V Simposio Internacional de Biofbricas

I Congreso Internacional de Flujos Reactivos

Biorrefineras: presente y futuro en la produccin de insumos
qumicos y biocombustibles
CUANTIFICACIN POR HPLC DE CAFENA Y ERGOSTEROL EN EL HONGO Pleurotus albidus
Anczar Otlvaro Soto a,b, Juan Pablo Mariscal b, Susana Hernndez Nio a,*
a

Laboratorio de Bioproductos, Departamento de Fsica y Qumica,

Qumica Facultad de Ciencias Exactas y NaturaNatur
les, Universidad Nacional
Nac
de Colombia Sede Manizales. Manizales, Colombia
b
Departamento de Ingeniera Qumica,
Qumica Facultad de Ingeniera y Arquitectura, Universidad Nacional de
Colombia Sede Manizales. Manizales, Colombia

2. Materiales y Mtodos
1. Introduccin
Las aplicaciones biotecnolgicas de los hongos estn
relacionadas con la capacidad que tienen estos
organismos de producir en sus clulas compuestos
qumicos, farmacuticos y enzimas, razn por la cual se
les ha denominado Biofbricas [1]. Las especies del
gnero Pleurotus son un grupo de hongos de alto valor
nutricional, propiedades teraputicas, y varias
aplicaciones ambientales
mbientales y biotecnolgicas [2].
Pleurotus ostreatus es despus de Agaricus bisporus la
segunda especie comestible ms cultivada en el mundo
mu
[3]. El hongo Pleurotus albidus,, es un hongo silvestre
comestible, que crece en pases
ses de Latinoamrica como
Argentina y Mxico, donde el proceso de recoleccin y
comercializacin se lleva a cabo entre los meses de
abril y septiembre [4]. En Colombia,
Colombia Pleurotus albidus
ha sido recolectado en bosques de la ciudad de
Manizales, Caldas. Es el primer registro taxonmico de
Pleurotus albidus para Colombia [5].
Investigaciones han establecido que las especies del
gnero Pleurotus incorporan cafena
cafe
en el micelio
durante su cultivo sobre bioresiduos del
de caf [6,7].
Cuantificar la cantidad
idad de cafena presente en los
cuerpos
rpos fructferos de los hongos comestibles
cultivados sobre bioresiduos
residuos de caf,
caf contribuye a
evaluar las implicaciones de la cafena en la calidad
nutricional
onal de los hongos cosechados y la viabilidad de
reciclaje y aprovechamiento de los bioresiduos de caf
en el cultivo de hongos comestibles.
El ergosterol es el principal esterol presente en las
membranas de las clulas de los hongos.
hongo Es el
precursor de vitamina D2 y tambin se utiliza en la
produccin de cortisona y la hormona progesterona.
progesterona
Actualmente, ergosterol se produce comercialmente por
fermentacin de la levadura Saccharomyces cerevisiae
[8]. Debido a la importancia industrial
indus
de ergosterol,
determinar la cantidad de ergosterol presente en otros
organismos ayuda a evaluar
ar posibilidades de
diversificacin del proceso de produccin de
ergosterol.
En el presente trabajo se describe la cuantificacin por
cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC) de
cafena y ergosterol presentes en el cuerpo fructfero
del hongo Pleurotus albidus cultivado sobre borra y
pelcula de caf.

2.1. Reactivos y solventes

El estndar de cafena
afena fue obtenida de la Empresa
Foodex de Colombia (Manizales, Colombia). El
estndar de ergosterol grado HPLC fue obtenido de
Sigma-Aldrich
Aldrich Chemie GmbH (Steinheim,
(
Alemania).
Metanol grado HPLC fue adquirido de Merck KgaA
(Darmstadt, Alemania). El agua grado HPLC fue
obtenida mediante un sistema desionizador
de
Thermo
Scientific (Dubuque, Iowa, USA).
2.2. Obtencin y purificacin del extracto del hongo
En un erlenmeyer de 250 mL se mezclaron 10 g del
cuerpo
fructfero seco y pulverizado del hongo
Pleurotus albidus y 100 mL de cloroformo. La mezcla
se agit por 43 h a temperatura ambiente. El extracto
clorofrmico se filtr y enjuag con 40 mL de
diclorometano. Los solventes fueron evaporados en el
rotaevaporador a 40C
0C y presin de 600 mbar. Se
obtuvo 657 mg dell extracto slido color amarillo, el
cual fue disuelto en una mezcla de CH2Cl2/MeOH (5:3,
v/v). Se realiz una segunda dilucin del extracto en
metanol (1:1, v/v). Una alcuota
cuota (1 mL) de la solucin
del extracto se pas a travs de una columna de
extraccin en fase slida (SPE
SPE Cartridge, C18 de 1 mL,
RESPREP). Se realiz una segunda purificacin
pasando la solucin del extracto por un acrodisco con
membrana de nylon (0.2 m x 25 mm, PN 4522A,
PALL).
2.3. Mtodo de cuantificacin
uantificacin por HPLC
La cuantificacin por HPLC de cafena y ergosterol en
el hongo Pleurotus albidus fue realizada en un equipo
de cromatografa lquida Shimadzu Prominence
acoplado a una bomba LC-20AD
20AD y un detector UV-Vis
SPD-20/SPDAV (Columbia,
Columbia, MD,
MD
USA). Los
componentes del extracto de hongo fueron separados y
analizados utilizando una columna Premier C18 (150
mm x 4.0 mm) y temperatura del horno de 40 oC. La
fase mvil consisti de solvente A (metanol) y solvente
B (agua). Se utiliz el siguiente procedimiento de
gradiente: a la inyeccin de la muestra se empez con
30% de solvente A y 70% de solvente B, este gradiente
se mantuvo durante 6 min; 100% de A hasta 20 min. La
velocidad de flujo fue de 1 mL min-1. Los picos del
cromatograma fueron identificados por comparacin de
los tiempos de retencin de estndares de cafena y
ergosterol, respectivamente. La longitud de onda del

V Simposio Internacional de Biofbricas

I Congreso Internacional de Flujos Reactivos
Biorrefineras: presente y futuro en la produccin de insumos
qumicos y biocombustibles
detector se fij a 274 nm para cafena y 282 nm para
ergosterol. Para la determinacin, alcuotas
a
de 20 L
del extracto fueron inyectadas directamente en el
HPLC.. Todas las inyecciones fueron repetidas tres
veces.
2.4. Mtodo de validacin
El estndar
ndar de cafena fue preparado disolviendo 1 mg
mL-1 de metanol. Niveles adicionales de calibracin
fueron preparados por una serie de diluciones con
metanol. La curva
rva de calibracin fue construida
utilizando soluciones del estndar de cafena en un
rango de 0.01-1.5 mg mL-1. Alcuotas
cuotas de 20 L de cada
solucin fueron inyectadas directamente en el HPLC.
Todas las inyecciones se realizaron por triplicado. El
anlisis de regresin lineal se realiz graficando las
reas de los picos contra la concentracin de cafena.
Se demostr la linearidad mediante un coeficiente de
correlacin (r2) de 0.9998. El estndar
ndar de ergosterol fue
f
preparado disolviendo 2.5 mg mL-1 de cloroformo.
Niveles adicionales de calibracin fueron preparados
por una serie de diluciones en cloroformo. La curva de
calibracin fue construida utilizando soluciones del
estndar de ergosterol en un rango de 0.05-1.8 mg mL1
. Alcuotas de 20 L de cada solucin fueron
inyectadas directamente en el HPLC. Todas las
inyecciones se realizaron por triplicado. El anlisis de
regresin lineal se realiz graficando las reas de los
picos contra la concentracin de cafena. Se demostr
la linearidad mediante un coeficiente de correlacin (r
( 2)
de 0.9968.
3. Resultados y Discusin
Este estudio describe la cuantificacin por HPLC de
cafena y ergosterol presentes en el cuerpo fructfero
del hongo Pleurotus albidus cultivado sobre borra y
pelcula de caf. De 100 g de hongo seco y pulverizado
se obtuvo 657 mg de extracto slido,
slido el cual fue
analizado por HPLC. La longitud de onda del detector
UV-Vis se fij a 274 nm para cafena y 282 nm para
ergosterol. Bajo las condiciones de HPLC utilizadas,
utilizadas se
obtuvo un tiempo de retencin paraa la cafena de 3.54
min. El tiempo de retencin para ergosterol fue de
13.91 min (Figura 1). La identificacin de los picos de
cafena y ergosterol se logr por comparacin de los
tiempos de retencin con estndares
estndare preparados de
cafena y ergosterol, respectivamente. Para la
cuantificacin de ambos compuestos se
s utiliz el
mtodo de estndar externo. La concentracin de
cafena en el extracto del hongo fue determinada con
base a las diluciones realizadas a los 657 mg de
extracto y utilizando la curva de calibracin
calibraci del
estndar de cafena (r2 = 0.9998, Figura 2), se compar
el rea del pico de cafena
na en el extracto con el rea del
estndar. Los resultados del presente estudio indican
una cantidad promedio de cafena de 22.08 mg/100 g
de hongo seco,, la cual es incorporada por el hongo
Pleurotus albidus durante su crecimiento y desarrollo
sobre borra y pelcula de caf. Estos resultados estn de
acuerdo con el estudio realizado por Salmones et al.
quienes reportaron un contenido de cafena entre 0.17%

y 0.22% en cuerpos fructferos de Pleurotus spp.

cultivados sobre pulpa de caf [6]. Nuestros resultados
indican un contenido bajo de cafena en el hongo
Pleurotus albidus, sugiriendo que sta cantidad de
cafena puede contribuir de manera favorable a la
calidad nutricional
onal del hongo cosechado sobre borra y
pelcula de caf. Diversas investigaciones realizadas
sobre el consumo de cafena han concluido que su
consumo moderado,
oderado, aproximadamente 400 mg da-1, es
saludable [9]. Para una persona adulta (con excepcin
de las mujeres embarazadas) es seguro
se
y benfico
consumir al da cantidades
ades moderadas de cafena
debido a que incrementa la disponibilidad de energa,
disminuye la fatiga fsica y mental, mejora el
desempeo
o motor y cognitivo, y aumenta la capacidad
de concentracin y atencin, entre otros beneficios [9].

Figura 1. Cromatograma de la solucin del extracto del

hongo Pleurotus albidus. Tiempo de retencin: Cafena
= 3.54 min; ergosterol = 13.91 min.

Figura 2.. Curva de calibracin del estndar de cafena.

Coeficiente de correlacin (r2) = 0.9998.
El contenido de ergosterol en el extracto del hongo fue
medido con base a las diluciones realizadas a los 657
mg de extracto y utilizando la curva de calibracin del
estndar de ergosterol (r2 = 0.9968, Figura 3), se
compar el rea del pico de ergosterol en el extracto
con el rea del estndar.. La concentracin de ergosterol
determinada fue 75.980 mg/100 g de hongo seco. Estos
resultados indican una cantidad baja de ergosterol en el
cuerpo fructfero del hongo Pleurotus albidus. Nuestros

V Simposio Internacional de Biofbricas

I Congreso Internacional de Flujos Reactivos
Biorrefineras: presente y futuro en la produccin de insumos
qumicos y biocombustibles
resultados son consistentes con investigaciones previas
donde se ha establecido para diversas especies de
Pleurotus un rango de ergosteroll entre 5 a 630 mg/100
g de hongo seco [10].

[5] Grupo de Investigacin de Bioproductos.

Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales.
Resultados en proceso de publicacin.
[6] Salmones D., Mata G., Waliszewski
Walisze
K-N.
Comparative culturing of Pleurotus spp on coffee pulp
and wheat straw: biomass production and substrate
biodegradation. Bioresource Technology 96 (2005)
537-544.
[7] Fan L., Soccol A.T., Pandey A., Soccol C.R.
Cutivation of Pleurotus mushrooms on brazilian coffee
husk and effects of caffeine and tannic acid. Micologa
Aplicada Internacional,, 15 (2003) 001:15-21.
001:15

Figura 3.. Curva de calibracin del estndar de

ergosterol. Coeficiente de correlacin (r2) = 0.9968.

[8] Shang F., Shaohong W., Wang X., and Tan T.

High-cell-density
density
fermentation
for
ergosterol
production by Saccharomyces cerevisiae.
cerevisiae Journal of
Bioscience and Bioengineering,
Bioengineering 101 (2006) 1: 38-41.
[9] Glade M.J. Caffeine-Not
Not just a stimulant. Nutrition,
26 (2010) 932-938

4. Conclusiones
Se cuantific por cromatografa lquida de alto desemdese
peo (HPLC)
la cantidad de cafena
afena y ergosterol
presentes en el cuerpo fructfero del hongo Pleurotus
albidus. El contenido de cafena en el
e hongo es bajo,
sugiriendo que sta cantidad de cafena puede contribuir de manera favorable a la calidad nutricional
nutrici
del
hongo cosechado sobre borra y pelcula de caf. Se
estableci que la cantidad de ergosterol en el hongo
Pleurotus albidus est en el rango de concentracin de
ergosterol para las especies dell gnero Pleurotus.
5. Agradecimientos
Los autores del trabajo desean agradecer a la Direccin
de Investigaciones de la Universidad Nacional de CoC
lombia Sede Manizales (DIMA) por el apoyo econecon
mico recibido a travs de la Convocatoria Semilleros de
Investigacin
n 2011, sin la cual no hubiese sido posible
completar el presente trabajo.
6. Referencias
[1] Meyer V. Genetic engineering of filamentous fungifungi
Progress, obstacles and future trends. Biotechnology
Advances, 26 (2008) 177-185.
[2] Lavi I., Levinson D., Peri I., Tekoah Y., Hadar Y.,
Schwartz
B.
Chemical
characterization,
antiproliferative and antiadhesive properties of
polysaccharides extracted from Pleurotus pulmonarius
mycelium and fruiting bodies. Applied Microbiology
and Biotechnology, 85 (2010) 1977--1990.
[3] Snchez C. Cultivation of Pleurotus ostreatus and
other edible mushrooms. Applied Microbiology and
Biotechnology, 85 (2010) 1321-1337.
1337.
[4] Moreno-F A., Bautista-N
N E. El hongo blanco patn,
Pleurotus albidus,, en Hidalgo. Su primer registro en
Mxico. Revista Mexicana de Micologa,
Micologa 22 (2006) 4147.

C., D., Hernandez R., Sobal

[10] Trigos A., Martinez-C.,
M. Ergosterol content in fruit bodies of Pleurotus is
variable. Micological Neotropical Aplication,10:93-96.
Aplication,