UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SINALOA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS

Ingeniera Bioqumica

Extraccin y caracterizacin de protenas de reserva de leguminosas

TRABAJO FINAL
Alumnos
Bobadilla Barraza Blanca Berenice
Camacho Camacho Jess Roberto
Leyva Armenta Librado Eduardo
Pacheco Plata Mara Felicitas
Prez Lpez Mara Lourdes
Reza Zaldvar Alicia Leticia
Soto Alvarado Brenda Karely
Zavala Campaa Manuel Gerardo

Profesor
Dr. Francisco Delgado Vargas

Culiacn, Sinaloa, Mayo 2014

NDICE GENERAL
Pag.
I RESMEN

II INTRODUCCIN

III EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE PROTENAS DE RESERVA

DE LEGUMINOSAS
3.1.

ASPECTOS GENERALES DE LAS LEGUMINOSAS

3.2.

CLASIFICACIN DE LAS PROTENAS EN LEGUMINOSAS

3.1 Reservantes
3.2 No reservantes

3.3. MTODOS DE EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE PROTENAS DE

RESERVA EN LEGUMINOSAS
3.3.1. Procedimientos de extraccin de protenas
3.3.1.1. Influencia del pH
3.3.1.2. Influencia de la fuerza inica
3.3.1.3 Influencia de la temperatura
3.3.2. Extraccin de protenas de acuerdo a la clasificacin de protenas
de Osborne (solubilidad)
3.3.3. Cuantificacin de protenas
3.3.3.1. Mtodo de Biuret
3.3.3.2. Mtodo de Brandford
3.3.3.3. Mtodo de BCA

3.3.4. Protemica
3.3.4.1. Separacin de protenas por electroforesis desnaturalizante
en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
3.3.4.2 Separacin de protenas por electroforesis bidimensional en
gel de poliacrilamida (2D-PAGE)

IV CONCLUSIONES
V BIBLIOGRAFA
Abreviaturas
Anexos
Figuras

I RESUMEN

Las protenas de los granos de leguminosas son una fuente potencial de nutrientes
valiosos, por lo cual son objeto de estudios para lograr su mejor aprovechamiento,
por lo que el objetivo de este trabajo es el dar a conocer primeramente, las diversas
protenas que se encuentran en las leguminosas, de igual forma se menciona la
clasificacin de estas protenas, que son reservantes y no reservantes, pero en este
trabajo nos enfocamos en las protenas de reserva presentes en las leguminosas, de
igual forma se hablara sobre los mtodos utilizados para la extraccin y
caracterizacin de las mismas.

II INTRODUCCIN

Las semillas maduras y secas de la familia Fabacea se conocen como leguminosas,

nombre derivado de legumbre (la vaina que las contiene), y se han usado en la
alimentacin humana desde hace muchsimo tiempo.

Las leguminosas siguen a los cereales en importancia como fuente de alimento para
el ser humano. Se les considera como la carne vegetal del mundo, ya que se
asemejan en valor proteico a la carne de animales. Sus protenas se caracterizan por
tener un alto contenido de la mayora de aminocidos esenciales, solo que son
deficientes en metionina, pero ricas en lisina.

Las leguminosas constituyen una amplia familia de plantas, muchas de las cuales
son cultivadas con fines comerciales tales como frijol (Phaseolusvulgaris), garbanzo
(Cicerarietinum), lenteja (Lens culinaris) y soya (Glycinemax). El valor nutricional de
estas plantas se debe al alto contenido de protenas, minerales y vitaminas de sus
semillas.

Las protenas que se encuentran principalmente en las leguminosas corresponden a

albminas, globulinas y glutelinas (fracciones separadas por Osborne) (BelitzGrosch, 1985).

En las protenas de las leguminosas no se han encontrado propiedades funcionales

de importancia comercial comparable a la capacidad de formar masa, de las
prolaminas y de las glutelinas de los cereales.

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/pena
cchiottii01/capitulo04/04.html

En el presente trabajo se hablar sobre la extraccin y caracterizacin de protenas

de reserva en leguminosas enfocndonos en su mayora en las ms conocidas, las
cuales son las siguientes: ajonjol (Sesamum indicum L.), frijol terciopelo (Mucuna
pruriens), garbanzo (Cicer arietinum) y soya (Glycine max).

III EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE PROTENAS DE RESERVA

DE LEGUMINOSAS

3.1.

ASPECTOS GENERALES DE LAS LEGUMINOSAS

Los granos de las leguminosas son nutrimentalmente importantes, como la principal

fuente de protenas en la dieta del hombre que no puede comprar protena animal,
debido a su alto costo. Son tambin una buena fuente de protenas para aves de
corral y otros animales monogstricos que proporcionan carne para consumo
humano. Adems, proporcionan caloras, vitaminas y minerales importantes en la
nutricin humana. Sin embargo, el consumo de todas las leguminosas se ve limitado
debido a que contienen ciertos factores antinutricionales que inhiben su
aprovechamiento por parte del hombre y de los animales (Corzo, 2000).

Como se mencion anteriormente las leguminosas son una buena fuente de

protenas, que proporcionan

muchos beneficios en la alimentacin tanto para el

hombre como para los animales monogstricos. En las leguminosas se pueden

encontrar diferentes tipos de protenas que en su mayora son ricas en aminocidos
azufrados, como nos mencionan, las protenas que se encuentran principalmente en
las leguminosas corresponden a albminas, globulinas y glutelinas (fracciones
separadas por Osborne) (Belitz-Grosch, 1985).
Otra cosa que es de importancia es que, las protenas en su gran mayora (70%),
son de reserva caracterizadas por su elevado peso molecular y por la facilidad de
asociacin disociacin, por ejemplo el frjol, habas, lentejas, arvejas, garbanzos.
Las globulinas presentes son insolubles a pH=4.5 (Qumica de Alimentos).
CLASIFICACIN DE LAS PROTENAS DE LEGUMINOSAS
Como sabemos, las protenas de leguminosas se pueden clasificar de diversas
formas que difieren en distintos aspectos. A continuacin se menciona la clasificacin
ms general de las leguminosas, segn la Universidad de Antioquia (Qumica de
Alimentos) se clasifican en protenas de reserva y no reservantes.
Las protenas de leguminosas reservantes, se encuentran en rganos protenicos,
principalmente en las semillas maduras, las de mayor frecuencias son las globulinas
que poseen alto peso molecular.
Por otra parte las protenas no reservantes, son constituyentes estructurales
(membrana y paredes), su funcin principal es enzimtica. Entre ellas se encuentran
las glutelinas y las albminas (Universidad de Antioquia, Qumica de Alimentos).

Como sabemos existen otras formas para clasificar las protenas de las leguminosas,
las cuales Qumica de Alimentos las menciona a continuacin, las protenas tambin
se clasifican de acuerdo a su solubillidad, as:

Globulinas: solubles en disoluciones salinas

Albminas: solubles en agua

Glutelinas: solubles en cidos y bases

Prolaminas: solubles en soluciones alcohlicas

PROTENAS EN LAS LEGUMINOSAS: FRIJOL, GARBANZO, LENTEJAS, SOYA

El frijol es la leguminosa alimenticia ms importante para cerca de 300 millones de personas, que en
su mayora viven en pases en desarrollo. El frijol se considera como la segunda fuente de protena en
frica y la cuarta en Amrica tropical (Camacho M. y col., 2010).

La calidad nutricional de las protenas es influenciada por el patrn de los aminocidos y la

digestibilidad, as como la cantidad y calidad de otras protenas consumidas; el frijol se caracteriza por
su deficiencia en aminocidos azufrados (metionina y cistena) y triptfano. Estos componentes
presentan baja digestibilidad in vitro debido a la presencia de inhibidores de proteasas. Los complejos
almidn-protena, las interacciones protena-protena y la presencia de fitatos y taninos (Bressani,
1975; Romero y Ryan, 1978). Adems, la estructura y la presencia de otros componentes de la semilla
(almidn, hemicelulosa, minerales, polifenoles) tienen efecto en la digestibilidad (Desphande et al.,
1989). La digestibilidad del frijol fresco oscila de 25 a 60%, pero el frijol cocido presenta un rango de
65-85% dependiendo de la variedad y del mtodo de coccin utilizado (Chang et al., 1981). A pesar de
la gran importancia del cultivo, la caracterizacin de protenas entre genotipos no ha sido cubierta,
salvo lo referente a protenas particulares como el caso de las faseolinas o argelinas (Montoya et al.,
2008).

En frijol comn se ha reportado contenidos de protena de 16-33%. La variacin gentica del

porcentaje de protena depende de los genes que controlan la sntesis y acumulacin de una fraccin
especfica de protena y de genes que controlan otros factores como el suministro de nutrimentos,
vigor de la planta, maduracin, tamao y rendimiento de la semilla, y la acumulacin y sntesis de
almidn en la semilla (Osborn y Brown, 1988).
Las concentraciones de protenas se determinaron usando el mtodo de Brandford y las lecturas de
absorbancia (495nm) se obtuvieron en un lector multimodal DTX 880 (Beckman Coulter). Como
estndar se emple albmina de suero bovina (Sigma-Aldrich).
El frejol (poroto) contiene las protenas Vicina y Faseolina, ambas son globulinas. Adems, contiene
una albmina conocida como Fasina, que corresponde a una hemoaglutinina. Las fitohemoaglutininas

conocidas como Lectina, causan la aglomeracin de los glbulos rojos de la sangre y a veces de los
leucocitos. Las lectinas de las plantas son generalmente glicoprotenas que contienen alrededor de un
5% de carbohidratos. Las leguminosas (alrededor de 600 especies) contienen lectinas entre el 2 y el
10% de la protena total (Robinson, 1991).
Lenteja y garbanzo. En estas leguminosas, se encuentran protenas del tipo de las globulinas.

------La separacin de las globulinas se realiza por centrifugacin y as se diferencian

fracciones segn el coeficiente de sedimentacin. Estas protenas reciben nombres
especficos de acuerdo a la funcin de la especie de origen:
Protenas con coeficientes de sedimentacin

7S

Vicilina en habas y guisantes

Conglicina en la soja
Conarraquidina en el cacahuate

11S

Legumina en las habas y guisantes

Glicina en la soja
Araquinina en el cacahuate
Considerando que el coeficiente de sedimentacin, s (minscula), tiene unidades de
tiempo y habitualmente se mide en unidades Svedberg, S (mayscula), siendo 1 S =
10-13 segundos.
La fraccin de albmina denominada:

Leguminina en las habas y guisantes

Faseolina en las alubias

Representan entre el 4-20% de la protena segn su especie y contienen la mayora

de las enzimas e inhibidores enzimticos de la semilla. La glutelina constituye entre
10-20% restante, debido a que las prolaminas se encuentran en muy baja
proporcin.

El valor bilgico de las anteriores protenas lo constituye el hecho de poseer bajos

niveles de aminocidos azufrados principalmente metionina y cistina.

Otras protenas que pueden encontrarse en menor proporcin son las ureasas, la
hemaglutininas y los inhibidores de la tripsina.

http://docencia.udea.edu.co/QcaAlimentos/contenido/leguminosas.htm

Las protenas de la soya son las ms utilizadas en la industria de alimentos, bien

sea como harina, aislado, concentrados, hojuelas, extracto, grits, entre otros. En
el caso especfico de la harina, se solubiliza de acuerdo al pH, por lo que su
harina puede ser adicionada a las bebidas, porque no forma grumos. Tambin se
emplea en la elaboracin de productos crnicos, por presentar buena propiedad
de retencin de agua, de adsorcin de grasa, previene la separacin de las
mismas y mejora la adhesin de los ingredientes, mejora la retencin de
humedad y la percepcin en la boca, la gelificacin mejora la firmeza y la textura,
facilita el corte en rebanadas, presenta ciertas propiedades como antioxidantes,
aumenta el valor nutricional del producto, agente blanqueador en el pan, mezclas
para donnas, protena vegetal hidrolizada, cereales para infantes, productos
farmaceticos, alimentos para mascotas.
La harina de man se utiliza en la elaboracin de alimentos a base de cereales,
luego de que est halla tenido un anlisis para micotoxinas.
Los aminocidos limitantes de las leguminosas son la cisteina (cis) y la metionina
(met), siendo la de mayor valor nutricional la soya y la de menor valor la arveja,
expresada esta como utilizacin neta de protena.
Algunas variedades de leguminosas producen flatulencia debido a la presencia
de oligosacridos en su testa, estos se eliminan si el grano seco es sometido a
remojo antes de su coccin y en ocasiones las protenas son factores
antinutricionales, ya que inhiben algunos aminocidos como son la tripsina y
hemoglutininas, estos tambin se destruyen durante el cocimiento de los mismos.

3.2. CARACTERSTICAS NUTRIMENTALES Y NUTRACUTICAS DE LAS

LEGUMINOSAS COMNMENTE CONOCIDAS
3.2.1. Caractersticas nutrimentales

3.2.1.1 Protenas
Las protenas son macromolculas constituidas por C, H, O, y N y la mayora de las
veces azufre, adems algunas de ellas contienen Fe, Cu, P o Zn. La hidrlisis de las
protenas libera 20 diferentes

-L-aminocidos, los cuales se encontraban unidos

mediante un enlace peptdico. Estos compuestos juegan un papel importante en la

estructura y la funcin celular, adems de constituir el 50% o ms de su peso seco
(Camacho, 1998).
Las protenas alimenticias, son aquellas que resultan sabrosas, digeribles, no toxicas
y econmicamente utilizables por el hombre. (Camacho, 1998).

3.2.1.1.1 Estructura protenica

Las protenas son macromolculas con diferentes niveles de organizacin
estructural;

tienen

estructura

primaria,

secundaria,

terciaria

cuaternaria

dependiendo del estado espacial progresivo de su cadena polipetdica. La estructura

primaria de una protena se relaciona a los enlaces peptdicos

entre sus

aminocidos componentes y a la secuencia de estos en la molcula protenica. La

estructura secundaria corresponde a la disposicin espacial adoptada por la cadena
polipetdica, causada por el plegamiento de la estructura primaria y es estabilizada
por enlaces tipo puentes de hidrogeno entre el nitrgeno amido de un residuo de
aminocido con el oxgeno del grupo carbonlicoamdico de otro residuo de
aminocido. Estos enlaces pueden formarse entre reas diferentes de la misma
cadena polipetdica o entre cadenas adyacentes en medio acuoso. En medio acuoso,
las interacciones hidrofbicas pueden contribuir grandemente a la estabilidad de la
estructura secundaria. La estructura secundaria puede ser tanto
plegada o tener una estructura al azar. La

-helice, hoja

-helice es una estructura semejante a un

cilindro. La cadena polipeptidica principal estrechamente enrollada forma la parte

interior del cilindro, y las cadenas laterales se extienden hacia afuera en una posicin
helicoidal. La

-helice es estabilizada por enlaces tipo puentes de hidrogeno

intramoleculares. Las protenas con estructura

-helice pueden ser globulares o

fibrosas. En la estructura hoja plegada, las cadenas de polipptidos estn casi

completamente extendidos y pueden formar puentes de hidrogeno entre cadenas

adyacentes, tales estructuras generalmente son insolubles en disolventes acuosos.

La estructura terciaria de las protenas se refiere al arreglo tridimensional de la
cadena polipeptdica; las fuerzas que estabilizan la estructura terciaria incluyen
puentes de hidrogeno, interacciones dipolo dipolo, interacciones electroestticas,
asociaciones hidrofbicas y enlaces disulfuro. La formacin de la estructura terciaria
resulta en la formacin de una unidad compacta, donde los residuos de aminocidos
polares estn localizados en el exterior y los grupos no polares de la cadena estn
localizados

en la parte interna. La estructura cuaternaria de las protenas es el

resultado de asociaciones de unidades protenicas; esta estructura es gobernada por

las interacciones hidrofbicas, inicas y uniones disulfuro. Las caractersticas fsicas
y qumicas intrnsecas de las protenas ejercen importantes efectos sobre sus
propiedades funcionales.

3.2.1.1.2 Contenido de las principales fracciones de protenas

Se ha reportado que las globulinas representan la fraccin principal de protenas en
grano de garbanzo (57%), seguido de la las glutelinas (18%), albminas (12%) y
prolaminas (3%). Sin embargo, otros estudios han encontrado que la fraccin de
albminas puede incrementarse considerablemente (48%) dependiendo de las
condiciones de extraccin (Quintero, 2013).

3.2.2. Caractersticas nutracuticas

En la ltima dcada dcada siglo XX comenzaron a desarrollarse nuevos conceptos

en nutricin debido a nuevos estilos de vida y la preocupacin por elevar la cantidad
de vida de los individuos. Del concepto alimento sano, debido como aquel alimento
libre de riesgo para la salud y que conserva su capacidad nutricional, su atractivo a
los sentidos, su pureza y su frescura, se pasa a otro concepto ms actual de
alimento funcional, descrito como aquel producto, alimento modificado o
ingrediente alimentario que da manera natural o formulada resaltan el desempeo
fisiolgico de quien los consume, proveyendo un beneficio a la salud superiores ms
all del aporte nutricional que contienen (Diplock, 1999). Los efectos positivos de un

alimento funcional pueden ser el mantenimiento del estado de salud y la reduccin

del riesgo de padecer una enfermedad (Quintero, 2013).

3.2.2.1. Compuestos fenlicos presentes en las leguminosas

Los compuestos fenlicos representan uno de los grupos de metabolitos

secundarios ms abundantes en las leguminosas y son considerados como
antioxidantes naturales. Estos compuestos antioxidantes reaccionan con radicales
libres y le ceden un electrn oxidndose y transformndose reaccionan como
radicales libes dbiles, con escasos o nulos efectos txicos. Los compuestos
fenlicos se originan principalmente a travs de dos rutas metablicas, la ruta del
cido shikmico y la de los poliacetatos. Sin embargo, algunos de los compuestos
fenlicos considerados como principios activos de las plantas medicinales se
originan a travs de rutas mixtas, que combinan la va de shikimato y acetato, tal es
el caso de los flavonoides.
La capacidad antioxidante de los compuestos fenlicos de debe principalmente a la
facilidad con la que un tomo de hidrgeno de un grupo hidroxilo de un anillo
aromtico, puede ser donado a un radical libre y la habilidad del grupo fenol
desprotonado para soportar un electrn sin aparear a travs de su deslocalizacin
alrededor del sistema del electrn.
El contenido de compuestos fenlicos reportado en garbanzo presenta una ampliz
variabilidad, lo cual se puede atribuir principalmente al genotipo utilizado, al color de
la testa y al mtodo empleado. El garbanzo tipo kabuli, Xu y Chang (2007)
reportaron un contenido de fenlicos totales de 154 mg GAE/100 g muestra (bs),
muestra que Han y Baik (2008) observaron un contenido de 220 mg GAE/100 g
muestra (bs). En garbanzo tipo desi, Kalogeropoulus y col (2010) reportaron un
contenido de fenlicos de 61.93 mg GAE/100 g muestra (bs), muestra que Segev y
col. (2010) y Heiras-Palazuelos y col. (2012) reportaron rangos de 150-680 GAE/100
g muestra (bs) y 123-151 GAE/100 g muestra (bs), respectivamente.

3.2.2.2.Flavonoides en leguminosas

Los flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales y que protegen
al organismo de dao producido por agentes oxidantes, como los rayos ultravioleta,
contaminacin ambiental, sustancias qumica presentes en los alimentos, entre
otros. El organismo humano no puede producirlos, por lo que deben obtenerse
mediante la alimentacin o en forma de suplementos.
Se han documentado cerca de 4000 flavonoides, indicando que estos compuestos
pueden agrupar en dos categoras dentro de esta familia: falvonoides 3desoxiflavonoides y 3-hodroflavonoides.
Los flavonoides contienen en su estructura qumica un nmero variable de grupo
hidroxilo fenlicos y propiedades de quelacin del hierro y otros metales de
transicin, lo que les confiere una gran capacidad antioxidante. Dicha capacidad
antioxidante les permite dar proteccin a las personas frente a los fenmenos de
dao oxidativo, y proporcionar efectos teraputicos en un elevado nmero de
enfermedades, incluyendo la cardiopata isqumica, la arterosclerosis o el cncer.
En garbanzo tipo desi, Zia-Ul-Haq y col. (2008) reportaron contenido de
flavonoides totales en un rango de 0.79-0.99 mg CAE/g muestra
(bs), para cuatro variedades de garbanzo tipo desi originarios de
Pakistn. Recientemente, Heiras Palazuelos y col. (2012) reportaron
un rango de 0.44 a 0.92 mg CAE/g mustra (bs) en genotipos de
garbanzo tipo desi, mientras que para un cultivo tipo kabuli (Blanco
Sin 92) encontraron un valor de 2.04 CAE/g muestra (bs).

3.2.2.3. Carotenoides en leguminosas

En la relacin a los carotenoides, se tienen dentro de los ms importantes alutena,

-caroteno, -caroteno y licopeno. La importancia de los carotenoides no es slo por su

funcin como pigmento, hoy en da se han atribuido a estos compuestos funciones y

acciones biolgicas. A los carotenoides se les ha relacionado con un aumento en el sistema
inmune y una disminucin del riesgo de enfermedades degenerativas, tales como cncer,
enfermedades cardiovasculares, degeneracin muscular relacionada con la edad y formacin
de cataratas. Estos efectos biolgicos se atribuyen a una propiedad antioxidante de los
carotenoides a travs de la desactivacin de los radicales libres (tomos o grupo de tomos
que poseen un electrn no compartido) y la captura del oxgeno singulete (Quintero, 2013).

De todos los carotenoides, el -caroteno es el ms ampliamente distribuido en

plantas y uno de los ms eficientes en la conversin de vitamina A. El garbanzo
contiene aproximadamente 49 g de -caroteno por cada 100g de harina. La lutena
y la zeaxantina; los valores promedio de lutena fueron 0.28 y 0.62 mg/100g en
kabuli y desi, respectivamente, mientras que para zeaxantina se observaron valores
de 0.16 y 0.23mg/100g. Le siguen en menor proporcin -caroteno, -caroteno y criptoxantina (Quintero, 2013).

3.2.2.4. Actividad antioxidante y antimutagnica

El garbanzo contiene compuestos antioxidantes, las cuales son
sustancias que retrasan, previenen o eliminan el dao oxidativo de
una molcula, porque los antioxidantes son importantes en la
proteccin

contra

la

hipertensin,

diabetes,

enfermedades

cardiovasculares y el cncer. Segn el Departamento de Agricultura

de los Estados Unidos de Amrica (USDA), el valor de actividad
antioxidante (ORAC) total para garbanzo tipo kabuli es de 847mol
TE/100 g muestra (bs) (USDA, 2010), mientras que Xu y Chang (2007) para
este mismo tipo de garbanzo reportaron una actividad antioxidante total
(ORAC) en el rango de 513 a 3466 mol TE/100g muestra (bs) dependiendo
del tipo de solvente de extraccin utilizado. En garbanzo tipo desi,
Zia-UI-Haq y col. (2008) reportaron valores ORAC de 858 a 1140
mol TE/100g muestra (bs) en variedades de garbanzo de Pakistn.

Recientemente, Heiras-Palazuelos y col.(2012) reportaron un rango

de valores ORAC de 5011 a 5756 mol TE/100g muestra (bs) en
cinco genotipos de garbanzo tipo desi crecidos en el estado de
Sinaloa.

El cncer es un problema de salud cuyo desarrollo se ha correlacionado

con varios factores ambientales (i.e. dieta, estilo de vida y fumar);
alrededor del 35% de los casos de cncer podran asociarse con la
dieta (Doll, 1992; Benigni, 2005) y a su vez compuestos
antimutagnicos de la dieta se han sugerido como factores
importantes en la prevencin o tratamiento de este padecimiento. La
mutacin del ADN se considera el evento clave en el desarrollo del
cncer (Ames y col.,1973) y la evaluacin in vitro de la
antimutagenicidad es utilizada comnmente como la primera etapa
para identificar nuevos compuestos con esta propiedad. Las plantas
o alimentos de origen vegetal representan la principal fuente de
metabolitos con antigedades antimutagnicas y anticarcinognicas
y varios estudios han mostrado una relacin entre estas actividades
y la actividad antioxidante. Recientemente, Garzn Tiznado y col.
(2013) evaluaron la antimutagnica de tres genotipos de garbanzo
tipo desi mediante el ensayo de microsuspensin utilizando la cepa
TA98 de Salmonella typhimurium, obteniendo valores de porcentaje
de inhibicin de 57.8 a 62.3%. Esta actividad se correlacion
positivamente con el contenido de fenlicos totales y actividad
antioxidante, lo que sugiere que los compuestos fenlicos son los
mayormente responsables de estas actividades.
Los estudios anteriores evidencian que el garbanzo posee un alto
contenido

de

compuestos

fitoqumicos

con

buen

potencial

antioxidante y antimutagnico, por lo que su consumo podra

contribuir en la prevencin de enfermedades degenerativas como el
cncer. Sin embargo, se requieren estudios adicionales para

determinar los mecanismos involucrados en esos efectos, as como

ampliar el nmero de genotipos y caractersticas evaluadas, con la
finalidad de relacionar estas propiedades con la variacin gentica
molecular y poder utilizar esta informacin en programas de
mejoramiento.

3.3. COMPOSICIN QUMICA

3.3.1. Extraccin de protenas de acuerdo a la clasificacin de protenas

de Osborne (solubilidad)
La extraccin de las protenas se basa en la capacidad de estas para disolverse en
diferentes sustancias. Desde el punto de vista termodinmico la solubilizacin
corresponde a una disociacin simultnea de las molculas del disolvente y de las
molculas de soluto, previas a una dispersin de estas ltima en el disolvente.
Esta clasificacin fue desarrollada por Osborne (1908) y consiste en una serie de
extracciones consecutivas con: agua, solucin de sal diluida, solucin de alcohol y
solucin de cidos o lcalisis diluidos. Usando esta secuencia de separacin, las
protenas se pueden clasificar en albminas, globulinas, gliadinas y gluteninas
respectivamente. La tabla 2, muestra las protenas presentes en las diferentes
fracciones, adems su papel biolgico y funcional (Goesaert y col. 2005).
Una fraccin importante de protenas se excluye de las fracciones e Osborne por que
no son extrables con ninguno de los disolventes utilizados.
Debido a este mtodo de separacin es relativamente simple, a menudo es muy
usado como una etapa de separacin inicial para obtener fracciones semipuras de
protena. (Goesaert y col. 2005)

3.3.2. Cuantificacin de protenas

3.3.2.1. Mtodo de Biuret

Se basa en la formacin en un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos NH de
los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad

de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces

peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias
interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la
cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
(Fernndez y Galvn,

3.3.2.2. Mtodo de Brandford

Se basa en la unin de un colorante. Comassie Blue G-250 (tambin Serva Blue) a
las protenas. E colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra
naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protenacolorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo
es sensible (1-15

g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su

determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las
soluciones bsicas.

3.3.2.3. Mtodo de BCA

El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un complejo
prpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Est reactivo forma la base de un
mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin
entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del
reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin e protenas que
es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos
que afectan a otros mtodos.

3.3.3. Protemica
La protemica es la nueva etapa de la investigacin biolgica que emana
naturalmente de la genmica y que incluye la caracterizacin de la expresin de las
protenas codificadas por un genoma y el establecimiento de sus propiedades
estructurales (Tobas y col.,2003).

3.3.3.1. Separacin de protenas por electroforesis desnaturalizante

en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
La separacin de protenas se realiza por SDS-PAGE deacuerdo con el protocolo de
Leammi(1970). Se utiliza una unidad electrofortica vertical MP3 (BioRad,
Hercules,CA,USA)

una

fuente

de

poder

EC800-90(Thermo

EC,

Watham,MA,USA).Los marcadores de peso molecular (BioRad) son: miosina,

201.237 KDa; -galactosidasa,114.317 KDa ;albumina de suero bovino, 74.141 KDa

3.3.3.2 Separacin de protenas por electroforesis bidimensional en

gel de poliacrilamida (2D-PAGE)
En la primera dimensin la protena se separa por isoelectroenfoque (IEF) utilizando
geles con gradientes de pH. Mediante la aplicacin

de un campo elctrico las

protenas migran a lo largo del gel hasta que coinciden con su punto isoelctrico en
el gradiente. En la segunda dimensin, el gel de IEF se coloca sobre un gel de
polacrilamida donde las protenas se separan de acuerdo a su peso molecular. Las
protenas se visualizan generalmente por tincin con azul de Coomassie o plata.
Para la identificacin de las protenas de inters, primeramente se remueven del gel
y se lavan para eliminar el colorante de teido. Posteriormente, se realiza una
digestin en el gel con una proteasa, usualmente tripsina, la cual corte en el extremo
carboxilo e lisina y arginina. La mezcla de pptidos se lava para eliminar las sales y
se resuspende en un solvente adecuado para su anlisis posteriormente por
espectrometra de masas (Salazar, 2007)

IV CONCLUSIONES
V BIBLIOGRAFA

Quintero

M.

2013.Variabilidad

Gentica

Molecular

su

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