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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

HOMEOPATÍA SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN EFECTO DE Ustilago maydis SOBRE LA VIABILIDAD DE

EFECTO DE Ustilago maydis SOBRE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HeLa in vitro

TESIS QUE PARA OBTENER EL DIPLOMA DE ESPECIALIDAD EN

TERAPÉUTICA HOMEOPÁTICA

PRESENTA

AGUSTIN BARBOSA MÁRQUEZ

DIRECTORES:

M.

en H. María de Lourdes Cruz Juárez

D.

en C. Paula Figueroa Arredondo

México D.F. Junio, 2011

1

4
4

El presente trabajo se llevó a cabo en el

Laboratorio de Microbiología Molecular

del Departamento de Investigación

de la ENMH-IPN

Bajo la dirección de las

Dras. María de Lourdes Cruz Juárez y Paula Figueroa Arredondo

con la asesoría de los M en C Ana Laura Luna Torres

y Miguel Espinoza Laparra.

Se contó con el

Financiamiento parcial de los

Proyectos SIP 2011 y Megaproyecto de Cáncer.

Índice

Resumen ………………………………………………………………………………

10

Abstracts

121

INTRODUCCIÓN

13

CÁNCER

15

Epidemiologia

CÁNCER DE CUELLO UTERINO (CaCU)

15

20

Fisiopatología

20

Cuadro clínico

22

HOMEOPATÍA

34

Ustilago maydis

37

Patogenesia de Ustilago maydis

39

JUSTIFICACIÓN

40

Hipótesis

42

Objetivo General

42

Objetivos Particulares

42

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

43

Material y métodos

45

Metodología

46

Cultivo celular y aplicación de Ustilago maydis

52

 

56

CONCLUSIONES

63

PERSPECTIVAS

64

BIBLIOGRAFÍA

65

Lista de figuras

Figura 1

Principales causas de muerte en hombres por tumores

malignos en México

16

Figura 2

Principales causas de muerte en mujeres por tumores

malignos en México

17

Figura 3

Causas de defunción por tumores malignos según sexo

18

Figura 4

Tazas de mortalidad por entidad federativa en México

17

Figura 5

Factores de riesgo relacionados con el cáncer de cérvix

19

Figura 6

Técnica para la toma del Papanicolau

25

Figura 7

Neoplasia Intraepitelial Cervical

26

Figura 8

Células HeLa

30

Figura 9

Efecto de la tintura madre y medicamentos dinamizados en

células de carcinoma de ascitis de Ehrlich

32

Figura 10

Efecto de Arsenicum album en células HeLa in vitro

34

Figura 11

Elote con la parasitación del hongo de Ustilago maydis

36

Figura 12

Estrategia experimental

41

Figura 13

Células HeLa en caja de petri.

44

Figura14

Medios nutritivos especiales para cultivo de células

44

Figura 15

Características morfológicas de células HeLa (ATCC)

45

Figura 16

Cámara de Neubauer

47

Figura 17

Cuadriculado especial de la cámara de Neubauer

47

Figura 18

Evaporación del alcohol Homeopático

48

Figura 19

Placa de pozos para cultivos celulares

50

Figura 20

Fotografía de células HeLa

53

Figura 21

Comparación de células HeLa 10x y 20x a las 24 horas

con los tratamientos

54

Figura 22

Viabilidad de células HeLa in vitro a las 24 horas

55

Figura 23

Porcentajes de viabilidad de células HeLa in vitro a las 24

horas

55

Abreviaturas

DMEM:

Dulbeco Modified Eagle Medium.

DNA:

Acido Desoxirribonucleico.

HeLa:

Henrietta Lacks.

LCR:

Región Larga de Control.

µl:

Microlitro.

NIC:

Neoplasia Intraepitelial Cervical.

Pap:

Papanicolau.

PBS:

Solución Buffer de Phosphatos.

pRb:

Proteína del Retinoblastoma.

SFB:

Suero Fetal Bovino.

SIL:

Lesión intraepitelial escamosa.

H-SIL:

Lesión intraepitelial escamosa de alto riesgo.

L-SIL:

Lesión intraepitelial escamosa de bajo riesgo.

VPH:

Virus del Papiloma Humano.

Ø:

Tintura

Resumen

El cáncer es una causa de mortalidad a nivel mundial, se le atribuyen 7.9 millones

de defunciones en el 2004 (aprox. 13%), se prevé que aumente hasta 12 millones

para el 2030. En México el cáncer del cuello uterino es la segunda causa de

defunciones en mujeres. En la actualidad no se tienen estudios in vitro con

Ustilago maydis y su acción en células de cáncer de cérvix, aunque en la materia

medica homeopática se menciona un cuello uterino tumefacto que sangra al

menor contacto por lo tanto se puede sugerir para el tratamiento de cáncer de

cérvix. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de Ustilago maydis sobre la

viabilidad de células Hela (Línea de cáncer cervical). Las células se trataron

durante 24 horas con diferentes concentraciones de Ustilago maydis (Tintura, 6c y

30c). A través de

la técnica con Azul de tripano, se realizó el conteo de las

mismas. Los resultados obtenidos muestran que las células tratadas con la tintura

de Ustilago maydis tuvieron un incremento en la viabilidad de un 70%, las tratadas

con la solución homeopática a la sexta centesimal (6c) incrementaron su viabilidad

un 75%, las tratadas con la 30c la incrementaron un 64%, las tratadas con alcohol

tuvieron un incremento del 75% comparado con un 83% de las células sin

tratamiento. Con estos resultados, concluimos que a partir de las cuentas viables,

se puede sugerir que en las células HeLa tratadas con la tintura de Ustilago

maydis, se disminuye la proliferación y por el contrario, los tratamientos con las 6c

y 30c estarían mostrando un aumento de la proliferación.

Abstracts

Cancer is cause of mortality worldwide, 7.9 million deaths were attributed in 2004

(aprox. 13%) and it is expected to increase to 12 million by 2030. In Mexico,

cervical cancer is the second leading cause of deaths in women. Currently there

are not in vitro studies with Ustilago maydis and its action in cells derived from

cervical

cancer,

but

in

the

homeopathic

medical

matter

cervical

cancer

is

mentioned as a swollen cervix that bleeds at the slightest touch. Applying the rule

of the similar, therefore Ustilago maydis may be suggested for the treatment of

cervical cancer. The aim of this study was to evaluate the effect of Ustilago maydis

on the viability of Hela cells (cervical cancer derived cell line). Cells were treated

with different concentrations of Ustilago maydis during 24 hours (Tincture, 6c and

30c), then quantitated through the technique using trypan blue dye. Results from

our study show that cells treated with Ustilago maydis tincture showed an increase

in viability of 70%, those treated with the homeopathic solution diluted to the sixth

centesimal (6c) increased their viability by 75%, those treated with the 30c the

reach a 64%, those treated with the alcohol the reach a 75% in comparison with

83% of the cells without treatment. With results from our experiments we here

conclude from the viablility estimations, may we suggest that HeLa cells treated

with tincture from Ustilago maydis, decreased their proliferation. On the contrary

treatments using the 6c and 30c show an increase in proliferation.

INTRODUCCIÓN

Las células del cérvix están en constante división durante la vida reproductiva, por

lo tanto el crecimiento anormal de las células, se puede promover al conjugarse

con factores de riesgo para el desarrollo de la patología cervical. Lo anterior junto

con la alta incidencia del virus del papiloma humano (VPH) se ha establecido

como causa de la displasia cervical, que evoluciona al cáncer cérvico-uterino. Las

neoplasias del cérvix son de gran importancia ya que constituyen 21.4% del total

de neoplasias malignas y 85% de las ginecológicas. La prevención del cáncer de

cérvix se puede realizar por medio de la detección oportuna, orientada a evitar o

disminuir factores de riesgo, el uso de preservativo, posponer el inicio de la vida

sexual, el número de gestas y la frecuencia de realización del Papanicolau (Pap),

lo anterior debe considerarse y tomar conciencia en mujeres con alto riesgo de

cáncer de útero (OMS,2007; Rodríguez,2009).

El cáncer de útero es uno de los principales problemas de Salud Pública no solo

en la República Mexicana sino en toda América Latina; en el Distrito Federal y la

Zona Metropolitana ocupa el primer lugar en frecuencia, en la última década se

reportaron más de 4950 defunciones (19.9/100 000 mujeres), se estima que cada

año mueren 12.5 mujeres al día debido a éste mal (INEGI, 2007).

De acuerdo con los resultados obtenidos en los diversos estudios epidemiológicos,

el factor asociado en forma más consistente con cáncer de cérvix es la infección

con el

Virus del Papiloma Humano (VPH). Los tipos asociados con el cáncer

cérvico-uterino son el VPH16 y VPH18 (Harold zur Hausen,1981 y Lutz Gissman,

1984). Se observó que las oncoproteínas E6 y E7 del VPH tienen un potencial

oncogénico y alteran el ciclo celular, por ejemplo: la oncoproteína E6 inhibe la

función de la proteína p53 que es una proteína supresora de tumores; la

oncoproteína E7 secuestra a la proteína Rb que interactúa con factores de

transcripción de E2F, que controlan la replicación celular (Lodish, 2008).

En la búsqueda de tratamientos contra el cáncer se han realizado estudios en

diferentes líneas celulares, una de estas líneas es la de células HeLa que

provienen de una mujer afroamericana Henrietta Lacks que murió de cáncer de

útero (Goodwin, 2000).

En homeopatía se ha experimentado el tratamiento para el cáncer con diversos

medicamentos

como

Graphites,

Arsenicum

album,

Carbo

animalis,

Carbo

vegetabilis (en cáncer genital) entre otros (Ranjit K. Roy,2008; Olvera, 2009) J. M.

Clarke observó que Ustilago maydis tiene afinidad a fibromas (Ranjit K. Roy,

2008). Pero en la actualidad no se han realizado estudios in vitro de Ustilago

maydis en cáncer de cérvix a pesar de que en la materia medica homeopática

(Vijnosky,

2002;

Vannier

,2008)

la patogenesia

menciona

un cuello uterino

esponjoso, tumefacto, que sangra al menor contacto, lo que es similar a la

sintomatología del CaCU.

Por lo que sería muy importante observar el efecto de

este medicamento en la viabilidad de las células HeLa in vitro.

CÁNCER

El cáncer se define como la pérdida del control del crecimiento y división de las

células a causa de mutaciones genéticas experimentadas. Estas células pueden

invadir otros tejidos destruyendo estructuras adyacentes y a su vez pueden

propagarse a sitios alejados, lo que se denomina metástasis. Así mismo puede

producir tumores en partes distales, con lo que pueden causar la muerte (NOM-

014-SSA2-1994).

Otros

términos

utilizados

para

denominar

al

cáncer

son

neoplasias y tumores malignos (Lacruz, 2001)

Epidemiologia

La Organización Mundial de la Salud (OMS) indica que desde la edad madura

hasta la vejez, una de las principales causas de muerte en las mujeres es el

cáncer y en los hombres son las cardiopatías. Los tumores malignos que afectan a

ambos sexos son: cáncer de pulmón, tráquea, bronquios, esófago,

hígado,

próstata, colon y recto, con mayor incidencia en varones y de mama, pulmón,

colon, rectal y de tipo ginecológico, en la población femenina (OMS, 2007).

Se estima que a nivel mundial el cáncer es la primera causa de mortalidad; se le

atribuyen 7.9 millones de defunciones en el 2004 (aprox. 13 % del total) de las

cuales un 30% de las defunciones son prevenibles.

Se prevé que siga aumentando hasta llegar a un estimado de 12 millones de

muertes para el 2030.

Las estadísticas muestran lo siguiente:

Pulmón (1.4 millones de defunciones)

Estómago (866 000 defunciones)

Hígado (653 000 defunciones)

Colon (677 000 defunciones)

Mama (548 999 defunciones)

Un 72% de las muertes por cáncer ocurridas en el 2007 se registraron en países

de medianos y bajos recursos económicos (OPS, 2009).

En el año 2005, en México se registraron 495 240 defunciones, de los cuales

55.2% en hombres y 44.8% en mujeres. Los tumores malignos son la segunda

causa de muerte con 30 899 defunciones (11.3%) en hombres y en mujeres con

32 224 defunciones (14.5%).

En los varones las tres principales causas de muerte por tumores malignos son:

1. Tráquea, bronquios y pulmón (15.6%)

2. Próstata (15.5%)

3. Estomago (9.1) (Fig. 1)

PRINCIPALES CAUSAS DE MUERTE EN HOMBRES POR TUMORES MALIGNOS

EN MÉXICO.

CAUSAS DE MUERTE EN HOMBRES POR TUMORES MALIGNOS EN MÉXICO. Fig. 1. Se observa el porcentaje

Fig. 1. Se observa el porcentaje más alto de cáncer siendo el de tráquea y pulmón los más afectados. (INEGI, 2007)

En las mujeres las tres principales causa de muertes por tumores malignos son:

1. Mama (13.3%)

2. Cuello del útero (13.1%)

3. Hígado y vías biliares (7.9%) (INEGI,2007) (Fig. 2)

PRINCIPALES CAUSAS DE MUERTE EN MUJERES POR TUMORES MALIGNOS EN MÉXICO

CAUSAS DE MUERTE EN MUJERES POR TUMORES MALIGNOS EN MÉXICO Fig. 2. Se observa el porcentaje

Fig. 2. Se observa el porcentaje más alto de cáncer siendo el de mama el de mayor incidencia seguido muy de cerca por el de cuello uterino. (INEGI, 2007)

Tanto a nivel mundial como en México, el control y prevención del cáncer del

cuello uterino es de suma importancia, y se han implementado importantes

programas para su detección oportuna y su tratamiento inmediato, teniendo como

objetivo reducir el índice de mortalidad en la población femenina.

El cáncer cérvico-uterino es uno de los principales problemas de Salud Publica no

solo en la República Mexicana sino en toda América Latina. Siendo la segunda

causa mas frecuente de neoplasia en la población femenina, teniendo como

consecuencia la muerte y observándose el mayor índice de mortalidad en zonas

marginadas, en donde los programas de salud para su prevención y tratamiento

no han tenido el resultado esperado. (INEGI, 2007) (Fig. 3).

CAUSAS DE DEFUNCIÓN POR TUMORES MALIGNOS SEGÚN SEXO

CAUSAS DE DEFUNCIÓN POR TUMORES MALIGNOS SEGÚN SEXO Fig. 3 Se observan los porcentajes de tumores

Fig. 3 Se observan los porcentajes de tumores en México por sexo (INEGI, 2007)

El cáncer cérvico uterino (CaCU) representa un grave problema por su magnitud

creciente y la trascendencia en el ámbito individual, familiar, social y económico.

Es más frecuente entre los 25 y 45 años de edad, lo que significa que afecta a las

mujeres en etapa productiva.

Se ha observado que las defunciones ocurren en

mujeres sin escolaridad (30%), o que no alcanzan la primaria completa (60%).

En la República Mexicana algunos estados

presentan una mayor

incidencia

de

tazas de mortalidad de CaCU en el período del 2000 al 2006. (Programa de

Acción Específico, SS, 2007-2012) (Fig.4).

TAZAS DE MORTALIDAD POR ENTIDAD FEDERATIVA EN MÉXICO

TAZAS DE MORTALIDAD POR ENTIDAD FEDERATIVA EN MÉXICO Fig. 4 Se observa la mortalidad por estados

Fig. 4 Se observa la mortalidad por estados en la Republica Mexicana (Programa de Acción Especifico, SS, 2007-2012) 2006

CÁNCER DE CUELLO UTERINO (CaCU).

Es el crecimiento y desarrollo desordenado del recubrimiento epitelial del cérvix

uterino. De acuerdo al grado de lesión de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) las

lesiones tempranas se clasifican en: crecimiento desordenado del tercio inferior

del epitelio NIC I, la maduración anormal de los dos tercios inferiores del epitelio

NIC II. Al abarcar más de dos tercios del espesor epitelial, la lesión se clasifica

como una NIC III o Carcinoma in situ (DeCherney, 2007).

Fisiopatología

Las células a nivel del cérvix requieren estar en división constante, esta actividad

del epitelio es necesaria para reponer las células viejas o muertas, por medio de

estímulos que dependen de las moléculas de señalización extracelular. La mitosis

se inicia después de que se haya replicado la totalidad del DNA y solo permite la

división celular si se ha completado el ciclo celular. Si uno de los pasos del ciclo

celular se retrasa, el sistema de control demora la activación del siguiente paso, o

sea que si la síntesis del DNA se demora durante la fase de la síntesis (S), la

célula no progresa a la fase de la mitosis (M) con una replicación incompleta, ya

que se activan proteínas reguladoras del ciclo celular como la P53 y Rb.

Si una

célula llegara a ser dañada en la fase G1, se eleva el nivel de p53 que a su vez

activa la expresión del gen p21, deteniendo el avance del ciclo

celular, dando el

tiempo necesario para reparar el daño genético antes de iniciar la replicación del

DNA.

La proteína Rb ayuda a regular el paso de las células en la fase G1 del ciclo

celular a la fase de síntesis, durante la cual se produce la síntesis del DNA.

Aproximándose a la etapa final de fase de G1, la subunidad pRb fosforilada libera

al factor de transcripción E2F y esto marca el compromiso irreversible de la célula

para ingresar a la fase de la síntesis (S) (Lodish, 2008). Existen factores de riesgo

que pueden inducir mutaciones las cuales dan lugar a la formación de células

anormales que pueden proliferar, llegando a producir los tumores, en este caso de

cáncer de cérvix.

Cuadro clínico

Por

lo

general

no

hay

síntomas

ni

signos

de

la

neoplasia

intraepitelial.

Frecuentemente el diagnostico se basa en un resultado anormal de un frotis de

citología cervical teñida por Papanicolaou (Pap), o si al realizar un examen

colposcópico

este

revela

una

zona

de

transformación

atípica

con

epitelio

acetoblanco engrosado y capilares superficiales, con patrones punteados gruesos

o en mosaico. También es típico encontrar la lesión como un área de epitelio

escamoso que no se tiñe con yodo (prueba de Schiller positiva) (DeCherney,

2007).

Factores de riesgo

Se han observado factores de riesgo que influyen para el desarrollo de cáncer de

útero, siendo el tabaquismo, multiparidad, múltiples parejas, inicio de vida sexual

antes de los 18 años y sin protección, analfabetismo o baja escolaridad etc.

(López-Saavedra, et al; 2006, NOM-014-SSA2-1994) (Fig. 5).

FACTORES DE RIESGO RELACIONADOS CON EL CÁNCER DE CÉRVIX

FACTORES DE RIESGO RELACIONADOS CON EL CÁNCER DE CÉRVIX Fig. 5. Los factores de riesgo relacionados

Fig. 5. Los factores de riesgo relacionados con el CaCU, son el tabaquismo, multiparidad, vida sexual con múltiples parejas, inicio temprano de las relaciones sexuales, desnutrición, analfabetismo, mujeres de 25 a 64 años y el VPH.

De acuerdo con los resultados obtenidos en diversos estudios epidemiológicos, el

factor más importante asociado con el cáncer de útero es la infección por el virus

del papiloma humano (VPH), transmitido por contacto sexual. Se dice que 20% de

las mujeres contraen esta infección, al inicio de las relaciones sexuales, pero la

mayor incidencia se presenta entre los 25 a 45 años de edad.

La infección por el VPH es un proceso crónico que se describe como un espectro

de la enfermedad, ésta puede progresar durante meses o años, desde el primer

contagio hasta que se presenta primero la displasia y posteriormente esta continúa

agravándose, hasta desarrollar finalmente un cáncer invasor. Sin embargo, la

persistencia del VPH 16 y el VPH18, se asocia con más frecuencia con el

desarrollo de lesiones de alto grado y por lo tanto a un cáncer de cérvix (Long Fu

Xi, 2006).

Los factores de riesgo más importantes para desarrollar cáncer cervical, se

pueden enumerar como sigue:

1. Tabaquismo

Un estudio hecho en el departamento de Obstetricia y Ginecología de

Escandinavia, mostró que las mujeres fumadoras tienen un alto grado de

prevalencia de lesiones intraepiteliales escamosas 40% en comparación

con las mujeres no fumadoras que presentan un 6%. Esto se atribuye a que

las toxinas inhaladas de los cigarrillos se acumulan en el moco cervical

actuando como mutágenos (Wolfgangeppel, 2005)

2. Multiparidad

El hecho de tener múltiples embarazos favorece el desarrollo del cáncer de

cérvix debido a los cambios hormonales que ocurren durante el embarazo,

siendo susceptible la zona de transición del cérvix. Además el trauma de

esta zona al paso del producto durante el parto, es otro factor que lesiona la

zona de transformación, por lo que es importante (Lazcano-Ponce, 1993).

3. Contacto sexual con múltiples parejas (tanto la mujer como su esposo).

En clínicas de Nicaragua determinaron la prevalencia de factores de riesgo

en infecciones de transmisión sexual encontrando que la promiscuidad

condiciona a la aparición de un alto grado de lesiones intraepiteliales

escamosas del cérvix uterino (H-SIL) (Claeys P, 2002).

4. Inicio temprano de las relaciones sexuales (antes de los 18 años)

El inicio de la vida sexual temprana, favorece la infección por virus del

papiloma humano por la omisión en el uso de métodos preventivos contra

infecciones de transmisión sexual, tales como el condón.

5. Deficiencia de folatos y vitaminas A, C, E en la dieta

Los radicales libres que nuestro organismo produce y bajo el control de los

antioxidantes,

permite

formar

defensas

para

los

virus

y

bacterias

protegiendo la salud, como por ejemplo: los betacarotenos (precursores de

Vitamina

A,

Vitamina

C,

Vitamina

E,

Glutatión,

acido

fólico,

etc.

(antioxidantes, 2008).

 

6. Analfabetismo o baja escolaridad

 

La

baja

escolaridad,

que

es

reflejo

de

un

nivel

de

educación

en

conocimientos generales y la carencia total de información para la salud

sexual, principalmente en zonas marginadas, hace que la mayoría de

mujeres en esta condición, no acudan a realizarse citologías vaginales y no

se puedan diagnosticar a tiempo las lesiones tempranas del cáncer del

cérvix.

7. Las mujeres con vida sexual activa de 25 a 64 años que nunca se hayan

practicado Pap (López-Saavedra, 2006). Las mujeres que se realizan Pap

al menos una vez al año, tienen mas probabilidad de detectar a tiempo una

lesión temprana y por tanto de recibir un tratamiento que la erradique.

8. La infección cervical por virus del papiloma humano

Se ha observado que el VPH es el principal factor de riesgo para el cáncer

de cérvix, ya que en estudios epidemiológicos, en la gran mayoría de las

biopsias de cáncer invasor se encontraron secuencias de los tipos de virus

HVP16 y predominantemente el HVP18. Algunas de las muestras de cáncer

cervical expresaban en sus células las oncoproteínas virales E6 y E7

(Harald zur Hausen, 2002).

Prevención

Prevenir la aparición del cáncer cérvico uterino significa

modificar conductas o

realizar acciones orientadas a evitar o disminuir los factores de riesgo que

aumentan la posibilidad de desarrollar tumores (León, 2008; Muñoz, 2007).

Este contexto, puede estar enfocado en dos aspectos:

Prevención primaria con aplicación de vacunas profilácticas contra los VPH en

la edad infantil o adolescencia, la divalente contra los tipos virales 16 y 18 y la

tetravalente contra los tipos 6, 11, 16 y 18 que expresan las proteínas E6 y E7

con el propósito de evitar la aparición de cáncer cervical. (Harald zur Hausen,

2002).

Prevención

secundaria,

ésta

se

refiere

a

la

detección

temprana

de

la

enfermedad, que se lleva a cabo mediante la tinción de Papanicolaou una vez

al

año

y revisiones

que

incluyen

la

auscultación

directa del cérvix

por

colposcopía con foto-documentación de las lesiones. Para la prevención de las

lesiones precursoras y de cáncer invasor, un aspecto fundamental es la

detección de la infección por el virus, en una etapa temprana mediante

coilocitosis en la citología vaginal teñida por Papanicolaou (NOM-014-SSA2-

1994).

No obstante los avances en este campo, continua siendo primordial la educación

para la salud, la información veraz y oportuna para la población y la promoción de

un ejercicio de la sexualidad de manera informada, segura, responsable y libre

(Pérez-Cruz, 2005).

Diagnóstico

Para el diagnostico de los tipos oncogénicos del VPH, se utilizan diferentes

técnicas pero el estudio de la citología cervical es el método de elección para la

detección oportuna del cáncer de cérvix, además del ensayo de captura de

híbridos que determina el tipo oncogénico presente en la muestra. La muestra

para captura de híbridos, se toma en forma de un cepillado endocervical; se trata

de una prueba biomolecular, basada en la amplificación de la señal de híbridos en

solución in vitro, para detectar blancos de DNA o RNA del VPH y se obtienen

células del canal endocérvical a través de un cepillo especial para su examen

microscópico.

El Papanicolau

es un análisis de citopatología ginecológica que consiste en la

tinción con el colorante especial diseñado por este investigador, se usa para

detectar el cáncer cervical y la infección por VPH, además de otras entidades

inflamatorias de menor importancia como la hiperplasia. El Pap es parte de un

examen pélvico, tiene una alta sensibilidad (75%) y especificidad (95%), con una

tasa de resultados negativos que varia del 5 a 50%, pero al repetir el estudio

disminuye la tasa de 1 a 2% (Fig. 6).

Para la toma es necesario acceder directamente al cuello del útero mediante un

espejo vaginal y que la mujer no esté menstruando, se toma una muestra

suficiente del exocérvix y endocérvix, para después extender las células del

cepillado cervical en una laminilla de vidrio (portaobjetos para microscopía) en la

que las células se fijan con spray para el cabello. (Ríos Pérez Mirta, 2009, NOM-

014-SSA2-1994)

TECNICA PARA LA TOMA DEL PAPANICOLAU

NOM- 014-SSA2-1994) TECNICA PARA LA TOMA DEL PAPANICOLAU Fig. 6. El Pap es un análisis para

Fig. 6. El Pap es un análisis para detectar el cáncer cervical en forma preventiva, mediante un examen pélvico, con una sensibilidad del 75% aproximadamente y una especificidad del 95% (Ríos Pérez Mirta, 2009).

Después de tomada la muestra se procede a su análisis para observar las

anomalías que pudieran haber, las cuales se clasifican de acuerdo al grado de

alteración.

Dentro de la clasificación de las neoplasias cervicales hay varias vertientes, entre

las más importantes está la clasificación de Bethesda, la cual toma en cuenta las

características de las lesiones y de las células encontradas con el exámen de

Papanicolaou y determina el grado de lesión, como se describe a continuación.

La neoplasia intraepitelial cervical (NIC) con tres grados progresivos (1, 2, 3),

incluyéndose en el grado 3 la displasia grave (Lacruz, 2003) (Fig. 7).

CIN I Displasia leve

CIN II Displasia moderada

CIN III Displasia intensa y CIS

NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL CON SUS GRADOS

PROGRESIVOS

NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL CON SUS GRADOS PROGRESIVOS Fig. 7. La clasificación de Bethesda de las neoplasias

Fig. 7. La clasificación de Bethesda de las neoplasias del cérvix uterino. Se aprecian las características de las lesiones y de las células encontradas en la biopsia como método de diagnóstico preventivo.

En abril de 1991 se hacen correcciones a la clasificación de Bethesda (Maryland,

EEUU) en donde incluyen las mencionadas en la Tabla 1.

 

Tabla 1. CORRELACIÓN ENTRE LAS DIFERENTES CLASIFICACIONES

Reagan, 1956

Richart, 1973

Bethesda, 1991

Normal

Normal

Normal

 

VPH

Displasia leve

NIC I

VPH L-SIL

D.

moderada

NIC II

D.

intensa

NIC III

H-SIL

"in situ"

NIC III

Clasificaciones de displasia (D. LEVE- displasia leve, NIC-Neoplasia Intraepitelial Cervical, VPH-Virus del Papiloma Humano, L-SIL-Lesiones Intraepiteliales Escamosas de Bajo Grado, H-SIL- Lesiones Intraepiteliales Escamosas de Alto Grado) (Bethesda,

2001).

(D. LEVE- displasia leve, NIC-Neoplasia Intraepitelial Cervical, VPH-Virus del

Las aportaciones de la más reciente clasificación de Bethesda son las siguientes:

Clasifica las anomalías de las células en categorías: NORMAL, ATIPIA,

L-SIL

(lesión

intraepitelial

escamosa

de

bajo

grado;

H-SIL

(Lesión

intraepitelial escamosa de alto grado) y el carcinoma invasor.

Evaluación hormonal, Recomendaciones clínicas

Correlación entre las diferentes clasificaciones (Tabla 2):

CLASIFICACIÓN ACTUAL DE BETHESDA, LESIONES CERVICALES.

Papanicolaou

I

II

III

IV

V

         

Carcinoma

CIN

0

I

II

III

invasor

           

Carcinoma

Bethesda

Normal

Atipia

L-SIL

H-SIL

invasor

Tabla 2: Clasificación actual de lesiones cervicales (Bethesda, 2001).

Tratamiento para el cáncer de cuello del útero

Los tratamientos en la actualidad son variados de acuerdo al sitio donde se

encuentre la lesión en el cérvix y tienen como finalidad la de erradicar la lesión.

Los efectos secundarios de algunos métodos conservadores como dolor, infección

bacteriana o fúngica de las lesiones, o la falta de educación para la salud, hacen

que las pacientes no terminen sus tratamientos y al no regresar al consultorio

quedan en un alto riesgo de que su lesión de lugar a metástasis precozmente

(Ahued, 2003; DeCherney, 2007).

Los tratamientos más comunes para destruir células cancerosas en el cuello del

útero son:

Cauterización o electrocirugía: empleo de la corriente eléctrica alterna de

alta frecuencia para escindir la zona de transformación y la lesión maligna

sobre el cérvix con una profundidad no menor a 5 mm.

Criocirugía: Aplicación de temperatura inferior a cero grados centígrados,

que alcanza el punto de congelación en las células produciendo la muerte

celular.

Cirugía laser ambulatoria: Uso de la energía fotónica para la destrucción o

escisión de las lesiones y las zonas de transformación del cuello uterino.

Conización:

Resección

quirúrgica

de

una

lesión

de

la

zona

de

transformación del cuello uterino con una profundidad no menor a 5 mm.

También se denomina cilindro o cono diagnostico.

Histerectomía: Intervención quirúrgica para extirpar totalmente el útero por

vía vaginal o abdominal que se sugiere realizar desde el NIC II.

Radiación: Uso de rayos X o de implantes de radium cerca de las células

anormales para destruir las células cancerosas.

Quimioterapia: Uso de sustancias químicas antitumorales para destruir las

células cancerosas.

Terapia combinada: Se utiliza cirugía quirúrgica y los tratamientos de

radiación y quimioterapia (LALCEC, 2000; NOM-014-SSA2-1994).

Deben buscarse alternativas de tratamientos conservadores tratando de que estos

sean menos riesgosos y que ofrezcan mayores beneficios, preferentemente con

menos efectos secundarios que impidan finalizar el tratamiento. Una buena

educación y concientización de las pacientes sería una excelente alternativa, ya

que no siempre les queda claro que su vida queda en riesgo de no terminar con

las células tumorales.

Se han realizado estudios para encontrar tratamientos más eficaces. Se ha

experimentado con medicamentos homeopáticos, en modelos de líneas celulares

tumorales, no tumorales (Kutan, 2007; Olvera, 2009).

Líneas celulares derivadas de cáncer cervical.

Se han hecho estudios encaminados a detectar alteraciones a nivel celular y

molecular en el cáncer cérvico uterino

y observar la inhibición de la proliferación

de cultivos expuestos con diferentes tratamientos, uno de estos modelos in vitro

utilizados para estudios del cáncer cervical son las células HeLa.

Células HeLa

Las células HeLa provienen de una mujer afroamericana de 31 años de edad

llamada Henrietta Lacks a quien le diagnosticaron un carcinoma invasor de cérvix

uterino y murió a causa del mismo (Fig. 8).

.

MICROGRAFÍA DE LAS CÉLULAS HELA

del mismo (Fig. 8). . MICROGRAFÍA DE LAS CÉLULAS HELA Fig. 8 La línea celular Hela

Fig. 8 La línea celular Hela vistas a baja densidad y alta densidad (ATCC, American Type Culture Collection)

El Dr. George Otto Gey tomó una muestra del tejido epitelial del cérvix e inicio la

realización de cultivos derivados de estas células.

Sus características como línea celular de origen tumoral son las siguientes: tienen

un periodo de duplicación de 24 horas, requieren de un periodo de estabilización

de 4 a 5 horas luego de sembrarse en placas, su transportación se debe realizar

en viales congelados, estas células contienen secuencias de DNA del virus del

papiloma humano 18 (VPH18) que se transcriben activamente. Este modelo de

línea celular es representativo, estable, presenta inmortalización y transformación

maligna y puede emplearse en el estudio in vitro de éste tipo de cáncer ya que

proviene de un carcinoma invasor de cérvix.

HOMEOPATÍA

Han pasado más de 200 años en que la Homeopatía solo se basaba en la

experiencia de los médicos que utilizan los medicamentos homeopáticos para

tratar a los pacientes. En la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía se hacen

esfuerzos para trabajar sobre esta área de investigación a través de caminos

indirectos diferentes y variados, que sugieren

que estos remedios

pueden tener

algunas acciones eficaces sobre los crecimientos malignos y sus diferentes

etapas.

Los medicamentos homeopáticos antitumorales conocidos hasta ahora se han

aplicado y probado en la India y los Estados Unidos. En algunos estudios

realizados por el Dr. Kutan G. de la India (2007), en su artículo de “Preparaciones

dinamizadas en cultivos celulares”, por ejemplo observo que Thuja y Lycopodium

eran sumamente citotóxicos en células de carcinoma de ascitis de Ehrlich (Ehrlich

ascites carcinoma- EAC) (Fig. 9).

EFECTO DE LA TINTURA MADRE Y MEDICAMENTOS DINAMIZADOS

Drogas Porcentaje de células muertas
Drogas
Porcentaje de células muertas

Fig. 9. Efecto de la tintura madre y medicamentos dinamizados en células de carcinoma de ascitis de Ehrlich. (a) Control no tratado, (b) diluyente dinamizado, (c) Thuja, (d) Hydratsis, (e) Lycopodium, (f) Conium, (g) Carcinosinum, (h) Ruta, (i) Chelidonium, (j) Condurango, (k) Podofhyllum, (l) Phytolacca. Fila oscura-Tintura madre; Fila gris-30c; Fila blanca-200c. *P<0.01 (Kutan, 2007).

Una

recopilación

de datos

por el

Dr.

Roy Ranjit

K (2008) en

su

libro “La

homeopatía en el tratamiento del cáncer” nos ilustra como los síntomas o signos

del paciente con cáncer nos pueden orientar a elegir el medicamento homeopático

adecuado, tal como lo menciona Hahnemann en el principio de la Ley de los

Semejantes.

El medicamento Thuja, fue descrito por Hahnemann para la Sycosis. Fortier-

Bernoville observó que todas las lesiones malignas tempranas, son susceptibles a

este medicamento, para todos los tipos de pre-canceres y cánceres tempranos

(mencionado en Ranjit, 2008).

Otros medicamentos que pueden ser prescritos para varios tipos de cáncer, son

aquellos que están indicados para los síntomas psicológicos que se suscitan al

recibir la noticia de tener cáncer. Por ejemplo: después del diagnostico, todos las

pacientes con cáncer, sufren de un estado mental de severa ansiedad, inquietud,

miedo a la enfermedad y miedo a la muerte. Arsenicum album puede ser un

medicamento indicado en estos casos.

Para

cánceres

de

órganos

genitales

femeninos

se

ha

observado

que

el

Kresosotum y otros carbones como: Carbo animalis, Carbo vegetabilis y Graphites

son medicamentos muy útiles (Ranjit, 2008).

J. H. Clarke (1986) en su materia médica menciona un número de medicamentos

que tienen acción contra el cáncer. Olvera en su tesis de Especialidad en

Homeopatía encontró que Arsenicum album a la 1c y 3c inhibió el crecimiento de

células HeLa in vitro (Olvera, 2009) (Fig. 10).

Ustilago maydis es útil para el tratamiento de los fibromas (Ranjit K Roy, 2008),

por lo que piensa que el medicamento Ustilago maydis pudiera tener acción en la

inhibición de procesos cancerígenos del útero.

Porcentaje

EFECTO DE ARSENICUM ÁLBUM EN CÉLULAS HELA IN VITRO.

Viabilidad del total

ÁLBUM EN CÉLULAS HELA IN VITRO . Viabilidad del total 100% Fig. 10. Se observa disminución

100%

Fig. 10. Se observa disminución de células HeLa a las diluciones de 1c y 3c (Olvera, 2009).

Ustilago maydis

Familia de los hongos: Tizones o carbones

Los hongos que constituyen el último grupo de los basidiomicetes son los

Ustilaginales, nombre relacionado con el latín Ustus, quemado, porque reducen

los granos de maíz y de otros cereales a una masa negra y pulverulenta, como el

hollín.

Los filamentos de estos hongos penetran también en la planta en que se han de

hospedar y se desarrollan dentro de ella, entre sus células, y, principalmente, en

los órganos florales. Las masas filamentosas se

resuelven, finalmente, en sus

células elementales, de paredes muy engrosadas y de color oscuro, que son las

esporas. Los basidios, nacen también de las esporas que forman el carbón o tizón.

Ustilago maydis (latín) pertenece a la familia de las Ustilagináceas y es una

infección fúngica del maíz que afecta a los tallos, los granos y las flores de las

mazorcas. La lesión es suave, esférica, lobulada, el color varía de un color pardo

azuloso a negruzco, tiene un aroma fuerte y desagradable (Zepeda, 2006).

Ustilago maydis

Tambien

es

conocido

como

tizón

del

maíz

(Sinónimos:

Carbón

del

maíz,

Carboncillo del maíz, Bolsas del maíz, Congorcio, Cuitlacoche o Huitlacoche. Este

hongo vive en el interior del maíz y cuando es tiempo de esporular, produce unas

agallas carnosas, de color blanquecino a veces azulosos o lívidos, de forma

irregular y de dimensiones variables, poco mayores que las de los granos de este

cereal o tamaños como de la cabeza de un infante; unas se forman en las

mazorca; otras en los tallos, comúnmente en la base de estos. Pero todas se

resuelven en gran cantidad de polvo negro y maloliente, Aparecen cuando el maíz

está ya en avanzado estado de desarrollo y durante la salida del grano del elote.

De

la

masa

esporífera

del

tizón

del

maíz

se

han

aislado

dos

alcaloides

cristalizados, la ustilagenina y la ustilagotoxina, que corresponden a la ergotonina

y a la ergotoxina del cornezuelo de centeno. También contiene lactoflavina y

vitaminas, entre las otras sustancias. En los Estados Unidos de Norteamérica se

preconiza el uso del extracto fluido de este tizón por sus excelentes virtudes

hemostáticas y para promover y facilitar el parto. Sería tanto y más activo que el

cornezuelo de centeno y menos tóxico.

Su uso debe quedar

reservado exclusivamente a los facultativos; no por su

toxicidad, sino por sus facultades abortivas (Pio Font Quer, 1979) (Fig. 11).

ELOTE PARASITADO CON EL HONGO DE Ustilago maydis

(Fig. 11). ELOTE PARASITADO CON EL HONGO DE Ustilago maydis Fig. 11. Se aprecian diferentes tamaños

Fig. 11.

Se aprecian diferentes tamaños del hongo en el maíz. (Foto de Inforural.

Com.mx)

Patogenesia de Ustilago maydis

En la experimentación pura los resultados de la patogenesia esta reportada en la

materia médica como: Cuello uterino esponjoso, suave, tumefacto, sangrando por

el menor contacto (Vijnosky, 2002; Vannier, 2008). Uno de los principales signos

del cáncer cervicouterino es el sangrado transvaginal y siendo reportado en la

materia medica, se debe realizar investigación para observar que efecto tiene

Ustilago maydis en el tratamiento del cáncer del cérvix.

Según Stevens (Diseases of Economic Plants, 1921) en América esta especie fue

mencionada por primera vez en 1754. En Europa, y más concretamente en

Francia se había introducido ya, por lo menos en 1815.

Pero el uso médico del tizón del maíz no empezó hasta el último tercio del siglo

pasado, en medicina homeopática. Hace unos 20 años que su empleo parece

ganar terreno en farmacología, sobre todo en Norteamérica.

Practica homeopática

Se menciona en la literatura médica homeopática por el doctor Küchenmaister en

1845. La experimentación pura fue reportada por el Dr. Heyne en 1872. (Allen, T.,

1872).

JUSTIFICACIÓN

El cáncer cérvico uterino (CaCU) ésta aumentando su tasa de mortalidad en

Latinoamérica, siendo la segunda causa de muerte en mujeres mayores de 25 a

45 años, lo mismo que en México (INEGI 2007). Se ha encontrado una relación

importante entre el virus del papiloma humano (VPH)

cérvico-uterino (CaCU).

y el desarrollo de cáncer

Este cáncer afecta a mujeres en la etapa productiva de sus vidas teniendo un

impacto negativo en su ámbito familiar, social, y comunitario (Programa de Acción

Especifico, SS, 2007-2012); su tratamiento y control se ubican entre los costos

más altos en la medicina. Esto representa un grave problema de salud pública por

su magnitud creciente y su trascendencia en las mujeres, causando la muerte.

En el campo de la homeopatía existen medicamentos que en su patogenesia

presentan signos semejantes a los reportados para el CaCU, entre los cuales

destaca

Ustilago

maydis,

el

cual

tiene

una

acción

sobre

el

cérvix

uterino

presentando hipertrofia, tumefacción y hemorragias al menor contacto.

El CaCU provoca sangrado transvaginal, observado por colposcopia se aprecia un

cérvix tumefacto, sensible al tacto, siendo esta característica la misma

que

provoca el tratamiento con Ustilago maydis en personas sanas.

Por lo anterior consideramos que es de gran importancia evaluar el efecto que

tiene el Ustilago maydis sobre la células Hela, debido a que estas provienen de un

cáncer cérvico uterino.

Hipótesis

Dado

que

produce

una

patogenesia

similar

a

la

del

cáncer

de

cérvix,

consideramos que Ustilago maydis podría mostrar su utilidad como medicamento

antitumoral al disminuir la viabilidad o causar citotoxicidad in vitro en células HeLa.

Objetivo General

Evaluar el efecto de Ustilago maydis como un probable tratamiento contra el

cáncer cervicouterino, usando tratamientos con la Tintura (Ø) diluida hasta la 6C y

30C, en un ensayo in vitro para evaluar la viabilidad de la línea celular HeLa.

Objetivos Particulares

1. Determinar la viabilidad de células HeLa en los cultivos celulares sin

tratamiento.

2. Determinar si Ustilago maydis tiene efecto sobre la viabilidad de las células

HeLa empleando tratamientos con la tintura.

3. Determinar si Ustilago maydis tiene efecto sobre la viabilidad de las células

HeLa empleando tratamientos a la dilución 6C.

4. Determinar si Ustilago maydis tiene efecto sobre la viabilidad de las células

HeLa empleando tratamientos a la dilución 30C.

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Se procedió a la estandarización de los cultivos de las células HeLa. Para

observar su viabilidad, se depositaron 200 000 células en cada pozo de una placa

para cultivos de células de fondo plano.

La preparación de los tratamientos que se utilizaron para los cultivos celulares fue

como sigue: un control negativo en el que se mezcla un volumen de alcohol con

dos de agua y luego se evapora solamente el vehículo (alcohol), quedando el

volumen

acuoso.

Por

separado

se

realizó

el

mismo

procedimiento

con

el

medicamento homeopático que contiene Ustilago maydis en las tres formas a

ensayar, como tintura, a

la

6c

y

a

la

30c. En

los ensayos se

les agregó los

tratamientos a las células en sus pocitos y se dejarón por 24 horas de incubación

a 37º en presencia de CO 2 al 5%. A continuación se tripsinizó la monocapa y se

resuspendieron en medio DMEM complementado con suero al 10%.

Una alícuota de 20 microlitros se tomó y las células contenidas en ese volumen,

se tiñeron con azul de tripano para realizar la cuenta viable en una cámara de

Neubauer, esto se repitió dos veces y los datos se vaciaron en una hoja de cálculo

para posteriormente obtener el análisis estadístico (Fig. 12).

Diseño de la estrategia experimental

.

Diseño de la estrategia experimental . Fig. 12 Estrategia experimental 44

Fig. 12 Estrategia experimental

Material y métodos

1. Células HeLa.

2. Medio nutritivo DMEM.

3. Suero fetal bovino (SFB) al 10%.

4. Unidades de filtración desechables para medio.

5. PBS (Soluciòn Buffer de Phosphatos).

6. Solución de Penicilina-estreptomicina.

7. Ustilago maydis tintura, 6c y 30c.

8. Alcohol homeopático 87º.

9. Azul de tripano.

10. Agua destilada.

11. Tripsina.

Instrumental

1. Botella de 25 cm 2 para cultivo o caja petri 10 cm de diámetro.

2. Microscopio invertido Eclipse TS100 Marca Nikon. NIS immage.

3. Placa de 24 pozos de fondo plano. especial para cultivos celulares.

4. Tubo eppendorf de 1.5 ml.

5. Cámara de Neubauer.

6. Vaso de precipitado de 500 ml.

7. Jeringas de 5 ml.

8. Puntas desechables de 200/1000 µl.

9. Puntas de 20/200 µl.

10.

Micropipetas automáticas de 20, 200, 1000 µl.

11. Filtros de 0.22 micras.

12. Frasco color ámbar de 30 ml.

13. Gasas estériles de 10 x 10 cm.

Equipo

1. Microscopio invertido marca Nikon modelo Eclipse TS 100, Class II Type

A2.

2. Centrifuga para tubos eppendorf.

3. Campana de flujo laminar marca Nuaire Biological Safety Cabinets.

Metodología

Obtención de células HeLa

Las células HeLa se

obtuvieron

por donación del Dr. Patricio Gariglio

del

Departamento de Genética del CINVESTAV, Ciudad de México, en una caja petri

para cultivo como se observa en la

Fig. 13

y

en

la

Fig. 14 se muestran

suplementos y el medio de cultivo empleado.

los

CÉLULAS HeLa EN CAJA DE PETRI

CÉLULAS HeLa EN CAJA DE PETRI Fig. 13. Obtención de Células HeLa por donación del Departamento

Fig. 13. Obtención de Células HeLa por donación del Departamento de genética del CINVESTAV.

MEDIOS NUTRITIVOS ESPECIALES PARA CULTIVO DE CÉLULAS

MEDIOS NUTRITIVOS ESPECIALES PARA CULTIVO DE CÉLULAS Fig. 14. Medio de cultivo contiene DMEM, Suero Fetal

Fig. 14. Medio de cultivo contiene DMEM, Suero Fetal Bovino (SFB) al 10% y ciproxina o Penicilina/Estreptomicina como antibiótico.

Mantenimiento del cultivo

Las células HeLa se cultivaron en botellas de 25 cm 2 con 5 ml de DMEM al 10%

de SFB y penicilina-estreptomicina; se incubaron a 37º y 5% de CO 2 en una

incubadora el tiempo necesario para llegar a una confluencia del 80%. Se cuidó

que las células tuviesen la morfología que marca el ATCC (American Type Culture

Collection) como se muestra en la figura 15.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE CÉLULAS HELA (ATCC)

15. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE CÉLULAS HELA (ATCC) Fig. 15 Células HeLa vistas a baja y alta

Fig. 15 Células HeLa vistas a baja y alta densidad

Tripsinización en la campana de flujo laminar

A una confluencia de 80%, se tripsinizó para separar las células de la placa, de la

siguiente manera:

1. Se aspiró el medio DMEM con una pipeta Pasteur nueva.

2. Se adicionaron de 2 a 3 ml de PBS (1X) a 37ºC y se agitó suavemente.

3. Se elimino el PBS y se volvieron a lavar las células con PBS nuevo.

4. Se retiró el PBS del lavado anterior y se adicionó 1 ml de tripsina.

5. Se dejaron las células con la tripsina por 5 minutos.

6.

Se observaron al microscopio que las células estuvieran redondeadas y

despegadas.

7. Se agregaron 2 ml de DMEM para neutralizar la tripsina.

Tinción con azul de tripano

Para realizar las cuentas viables de cada condición:

1. Se colectó el medio + tripsina en un tubo eppendorf

(15ml) para

centrifugarse a 1500 rpm a 4º por 5 minutos.

2. Se decantó el medio y al pellet (botón) de células se le adicionaron 2 ml

de DMEM, se homogenizó suavemente sin hacer burbujas.

3. Una vez que se homogenizó la suspensión celular, se tomaron 50 µl (de

la parte media del tubo) y se adicionaron a un tubo eppendorf

azul de tripano.

50µl de

4. La mezcla anterior se homogenizó suavemente, y se tomaron 20µl de la

suspensión y se colocaron en la cámara de Neubauer

(Fig. 15) y se

observaron los cuatro cuadrantes de las esquinas, contando el número

de células vivas (células refringentes) y células muertas (color azul).

5. Este procedimiento se repitió por 3 ocasiones, a fin de obtener la media

y la desviación estándar.

Para conocer el número de células por ml se empleo la siguiente formula.

obtener la media y la desviación estándar. Para conocer el número de células por ml se

CAMARA DE NEUBAUER

CAMARA DE NEUBAUER Fig. 16. Se utiliza para el conteo de células, por el sistema de

Fig. 16. Se utiliza para el conteo de células, por el sistema de cuadriculado especial con que cuenta.

CUADRICULADO ESPECIAL DE LA CÁMARA DE NEUBAUER

que cuenta. CUADRICULADO ESPECIAL DE LA CÁMARA DE NEUBAUER Fig. 17. Se utilizan los cuadros que

Fig. 17. Se utilizan los cuadros que se observan en las 4 esquinas de la cuadrícula para el conteo de las células, las azules están muertas.

Evaporación del alcohol homeopático

En un vaso de precipitado de 500 ml se agregaron 5 ml de alcohol homeopático de

87º más 10 ml de agua destilada, quedando un total de 15 ml, esto se hace para

tener un control negativo adecuado. Se cubrió este preparado con una gasa para

evitar la contaminación y se dejó por 24 hrs a temperatura ambiente, a fin de que

se evaporara el alcohol 87, quedando solamente 5 ml de la solución acuosa. Este

mismo procedimiento se llevó a cabo con la Tintura, 6c y 30c de Ustilago maydis

(Fig.18).

EVAPORACIÓN DEL ALCOHOL HOMEOPÁTICO

maydis (Fig.18). EVAPORACIÓN DEL ALCOHOL HOMEOPÁTICO Fig. 18. Se agregó en un vaso de precipitado 5

Fig. 18. Se agregó en un vaso de precipitado 5 ml de alcohol homeopático además Ustilago maydis en Tintura a la 6c y 30c, en forma independiente más 10 ml de agua destilada a cada uno.

Cultivo celular y aplicación de Ustilago maydis

En una placa de 24 pozos de fondo plano para cultivo celular se sembraron

100,000 cél /ml en 15 pozos. Se incubaron estas celulas por 24 horas. Sabiendo

que el tiempo de duplicación de las células Hela es de 24 horas aproximadamente,

al día siguiente contábamos con 200 000 cél/pozo.

A estos pocillos se les adicionaron 200 µl del tratamiento: alcohol evaporado,

Ustilago maydis en tintura, medicamento a la 6c y a la 30c.

A

los pozos con células no tratadas se les adicionaron 200 µl de DMEM fresco a

fin

de homogenizar todos los tratamientos.

Se empleó el siguiente esquema de tratamiento:

1. Control: Se agregaron células HeLa, en tres pozos (A, B, C)

2. Vehículo: Se agregaron células HeLa y alcohol homeopático evaporado.

3. Tintura: Se agregaron células HeLa y tintura de Ustilago maydis.

4. Ustilago maydis 6C: Se agregaron células HeLa y medicamento.

5. Ustilago maydis 30C: Se agregaron células HeLa y medicamento

Las células se incubaron a 37ºC en presencia de CO 2 al 5% durante 24 horas, en

la Figura 19 se muestra la forma en que se aplicaron los tratamientos.

PLACA DE POZOS PARA CULTIVOS CELULARES

A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 C3 C4 C5
A1
A2
A3
A4
A5
B1
B2
B3
B4
B5
C1
C2
C3
C4
C5

Fig. 19. Solo se utilizaron 15 pozos de los 24 que trae la placa para cultivos celulares

Determinación de la viabilidad celular después de la administración de

Ustilago maydis

Técnica: Determinación de viabilidad de células por exclusión de azul de tripano.

Transcurrido las 24 horas con el medicamento, se realizó la siguiente operación en

la campana de flujo laminar.

1. Se aspiró el medio.

2. Se agregó 200 µl de PBS (1X) a temperatura ambiente a cada pozo para

lavar las células una sola vez.

3. Se quitó el PBS y se adicionó 200 µl de tripsina a cada pozo por 5 minutos.

4.

Una vez finalizado el tiempo se observaron al microscopio las células para

confirmar si se despegaron por completo.

5. Posteriormente

se

agregó

400

neutralizar la tripsina.

µl

de

DMEM

con

SFB

al

10%

para

6. Se colectó el medio + tripsina

y se coloco en un tubo eppendorf nuevo;

esta operación se repitió por cada tratamiento. A fin de que las células se

mantuviesen vivas, los tubos se trasladaron en hielo.

7. Se centrifugaron los tubos a 1500 rpm a 4º por 5 minutos.

8. Finalizado el tiempo, se decantó el sobrenadante dejando solo el pellet (en

hielo).

9. Se agregó 400 µl de PBS que son del lavado de cada pozo y se centrifugó

nuevamente a 1500 rpm a 4º por 5 minutos.

10. Se decantó el sobrenadante y se adicionaron 500 µl de PBS, el cual se

homogenizó suavemente y se tomaron 50 µl de la suspensión celular, estos

50 µl se mezclarón

con 50

homogenizó suavemente.

µl de azul de tripano

y

toda la mezcla se

11. Se tomó 20 µl de la suspensión anterior y se colocó en la cámara de

Neubauer para el conteo de células (Fig. 19).

12.Se realizó el conteo en los cuatro cuadrantes anotando el número de

células vivas (células refringentes) y el número de células muertas (color

azul).

13.Se contó cada ensayo por triplicado.

14.Se graficó y se realizó el análisis estadístico mediante la aplicación de los

datos al programa Stata.

RESULTADOS.

Con la finalidad de comprobar el efecto de Ustilago maydis en el tratamiento del

cáncer cervicouterino, evaluamos la viabilidad celular de las HeLa en ausencia y

presencia de los diferentes tratamientos homeopáticos.

Se tomaron fotografías de las células HeLa antes de adicionar los diferentes

tratamientos, a fin de corroborar su morfología característica como lo marca la

ATCC e identificar los cambios posteriores atribuibles a los tratamientos.

.

FOTOGRAFÍAS DE CÉLULAS HELA

a los tratamientos. . FOTOGRAFÍAS DE CÉLULAS HELA Fig. 20 Células HeLa (20X y 40X). La
a los tratamientos. . FOTOGRAFÍAS DE CÉLULAS HELA Fig. 20 Células HeLa (20X y 40X). La
a los tratamientos. . FOTOGRAFÍAS DE CÉLULAS HELA Fig. 20 Células HeLa (20X y 40X). La

Fig. 20 Células HeLa (20X y 40X). La morfología celular que se aprecia corresponde a la documentada por la ATCC.

Después de agregar los diferentes tratamientos a las células en cultivo, se observó

y se foto-documentó al microscopio invertido el resultado (10X, 20X), luego de 24

horas de incubación. Los resultados se muestran en la siguiente figura (Figura 20)

COMPARACIÓN DE CÉLULAS LOS TRATAMIENTOS HELA A 10X Y 20X A LAS 24 HORAS CON

Control

Alcohol

Tintura

Um 6c

Um 30c

10X

LAS 24 HORAS CON Control Alcohol Tintura Um 6c Um 30c 10X 20X Fig. 21 Imágenes
LAS 24 HORAS CON Control Alcohol Tintura Um 6c Um 30c 10X 20X Fig. 21 Imágenes
LAS 24 HORAS CON Control Alcohol Tintura Um 6c Um 30c 10X 20X Fig. 21 Imágenes
LAS 24 HORAS CON Control Alcohol Tintura Um 6c Um 30c 10X 20X Fig. 21 Imágenes
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20X

24 HORAS CON Control Alcohol Tintura Um 6c Um 30c 10X 20X Fig. 21 Imágenes de
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Fig. 21 Imágenes de las células HeLa a las 24 hrs con los diferentes tratamientos empleados, captadas con objetivo 10X y 20X.

Se determinó la viabilidad por exclusión del azul de tripano, como se mencionó en

el apartado de metodología, encontrando los siguientes resultados.

A las 24 horas encontramos que en las células sin tratar y en las células en que se

aplicó el tratamiento con el “simulador” (usando el agua después de evaporar el

alcohol homeopático), no se observaron alteraciones en la viabilidad celular (Fig.

21). En las condiciones con tratamiento de Ustilago maydis tintura, a la 6c y 30c al

microscopio solo se observaron algunas células muertas (ver mas adelante las

cuentas viables). En los tratamientos con Ustilago maydis a la 6c y a la 30c

aparentemente no se condiciono la viabilidad celular.

Por otra parte, en el experimento con la tintura de Ustilago maydis, la viabilidad fue

menor en comparación con un control sin tratamiento, lo que indica que su

contenido lleva inhibidores del crecimiento o la proliferación celular.

Por otra

parte, la viabilidad en el experimento con tintura también resultó menor al

compararla contra los tratamientos empleando las diluciones de Ustilago maydis a

la 6c y a la 30c. En el grupo de Ustilago maydis a la 6c, la viabilidad resultó ser la

mayor en comparación con los demás grupos, al parecer las concentraciones

homeopáticas permiten diluir la toxicidad de la tintura, de modo que la viabilidad

no solo no se afecta sino que los cultivos aún parecen proliferar.

En la Figura 22 se muestra por separado el numero de células vivas y muertas

contabilizadas en cada condición. Se presenta la media aritmética ± Error

estándar. Encontramos que el número de células viables fue menor en el grupo

con la tintura de Ustilago maydis y por consiguiente hay una mayor viabilidad a la

6c y 30c contra el grupo que contiene el “simulador”.

VIABILIDAD DE CÉLULAS HELA IN VITRO A LAS 24 HORAS (CÉLULAS VIVAS Y MUERTAS POR SEPARADO)

500000 * 450000 400000 350000 * 300000 250000 * 200000 150000 100000 * 50000 0
500000
*
450000
400000
350000
*
300000
250000
*
200000
150000
100000
*
50000
0
Control
Alcohol
Tintura
6c
30c
Muertas
Vivas
Núm. de células

Fig. 21. Viabilidad de células HeLa in vitro a las 24 horas. Control sin tratamiento, alcohol dinamizado, Ustilago maydis -Tintura, Ustilago maydis 6c, Ustilago maydis 30c (*

p<0.05)

Finalmente cuando se estimó el número de células muertas, únicamente se

encontraron diferencias estadísticamente significativas comparando con el grupo

tratado con “simulador” vs los experimentos realizados con tintura, 6c y 30c de

Ustilago maydis, el paquete estadístico usado es el SIGMA-STAT 3.1, la prueba

estadística empleada fue la ANOVA (Análisis de varianza múltiple) de una cola ó

vía, y la prueba post-hoc fue Kruskall-Wallis, p> 0.005 (Fig. 21).

Las células tratadas con Tintura de Ustilago maydis tuvieron un incremento del

70% de la viabilidad; las tratadas con la 6c tuvieron un incremento del 75 % de

viabilidad y las células tratadas con la 30c tuvieron un incremento del 64 % de

viabilidad, las células tratadas con alcohol tuvieron un incremento del 75 %

comparadas con las células sembradas inicialmente con el control sin tratamiento

que fue del 83% (Fig. 22).

PORCENTAJE DE VIABILIDAD CELULAR DE CELULAS HELA IN VITRO A LAS 24 HORAS

VIABILIDAD CELULAR DE CELULAS HELA IN VITRO A LAS 24 HORAS Fig. 22. Porcentaje de Viabilidad

Fig. 22. Porcentaje de Viabilidad de células HeLa in vitro a las 24 horas. Control sin tratamiento, alcohol dinamizado, Ustilago maydis -Tintura, Ustilago maydis 6c, Ustilago maydis 30c (* p<0.05)

DISCUSIÓN

Al tratar con la tintura homeopática, no solamente hubo menor viabilidad sino que

hubo muerte celular, la viabilidad bajó hasta un 57% comparando con el control

del “simulador” (100%).

En este trabajo encontramos que las células tratadas con las diluciones de

Ustilago maydis a la 6c y 30c tuvieron una mayor viabilidad, con respecto a los

experimentos tratados con la tintura homeopática.

Sin embargo al comparar el número de células muertas, la mayor proporción de

células con muerte celular la presenta Ustilago maydis a la 6c, seguida por la

tintura y finalmente la 30c.

Por lo anterior podemos sugerir que la tintura madre de Ustilago maydis tiene

efecto, disminuyendo la proliferación o deteniendo el ciclo celular y probablemente

por ello hay un número menor de células viables en la tintura, con respecto al

control (células no tratadas) y al grupo tratado con el “simulador”.

Aunque la dilución a la 6c provoca más muerte celular, no podría tener aplicación

como antitumoral, ya que finalmente causa un aumento de la viabilidad, por lo que

se cree que puede estimular la proliferación.

La dilución a la 30c no podría tener aplicación como antitumoral, ya que su

viabilidad semeja a la obtenida en los experimentos sin tratamiento y con el

tratamiento usando “simulador”. La muerte celular resultó ser más bien baja en

esta dilución 30c y por lo tanto no parece tener efecto modulador en la lìnea

celular Hela bajo las presentes condiciones experimentales. Los principios tóxicos

de la tintura se diluyen tanto que se pierde el efecto citotóxico.

No hemos encontrado que Ustilago maydis esté reportado como antitumoral, pero

sí se le han descrito toxinas como constituyentes.

En

la literatura se han reportado a

la ustilagenina y la ustilagotoxina que

corresponden a la ergotonina y ergotoxina del cornezuelo de centeno con virtudes

hemostáticas y para promover y facilitar el parto; sin embargo no hay reportes de

los efectos de estos metabolitos sobre el ciclo celular y la viabilidad. No obstante,

estas toxinas podrían ser las que estén modulando la viabilidad y la muerte celular

en nuestros experimentos, pero habría que caracterizar los componentes del

extracto para confirmar que contengan moléculas con estas propiedades.

Por lo anterior consideramos que más experimentos deben ser desarrollados a fin

de comprobar si realmente se está alterando el ciclo celular por el tratamiento con

Ustilago maydis y en este caso determinar a que nivel tiene su acción biológica.

CONCLUSIONES

1. En las células control (no tratadas) y las células tratadas con el “simulador”,

(una solución acuosa que resulta de evaporar el alcohol homeopático), no

se afecto la viabilidad celular por cuentas viables y exclusión del colorante

azul de tripano.

2. En el grupo tratado con tintura de Ustilago maydis se encontró que la

viabilidad celular fue alterada (células muertas) además que se mostró una

disminución en el número de células vivas con respecto a los controles sin

tratamiento y las células tratadas con el “simulador” *control tipo mock”.

3. Finalmente encontramos que las células tratadas con Ustilago maydis a la

6c y 30c tuvieron un mayor número de células viables con respecto al grupo

tratado únicamente con la tintura homeopática,

4. Sin embargo el número de células muertas con tintura fue mayor que las

muertas en la potencia (6c) y menor que las muertas en la potencia (30c).

Indicando que la tintura contiene el efecto citotóxico y este se diluye.

5. Por lo tanto la tintura de Ustilago maydis disminuye el número de células

viables con respecto a las células tratadas con Ustilago maydis a la 6c y

30c y además presentan un número considerable de células muertas.

Por lo anterior sugerimos que se requieren experimentos adicionales a fin de

poder complementar estos resultados con ensayos de viablilidad y de muerte

celular relacionada con la inflamación para elaborar mejores conclusiones.

PERSPECTIVAS

1. Determinar en las potencias menores (1c, 2c, 3c, 4c y 5c) el efecto del

Ustilago

maydis

en

la

viabilidad

dependiente de la potencias.

celular

a

fin

de

determinar

si

es

2. Evaluar en diferentes tiempos el efecto de Ustilago maydis

celulares.

en los cultivos

3. Emplear técnicas moleculares como reducción del MTT a fin de evaluar la

actividad mitocondrial; proliferación celular por incorporación de timidina 3 H,

o bien por una técnica que no emplea la radiactividad como la 5-carboxi-

fluoresceína

o

bien

con

alguna

técnica

que

determina

la

posible

genotoxicidad de la tintura de Ustilago maydis.

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