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Aula de Bioqumica I

Tema:
Funo de Protenas:
Mioglobina e Hemoglobina

Prof. Dr. Jlio Csar Borges
Depto. de Qumica e Fsica Molecular DQFM
Instituto de Qumica de So Carlos IQSC
Universidade de So Paulo USP
E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br
Protenas
Funes
Transporte e Estoque;
Catlise enzimtica;
Movimento;
Suporte mecnico;
Proteo imune;
Sinalizao intra e extracelular;
etc.
Variedade Funcional Diferentes Estruturas Tridimensionais

Estrutura 3D Estrutura Estvel em funo do tempo
Estabilidade versus flexibilidade
Funo versus Conformao.
Como as Protenas Funcionam
Grande maioria interao com outras molculas

Interaes reversveis ligante (qualquer tipo de molcula, inclusive protena);
***Natureza transitria das interaes protena-ligante***

VIDA

RESPOSTA RPIDA E REVERSVEL A MUDANAS AMBIENTAIS E CONDIES
METABLICAS

STIO DE LIGAO

Interao especfica

Acoplada a uma mudana conformacional ENCAIXE INDUZIDO


*ENZIMAS: Substratos; Stio cataltico ou Stio ativo.
Introduo
Organismos aerbicos Necessitam de suprimento de O
2
constante
Organismos multicelulares vertebrados
- Desenvolvimento de sistema circulatrio
- Desenvolveram protenas de transporte de O
2
1 Mioglobina msculo
- mantm suprimento local de O
2
2 Hemoglobina sangue hemcias
- Transporta O
2
dos pulmes para os tecidos
- Transporta CO
2
e H
3
O
+
dos tecidos para os pulmes

Mioglobina versus Hemoglobina

- So similares na Estrutura Primria, Secundria e Terciria
- Ligam O
2
de maneira muito similar
- Em condies similares aos tecidos, a Hemoglobina est 7% saturada com O
2
enquanto
que a Mioglobina apenas 90% saturada
- Hemoglobina liga O
2
de maneira cooperativa e uma protena alostrica
- Ambas so importantes protenas-modelo de estudo Bioqumico
Grupo Prosttico = Heme
A ligao O
2
pelas globinas depende do grupo Heme
Grupo Heme Protoporfirina + Fe
2+
= responsvel pela cor vermelha do sangue
- Protoporfirina 4 anis pirrlicos (anel tetrapirrlico)
- 8 Cadeias Laterais = 4 metilas, 2 vinilas e 2 cidos Caboxlicos
- Ferro coordenado no centro pelos tomos de Nitrognio dos 4 grupos Pirris.
Porfirina
Heme Fe
2+
Coordenao
Hexagonal
Holomioglobina
Grupo heme est ligado apoprotena:
1) pelo ocupao do Quinto ponto de coordenao do Fe
2+
pela His proximal
2) Interaes Hidrofbicas do anel tetrapirrlico
- Sexto ponto de coordenao do Fe
2+
ocupado pelo O
2
- Na forma deoxi, a His Proximal retira o Fe
2+
do plano central da porfirina
Holomioglobina
1 Protena a ter a sua estrutura 3D resolvida
- Estrutura em Hlices Alfa - Possui 153 resduos de AA
- Total de 8 hlices anfipticas nomeadas de A a H
Grupo Heme est ligado entre as hlices E e F
- Hlice alfa F contm a His Proximal (Chamada de His F8)
- Hlice alfa E contm a His Distal (Chamada de His E7)
Holomioglobina
Grupo Heme est ligado entre as hlices E e F
- Hlice alfa F contm a His Proximal (Chamada de His F8)
- Hlice alfa E contm a His Distal (Chamada de His E7)
A ligao O
2
Fe
2+
gera a
transferncia parcial de 1
eltron do Fe
2+
para o O
2

forma o on superxido O
2
-


A His E7 estabiliza o O
2

ligado ao Fe
2+
por uma ligao
de H;

Evita a formao do on
superxido;

- O componente protico
estabiliza a reatividade do O
2
Interao Protena-Ligante
pode ser quantificada
A interao Protena P com o Ligante L obedece as leis da Termodinmica




k
1
e k
2
so as constantes de velocidade de associao e dissociao
K
A
e K
D
so as constantes de equilbrio no sentido de associao e dissociao

K
A
dado em (mol/L)
-1
(M
-1
) Quanto maior o valor de K
A
maior a afinidade da interao PL
K
D
dado em mol/L (M) Quanto menor o valor de K
D
maior a afinidade da interao PL

Quando a [L] >>> [P] podemos considerar que a formao do PL no altera a [L]

A frao de Stios de ligao na P frente ao L pode ser descrita pela seguinte equao
P + L PL
k
1

k
2
A
D A eq
K
K
L P
PL
k
k
K K
1
] ][ [
] [
2
1

] [ ] [
] [
Totais Stios
Ocupados Stios
P PL
PL


Interao Protena-Ligante
pode ser quantificada
pode ser monitorado e seu valor em funo da [L] resulta numa hiperblica retangular
] [ ] [
] [
P PL
PL


] ][ [ ] [
] ][ [
] [
L P K PL
L P
PL
K
A A

D
A
A
A
A
A
K L
L
K
L
L
L K
L K
P L P K
L P K

] [
] [
1
] [
] [
1 ] [
] [
] [ ] ][ [
] ][ [

Dividindo
ambos os
por [P]
Dividindo
ambos por
K
A
D
A
K
K

1
Quando [L] = K
D
[L]
onde metade dos stios
de ligao esto
ocupados pelo Ligante

Para 90% de
saturao [L] = 9 x K
D
Substituindo [PL]
Interao Mioglobina-O
2
A interao entre a mioglobina e O
2
segue as leis da termodinmica mesmo considerando o
Oxignio como gs
- Adequao experimental e matemtica necessria
D
K O
O

] [
] [
2
2
Se P
50
= [O
2
] na qual metade
dos stios esto ocupados

Quando pO
2
for equivalente metade do
sinal mximo temos K
D
e assim podemos
definir P
50
D
K pO
pO

2
2
O
2
liga fortemente
mioglobina com um P
50
de
0.26 kPa
- Condio na qual metade
dos stios esto ocupados
A [O
2
] em soluo depende
diretamente da presso de O
2
na
atmosfera que pode ser controlada.
50 2
2
P pO
pO

D
K P
50
Estrutura da Hemoglobina

A Hemoglobina um heterotetrmero
- Duas cadeias Alfa (141 resduos) e duas cadeias Beta (146 resduos)
- Possui estrutura em hlice alfa
Hemoglobina A (HbA) = par de dmeros
1

1
e
2

2
- A interface
1

1
e
2

2
apresenta ~30 contatos
- A interface
1

2
e
2

1
apresenta ~19 contatos
Maioria hidrofbicos e alguns hidroflicos Importantes para regulao
- Grupos Heme esto bem separados (24-40 )
Estrutura da Hemoglobina

Cadeia Alfa e Beta da HbA apresentam ~25% de identidade com a Mioglobina
Alta identidade estrutural

- Apesar da baixa identidade sequencial
- Identidade estrutural mais conservada

Mesma forma de ligar grupo Heme
-Possui His Proximal e Distal
Estrutura da Hemoglobina

A HbA liga O
2
de maneira cooperativa curva Sigmoidal
- A ligao de O
2
com HbA >10 x mais fraca do que com a Mioglobina
- A ligao ou sada de O
2
em uma cadeia da HbA aumenta a ligao ou a sada de O
2
nas
demais cadeias
A baixa afinidade da HbA por O
2
est relacionada com a funo desta protena
- Captar O
2
nos pulmes (alta pO
2
) e liberar nos tecidos (baixa pO
2
)
A alta afinidade da Mioglobina por O
2
est relacionada com a funo: Armazenar O
2
Ligao de O
2
na Hemoglobina

Em exerccio, o sangue arterial, aps uma passagem pelo pulmo, apresenta ~98% de
saturao da HbA com O
2

Aps passar pelos tecidos, o sangue venoso apresenta ~32% de saturao de O
2

- Portanto, ~66% dos pontos de ligao contriburam para o transporte de O
2

A ao cooperativa da HbA favorece a DESCARGA adequada de O
2

- Nestas condies, a Mioglobina permaneceria com 91% de saturao 7% de transporte
A HbA transporta ~10 x mais O
2
do que a Mioglobina
O
2
A cooperatividade da HbA

A ligao de O
2
na HbA resulta em mudanas conformacionais na tetrmero de HbA-O
2
- Um dmero Alfa-Beta sofrem rotao de 15 em relao ao outro
A HbA existe em duas conformaes principais:
1) T (Tenso) Estado deoxigenado
2) R (Relaxado) Estado Oxigenado
- O Estado R apresenta maior afinidade por O
2
do que o estado T
- Na presena de O
2
, o estado R mais estvel
A cooperatividade da HbA

Estado T apresenta um intricada rede de pares inicos na interface
1

2
e
2

1
A ligao de O
2
altera a estrutura do grupo Heme que perturba a rede de pares inicos
- Mudanas no
ambiente do grupo
Heme so
transmitidas para
as outras cadeias
do oligmero
A cooperatividade da HbA

A HbA pura no estado T muito instvel
- Liga avidamente O
2
em baixas [O
2
] e libera apenas 8% de O
2
em condies fisiolgicas

A transio T R adequada depende de um ligante o 2,3-Bisfosfoglierato 2,3-BPG
A [2,3-BPG] nas hemcias
aumentada na altitude.
- Adaptao em ~ 24 horas

- Permite menor afinidade
entre HbA-O
2

- A HbA liga menos O
2
,
MAS descarga de O
2
nos
tecidos MAIOR apesar da
menor pO
2
atmosfrica
A cooperatividade da HbA

O 2,3-BPG:
1) Liga-se no centro do
Tetrmero da HbA;
2) liberado aps transio
T R;
3) Age mantendo HbA no
Estado T;
4) um Efetor Alostrico.
Estado R Estado T Estado T
A Hemoglobina Fetal
- A Hb fetal contem duas cadeia Alfa e duas cadeias Gama
A cadeia Gama 72% idntica cadeia Beta na seqncia de aminocidos
- A modificao Beta-His143 Gama-Ser143
- Modifica o stio de interao do 2,3-BPG com a Hb
Consequncias:
- Reduo da afinidade da Hb Fetal por 2,3-BGP
- Aumento da afinidade da Hb Fetal por O
2
Permite que a Hb Fetal receba
eficientemente o O
2
transportado pela HbA
maternal
- O feto no experimenta pO
2
atmosfrica

Outros genes
Existem outras 3 cadeias de hemoglobina
expressas em diferentes estgios do
desenvolvimento
Existem ainda: Neuroglobina e citoglobina
(+ similares mioglobina)
A HbA transporta H
+
e CO
2
dos tecidos para o pulmo

A HbA sensvel aos nveis de H
+
e CO
2
nos tecidos
- H
+
e CO
2
so efetores alostricos da HbA aumentam a liberao de O
2
para os tecidos
O estado T estabilizado pela reduo do pH
- Resultado: descarga de O
2
nos tecidos
chamado de Efeito Bohr (Christian Bohr, pai de Niels Bohr)
O CO
2
hidratado pela enzima
Anidrase Carbnica nas hemcias
A afinidade da HbA por O
2

diminui com a reduo do pH
A HbA liga H
+
e CO
2
A HbA transporta H
+
dos tecidos para o pulmo
A Hidratao do CO
2

catalisada pela Anidrase
carbnica
No capilar sanguneo (tecidos)
O prton liberado pela hidratao do CO
2
liga-se
cadeia Beta da HbA estabilizando uma ponte salina
estabilizao do estado T
Permite o transporte de prton para os pulmes
- 80% do transporte
Ponte salina na
interface
2

1
A HbA liga H
+
e CO
2

A HbA transporta CO
2
dos tecidos para o pulmo
O CO
2
liga-se aminas terminais
- ~15-20% do transporte ligado HbA
- Restante transportado na forma de HCO
3
-
solvel
Forma grupos carbamato carga negativa
Estabiliza estado T por favorecer interaes
eletrostticas na interface cadeia Alfa-Beta da HbA
Descarga de O
2
pela HbA
77%
88%
Mutaes na HbA

Os genes da Hb sofrem mutaes que alteram a cadeia protica
- Podem prejudicar a afinidade da Hb pelo O
2
- Originam as Hemoglobinopatias so as anemias hereditrias
- ~ 500 tipos de mutaes identificadas na populao humana
- Muitas mutaes so incuas
- O Surgimento da anemia depende se o indivduo heterozigoto ou homozigoto
Anemia falciforme
- devido mutao D6V na cadeia
Beta
- Forma a Hemoglobina S
- Forma um contato hidrofbico com
a F85 e V88 entre as cadeias beta
inter-tetrmeros
Mutaes na HbA

As pontes hidrofbicas inter-cadeias precipitam a HbS no liga O
2


A HbS forma fibras que deformam a estrutura das hemcias
HbS aumenta resistncia malria parasita vive dentro das hemcias
-possvel fator seletivo positivo da HbS por isto foi selecionada e persiste presente

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