Centro de Bachillerato Tecnolgico Industrial y de

Servicios N85
Especialidad Laboratorista Qumico

Semestre: 3

Grupo: 3ALV

Nombre del Docente:

Roque

Vargas

Apellido Paterno

Apellido Materno

Ral
Nombre(s)

Coatzacoalcos, Veracruz a 07 de Octubre del 2013.

Objetivo
Explicar el concepto microbiolgico de indicador de contaminacin.

coliformes fecales y Escherichia coli.

ales de los microorganismos coliformes fecales.
determinacin de viables.

Introduccin
La determinacin de la calidad bacteriolgica reviste gran importancia en el mbito de la salud pblica
ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al consumo evitando as epidemias
gastrointestinales.
El agua destinada al consumo humano puede ser contaminada por las agua residuales o por desechos
humanos y animales que pueden contener microorganismos patgenos (principalmente intestinales)
como son los causantes de la tifoidea (Salmonella typhi), la disentera (Shigella dysenterieae) o el clera
(Vibrio cholerae) entre otros.
Sin embargo, la deteccin de microorganismos patgenos es poco prctica por las siguientes razones:
a) No siempre estn presentes en la fuente de contaminacin (material fecal), pero pueden aparecer
repentinamente.
b) Al diluirse en el agua, pueden quedar en concentraciones no detectables por los mtodos de
laboratorio.
c) Sobreviven relativamente poco tiempo en el agua, por lo que pueden desaparecer antes de ser
detectados.
d) Los resultados del anlisis bacteriolgico del agua se obtienen despus que sta ha sido consumida
por lo cual si hay patgenos, la poblacin habr estado expuesta a la infeccin.
Todo esto hace indispensable una medida de control ms efectiva como es la deteccin del peligro
potencial; es decir, la advertencia del riesgo de contaminacin con microorganismos patgenos antes de
que aparezcan.
Para detectar ese peligro potencial, se utilizan indicadores de contaminacin que renen las siguientes
caractersticas:

a) Se encuentran como flora normal en la fuente de contaminacin, es decir, en la materia fecal,

independientemente de que haya o no microorganismos patgenos.
b) Son ms resistentes y sobreviven en el agua ms tiempo que los patgenos.
c) Su deteccin en el laboratorio es relativamente rpida, fcil y confiable.

Las bacterias coliformes renen las caractersticas anteriores, ya que se encuentran en grandes
cantidades en el tracto intestinal del hombre y de los mamferos y por lo tanto en sus heces y es fcil
diferenciar las especies coliformes de origen fecal de las que no lo son.
La sobrevivencia de los coliformes en el agua es mayor que la de cualquier bacteria es enteropatgena y
su identificacin es fcil y confiable.
Por todo ello, el aspecto ms importante del anlisis bacteriolgico del agua es la determinacin de
coliformes que puede hacerse por el mtodo del nmero ms probable (NMP) o por el mtodo de
filtracin de membrana (FM), el primero es el mtodo oficial en nuestro pas.
Existen otros mtodos microbianos que son indicadores de otros tipos de contaminacin:
Bacterias mesfilas aerobias que reflejan la exposicin de la muestra a la contaminacin en general, la
existencia de condiciones favorables para la multiplicacin de microorganismos y la presencia de materia
orgnica. La determinacin de bacterias mesfilas aerobias tambin es rutinaria en el anlisis
bacteriolgico del agua.
Streptococcus de origen fecal, que son ms abundantes que los coliformes en el tracto intestinal y heces
de los animales, pero sobreviven menos que los coliformes porque prcticamente no se multiplican en el
agua, por ello su predominio en el agua indica contaminacin fecal proveniente de animales o
contaminacin relativamente reciente.
La relacin entre el nmero de coliformes y el nmero de Streptococcus de origen fecal son: S. faecalis,
S. faccium, S. durans, S. equinus y S. bovis.
Clostridium perfringens que tambin se encuentra en la flora normal intestinal y, por ser esporulado,
resiste la presencia de sustancias txicas que se encuentran en aguas residuales de industrias; por eso
es indicador de contaminacin fecal en este tipo de aguas, en las que otros microorganismos no
sobreviven.
El Cdigo Sanitario Mexicano establece que el agua potable debe contener menos de 20 coliformes por
litro (es decir menos de 2/100mL) determinados por el mtodo del NMP, y que la cuenta de mesfilos
aerobios no debe exceder de 200 colonias/mL de agua determinadas en agar triptona glucosa extracto
de levadura a 35C durante 24 horas.

Desde el punto de la salud Pblica, los resultados individuales de muestras tomadas de la red de
distribucin tienen solo un valor relativo; el control de la calidad bacteriolgico del agua debe ser
sistemtico.
Los programas de control se establecen tomando en cuenta la calidad bacteriolgica de la fuente de
abastecimiento, los riesgos de contaminacin, la longitud de la red de distribucin, los cambios
estacionales y eventualidades tales como brotes epidmicos, reparaciones, interrupciones y operacin
anormal, entre otras.

Nmero ms probable
El mtodo del nmero ms probable (NMP), al igual que el mtodo de recuento en placa, nos
proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una nica clula viva puede
desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realizacin una serie de diluciones seriadas
al dcimo de la muestra de cultivo, en un medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho
organismo (Figura 8.10). Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez
que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos.
Aquellos tubos que fueron inoculados con una o ms clulas microbianas a partir de la muestra, se
pondrn turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna clula permanecern transparentes. A
medida que se aumenta el factor de dilucin, se alcanzar un punto en el cual algunos tubos contendrn
tan slo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran
ninguna clula, se puede determinar el nmero ms probable de microorganismos presentes en la
muestra original, utilizando para ello una tabla estadstica. La Tabla 8.6 muestra una tabla del NMP.
La precisin del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que se usan, aunque cinco
tubos por dilucin se consideran como una relacin apropiada entre la precisin y la economa. El
mtodo del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difciles de cultivar en medio slido.
Tambin se usa para determinar el nmero de clulas de un cultivo mixto que pueden crecer en un
medio lquido determinado. Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminacin del agua
potable, determinando el nmero de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa.
Estas bacterias probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y
la presencia de E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminacin.

Tabla 8.6. Tablas del nmero ms probable

Nmero de tubos con turbidez
Nmero de tubos con turbidez
inoculados a partir de tres
NMP
inoculados a partir de tres
diluciones sucesivas
diluciones sucesivas

NMP

0,18

2,3

0,20

3,1

0,40

3,3

0,45

4,6

0,68

4,9

0,68

7,0

0,93

9,5

0,78

7,9

1,1

11,0

1,1

14,0

1,4

13,0

1,3

17,0

1,7

22,0

1,7

28,0

2,1

24,0

2,2

35,0

2,6

54,0

2,7

92,0

160,0

Preparacin de las diluciones decimales adicionales.

Transferir 1.0 mL o un mltiplo de la dilucin primaria, a otro recipiente que contenga nueve
volmenes del diluyente estril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y
el diluyente. Si se toma 1.0 mL de muestra en 9.0 mL de diluyente, se obtendr una dilucin
1:10; si se utilizan 10.0 mL de muestra se utilizarn 90.0 mL de diluyente y as se tendr la
misma dilucin 1:10

Mezclar cuidadosamente cada nueva dilucin. Agitar la muestra manualmente en un arco de 30 cm.,
con 25 movimientos de arriba abajo, efectuados en un tiempo de 7 segundos.

La seleccin de las diluciones a preparar, as como de aquellas que se van a inocular, depende
del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base en los resultados de anlisis
previos y de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En
ausencia total de informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente el tubo Seleccionado.
El volumen transferido debe ser > 10% de la capacidad total de la pipeta.

Mientras se afora el lquido de la pipeta, la punta de sta debe apoyarse en el interior del tubo
debe inclinarse lo necesario.

En todos los casos, deben de prepararse las diluciones que permitan obtener resultados dentro del rango
de sensibilidad del mtodo, por lo menos en una de tres diluciones; como el rango de sensibilidad del
mtodo generalmente va de n a 10n (de 15 a 150 de 25 a 250 colonias, por
Ejemplo), el obtener resultados dentro del rango en 2 diluciones subsecuentes se considera evidencia de
que se ha logrado la distribucin uniforme y se han controlado los factores de variacin.
CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS:
Despus de efectuar el anlisis en cuestin, aplicar el factor de dilucin; por tratarse de diluciones
decimales, el factor es el inverso de la dilucin.
Es decir, que si los resultados estadsticamente confiables se obtuvieron en la dilucin 10-3, el factor de
dilucin es 103. Si se us otra proporcin en las diluciones, el inverso de la proporcin en que se diluy
ser el factor de dilucin.

Reportar como se indica para cada grupo microbiano, por gramo o mililitro de muestra, redondeando el
nmero de microorganismos a 2 cifras significativas y potencias de 10, y especificando las condiciones
de cultivo.

Materiales y Equipo para el Muestreo y Anlisis del Agua.

Frasco de vidrio de boca ancha con tapa de rosca.

Esptula
Tubo de ensaye con tapn de rosca
Campanas de fermentacin (tubos Durham)
Pipetas graduadas bacteriolgicas de 10 y 1 ml.
Gradilla
Asa de platino
Mechero
Cajas Petri.
Papel Kraft
Algodn
Equipo:
Autoclave
Balanza Analtica
Estufa de cultivo

Reactivos:
Solucin de tiosulfato de sodio al 10%
Etanol.
Agua destilada
Caldo Lactosado: Pesar 5.2 gramos de medio, agregar a 400 ml de agua destilada y mezclar.Distribuir
en 40 tubos con rosca a cada tubo se le coloca una campana de Durham y se esterilizan a 121 C,
durante 20 minutos.
Caldo Bilis Verde Brillante: Pesar 16 gramos de medio, agregar a 400 ml de agua destilada y mezclar.
Distribuir en 40 tubos con rosca a cada tubo se le coloca una campana de Durham y se esterilizan a 121
C, durante 20 minutos.
Medio EC: Pesar 14.8 gramos de medio, agregar a 400 ml de agua destilada y mezclar

Solucin salina diluciones: Distribuir en 40 tubos con rosca a cada tubo se le coloca una campana de
Durham y se esterilizan a 121 C, durante 20 minutos.
Cloruro de Sodio: Pesar 3.4 gramos de medio, agregar a 400 ml de agua destilada y mezclar
Distribuir en 40 tubos con rosca a cada tubo se le coloca una campana de Durham y se esterilizan a 121
C, durante 20 minutos.

Metodologa:
1.- Preparacin de los frascos:
1. Lavar perfectamente el frasco, eliminando todo resto de jabn o detergente
2. Agregar 0.1mL de tiosulfato de sodio al 10% (0.5mL para frascos de 500mL)
3. Colocar una tira de papel kraft de 1 x 5cm entre tapn y cuello (frascos refractarios con tapn
esmerilado)
4. Cubrir el tapn y el cuello del frasco con papel kraftin
5. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

2.- Toma de la muestra:

1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70%
2. Para grifos lo primero es desinfectar el grifo con algodn y etanol y dejar correr el agua por 3 minutos.
3. Generar zona asptica cuando sea posible hacerlo.
4. Destapar el frasco, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar inmediatamente.
5. Para la recoleccin de agua a partir de depsitos naturales y cuerpos receptores, retirar la cubierta de
papel y sostener el frasco por la base e introducirlo en el agua 30cm.
6. Destapar y llenar contra corriente o movindolo al frente, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar
inmediatamente.
7. En cada caso etiquetar el frasco y elaborar una hoja de registro de datos.
8. Llevar las muestras al laboratorio lo ms pronto posible, para analizarlas antes de que transcurran 2
horas, o 5 horas si se transportan en hielo.

PROCEDIMIENTO
1.- De las diluciones seleccionadas, se coloca 1 ml con caldo lactosado en condiciones estriles. Se
siembra por triplicado. Posteriormente los tubos se incuban a 37 C y se revisan a las 24 y 48 horas.
2.- Como medio de confirmacin se utiliza el medio de cultivo bilis verde brillante. As de cada tubo que
resulte positivo, es decir que presente gas se toma una azada y se siembra un nmero igual de tubos en
el medio de confirmacin y se incuba a 37 C por 48 horas.
3.- Para confirmar la presencia de coliformes fecales, Se toma una azada de los tubos positivos de caldo
lactosado y se siembra un nmero igual de tubos; pero en medio EC. Se incuban a 45 C por 48 horas y
se revisa si son positivos (formacin de gas).
4.- Para el reporte de los resultados, se toma la serie de tubos de las pruebas confirmativas que den
formacin de gas, despus del periodo de incubacin requerido y se busca el MNP, en las tablas
correspondientes.

DILUCIONES EN CALDO LACTOSADO:

PRUEBA PRESUNTIVA:

NOTA: A CADA TUBO SE LE INTRODUCE UNA CAMPANA DURHAM.

Figura 1: El mtodo del nmero ms probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el
factor de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen slo un organismo y los otros,
ninguno. A partir del nmero, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones
sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede determinarse el nmero ms probable de clulas
estadsticamente (11,0) en la primera de las tres diluciones, mediante una tabla de nmeros ms
probables (Tabla 8.6). Este valor, multiplicado por el factor de dilucin nos proporciona el nmero de
clulas viables de la muestra.

Bibliografa complementaria:
Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American Public Health
Association. 20th edition. Washington.
-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias
aerobias en placa.
ma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de bacterias
coliformes. Tcnica del nmero ms probable.
-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo para consumo
humano, envasado y a granel. Especificaciones sanitarias.

Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005

Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and application. 2nd
edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006.
Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006
clnica. 3 edicin. Mdica Panamericana, Argentina. QR67 M3318 2003
6th edition. McGraw-Hill.
USA. QR41.2 P74 2005
edition. Benjamin Cummings. USA. QR41.2 T67 2007
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

ANEXOS:

CONCLUCION

EN CONCLUCION ESTA PRACTICA NOS AYUDO A RECONOCER LOS

DIFERENTES TIPOS DE MICROORGANISMOS DEL AGUA MEDIANTE UNA
SERIE DE PRUEBAS COMO LA DILICION EN CALDO E-COLI U OTROS
TIPOS DE SIEMBFRA COMO CALDO LACTOSADO Y ASI PODER
IDENTIFICAR LOS ORGANIMOS COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES
FECALES Y TAMBIEM NOS AYUDO A SABER POR QUE EL CALDO
LACTOSADO SE DECOLORA AL SEMRARLE LOS MICROORGANISMOS.

OBSERVACIONES: