios e por outro lado, perdas irreparveis, confiabilidade abalada e pr

financeiro. Todos os setores da empresa influem efetivamente na qualidade

do produto propriamente dito, dos aspectos ticos, de suporte tcn

atendimento a ele vinculado.

No setor produtivo e de controle de qualidade, procedimentos de valid

so

fundamentais,

devendo

ser

implantados

de

maneira

planejad

documentada. Tambm os procedimentos de operao devem ser padroniz

com a finalidade de obter produtos de acordo com as especifica

determinadas durante o desenvolvimento.

A discordncia dos resultados obtidos em relao s especific

significa falha em alguma etapa da cadeia do processo produtivo, merec

localizao do erro e imediato acionamento de procedimentos corretivos,
como referncia a documentao do produto.

Apesar da Lei n 6.360 133 , de 23 de setembro de 1976, que dispe so

vigilncia a que ficam sujeitos os medicamentos, os frmacos, os ins

farmacuticos e correlatos, cosmticos, saneantes e outros produtos, pub

farmacuticos pela Lei nO 9787 de 10 de fevereiro de 1999133 e regulamen

pela Lei nO 391 de 10 de agosto de 19991aJ.

Dentre as publicaes mais recentes que regulamentam a produ

controle de qualidade de produtos farmacuticos, merece meno a Por

nO 16167 do Ministrio da Sade, publicada no Dirio Oficial em 06 de mar

1995, onde constam as normas de Boas Prticas de Fabricao (BPF). Apesa

/jmpacto que causou, as mais grotescas fraudes na rea farmacutica fo

posteriores a ela, confirmando falha no sistema vigente.

Segundo WILLlG e STOKER215 as normas de BPF no so esttica

que exige da empresa no somente implantar as normas em vigor, mas e

atenta a inovaes que possam colaborar para a melhoria da qualidade.

medicamento produzido de acordo com as normas de BPF deve apresentar to

as caractersticas inerentes a um produto seguro e com eficcia teraputica.

As normas de BPF contemplam os distintos grupos de produtos, faze

distino entre aqueles destinados a administrao parenteral e oral, entre ou

particularidades. Os produtos orais, como o caso das cpsulas, tm para

fabricao exigncias compatveis com o risco que representam, seja no asp

clnico ou de estabilidade do produto, abrangendo aspectos de contamina

cruzada, microbiana e de condicionamento ambiental.

A produo de cpsulas envolve procedimento relativamente simple

enchimento do corpo destas com o medicamento pulverizado e posterior enc

da parte complementar. So encontradas no comrcio cpsulas de tetraci

fornecidas por vrios laboratrios produtores, sendo mais comumente encont

o c1oridrato de tetraciclina.

Outras observaes foram de cpsulas sem brilho e presena do corante

embalagem impregnado na superfcie das mesmas, indicando umidade rela

inadequada. Segundo DIGENIS e colaboradores 47 a cpsula produzida

umidade de 13 a 16 %. Quando a umidade menor que 13 % a cpsula pod

desintegrar com o manuseio. Se superior a 18 % pode ocorrer o amolecimen

deformao, que podem alterar o tamanho da cpsula e causar problemas

processo de enchimento automtico. Evidncia na falha do processo

enchimento foi constatada pela presena de cpsulas abertas, quebradas e

completamente encaixadas. Como conseqncia da alta umidade DlGENI

colaboradores 47 citaram que a umidade do contedo da cpsula deve

controlada para evitar a ao da umidade na sua parede. As farmacop

recomendam que o medicamento contido na cpsula no deve causar

deteriorao58 ou apresentar incompatibilidade2B 88 .163 com a mesma e que d

ser vulnervel ao fluido digestivo para que seu contedo seja liberado

Segundo DIGENIS e colaboradores 47 , condies de umidade, tempera

elevada e algumas substncias podem ocasionar ligaes cruzadas na estru

molecular da gelatina alterando propriedades fsico-qumicas, podendo prov

considervel modificao no perfil de dissoluo. As farmacopias recomen

que as cpsulas sejam estocadas em recipientes hermeticamente fechados

temperatura abaixo de 30 C58 88 , protegidos da luz, da umidade excessiva, e

condies de ambiente por demais seco88 .

O processo de produo tambm pode ser avaliado atravs da observa

da Tabala 5, que descreve material no homogneo contido nas cpsulas, se

que unidades do mesmo lote e de diferentes lotes de um mesmo labora

apresentaram variao na tonalidade da cor amarela.

de 100 unidades. Considerando que o consumo por paciente deste medicam

para tratamento teraputico inferior a 100 cpsulas, tambm nas embala

primrias devem estar impressas informaes que incluem o nome do pro

identificao e teor dos princpios ativos, o nmero de cpsulas, data de prod

e prazo de validade, condies de armazenamento e manipulao, no

endereo do produtor100,167. Na amostragem efetuada, foram encontradas

amostras produzidas por cinco laboratrios sem informaes quanto ao n

do lote e prazo de validade. Este fato impede o rastreamento de amostras

apresentam problemas, detectados aps a liberao do produto no mercado.

a aplicao das exigncias descritas na Portaria 2.814 no seu artigo 5, data

29 de maio de1998168 em relao notificao de produtos falsificados ou

suspeita de falsificao, deve haver no produto a indicao do nmero de

para possibilitar tambm a apreenso do produto e orientao aos pos

usurios no sentido de interrupo do seu uso, seguido de acompanham

mdico. Foi observada, em um lote, rebarba no blister de alumnio represen

risco de corte durante o manuseio. Tanto o material de embalagem como o

devem estar de acordo com as especificaes de qualidade para s

aprovados e liberados215.

No que se refere a produto medicamentoso contido nas cpsulas, as

fundamental diz respeito ao peso mdio, tendo sido portanto incluso no pre
trabalho sua determinao. O peso mdio das amostras foi obtido

determinao do peso individual de cada unidade, e os valores foram compa

com a mdia. A porcentagem de unidades foi considerada fora do limi

variao, quando diferindo da recomendao da Farmacopia Brasileira62 em

homogeneidade de contedo de p nas amostras.

Na monografia da Farmacopia Americana XXIII 2CIl, enquanto p

cpsulas recomendado o ensaio da uniformidade de contedo,

comprimidos de hiclato de doxiciclina preconizada a determinao da varia

de peso. Estes testes no esto descritos nas monografias da Farmacop

Britnica:D. As empresas A e L produziram cpsulas com quantidade

excipiente superior em relao aos demais laboratrios, seguindo procedime

adequado para preencher todo o espao interno da cpsula. Dentre as amostr

duas apresentaram peso mdio menor que o contedo declarado de 500 mg

princpio ativo, sendo o tamanho das cpsulas igual as outras amostras, deixan

espao vazio que com maior probabilidade promove degradao do princ

ativo.
No Quadro 1, esto listados 23 laboratrios produtores de cpsulas

cloridrato de tetraciclina-500 mg, relacionados no DEF4S. Os produtos constitue

se em especialidades farmacuticas similares e portanto intercambiveis,

apresentarem o mesmo princpio ativo, na mesma concentrao e na mes

forma farmacutica. O teste de desintegrao foi empregado at o final dos an

60 como mtodo oficial para determinar e estudar o perfil de dissoluo
princpio ativo, que tende a aumentar quando a superfcie da rea exposta

grnulos aumenta. Mas, CHOWDARY e RAJYALASHMI37 mostraram que par

ao teraputica esperada do medicamento, imprescindvel a dissoluo

princpio ativo no local de absoro e em quantidade adequada para se ating

nvel plasmtico desejado aps a absoro. A dissoluo avaliada por mto

in vitro, descrito conforme as farmacopias:D,2CIl, sendo teste exigido p

tetraciclina apresentando teor individual e mdia dos teores muito abaixo

especificado (Tabelas 8 e 9), que de no mnimo 80 % (Q) do teor declarado

rtulo. Os valores de ambos foram 43,9 e 57,S %, respectivamente para os lote

e 3 do laboratrio D. Todos os valores individuais de teor estavam abaixo do v

de Q. Nas tabelas citadas inicialmente, observamos que para o lote 2 de drg

de cloridrato de doxiciclina, lotes 1 e 2 de cpsula do laboratrio B e o lote 2

cpsulas do laboratrio C, foram requeridos restestes. Para a interpretao

resultados do teste e reteste, quando o teor encontrado foi menor que o valo

empregaram-se as tabelas de aceitao/rejeio que constam na Farmaco

Americana 208 (Tabelas 10, 11 e 12). Particularmente, a restrita quantidade

amostra do laboratrio C no permitiu o reteste, que foi possvel para as ou

trs amostras,

conduzindo

a aprovao.

As

duas amostras

reprova

apresentaram coeficiente de variao em relao aos teores em valores prxi

de 4,0 %, contrastando com aquelas retestadas, em que o coeficiente de varia

foi maior (14,2 %) tendo os teores variando de 75,9 a 115,4 % para o lote 2

laboratrio B. Outros nove lotes, embora aprovados para o teste de dissolu

tambm apresentaram coeficiente de variao superior a 5 %. A metodologia

Farmacopia Americana208 exige que o teor encontrado e a mdia se

superiores ao valor de Q, mas no impe limite de variao dos resultados.

relao s amostras de drgea de cloridrato de doxiciclina, o lote 2 apresen

uma unidade com teor inferior a 85 % no teste, sendo portanto realizado o ret

com mais seis unidades. A mdia dos valores de teor obtidos das 12 unida
testadas foi de 93,2 % como apresentado na Tabela 8. Sendo que nenhuma

unidades apresentou o valor de teor inferior a 70 %, de acordo com

especificao colocada na Tabela 12, a amostra foi aprovada. A metodologia

superior em gua destilada quando comparada com meio contendo

clordrico, foi empregado neste trabalho, o cido clordrico 0,1 N como meio
dissoluo por se tratar de uma preparao na forma de drgea. Contudo,

isto foi realizado um teste preliminar objetivando verificar a dissoluo do pa

de cloridrato de doxiciclina em cido clordrico 0,1 N. Na quantidade empreg

para este ensaio ocorreu a dissoluo rpida deste frmaco no meio cido. D

se considerar que mesmo sendo menos solvel em meio cido, seu emp

justifica-se pois nas condies ambiente da drgea no organismo ser

concentrao elevada do cido clordrico.

Tendo em vista a necessidade da biodisponibilidade do antibitico pa

eficcia do tratamento teraputico,

garantido pela manuteno do n

plasmtico, o perfil de dissoluo do princpio ativo deve ser relativam

homogneo, objetivando a liberao e absoro em quantidade e no te

adequados. A preocupao quanto a falsos resultados do teste de dissolu

levou ao acompanhamento sistemtico dos ensaios com um branco, anula

assim a interferncia do corante da cpsula gelatinosa na determinao

absorbncia da amostra. Algumas amostras apresentaram diferencial de 3,3 %

transmitncia devido ao corante, e embora para outras no houvesse qual

interferncia, foi possvel constatar o risco de diferena significativa

resultados. GOODHART e colaboradores84 realizaram o ensaio de dissolu

preparaes farmacuticas empregando uma matriz, que foi testada nas mes

condies das amostras, e que foram empregadas, como neste trabalho, ape

para correo dos valores da leitura espectrofotomtrica da amostra. Em rela

ao c1oridrato de doxiciclina, as Farmacopias Americana 208 e Britnica30
descrevem metodologia para o teste de dissoluo de drgeas da mesma.

tendo funo semelhante de uma ncora. MATOS e colaboradore

empregaram espirais de prata no ensaio de dissoluo de cpsulas de doxicidi

Neste trabalho, optou-se pela no adoo deste procedimento, pois segun

WHITEYe MAINVILLE217 a flutuao das cpsulas ocorre por breve perodo

tempo, de 2 a 5 minutos, sendo que se dissolvem aps cerca de 5 minu

liberando o seu contedo. Portanto, estes autores no recomendam procedime

para evitar a flutuao, como o uso de ncoras, nas quais as cpsulas de gela

podem ser aderidas, ocasionando o contato irregular das cpsulas com o meio

dissoluo, e introduzindo variveis no reprodutveis no ensaio. L1N

colaboradores 156 e PERNAROWSKI e colaboradores 161 sugeriram o aparelho

dissoluo com cesto para evitar a flutuao das cpsulas, e para minimizar a
aderncia na cuba, p e haste de agitao.

A importncia da avaliao da biodisponibilidade de uma prepara

farmacutica foi destacada por STEINBACK e STRITTMATER I94 , pois os auto

propuseram condicionar a aprovao das amostras apresentao de teor den

do limite especificado, com os critrios de biodisponibilidade obedecidos.

Para a anlise de antibiticos, alm dos mtodos fsico-qumicos descr

nas monografias das farmacopias mais recentes, os mtodos microbiolgi

permanecem como recomendao. Encontram-se descritos na forma de mto

gerais, sendo eletivos nos casos decisivos de avaliao de um produto quant

potncia, devido sua maior sensibilidade para os diferentes grupos

antibiticos e por representarem a atividade antimicrobiana. Embora os mto

microbiolgicos sejam oficiais, apresentam desvantagem pois so dispendioso

demorados, alm de possuir menor preciso e freqentemente menor exati

assegurar quanto a adoo de mtodos sensveis e especficos para detecta

tetraciclinas a baixos nveis de concentrao, considerou-se fundamental in

neste estudo a determinao da potncia do antibitico atravs de en

microbiolgico turbidimtrico. Procedeu-se conforme mtodo recomendado

Farmacopia Americana208 , empregando como reagente biolgico

Staphylococcus aureus ATCC 29737. Nas Tabelas 24, 25 e 26, esto coloca
os valores de potncia em miligramas, obtidos por cpsula ou drgea.

A exce

de duas amostras, todos os resultados foram concordantes com a especifica

estabelecida pela Farmacopia Americana208 , que exige teor de 90 a 125 %

relao ao valor declarado no rtulo, ou seja de 450 a 625 mglcpsula

cloridrato de tetraciclina, de 90 a 120 % ou 450 a 600 mglcpsula de cloridrato

oxitetraciclina e 90 a 120 % ou 90 a 120 mg/drgea de cloridrato de doxicic

As duas amostras em desacordo com a especificao foram obtidas dos lotes

3 de c1oridrato de tetraciclina da O, cujos resultados foram 55,5 e 68,7

respectivamente. A porcentagem de amostras fora do limite definido de pot

foi de 5,3 %, em relao ao total analisado.

laboratrio de controle de qualidade tem como um dos princi

objetivos a obteno de resultados analticos exatos e confiveis atravs

mtodos de ensaio que atendam finalidade proposta. Deseja-se qu

metodologia analtica apresente, alm da eficcia, uma boa relao cu

benefcio, que seja inclusa dentre os procedimentos do sistema de qualid

devidamente documentada21~. ainda desejvel que permita a compatibiliza

tcnica para a obteno rpida dos resultados.

constantemente desenvolvidos. A escolha de um mtodo de anlise leva

considerao a capacidade operacional do laboratrio, que tambm tende a m

satisfao, vencendo limitaes tcnico-operacionais e incorporando m

rapidez na obteno do resultado. Isto pode ser observado nas farmacopi

compndios oficiais:l),38.28 mais recentes que a cada nova edio vm substitu

mtodos convencionais por outros, empregando cromatografia lquida de
eficincia (CLAE).

A CLAE, alm da rapidez na execuo, apresenta atributos indispens

como sensibilidade, especificidade, exatido e preciso, que tomam o
emprego vantajoso em relao a outras metodologias.
As Farmacopias Arnericana20s e BritnicaJO adotaram a CLAE de

reversa para a determinao quantitativa da tetraciclina. A Farmaco

Americana20S recomenda o emprego de coluna de octilsilano (Ca) e a Britnic

coluna de octadecisilano (C1a), sempre ligadas quimicamente ligadas s partc

de slica. Na literatura, ambas as colunas so empregadas para a dosagem

tetracidina, no entanto, HEYDEN e colaboradores99 constataram o me

desempenho da coluna Ca na etapa de separao.
Para a escolha do mtodo a ser empregado neste trabalho,

comparao entre os dois mtodos foi realizada sob as condies anal

estabelecidas nos mtodos oficiais, atravs da injeo de solues-teste
substncias

padro

de

c1oridrato

de

tetraciclina

cloridrato

4-epianidrotetracidina. No mtodo da Farmacopia BritnicaJO a passagem

I

fase mvel constituda de dimetilformamida, acetonitrila e cido oxlico 0,1 M

coluna C18 empregada, foi a uma velocidade de 1,5 mUminuto. A press

sistema, de cerca de 2282 psi, no se constituiu em fator de risco para perd

recomendadas provocou o aumento da presso ultrapassando 4000 p

presso mxima aplicada coluna para a manuteno da sua integridade. S

assim, testes de adequao do sistema cromatogrfico foram necessrios p

aplicao desta metodologia. De incio foi determinada a presso correspond

cada velocidade de fluxo da fase mvel. A presso mxima foi ating

1,6 mUminuto (Tabela 13). A vida til da coluna, entre outros fatore

infuenciada pela presso aplicada no material de empacotamento. Port

presso menor aumenta o tempo de uso da coluna. No entanto, por

diretamente relacionada com a velocidade de fluxo, mantendo outras cond

constantes, uma velocidade de fluxo menor corresponde a uma presso me

pode interferir no tempo de reteno de uma substncia. Para verificar

interferncia, os tempos de reteno para a eluio da tetraciclina com flux

0,8, 1,0 e 1,2 mUminuto foram determinados, sendo os resultados apresen

na Tabela 14. A presso registrada para cada velocidade de fluxo da fase m

foi reproduzida em relao ao teste anterior (Tabela 13). A mdia do temp

reteno para a maior velocidade de fluxo testada, 1,2 mUminuto, fo

7,8 minutos e para a menor velocidade, 13,1 minutos. Considerando q

presso adequada para a coluna e o tempo de reteno menor, foi verif

a vantagem da diminuio da velocidade de fluxo de 2 mUminuto

1,2 mUminuto. Para o tempo de reteno maior, a desvantagem consis

dispndio maior de tempo de anlise. L1NDAUER e colaboradores 137 verific

que para velocidade de fluxo diferentes, mas mantidas constantes, foram ob

determinaes exatas. Ainda, os autores verificaram que a diminui

velocidade da fase mvel de 1,12 para 0,35 mUminuto provocou um aumen

eficincia para a 4-epianidrotetraciclina de 37 para 87, quando empreg

orgnica. Contudo, a concentrao dos sais na fase mvel elevada, o

provoca a elevada presso no sistema. Fase mvel modificada com a diminu

da proporo dos sais foi empregada. A fase orgnica, dimetilformamida,

mantida constante e os resultados mostraram tempo de reteno menor pa

fase mvel quando o sal foi reduzido em 10 % (Tabela 15). A menor concentra

o sal na fase mvel permite prolongar a vida til da coluna 11 e minimiz

possibilidade do seu entupimento e de perda da pedra de safira, de c

elevado, que integra o dispositivo para o controle do bombeamento da fase m

no cromatgrafo. Ao aumentar a proporo de dimetilformamida na fase mve

fase mvel VI apresentada na Tabela 16, com volume adicionado de 50
precipitou temperatura ambiente, pela diminuio da fase aquosa, meio em

os sais so solveis. Este aumento da fase orgnica, menos polar que a

resultou na diminuio do tempo de reteno que tambm foi proporciona

volume de dimetilformamida adicionado, quando comparado as fases com 1

25 mL de dimetilformamida, como pode ser observado na Tabela 16. Resul

semelhante foi obtido por TSUJI e ROBERTSON 196 quando estudaram

influncia da concentrao de metanol na fase mvel aquosa. O tempo

reteno do pico da tetraciclina foi de 9,7 minutos com a fase mvel contendo
de metanol, de 6,2 minutos com concentrao de 10 % e de 5,1 minutos

13 %, empregando fluxo constante. Aps este estudo, a fase mvel foi defi

com modificao na proporo da fase aquosa e orgnica e na concentrao

sal.

Como foi

observado

no estudo anterior,

aumento do

volume

dimetilformamida de 50 mL na fase mvel resultou em formao de precipit

enquanto que quando a concentrao dos sais das solues de oxalato

amnio e fosfato dibsico de amnio foi diminuda proporcionalmente, tal fato

ocorreu. Analisando os resultados, possvel observar que a fase m

substncias testadas pelo mtodo da Farmacopia Americana 20s , modificado.

tempos de reteno para o c1oridrato de tetraciclina e o c1oridrato

4-epianidrotetraciclina foram de 9,0 e 5,3 minutos e de 22,6 e 12,8 minu

respectivamente para o mtodo modificado da Farmacopia Americana2

BritnicaJo . Na escolha do mtodo deve ser considerada a rapidez na obten

dos resultados, baseada na eluio mais rpida. Neste sentido, o m

modificado da Farmacopia Americana mostrou-se favorvel. Na comparao

perfil da curva, deve ser considerada segundo BOURQUIN 20 a forma gauss

da curva para obter maior preciso e reprodutibilidade no ensaio. Neste estu

os picos do cromatograma obtido atravs do mtodo da Farmacopia Britn

mostraram alargamento da base do pico para o c1oridrato de tetraciclin

assimetria acentuada do pico do c1oridrato de 4-epianidrotetraciclina. O f

capacidade calculado de 10,5 para o cloridrato de 4-epianidrotetraciclina

muito elevado,

caracterizando

um ensaio demorado.

A otimizao

condies cromatogrficas incluiu o estudo da modificao da concentrao

componentes

na

fase

mvel,

pH
JO

metodologia da Farmacopia Britnica

temperatura

da

coluna.

empregando fase mvel composta

modificadores orgnicos, dimetilformamida e acetonitrila, pode ser alterada p

obter condies do sistema cromatogrfico mais adequadas.
Nas colunas cromatogrficas de slica, como na coluna

~-Bonda

empacotada com octadecilsilano, empregada na metodologia da Farmaco

BritnicaJO , os grupos silanis esto presentes e mesmo que em peque

quantidades, adsorvem a tetraciclina no lugar da gua causando o alargam

do pico. Tais agrupamentos podem ser eliminados atravs de reaes

tetraciclina em soluo, se epimeriza para 4-epitetraciclina. Portanto, no m

da Farmacopia Britnica29 a epimerizao pode ocorrer durante o ensaio, de

ao pH da fase mvel de 3,9. A reao reversvel a valor de pH elevado, p

em pH baixo, alm da epimerizao, ocorre a desidratao da tetracicli

4-epitetraciclina.

Os mtodos oficiais descritos nas farmacopias e compndios oficiais

elaborados atravs de estudo colaborativo que inclui avaliao rigorosa de t

os parmetros que possam influenciar os resultados do teste. Mesmo adotan

metodologia oficial, existe a necessidade de alteraes para obteno

mtodos confiveis, o que ocorre devido s diferentes condies do en

Segundo as normas de Boas Prticas de laboratri021S , regulamentadas

FDA, qualquer alterao na metodologia analtica exige que uma revalidao

efetuada. No entanto, alguns trabalhos publicadoSllO.llS.116 colocam em discuss

questo da necessidade de validao, e em que casos uma adequa

mtodo aceitvel. Desta forma, o primeiro parmetro estudado foi a lineari

da resposta em relao concentrao. A curva de calibrao do cloridra

tetraciclina foi construda apresentando linearidade na faixa estudada de 0

500 J,lg/ml com coeficiente de correlao (R) de 0,9999, que pode ser obser

na Figura 6. Mesmo a concentrao de 0,5 J,lgfml, o coeficiente de variao f

1,3 % para 5 rplicas de resultados de fator de anlise (Tabela 18), sendo q

Farmacopia Japonesa ll3 recomenda coeficiente de variao de no mximo
para determinao do limite de quantificao. O coeficiente de variao

todos os resultados para diferentes concentraes foi de 3,9 %, confirman

caracterstica de repetibilidade do mtodo empregado, ou seja, a preciso.

emprego de solues-teste adicionais em diferentes concentraes, possibilita

a obteno de resultados mais precisos, sem dispndio adicional de tempo pa

realizao dos clculos. Desta maneira, foi analisada a variao dos resulta

atravs do coeficiente de variao para ensaios empregando diferentes nme

de solues-teste do padro e amostra. Ao determinar o teor de cloridrato

tetraciclina em uma amostra empregando duas solues-teste da mesma, de 2

100

~glmL,

e curva padro nas concentraes de 10 a 500

~glmL,

o coeficie

de variao obtido foi de 1,1 % para todas as 10 rplicas, como pode

observado na Tabela 20, evidenciando a preciso da metodologia.

Comparando os resultados provenientes de cada soluo-teste da amo

obtida com a mesma curva de calibrao, tendo como referncia o coeficiente

variao que foi de 0,5 % e 0,1 %, respectivamente para as solues com 2

100

~g/mL,

a reprodutibilidade de resposta para cada concentrao

satisfatria, resultando em pequena variao do teor encontrado (Tabela

Diminuindo o nmero de concentraes testadas de amostra e padro fo

estudadas as variaes nos resultados. Uma nica soluo-amostra com

concentrao de 50

~g/mL

foi testada frente a trs grupos de soluo-padro.

primeiro grupo, a soluo-padro empregada foi somente a de 25

segundo, as solues de 25 e 50
100

~glmL.

~g/mL

~glmL,

e no terceiro, as solues de 25, 5

Os coeficientes de variao de cada um dos ensaios foram m

baixos, e todos semelhantes entre si, como pode ser observado na Tabela 21

considerar o conjunto de resposta, o coeficiente de variao foi de 1,0

mostrando portanto a preciso dos ensaios nas condies testadas. Prossegu

as determinaes, as solues-teste empregadas foram as mesmas, de 5

Farmacopia

Americana208

recomenda

concentrao

10

vezes

supe

(500 llglmL), esta soluo-teste adequada, pois a saturao da coluna toma

mais lenta, prolongando sua vida til.
EKSBORG e EKQVIST53 investigaram os materiais de enchimento

colunas com o mesmo comprimento da cadeia alqulica, porm de difere

fornecedores. Diferena significativa na reteno foi observada. Em outro estu

IRVERSEN e colaboradores llo , constataram diferenas no desempenho

mesma coluna ciano de diferentes nmeros de lote e mesmo fornecedor

ensaio de oxitetraciclina. Mas nas condies timas, resultados satisfat

foram

facilmente

colaboradores

49

obtidos,

pela

mudana

na

fase

mvel.

DIHUIDI

empregando trs diferentes colunas de PRP-1 para o ensaio

doxiciclina, obtiveram separaes comparveis, com coeficiente de variao e

os resultados menor que 1 %. Com a finalidade de verificar a reprodutibilidade

mtodo cromatogrfico estabelecido, foi realizado um estudo comparativo e

os resultados cromatogrficos de fator de anlise, obtidos empregando colu

com o mesmo material de empacotamento e provenientes do mesmo fornece

SYMMETRY"', mas com nmero de lote diferentes. O coeficiente de variao

de 2,9 %, para todos os resultados obtidos a partir das 3 colunas (Tabela

Para este fator de variao, o mtodo mostrou ser reprodutvel. Segundo aut

citados 110, um dos fatores para o aparecimento de picos com formao de ca

(tai/ing) est relacionado com a formao de quelatos por complexao

tetraciclinas com ons metlicos, que ficam adsorvidos nas colunas de

reversa ligadas a cadeias alqulicas, como o octilsilano, empregado n

trabalho. Porm, a formao deste tai/ing foi evitada por meio do emprego de

abaixo do valor especificado na Farmacopia Japonesa ll3 .

Na determinao do limite de deteco os resultados foram semelha

para a tetraciclina e 4-epianidrotetraciclina. O limite de deteco encontrado

as tetraciclinas, por vrios autores1 04, 110,123,137, 197,212 est prximo de 4 a 12

sendo a razo pico/rudo entre 2 e 3. O limite de deteco determinadas par

duas substncias neste trabalho foi de 0,2 ng, que indicou uma gra
sensibilidade do mtodo empregado.

A Figura 11 mostra a sobreposio dos cromatogramas corresponde

s solues de 0,01 e 0,005 Ilg/mL de cloridrato de 4-epianidrotetraciclina. O

da concentrao maior aparece de forma discreta no tempo de reteno

5,0 minutos, enquanto que para a concentrao de 0,005 llg/mL no h evid

de pico. Com maior atenuao dos picos, e considerando a sobreposio dos

picos anteriores, mostrados na Figura 12, pode-se observar a presena

cromatograma de 0,01 Ilg/mL, de um pico que se diferencia do rudo da linh

base, enquanto que no outro cromatograma, no mesmo tempo de reteno, o
menor que o dobro da altura do rudo.

Empregando solues-teste do padro a 50 e 100 llg/mL e amost

50 llg/mL, a quantificao do cloridrato de tetraciclina e fosfato de tetraclin

efetuada

com

mtodo

cromatogrfico

estabelecido

os

resulta

representados nas Tabelas 25 e 26. Os resultados apresentados na Tabela

indicam duas amostras com teor abaixo do especificado, sendo de 243

317,0 mg/cpsula, respectivamente para os lotes 1 e 3 do laboratrio D. As ou

Tabelas 27 a 31. Para cada amostra foram efetuadas de quatro a seis repeti

do ensaio, em dias diferentes, sendo cinco determinaes para cada ensaio

coeficiente de variao para cada ensaio foi muito baixo, de at 0,6
evidenciando portanto boa preciso. Analisando os resultados obtidos para
mesmo laboratrio, foi possvel constatar a preciso do ensaio, caracterstica

se manteve mesmo quando considerados aqueles obtidos para os diferen

laboratrios produtores.

Outro parmetro importante, a exatido, foi determinada atravs do te

de recuperao aplicado a diferentes amostras. Pelos resultados apresentados

Tabela 32, a quantidade recuperada do padro de cloridrato de tetracic

adicionado foi prxima de 100 % para as trs diferentes quantidades de c1orid

de tetraciclina testadas, sendo o menor valor recuperado de 95,5 % par

amostra 10 e o maior, 102,7 % para a amostra 4. Foi confirmada portanto

exatido do mtodo testado para amostras provenientes de diferentes laborat

produtores. A interferncia de excipientes ou impurezas de sntese ou

degradao no foi significativa para esta metodologia. A sensibilidade do mt

no foi alterada, nas concentraes das solues de recuperao de 80, 10

150 J.1g1mL testadas.

A Farmacopia Americana208 recomenda limite mximo de cloridrato

4-epianidrotetraciclina de 3 %. Neste trabalho, aps verificar o limite

quantificao do cloridrato de 4-epianidrotetraciclina para o mtodo (0,10 J.1g1

a menor concentrao com coeficiente de variao inferior a 10 % (Tabela 23)

realizada a dosagem desta substncia no padro de cloridrato de tetraciclina

potncia 994 J.1g/mg empregado nos ensaios, e nas amostras comerciais. P

determinar a concentrao adequada da soluo-teste do cloridrato de tetracic

determinao quantitativa nas amostras comerciais. O padro primrio

cloridrato de 4-epianidrotetraciclina empregado neste trabalho, adquirido

Farmacopia Americana, apresentou um pico de impureza eluido em cerca

21,5 minutos (Figura 10). A altura deste pico corresponde a apenas cerca

0,03 % da altura do pico da 4-epianidrotetraciclina, mas nas injees sucessi

interfere com o pico principal devido a pela sobreposio. Portanto, durant

ensaio, foi necessrio tempo maior para a eluio deste pico, de forma a elim

sua interferncia. Os valores de teor de c1oridrato de 4- epianidrotetraciclina

padro de cloridrato de tetraciclina esto apresentados na Tabela 33.

porcentagem de teor obtida para a amostra foi de 0,2 % ou 2,3 Ilg/mg

coeficiente de variao para este ensaio foi de 8,0 %, abaixo do recomend

pela Farmacopia Japonesa 113, mostrando a preciso do mtodo para diferen

ensaios, embora o coeficiente de variao para as rplicas de um ensaio fo

maior que 2 %, valor recomendado de coeficiente de variao para rplica

cinco injees do c1oridrato de tetraciclina. O pico de uma substn

desconhecida eluda imediatamente antes foi identificado por HEYDEN

colaboradores99 , como da 4-epitetraciclina, empregando as mesmas condi

cromatogrficas deste trabalho, tambm adaptadas da USP XXIll 20s .

Nas amostras comerciais o c1oridrato de tetraciclina foi deteminado atra

do mesmo procedimento, fornecendo os resultados expressos nas Tabelas 3

35. Todas as amostras apresentaram teor menor que 3 % de cloridrato

4-epianidrotetraciclina, com valores entre 0,1 a 0,8 %. Para os dois lotes

amostras reprovadas quanto ao teor de c1oridrato de tetraciclina, provenientes

fosfato de tetraciclina permaneceu estvel por cerca de 4 anos. Este fato

atribudo presena do fosfato, que catalisa a reao de epimerizao l82. 193

influi favoravelmente na formao de complexos metlicos, ocasionando um

diminuio da tetraciclina disponvel 192. Neste trabalho, os resultados de teor pa

fosfato e cloridrato de tetraciclina no evidenciaram diferena significativa e

relao ao total das amostras.

Seguindo a recomendao da Farmacopia Americana 208 , a resoluo (

entre os picos da tetraciclina e de 4-epianidrotetraciclina foi calculada a partir
uma soluo de resoluo com a mistura dos dois padres, modificando

concentrao, porm mantendo a proporo da concentrao das substncia

Para isto, foi empregado cromatograma obtido desta soluo de resoluo com

representado na Figura 14. O valor mdio da resoluo foi de 3,7 (Tabela 37

Para avaliar o mtodo de determinao da 4-epianidrotetraciclina em relao
desconhecido (1), foram empregados cromatogramas de solues-teste

tetraciclina, sendo os resultados apresentados na Tabela 36. A separao po

ser claramente observada nos cromatogramas, sendo que melhor separa

ocorreu entre a 4-epianidrotetraciclina e a tetraciclina, como pode ser constata

nos cromatogramas respectivos, Figuras 13 e 14. Outro parmetro estudado co

a mesma soluo de resoluo, foi a seletividade do mtodo. A seletivida

apresentou valor mdio de 1,52, mostrando diferena no tempo de eluio ent

tetraciclina e 4-epianidrotetraciclina.

No sistema cromatogrfico adequado, os picos devem apresentar simet

para garantir resultados precisos e minimizar o erro. A assimetria (T) do pico
calculada atravs do cromatograma obtido para a soluo de c1oridrato

disponibilidade tcnica, de material e pessoal, no sendo considerados no estu

de adequao do mtodo. A validao envolve o estudo de reprodutibilidade

robustez do mtodo analtico81.113.208 e permite identificar as fontes de variao.
CARTWRIGTH33
dissoluo in

descreveu um

vitro de preparaes

estudo

colaborativo

do

ensaio

slidas,

empregando

mtodo

Farmacopia Britnica27 em oito diferentes laboratrios. Diferena no perfil

dissoluo das preparaes, encontrada para os diferentes laboratrios,
atribuda a diferenas constatadas no nvel de vibrao das cubas do aparelho

dissoluo. Foi constatado que as discrepncias entre os resultados obtidos n

estavam relacionadas com o produto analisado, mas com o equipamen

empregado em cada laboratrio.

Considerando a grande diversidade

fornecedores de matrias-primas, reagentes, solventes, de equipamentos,

aprimoramento tcnico e pessoal, entre outras fontes de variao, a exigncia

revalidao peridica dos mtodos analticos, fundamental, assim como estud

colaborativos envolvendo vrios laboratrios, para determinar a reprodutibilida

e garantir a confiabilidade das metodologias analticas. A validao, consideran

as exigncias de suporte material, pessoal, de espao fsico e documenta

aumenta o custo analtico em 20 a 25 %. Para o futuro, o processo de valida

deve ser realizado e estratgias devem ser definidas com a finalidade de redu
1S4
os custos, sem no entanto comprometer a qualidade do produto .

Quando ocorrem as modificaes dos mtodos cromatogrficos, os limit

para que estas modificaes no descaracterizem a natureza do mtodo ofic

foram estudados por FURMAN e coJaboradores 80 . Dentre os ajustes possv

esto a troca da coluna para melhorar seu desempenho, a sensibilidade, redu

mvel. Estas alteraes ocorreram respeitando os limites estabelecidos p

autores.

Aspecto prtico a ser considerado consiste no fato de que a co

cromatogrfica, aps sucessivas injees vai se tomando saturada, ou s

degradao

pelo

emprego

de fases muito agressivas

ao material

empacotamento. No sentido de verificar o envelhecimento da coluna aps v

injees de amostra e passagem de grande quantidade de fase mvel, fo

determinados os valores de fator de capacidade (K') e eficincia (N) da coluna

incio e no final do seu uso, aps cerca de 1000 injees de volumes de 20

Pelos resultados da Tabela 39, verifica-se que ocorreu uma perda de eficincia

coluna em cerca de 50 %. A resoluo foi alterada de 3,39 para 2,69 qua

determinada para picos de soluo do padro de 50 Ilg/mL de cloridrato

tetraciclina, e de 3,37 para 2,73 para soluo de 100 IlglmL. No entanto

comparao entre os resultados obtidos para as diferentes concentraes

solues, no incio das injees ou aps vrias injees, no apresenta

diferenas significativas. Para IVERSEN e colaboradores 110, aps 400 injee

amostra de plasma para anlise da oxitetraciclina, a pr-coluna foi saturada

linha de base tomou-se no uniforme. Em relao coluna, mais

3000 injees foram efetuadas sem a mudana nos resultados, sendo o vol
de injeo de 14 Ill, indicando a possibilidade do emprego da coluna.

O programa de Software interligado ao cromatgrafo oferece gra

vantagem, registrando e processando os dados, permitindo o armazenamen

reviso destes quando requerido. O grande nmero de informaes cumulativ

ensaios analisado, proporcionando exatido e rapidez na obteno
BIBlIOT!~.

rlCuldade de Cj~l1c;as ~. ~
Uruysrsidad3 df.

----

...

---=----~

S;~

.-,

PdU

dos

cromatogramas

de

cloridrato

de

tetraciclina

c1oridrato

de

4-epianidrotetraciclina, respectivamente, obtidos de solues de concentrao

crescentes, na razo de 1:2. Pode-se observar a semelhana, o mesmo tempo de

reteno e a proporcionalidade da rea dos picos. Na Figura 17, foram

sobrepostos dois cromatogramas. O primeiro foi obtido da soluo de resoluo

contendo 12,5 Jlg/ml de cloridrato de 4-epianidrotetraciclina (cromatograma com

traado

na

cor

preta).

O outro,

de

uma

soluo

de

c1oridrato

de

4-epianidrotetraciclina, tambm na concentrao de 12,5 Jlg/ml (cromatograma

com traado na cor azul). Observa-se a sobreposio exata dos picos da soluo

de resoluo e do cloridrato de 4-epianidrotetraciclina, que possuem a mesma

concentrao.

Na Figura 18, a sobreposio dos dois cromatogramas permite determina

o pico correspondente ao c1oridrato de 4-epianidrotetraciclina e mostra a

semelhana dos picos desta substncia com o pico da tetraciclina com a mesma

concentrao. Da mesma forma, nas Figuras 19 e 20, pode-se identificar pico da

4-epianidrotetarciclina, presente em pequena concentrao na soluo d

cloridrato de tetraciclina 50 Jlglml, atravs da observao da posio dos picos

apresentando tempo de reteno semelhante. Na Figura 21, mesmo a uma baixa

concentrao do c1oridrato de 4-epianidrotetraciclina,

pode-se verificar o

aparecimento do pico no mesmo tempo de reteno que o pico do c1oridrato d

mesma substncia, presente na soluo desta, quando obtido nas mesma

condies cromatogrficas.
No estudo estatstico,

a preciso dos

mtodos

microbiolgico

cromatogrfico foi calculada atravs da obteno do desvio-padro (Tabela 40)

da anlise foram ilustrados atravs do histograma, observando-se a concentra

dos erros em tomo do zero. Para determinar o efeito do erro da anlise, com

objetivo de determinar a conformidade ou no do lote, as Figuras 24 e 25 for

empregadas. O erro de anlise tambm apresentou limites de especifica

simtricos em tomo desta.

A representao grfica do desvio padro da anlise e do proce

produtivo foi ilustrado na Figura 25, havendo baixa probabilidade em se ace

um produto fora de especificao, o que viria a ter conseqncias graves dev

ao risco do consumidor, e de rejeitar um produto conforme a especificao.

Na Figura 26 foi ilustrado o grfico de controle com os resulta

individuais da determinao do teor pelo mtodo cromatogrfico. Todos

resultados estiveram prximos do valor esperado de 500 mg/cpsula, situando

fora do limite especificado dois resultados, correspondentes a duas amostras

laboratrio D.

A deteco dos dois desvios, se de um lado aparenta despreocupante p

incidncia, de outro gravssimo se lembrada a falha na eficcia teraput

certamente caracterstica de todas as unidades inerentes aos lotes em quest

indevidamente distribudos para o consumo. Grfico semelhante ao anterior

preparado

com

os

resultados

obtidos

dos

mtodos

microbiolgico

cromatogrfico, podendo ser observado na Figura 27. Segundo KAZEMIFARO

a vantagem apresentada pelo mtodo microbiolgico em dimensionar a ativid

biolgica, consiste simultaneamente em limitao pois tambm considera

produtos de degradao ou contaminantes das tetraciclinas, com atividade,

estejam presentes em diferentes quantidades em matrias-primas e produ

resultados do ensaio microbiolgico sempre superiores ao cromatogrfico

forte indcio de veracidade da hiptese apresentada. Vrios autores estudar

correlao do mtodo CLAE com o microbiolgico ll ,12.J5,65,85,104,196,197 pa

determinao das tetraciclinas e seus produtos de degradao. Boa correla

encontrada em todos os trabalhos realizados, exceto para AZSAlO

colaboradores 11 . Os resultados da determinao da potncia da tetraciclina

mtodo microbiolgico recomendado no CFR mostrou valores de teor 2 a

superiores aos encontrados pelo mtodo CLAE, como ocorrido neste es

Parte desta diferena foi atribuda pelos autores, diferena do teo

tetraciclina e outras impurezas, como a clortetraciclina, que juntos pod

contribuir com a potncia microbiolgica do antibitico. Portanto, a dife

obtida nos resultados, entre os dois mtodos, foi explicada pela diferena
atividades das impurezas que no foram quantificadas pelo mtodo CLAE.
Tendo em vista esta diferena entre os resultados obtidos pelas
metodologias, e com a meta de obter informaes quanto correlao
ambas, aplicou-se o emprego do teste

t de Student68 . Este teste tem

objetivo determinar se estatisticamente existe diferena significativa ent

mdias de duas sries de resultados analticos a um dado nvel de probabilid

O valor de t calculado para avaliar a diferena entre a mdia dos resul

de teor obtidos pelos mtodos cromatogrfico e microbiolgico foi de 12,76

p < 0,001, portanto superior ao

t tabelado, evidenciado diferena signifi

entre as duas metodologias.

Com a mesma finalidade, determinou-se adicionalmente o coeficien

correlao de Pearson68 , que tambm decorreu na concluso quan

inferior para o ensaio microbiolgico. Estes resultados colocados na Tabela

foram representados na forma de histograma (Figura 29) para melhor visualiza

dos dados obtidos. Ainda conforme pode ser observado na Tabela 41, alm
laboratrio O, o laboratrio J apresentou 4,4 % dos ensaios individuais com

fora do limite especificado no ensaio cromatogrfico, embora o seu teor mdi

apresentasse dentro do limite especificado. Para o ensaio microbiolgico, ape

o laboratrio O com as amostras reprovadas, mostrou resultados abaixo do li

especificado, enquanto que em relao ao limite superior, quatro laboratrios

G, I e K, tiveram resultados individuais superiores ao limite de especificao

porcentagens de, 7,1; 7,7; 8,3 e 5,6 %, respectivamente. Estes resulta

reforam a diferena existente entre as duas metodologias.

A constatao dos valores obtidos de teor de tetraciclina, particularm

para amostras representativas de um dos laboratrios produtores, abaixo

limites especificados, leva a considerao quanto ao risco do paciente, recebe

medicao que no permita eficcia teraputica. Resultados obtidos quan

ensaios de dissoluo das mesmas amostras apenas confirmam a existncia

motivo de preocupao. O Ministrio da Sade, devido s freqentes dennci

comprovao da existncia de medicamentos falsificados sendo comercializa

de forma pertinente publicou a Lei n 9.677 lJ4 , de 02 de julho de 1998,

considera crime hediondo, os delitos praticados contra a sade pblica, com

falsificao, adulterao ou alterao de produtos destinados a fins teraputi

Os produtos considerados falsificados incluem aqueles em desacordo co

frmula do registro, sem as caractersticas de identidade e qualidade,
reduo do seu valor teraputico ou atividade, de procedncia ignorada,

registro ou adquiridos de estabelecimentos sem licena da autoridade sanitria

medicamento genrico, em processo de aprovao no Brasil e simultaneamen

considerando distintos patamares de atendimento aos conceitos de qualidade p

diferentes laboratrios produtores, assim como limitaes que ainda enfrentam

Sistema de Vigilncia Sanitria no pas, e mesmo a escassez momentnea

laboratrios certificados, h que se tratar o assunto por graus de prioridad

Assim,

mesmo

anteriormente

exigncias

amplas

de

ensaios

biodisponibilidade e bioequivalncia, h que se exigir dos produtos farmacutic

atendimento aos padres de qualidade farmacopicos, atravs de ensaios in vi

de dissoluo, assim como ensaios de teores dos princpios ativos e limites
impurezas, desenvolvidos em laboratrio que observem as Boas Prticas
Laboratrio.

Estas consideraes esto pautadas nos resultados experimentais de

trabalho, uma vez que se tomou para o seu desenvolvimento amostras

produtos farmacuticos disponveis ao consumo pela populao. Somandoesta providncia das inspees peridicas nas empresas quanto a adoo
BPF, certamente se poder contar, em breve, com a dispensao
medicamentos que possam incorporar as caractersticas indispensveis
qualidade.

S3snl~NO~

61,

7.2.

O peso individual de drgeas e o contedo das cpsulas avaliadas for

no geral adequados, exceto para um lote de um dos produtores
cpsulas (Laboratrio O).

7.3.

Os antibiticos do grupo da tetraciclina disponveis para consu

apresentam incidncia de lotes com desvios de teor (5,3 %) e
dissoluo (5,3 %) que podem comprometer a eficcia teraputica
tratamento.

7.4.

Resultados de coeficiente de variao (cinco amostras com valo

prximo ou superior a 10 %) obtidos do ensaio de dissoluo d

antibiticos do grupo da tetraciclina podem ser associados a falha
homogeneidade do processo industrial.
7.5.

Estudo comparativo de metodologias CLAE de quantificao aplicadas

cloridrato de tetraciclina e cloridrato de 4-epianidrotetraciclina, conforme

Farmacopias Americana e Britnica privilegia a primeira, em que
obteve menor tempo de reteno e pico com forma gaussiana.
7.6.

Constatou-se que a aplicabilidade do mtodo CLAE apresentado n

Farmacopias Americana e Britnica exige condies modificadas,
forma a permitir resultados confiveis.

7.9.

O mtodo cromatogrfico modificado apresenta boa preciso p

amostras provenientes de diferentes laboratrios, tanto para varia

intra-dia e inter-dia de ensaios.

7.10. O mtodo cromatogrfico modificado permitiu boa separao dos picos

cloridrato de tetraciclina e do c1oridrato de 4-epianidrotetraciclina,

como dos picos do cloridrato de 4-epianidrotetraciclina e do desconhe

eluido imediatamente antes.

7.11. Os resultados de teor de c1oridrato de tetraciclina nas amostras

cpsulas obtidos pelo mtodo turbidimtrico foram sempre superiores

relao ao mtodo cromatogrfico empregado.

S"~I:I"~~OI1818 S"I~N3~3:13~
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amostras, conforme o mtodo recomendado pela USP XXIII. Das amostras, dua

foram reprovadas e outras quatro foram aprovadas aps o reteste. A variao do

valores individuais obtidos no ensaio de dissoluo para cada amostra, fo

significativa, apresentando coeficiente de variao de at 14,2 %. A determina

quantitativa atravs do mtodo microbiolgico turbidimtrico empregand

Staphy/ococcus aureus ATCC 29737, resultou em duas amostras de um mesm

fabricante com potncia muito abaixo do limite especificado de 90 a 125 % d

valor rotulado, com 55.5 e 68,7 %. Estudo comparativo desta metodologia com

mtodo de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) foi realizado. Para isto

o mtodo da USP XXIII foi escolhida aps o ensaio preliminar, seguido d

determinao dos parmetros de validao e adequao do mtodo. O sistem

cromatogrfico estabelecido consistiu de coluna de fase reversa SYMMETRY'" C

e fase mvel composta de oxalato de amnio 0,09 M, dimetilformamida e fosfat

dibsico de amnio 0.18 M (64:32:4.7) com pH entre 7,6 e 7.7. Os resultados par

determinao de cloridrato de tetraciclina confirmaram os valores obtidos n

ensaio microbiolgico. sendo reprovadas duas amostras. O teor mxim

encontrado de 4-epianidrotetraciclina foi de 0,5 %, abaixo do limite de 3 %

especificado na USP XXIII. Na comparao entre os dois mtodos, foram

observados resultados sempre superiores para o mtodo microbiolgico.

anlise estatstica destes resultados mostrou diferena significativa entre a

mdias das determinaes obtidas a partir de cada mtodo.

A~VlNlNnS

8tl

in 38 samples of tetracycline hydrochloride and phosphate and oxytetracyc

hydrochloride capsules and docycycline hydrochloride coated tablet taken from

manufactures. The range of dissolution of the substance was determined in ali

samples, according to the method recommended by USP XXIII. On the wh

only t'NO of samples were rejected and ali the others approved without restrictio

except four of them, wich required a retest. The evaluation of the individual val

obtained in the assay of dissolution in each sample was significant, with a varia

coefficient of up to 14.2%. The quantitative determination through the turbidime

microbiological method employing Staphylococcus aureus ATCC 29737, resu

in t'NO samples of tetracycline hydrochloride from the same manufatures w

potency of 55.5 % and 68.7 % below the specified limit from 90 % to 125 %

labeled value. A comparative study of this method and the HPLC one was t

performed. The USP XXIII method was chosen after a preliminary assay, follow
by the determination of its validation parameters and system suitability.
established

chromatographic

method

employed

reversed

phase

colu

Tlot

SYMMETRY Ca (octylsilane chemically bounded to totally porous slica partic

and mobile phase consisting of ammonium oxalate 0.09 M, dimethyformamide
dibasic ammonium phosphate 0.18 M (63.9:32:4.7) adjusted to pH 7.6-7.7.
results confirmed the values obtained in the microbiological assay. When

method (HPLC) was used for the determination of 4-epianidrotetracycline

maximum of 0.5 % was found, below the limit of 3% specified in the USP X

The comparison between both methods reavealed constant superior results in

microbiological

one,

and

the

difference

between

determinations from the methods was meaningful.

the

averages

of