Tcnico en qumica, mencin qumica

industrial
Biotecnologa

Laboratorio n 3
Identificacin bacteriana
Objetivos

Comprender el concepto de caracterizacin bioqumica de un microorganismo

Aprender la tcnica de realizacin de una batera bioqumica
Comprender la interpretacin de una batera bioqumica
Integrar los datos de morfologa, afinidad tintorial, crecimiento en medios diferenciales y
pruebas bioqumicas para la identificacin de un microorganismo.

Junto a la observacin cualitativa, morfolgica, tintorial y de crecimiento de un microorganismo,

hay que buscar otros mtodos que finalmente permitan identificar, con certeza absoluta, la
especie de la que se trata. Dentro de esos mtodos, el ms usado por su sencillez, costo, tiempo
y facilidad de interpretacin es la caracterizacin bioqumica. Este mtodo se basa en la
utilizacin diferencial de sustratos variados por parte de las bacterias en distintas condiciones de
cultivo, lo que se puede visualizar sencillamente por cambios de tonalidad de los medios
utilizados producto de la liberacin de metabolitos que reaccionan con los indicadores
presentes.
Dentro de los medios mas usados estn agar triple azcar (TSI, triple sugar agar), agar lisina
fierro (LIA, lisien iron agar), sulfuro indol movilidad (MIO), citrato de Simmons, urea, etc. TSI es
una mezcla de 3 azcares que permite distinguir las bacterias no-fermentadoras de las
fermentadoras, y dentro de estas ltimas las que producen CO 2 y/o H2S. LIA permite ver la
descarboxilacin la desaminacin del aminocido Lisina por parte de la clula, as como la
generacin de H2S. SIM permite visualizar la movilidad del microorganismo, as como tambin la
produccin de Indol y sulfuros. Agar citrato slo permite ver la utilizacin de este cido por parte
de la bacteria, lo mismo que para la urea en el medio respectivo.
Triple Sugar Iron (TSI):
Este agar se utiliza para determinar la fermentacin de carbohidratos y produccin de
H2S como un primer paso en la identificacin de bacilos Gramnegativos.
Fundamento: el principio de la fermentacin de carbohidratos est basado en los
estudios de Pasteur que establecen que la accin de varias especies de microorganismos
sobre un sustrato de carbohidratos resulta en la acidificacin del medio. El TSI se basa
en la habilidad de las enterobacterias para usar la glucosa anaerbicamente con la
formacin de productos finales cidos. Una reaccin alcalina/alcalina en este medio
indica falta de produccin de cido y la incapacidad del microorganismo en estudio para
fermentar glucosa y los otros carbohidratos presentes.

Citrato de Simmons:
Se usa porque puede ayudar a diferenciar entre miembros de la familia
Enterobacteriaceae. Los medio usados para detectar el uso de citrato deben estar
desprovistos de protenas y carbohidratos como fuentes de carbono.
Fundamento: la utilizacin de citrato por una bacteria en el medio citrato es detectada
por la produccin de productos alcalinos, El medio incluye citrato de sodio, como nica
fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las bacterias
que pueden usar citrato, tambin pueden extraer nitrgeno desde la sal de amonio, con
la produccin de amonaco llevando a la alcalinizacin del medio por la conversin del
NH2+ a hidrxido de amonio.
Urea
Se usa para microorganismos que utilizan la enzima ureasa, que acta hidrolizando la
urea presente en el medio, liberando amonaco.
Fundamento: la ureasa es una enzima que poseen muchas especies de microorganismos,
los cuales pueden hidrolizar la urea liberando amonaco. Este reacciona en la solucin
para formar carbonato de amonio, resultando en la alcalinizacin y aumento de pH del
medio. Esta reaccin es detectada por el indicador rojo fenol el cual cambia su color de
amarillo a rosa.
Motilidad Indol Ornitina (MIO):
El medio MIO permite determinar tres caractersticas importantes en la identificacin de
las enterobacterias: motilidad, indol y descarboxilacin de la ornitina.
Fundamento: la descarboxilacin forma dixido de carbono como producto secundario,
cada enzima descarboxilasa es especfica para un amnocido. Entonces el producto
amino-especfico de la ornitina es la putrescina. Aqu se produce un cambio de pH,
utilizando como indicador el ppura de bromocresol. La motilidad puede notare por el
crecimiento bacteriano en el agar semislido.
Lysine Iron Agar (LIA):
Este es un medio diferencial usado para registrar la habilidad de los miembros de la
familia Enterobacteriaceae para producir H2S y descoarboxilar la lisina.
Fundamento: el agar LIA detecta formacin de H2S, descarboxilacin y deaminacin de
la lisina. Este agar contiene glucosa, lisina, citrato frrico amoniacal y tiosulfato de
sodio para deteccin de H2S y prpura de bromocresol como indicador de pH.
Rojo de metilo (RM):
El test de rojo de metilo proporciona una caracterstica valiosa para identificar especies
bacterianas que producen intensa acidificacin a partir de glucosa.

Fundamento: la presencia de ciertas enzimas metablicas puede ser usada para

diferenciar microorganismos basndose en los productos finales del metabolismo de
glucosa detectados con reactivo indicador de color.
Tincin de Gram.
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con
el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el
medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de
colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o
para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos,
esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas,
proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente,
aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y
alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen cambios
estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han
sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y
siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el
encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan
mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han
sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el
cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativameute
(aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales
como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo
Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este
grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para
revelar la localizacin de las gotculas o depstos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudn.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son
suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen
colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no
produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til
para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte
del material no celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan
sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el
perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco

que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las
clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal)
o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo
satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su
mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas
bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin,
ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones
precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son
formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales
estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la
seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura
realmente existente.
Tcnica de sembrado en tubos con agar
En general en los tubos con agar inclinado se pueden realizar dos tipos de sembrado:
-

siembra en superficie
siembra en profundidad

La manera de sembrar la muestra en cada caso es absolutamente diferente (lo que se

infiere del nombre) y se escoge cual hacer segn la finalidad que se persiga.
Para la siembra en superficie tome el tubo y quite cuidadosamente la tapa bajo mechero.
Con el asa curva tome una gota del cultivo crecido o colonia resuspendida del
microorganismo a propagar y/o analizar y esprzalo en zig-zag slo una vez sobre la
superficie expuesta del agar. El tubo se tapa y se lleva posteriormente al incubador con
las condiciones adecuadas para el crecimiento de la cepa.
Para la siembra en profundidad tome el tubo y quite cuidadosamente la tapa bajo
mechero. Con el asa recta pique la colonia a estudiar o sumrjala completamente en el
cultivo crecido y entirrela hasta el fondo del tubo. Este procedimiento puede realizarse
1, 2 3 veces, dependiendo del medio y la finalidad del experimento.
ACTIVIDAD 1: Siembra en medios caractersticos
Ud. realizar en este prctico la caracterizacin bioqumica de una cepa aislada
Segn del material que disponga puede partir desde:
-

una colonia aislada desde una placa de agar LB. Para ello primero realice la
actividad de siembra en profundidad y luego tome la colonia con asa curva
un cultivo lquido en medio LB

Siembre su cepa en un tubo de cada uno de los siguientes medios disponibles: TSI, LIA,
SIM, MIO, Citrato, Urea. Una vez sembrado lleve a estufa a 37 C durante 24 hs y

analice sus resultados, fundamentando metablica y qumicamente sus observaciones.

Comprelos con los resultados obtenidos por bibliografa.
ACTIVIDAD 3: Tincin de Gram
Actividad 1: Fijacin de un frotis
A) Con calor:
1. Limpie un porta objeto
2. Coloque una gota, con el asa curva o con una pipeta Pasteur, del inculo
bacteriano (medio lquido), si la muestra proviene de un medio slido coloque
una gota de agua n el porta objeto y luego con el asa tome una muestra del
medio y realice movimientos circulares con el agua.
3. Haga movimientos circulares en el portaobjeto.
4. Fije la muestra con calor: pase el portaobjeto varias veces por encima de la llama
hasta que se seque.
5. Deje enfriar hasta su posterior utilizacin.
Actividad 2: tincin de Gram
1. Agregue una o dos gotas de cristal violeta y deje actuar por un minuto
2. Lave con agua de la llave, tenga precaucin de no colocar la muestra justo
debajo del chorro de agua.
3. Agregue una solucin de yodo (lugol), de actuar un minuto
4. Lave con agua de la llave.
5. Agregue alcohol acetona (decoloracin), esto debe ser rpido, agregar hasta que
no quede rastro del mordiente.
6. Lave con agua de la llave hasta que no se desprenda ms colorante.
7. Luego agregue la coloracin de contraste, safranina y deje actuar por un minuto.
8. Lave nuevamente con agua de la llave.
9. Seque con papel filtro sin restregar
Observe la microscopio las muestras