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Figura 2. GbcO se requiere para la sntesis de GBC. (A) IFM de bacterias recogidas
en fase estacionaria y etiquetados con suero anti-GBC y Aglutinina de germen de trigo
de lectina para detectar GBC (rojo) o PG (verde), respectivamente. Las vistas
representativos muestran el antgeno GBC expuesta en la superficie de NEM316 WT
y complementadas (Delta gbcOpTCV omega gbcO) cepas, pero no en la superficie del
mutante Delta gbcO. (B) la microscopa inmunoelectrnica (IEM) de NEM316 WT,
Delta gbcO mutantes y complementadas (Delta gbcO pTCV omega gbcO) cepas. La
localizacin subcelular de GBC se analiz utilizando IEM sobre delgada secciones
(menor a 100 nm) de clulas congeladas; marcado con suero anti-GBC y revelado con
partculas coloidales de oro (puntos negros). Los puntos negros son claramente
visibles en la periferia y los tabiques de las clulas de las cepas WT y
complementados; no etiquetado puede ser detectado con la cepa Delta gbcO. (C) La
inmunodeteccin de GBC en extractos de pared celular mutanolisina obtenidos a
partir de cultivos cosechados en la fase estacionaria. Extractos de pared celular se
trataron con pronasa, separados en SDS-PAGE, se transfirieron sobre nitrocelulosa y
la membrana se incub con suero anti-GBC. En este experimento, la seal asociadaGBC apareci como un nica banda que era indetectable en los extractos de pared
celular de Delta gbcO. Como control de carga, extractos de la pared celular antes del
tratamiento pronasa se probaron con la lectina biotinilada Malii. (D) Anlisis de cido
murmico, fosfato, y el contenido de ramnosa de la pared celular de WT (barras
negras), Delta gbcO (barras de color gris claro), y complementarias (barras grises
oscuros) de las cepas recolectadas en la fase estacionaria (vase el texto S1 en la
informacin de apoyo). Para cada compuesto la GC-MS resultado del anlisis se
presenta como un porcentaje del valor de WT. Ramnosa, el azcar principal GBC, no
se detect en la pared celular de la cepa Delta gbcO. Las barras de error representan
Ms o menos S.E. de dos experimentos independientes.
La morfologa celular, ubicacin de membranas y separacin celular se ven
afectadas en la mutacin de GBC agotado.
En antiguas culturas, las cepas de mutaciones gbcO tienden a flocular rapidamente
(Figura 5A) y observaciones de microscopa de contraste de fases revelaron la
presencia de agregados celulares largos de pequeas cadenas tipicas de ovococci
(Figura 5B). Una examinacin exhaustiva de los racimos celulares de gbcO (Figura
5B) sugiere que cada uno es originado de una unica cadena. Para confirmar esta
observacin, seguimos el crecimiento de las celulas mutagenas de gbcO en
experimentos por lapsus de tiempo bajo la luz del microscopio. Este experimento
revel que los racimos de clulas mutagenicas de gbcO surgen del crecimiento de
una cadena que no se quiebra, mientras que las cepas de WT forman cadenas
individuales cortas (Ver Video S1 para NEM316 WT y video S2 para informacin
anexa de gbcO). Esta observacin indica que el proceso de separacin celular del
S. agalactiae fue fuertemente alterando en la ausencia de GBC. La clula y la
morfologa de cadena de WT, de la mutacin y de las cepas complementarias fueron
entonces examinados por microscopa de escaner electronico (SEM) y microscopa de
transmisin electronica (TEM). Como era esperado, el NEM316 WT y las cepas
complementarias muestran un tamao regular y fueron montadas en una tipica
cadena de ovococci, con membranas formado en sucesivos planos pararelos
perpendiculares al eje de la cadena (Ver Figura 6A, 6B y Figura S3). En contraste,
patrones no regulares de divisin pueden ser observados por la mutacin gbcO: las
celulas eran heterogeneas en tamao y forma y la ubicacin de la membrana pareca
ocurrir aleatoriamente (Figura 6A, 6B, S3). Adems, en las cepas mutantes, el
proceso de membranizacin (?) fue incompleto y las celular fueron pobremente
individualizadas explicando el anormal modo de crecimiento observado en los
experimentos en lapsus de tiempo.
Como en muchos estreptococos, WT y las cepas complementarias muestran una
zona de densidad electrnica periferica (principal grosor, 6,03+/- 1,07 nm) que no fue
observada en las clulas gbcO (ver flechas en figura 6C). Esta estructura no debe
ser confundida con la capsula de polisacaridos de la S.agalactiae que no puede ser
detectada por el procedimiento convencional de tincin de metales pesados usado
aqu. Esta estructura de pared celular, de la cual se desconoce la funcin, fue
nombrada pellicle en Lactococus lactis y, aunque su composicin no fue
formalmente establecida, presenta correlacin con la sintesis de un polisacarido de
superficie. As parece que, como se muestra en L. lactis, el agotamiento de un
Observaciones finales
La pared celular de S. agalactiae contiene dos polisacridos PG anclados: la cpsula,
un importante factor de virulencia de GBS [3840], y el GBC, los cuales nos revelan
una importante funcin biolgica vinculada a la biosntesis de PG y a la divisin
celular. Mutantes S.agalactiae no encapsulados pueden ser fcilmente construidos in
vitro and que no muestran ningn crecimiento o defectos morfolgicos mientras es
severamente afectado por la virulencia en el modelo de ratn [40]. Por otra parte,
GBC pareca ser crucial para la organizacin de la pared celular de S. agalactiae y su
ausencia fue asociada con una prdida sustancial de fitness (aptitud). En este estudio,
proporcionamos la primera evidencia gentica de que la sntesis de GBC es iniciada
por la transferencia de fosfato GlcNAc a un lpido portador de fosfato a travs de la
actividad de GbcO, un cercano homlogo de las enzimas (TagO/TarO) catalizan el
primer paso de la sntesis de WTA en B. subtilis o S. aureus (Figure 1B). El
crecimiento, morfolgico, y defectos de divisin del mutante GbcO-null S. agalactiae
eran una reminiscencia de los reportados B. subtilis [41-43] y S. aureus [24] WTAcarentes. Adems, la disminucin de PG cross-linking medido en la cepa NEM2772
(gbcO) era tambin observado recientemente en mutantes TarO-null S.aureus [1213]. En S. aureus, el agotamiento de WTA fue asociado con la deslocalizacin de dos
protenas involucradas en el metabolismo de PG: la protena PBP4 penicilinavinculante involucrada en la reaccin de transpeptidacin [13] y la autolisina Atl [12].
Del mismo modo, se demuestra que el agotamiento de GBC causa la deslocalizacin
de PcsB, una importante enzima de la pared celular (Figure 8). GBC puede, por lo
tanto, ser considerada como un equivalente funcional de la convencional WTA
encontrada en B. subtilis o S.aureus. Aunque la ramificada estructura polisacrida rica
en rhamnose de GBC es totalmente diferente de la de pAdoP-WTA presente en B.
subtilis y S. aureus, estos polmeros compartes dos importantes propiedades: primero,
ambos presentan un carcter aninico conferido por su alto contenido en fosfato;
segundo,que estn anclados covalentemente a la PG que sugiere una estrecha
coordinacin de su sntesis con el de PG. Es importante destacar que la aptitud del
mutante GBC-carente se redujo drsticamente in vitro y observamos que la aptitud de
la cepa WT se redujo similarmente a cuando GbcO fue inhibido con tunicamycin.
Estos hallazgos indican que la ruta de biosntesis GBC podra constituir un objetivo
valioso para el desarrollo de nuevos antibiticos.
La precisa estructura del antgeno Lancefiel se ha determinado para GBC solamente.
Sin embargo, anlisis inmunoqumicos y de composicin de Grupo A, C, E y G de
glicopolmeros de la pared celular han puesto de manifiesto de manera similar un alto
contenido de ramnosa 4448]. En estas especies de estreptococos, las rutas
biosintticas y funciones biolgicas de los glicopolmeros de la pared celular no han
sido investigados an. Un examen cuidadoso de los genomas de especies
representativas de los principales linajes filogenticos estreptoccidas (el llamado
pigenos, bovis, salivarius, mutans, mitis y anginosus grupos) revel la presencia de
un gbcO ortlogo junto con loci que se cree participan en la sntesis de un
exopolisacrido contenedor de ramnosa. Mientras que ortlogos genes de la
convencional WTA sintetizadora no fueron detectados.
Este anlisis suguiere que polisacaridos ricos en ramnosa anclados a PG estan muy
extendidos entre los estreptococos inlcuyendo importantes patogenos humanos
estreptococal (como S. galactiae y S. pyogenes). Es probable que su funcin es