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Trabajo Final
Experto Universitario de Biotecnologa Aplicada a los Alimentos
UNED
Profesoras Gua:
Dra. Estrella Corts Rubio. Profesora Titular de Universidad. rea: Bioqumica y
Biologa Molecular.
Dra. Gloria Morcillo Ortega. Profesora Titular de Universidad. rea: Biologa
Celular.
INDICE
1. Introduccin, pag.3
2. Transferencia de ADN a clulas animales, pag.5
3. Vectores de transferencia gnica, pag.5
4. Transfeccin de clulas somticas animales, pag.8
5. Transgnesis en animales, pag.9
6. Transferencia gnica por microinyeccin, pag.11
7. Transferencia gnica con trasposones, pag.16
8. Transferencia gnica con vectores virales, pag.19
9. Transferencia gnica mediada por semen, pag.22
10. Transplante de ncleos y clones, pag.24
10.1. Clonacin, pag.24
10.2. Mtodos de clonacin, pag.24
10.3. Clonacin de la oveja Dolly, pag.30
10.4. Transferencia nuclear de clulas trasfectadas diploides fetales,
pag.31
10.5. Transferencia nuclear Honolulu, pag.32
10.6. Aplicaciones de la clonacin mediante la tcnica de transferencia
nuclear, pag. 33
11. Generacin de animales knockout, pag.40
11.1. Generacin de ratones knockout, pag.40
11.2. Condicional knockout, pag.42
11.3. Aplicaciones de las tcnicas knockout, pag.43
12. Modelos de animales transgnicos, pag.45
12.1. Animales transgnicos como fbricas de protenas: Vaca transgncia
productora de hormona del crecimiento, pag.45
12.2. Animales transgnicos resistentes a mastitis: Vaca resistente a la
infeccin intramamaria, pag.48
13. Bibliografa, pag.52
Introduccin
integracin (para permitir la inclusin del material exgeno dentro del genoma
de la clula hospedadora), secuencias de recombinacin homloga (para
permitir el intercambio de material gentico con el genoma hospedador con
una regin especfica), secuencias de empaquetamiento (para introducir el
material gentico en el interior de un vector viral), secuencias
inmunoestimulantes (secuencias bacterianas del tipo islas CpG no metiladas
que sirven como coadyuvantes en las vacunas de ADN)
Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material
gentico transportado y de vencer todas las barreras biolgicas hasta alcanzar
su destino final, el ncleo de la clula diana, donde tiene lugar la regulacin
gnica. Tambin de ellos va a depender la va de administracin a utilizar.
En los casos de transferencia gnica en individuos postnatales, el vector ha de
solventar barreras en su camino hacia su destino funcional. Entre estas
barreras se incluyen: la estabilidad en el medio extracelular (para evitar su
degradacin y eliminacin), el reconocimiento de la clula diana (generalmente
mediante un receptor especfico), su unin a la membrana, su internalizacin
en la clula (normalmente utilizando un sistema de transporte vesicular como
la endocitosis), el escape de los sistemas de degradacin intracelular
(lisosomas) y su entrada final al ncleo, donde debe desmantelarse para
permitir que el material gentico que transporta gane acceso a su ubicacin
final y a la maquinaria de transcripcin.
Los vectores son los vehculos microscpicos que se utilizan para transferir
genes a las clulas, a continuacin se exponen sus caractersticas y su
relevancia. Hay tres principales tipos de vectores: virales, no virales y fsicos.
Virales: El mtodo ms eficaz para llevar genes sanos a las clulas daadas
es por medio de virus que han sido adaptados como vectores. Los virus son
tiles ya que pueden penetrar naturalmente las clulas, insertando en ellas su
material gentico.
Sin embargo, antes de poder usarlos como vectores deben modificarse para
eliminar los genes virales que les permiten replicarse y causar enfermedad. A
estos virus se les llama virus modificados o atenuados, y entre los ms
utilizados como vectores se encuentran los retrovirus, adenovirus y virus
adeno-asociados. Tambin se han desarrollado poxvirus (especialmente el
virus de la vaccinia) para vacunas y terapias gnicas. Actualmente, los
vectores virales son los ms eficientes para transformar clulas, aunque no
carecen de desventajas: son de manufactura costosa, hay lmites a la cantidad
de genes (es decir, la longitud de los fragmentos de ADN) que pueden ser
insertados en los vectores y que pueden llegar a desencadenar una respuesta
inmune (inmunogenicidad).
No virales: Bsicamente se trata de inyectar el fragmento de ADN que
contiene el gen de inters directamente a las clulas o empacado dentro de
otras molculas como son los liposomas (pequeas vesculas de grasa que
pueden transportar sustancias al interior de las clulas). Los vectores no
virales son menos eficientes para transformar clulas, pero no tienen limites
para el tamao del inserto (el tamao del ADN que se va a inyectar), son
menos inmunognicos y ms fciles de elaborar.
Fsicos: Involucran sobre todo inyectores sin aguja y electroporacin. Los
inyectores sin aguja utilizan alta presin para insertar el ADN en clulas de la
piel o en clulas en cultivo, mientras que la electroporacin utiliza pulsos
elctricos que abren temporalmente agujeros en las membranas de las
clulas, permitiendo insertar el ADN. Los mtodos fsicos an son ineficientes
en la transformacin y tienen un rango limitado de aplicacin.
Los riesgos de la terapia gnica continan siendo difciles de cuantificar. Por
ello cada ensayo debe comenzar lentamente, con un control muy cuidadoso de
la dosis de vectores que contengan los genes que se pretende insertar. Estos
riesgos tomaron una nueva dimensin en el otoo de 1999, cuando un joven
de 18 aos muri cuatro das despus de haber iniciado un tratamiento con
terapia gnica. Los mismos riesgos podemos asumir para el resto de especies
animales manipuladas genticamente.
Transgnesis
La transgnesis se puede definir como la introduccin de ADN extrao en un
genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a
todas las clulas en los organismos multicelulares. Generalmente, en
animales, el ADN extrao, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los
embriones que hayan integrado el ADN extrao en su genoma, previamente a
la primera divisin, producirn un organismo transgnico; de modo que el
transgn pasar a las siguientes generaciones a travs de la lnea germinal
(gametos).
Entre las aplicaciones de los animales transgnicos se pueden destacar:
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Fig.4
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de los embriones hacia las hembras receptoras. Otros factores como el largo
perodo de gestacin y el bajo nmero de animales por generacin, sumado al
costo extra de cuidado de los animales, han contribuido a la lenta adopcin de
estas tecnologas, especialmente en los pases menos desarrollados.
Los primeros estudios realizados en animales de granja se enfocaron hacia el
uso de genes que controlan la productividad del animal, por ejemplo genes de
la hormona del crecimiento para incrementar la tasa de crecimiento y la
eficiencia de conversin por Pursel y Rexroad en 1993. Estos estudios
mostraron los problemas de la inyeccin pronuclear con relacin al control de
los niveles de expresin del transgen. Se encontr una gran variacin de
expresin en las lneas de animales transgnicos generados, siendo sta en
general muy pobre, especialmente si no todos los elementos reguladores del
transgen eran incluidos en la construccin gentica (plsmido). Esto llev a
que muchos investigadores dedicaran mayores esfuerzos a entender la forma
en que los transgenes se insertan en el genoma del animal y los factores que
afectan la expresin de los mismos. Esto explica por qu la mayora de los
experimentos dirigidos a alterar la composicin de la leche han sido realizados
principalmente en el ratn, aunque existen algunas notables excepciones tales
como la secrecin de protenas de valor teraputico como el factor IX de la
coagulacin en la leche de ovejas por Wright y colaboradores en 1991, el
activador de plasmingeno de tejido en la leche de cabras por Ebert y
colaboradores en 1991 y la lisozima humana en la leche de bovinos por
Krimpenfort y colaboradores en 1991. Sin embargo, dada la baja eficiencia de
esta tecnologa, sumado a los costos involucrados, es que ha habido una
bsqueda constante por nuevas alternativas.
En trminos generales, a continuacin se presenta una grfica con los niveles
de eficiencia de la tcnica para diferentes especies de animales:
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Superfamilia no vrica
SINE Alu y B1 de mamferos,
pseudogenes procesados derivados de
la polimerasa II
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Vectores retrovirales
Los retrovirus son virus de ARN con envuelta. Poseen una elevada eficacia de
transduccin en un gran nmero de tipos celulares, son capaces de integrarse
de forma estable en el genoma de las clulas que infectan sin expresar
ninguna protena viral inmunognica, y son relativamente poco patognicos,
con excepcin de algunos como el VIH. La mayora de ellos derivan del virus
de la leucemia murina (MuLV).
En general, su principal limitacin es que slo pueden transducir eficazmente
clulas en divisin, ya que el acceso al ncleo del complejo de preintegracin
requiere la ruptura de la membrana nuclear. Hay un tipo de retrovirus, los
lentivirus, que si que pueden infectar e integrarse en clulas quiescentes,
como el VIH y SIV, pero el riesgo inherente al uso de los mismos limita su
aplicacin.
Otro inconveniente que tiene el uso de retrovirus como vectores es la poca
estabilidad de las partculas y su baja tasa relativa de produccin. Esto ha
sido parcialmente resuelto con la sustitucin de la protena de la envuelta por
la glicoprotena G del virus de la estomatitis vesicular que posibilita la
obtencin de ttulos de hasta 109 p.i. /ml y estabiliza las partculas.
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Debido a que estos virus tienen un rango de infectividad muy amplio, cuando
se quiere transducir selectivamente una poblacin celular, se le incorporan
ligandos heterlogos o anticuerpos monocatenarios que generan nuevas
especificidades. Son vectores que poseen protenas quimricas en la envuelta.
Contrario a la percepcin de muchos, los primeros animales transgnicos
fueron producidos hace ya casi 30 aos mediante la microinyeccin de ADN
viral (SV40) en la cavidad del blastocele de embriones de ratn (Jaenish y
Mintz, 1974). Los prximos intentos involucraron embriones de ratn
infectados con el retrovirus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), lo que
result en la transmisin estable hacia la lnea germinal (Jaenish, 1976). Esto
se logr reemplazando genes que no son esenciales para el virus por genes
heterlogos, aprovechando as la capacidad de los virus de infectar un amplio
espectro de clulas y con una gran eficiencia. Una de las grandes desventajas
de este mtodo radica en que la integracin del ADN se produce en diferentes
etapas del embrin en desarrollo, lo que implica que el ADN no se integra en
todas las clulas somticas o en la lnea germinal y por lo tanto no hay
transmisin del transgen a la descendencia. Adems, los animales generados
por este mtodo tienen a menudo ms de un sitio de integracin, lo cual
ocurre cuando ms de una clula del embrin es infectada por el virus
(Palmiter y Brinster, 1985). Esto implica que las lneas de ratones
transgnicos deben ser cruzadas para segregar los diferentes loci conteniendo
el transgen y poder as aislar lneas con un sitio de insercin nico.
Finalmente, los vectores retrovirales poseen una limitada capacidad de ADN
forneo que puede ser acomodado, alrededor de 8 kb, lo cual imposibilita
muchos experimentos especialmente con secuencias genmicas humanas que
pueden superar ampliamente este tamao.
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Vectores Adenovirales
Los adenovirus son virus de DNA sin envuelta con un genoma bicatenario
hasta 36 kb. Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtencin de
vectores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa ni originar
tumores en animales. Pueden transducir un nmero bastante amplio de tipos
celulares distintos, tanto clulas en divisin como post-mitticas, con una
eficacia muy elevada. El genoma viral se mantiene epismico, lo que permite
una expresin gentica transitoria.
Originalmente la capacidad del vector para incorporar ADN era de hasta 8 kb.
Recientemente se ha conseguido eliminar casi todo el genoma viral,
manteniendo las secuencias de empaquetamiento y las secuencias terminales,
rindiendo vectores que pueden incorporar hasta 35 kb a los que se les ha
denominado vectores sin tripas (gutless).
La eliminacin de material genmico viral adems de aumentar la capacidad
del vector de incorporar ADN, disminuye el riesgo de induccin de respuesta
inmune. La mayora de la poblacin ha sido infectada en algn momento por
adenovirus y presenta una respuesta inmune inicial.
Una de las mayores ventajas de estos virus es su alta reproductividad con
ttulos de hasta 1010 p.i./ml, y su gran estabilidad, que les permiten ser
concentrados adicionalmente para alcanzar valores de 1012 p.i./ml.
Su falta de especificidad celular se compensa con el desarrollo de estrategias
de redireccionalidad. Quimeras que introducen ligandos especficos en
protenas de la cpside y molculas biespecficas que reconocen tanto la
cpside viral como el receptor seleccionado.
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Fig.13. Dolly: El primer mamfero clonado por transferencia nuclear desde una
clula diferenciada.
Dolly fue el resultado de la fusin de un ncleo procedente de una clula
mamaria extrada de una oveja adulta con un vulo al que previamente se le
haba extrado el material gentico (proceso conocido como enucleacin). El
equipo escocs demostraba as que las clulas adultas y especializadas podan
ser reprogramadas.
La etapa clave de este proceso fue la coordinacin del ciclo celular de la clula
receptora y el de la clula donante de ncleos que se logr mediante la
deprivacin de suero de estas ltimas (Campbell y col., 1996; Wilmut y col.,
1997). La deprivacin de suero, previo a la transferencia nuclear, induce a las
clulas a salir del ciclo de crecimiento y entrar en un estado de arresto celular
o quiescencia (G0/G1 en el ciclo celular), el cual potenciara el desarrollo
embrionario, permitiendo a los factores en el ooplasma reprogramar el ncleo
donante (Campbell y col., 1996).
Los requisitos mnimos para la SCNT incluyen el uso de dos tipos de clulas:
somticas o no sexuales, y sexuales femeninas, u oocitos. Los ncleos de
clulas somticas de individuos postnatales se transfieren dentro de oocitos o
de cigotos enucleados. Esta tcnica tiene la ventaja que permite conservar el
genoma durante la diferenciacin celular y la capacidad del citoplasma celular
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Fig.21. Seccin frontal cerebral de un ratn doble transgnico NEX-Cre*LacZmarcador a la edad de 55 das. La tincin de lac-Z corresponde exactamente a
la expresin conocida de los dominios del gen NEX, como el hipocampo y el
neocortex.
11.3. Aplicaciones de las tcnicas knockout
Actualmente existe una gran carencia de rganos para trasplantes humanos
que no es cubierta por las donaciones. El trasplante de rganos de animales
hacia humanos (xenotrasplantes) podra ser la solucin. Sin embargo, existen
muchas barreras de rechazo entre especies que limitan su uso. La principal
barrera consiste en el fenmeno de rechazo hiperagudo debido a la presencia
de anticuerpos naturales contra eptopes del disacrido galactosa 1-3
galactosa presente en las superficies celulares de mamferos, pero que estaran
ausentes en las superficies celulares de humanos y monos (Gallili y col.,
1985). Este es uno de los principales usos donde la tecnologa de
recombinacin homloga acoplada con transferencia nuclear est siendo
explotada. La reciente generacin de cerdos transgnicos en los que se elimin
el gen 1-3 galactosiltransferasa y que permitira la produccin de animales que
carecen del eptope responsable del rechazo hiperagudo, es una clara
demostracin del poder de esta tecnologa (Phelps y col., 2003).
Otra de las aplicaciones de esta tecnologa est en la creacin de animales
resistentes a ciertas enfermedades. Las enfermedades ocasionadas por priones
han tenido un enorme impacto econmico en algunos pases de Europa y la
utilizacin de productos animales para su uso en humanos es una
preocupacin constante.
Este es el caso de la encefalopata espongiforme bovina (EEB) o ms
comnmente conocida como enfermedad de las vacas locas que sera la causa
de una nueva forma de enfermedad de Creuzfeldt Jacob en humanos
denominada vCJD (Hill y col., 1997). Experimentos realizados en ratones
(Prusiner y col., 1993) y ms recientemente en ovejas (Denning y col., 2001),
demuestran que es factible eliminar el gen para los priones (PrP) mediante
recombinacin homloga y que los animales producidos son resistentes al
Scrapie. Dado que las ovejas y vacas estn siendo utilizadas para producir
protenas humanas de uso farmacolgico y que estos animales poseen genes
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Promotor
(del gen para
casena)
GEN de inters
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Tratamiento
Interleukina-2
Deficiencias inmunolgicas
a-Glucosidasa
Enfermedad de Pompe
Resistencia a la heparina
Hemofilia
Protena C
Prevencin de trombos
a1-antitripsina
Fibrosis qustica
Factor de coagulacin IX
Hemofilia
lactoferrina
Deficiencia de hierro
Enanismo
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Cuando ingresan las bacterias a la ubre no son eliminadas a pesar del efecto
removedor que se produce durante el ordeo, debido a que ellas emplean
diversas tcnicas para permanecer, tales como la rpida multiplicacin, su
adherencia tisular o la invasin intracelular. Tericamente la transgnesis
puede ser usada para aumentar la actividad antimicrobiana con la mayor
produccin de sustancias como lisozimas, bloquear una ruta metablica
bsica del microorganismo, prevenir la adherencia al tejido o todas en
conjunto.
Eliminar la infeccin, reducir inflamacin y minimizar el dao tisular:
Una vez el microorganismo invade la glndula inicia su multiplicacin
generando por parte del husped una respuesta inflamatoria con el propsito
de controlar o eliminar el agente invasor, ya sea recurriendo a la respuesta
humoral o a la celular; la transgnesis podra emplearse para modificar la
velocidad y naturaleza de la respuesta celular, aumentar la produccin local
de anticuerpos o neutralizar toxinas y metabolitos que produzcan dao
celular.
La estrategia transgnica que se ha venido investigando en la Universidad de
Vermont, tiene por objetivo aumentar la resistencia gracias a la codificacin
gentica que estimula la produccin de pptidos antibacterianos en la
glndula mamaria (Williamson y Col 1964, Kerr y col 2001). A continuacin se
presentan los progresos de estas investigaciones.
Numerosos pptidos y protenas antimicrobianos son producidos por
microorganismos, plantas o animales, que segn su actividad van desde los
que tienen un estrecho espectro como colicinas y lisostafinas hasta molculas
de mayor espectro con actividades no especficas como lisozimas y
lactoperoxidasa. Unas y otras tienen ventajas y desventajas cuando se quiere
elegir a una de ellas para la transgnesis. En este caso se eligi un pptido, la
lisostafina que tiene un espectro especfico antiestafilococo. Esta es una
endopeptidasa que hidroliza los enlaces pentaglicina en el pptidoglicano de la
pared de Staphylococcus aureus, produciendo la lisis celular. Naturalmente la
lisostafina es producida por especies Coagulasa Negativa del gnero
Staphylococcus como es el S. simulans. Se caracteriza por ser especifica para S
aureus , con poca actividad para otras especies del mismo gnero, no es txica
y no afecta las clulas animales ni las protenas de la leche. Bramley y Foster
demostraron en 1990 que una concentracin de 10 mcg de lisostafina era
suficiente para prevenir mastitis en ratas en lactacin. Adems la expresin
gentica puede estar orientada a un tejido en particular o a un estado
fisiolgico por la adicin de sustancias promotoras o reguladoras, por ejemplo,
la produccin de B-lactoglobulina, la cual es una expresin gentica de la
glndula mamaria. La expresin de la lisostafina dirigida por una secuencia
reguladora hacia las clulas secretoras de la glndula mamaria puede lograr
animales resistentes a mastitis causada por S. aureus.
Para conseguir el objetivo de las investigaciones el gen de la lisostafina
necesitaba ser clonado del S. simulans y modificado para que se expresara en
clulas animales, esto requiere de un codon particular y del cambio de la
secuencia para minimizar las diferencias existentes entre el DNA de las clulas
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BIBLIOGRAFA
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