Biotecnologa Mdica Ingeniera Biotecnolgica

Ancco Mamani Midwar Universidad Catlica de Santa Mara

Taller: Secuenciacin del ADN

Introduccin

El secuenciamiento de DNA es el proceso por medio del cual se determina el orden exacto de
las cuatro bases A, T, C y G del genoma de un organismo o de cualquier fragmento de DNA.
Este es el anlisis ms detallado de la estructura del ADN.

A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes mtodos para obtener la secuencia de
nucletidos del ADN, sin embargo, actualmente los mtodos ms utilizados son el de
secuenciacin automtica y el mtodo enzimtico de terminacin de cadena de Sanger.

Fred Sanger, investigador de la universidad de Cambridge (Inglaterra) es uno de los pioneros
en la secuenciacin de protenas, l invento en el ao de 1977 el mtodo de secuenciacin de
ADN llamado "interrupcin de la cadena" o mtodo didesoxi.

El mtodo de Sanger trataba de sintetizar una nueva hebra de DNA que fuera el complemento
de una plantilla de una sola hebra, de manera que la identidad de la ltima letra estuviera
determinada, es decir, el DNA es usado como una plantilla para generar un conjunto de
fragmentos que difieren en longitud por una sola base. Sanger logro esto gracias al uso de
nucletidos didesoxi modificados (ddNTP-H*) y marcados. Est base modificada (ddNTPH*) se
incorpora a la cadena de DNA sin ningn problema, pero no puede establecer un enlace con la
siguiente base de la cadena, con lo que la amplificacin de la cadena de DNA se ve
interrumpida, obtenindose as fragmentos de diferente tamao, que luego son separados en
un gel de acuerdo a su peso molecular y la secuencia se lee en una escala de bandas reactivas.

Entonces, los compuestos necesarios para realizar la secuenciacion son:
DNA plantilla que se desea secuenciar.
DNA polimerasa I
Cebadores o Primers
Los nucleotidos trifosfato (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP y dTTP).
Los nucleotidos didesoxi (ddNTP*s: ddATP*, ddCTP*, ddGTP* y ddTTP*).








Figura N1: Los nucleotidos didesoxi (ddNTP*s: ddATP*, ddCTP*, ddGTP* y ddTTP*)
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Mtodo enzimtico de terminacin de cadena
Este mtodo se realiza en cuatro tubos diferentes, con cuatro mezclas de reaccin
conteniendo: dNTPs, ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un ddNTP*
(e.j. ddATP*) a una concentracin baja. En cada mezcla, el ddNTP* utilizado competir con
su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se est sintetizando,
produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se incorpora el
ddNTP*.
Por este sistema, en cada mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de ADN
de nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucletido y
marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el
cebador utilizado).
Los fragmentos de ADN de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se separan
por tamaos mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida que permiten
distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucletido. Los productos de
cada una de las cuatro mezclas de reaccin se insertan en cuatro calles o carriles
diferentes del gel.
Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica
de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la
autorradiografa en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia
del ADN de nueva sntesis (complementario al ADN molde) est la base correspondiente al
ddNTP* utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente.
Teniendo en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si se
comienza a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y se avanza al
aumentar el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obteniendo la secuencia del ADN de
nueva sntesis en la direccin 5' 3' (figura N2).










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Figura N2: Mtodo enzimtico de terminacin de cadena

Mtodo automtico de secuenciacin
La principal diferencia entre el mtodo enzimtico de terminacin de cadena y este mtodo,
radica en primer lugar en el tipo de marcaje, ya que en este mtodo, en vez de radiactividad,
utiliza 4 tipos de fluorocromos que a la vez permitirn combinar el resultado de las 4
reacciones y aplicar la mezcla en un mismo pocillo del gel en la electroforesis.
La fluorescencia de cada fluorocromo que corresponde a la presencia de las bandas (de
acuerdo a su peso molecular, de menor a mayor) ser detectada a travs de un lser y se
generara un registro informtico de los 4 perfiles de color que combinados se interpretan
como una secuencia de DNA (Figura N3).




Mtodo del escopetazo
James Weber, director de la Marshfield Research Foundation de Winsconsin, alrededor del ao
de 1993 empez a trabajar en un mtodo de secuenciamiento que no necesitara del tedioso
proceso de localizar y secuenciar fragmentos previamente ordenados de cada cromosoma, es
decir que se pudiera secuenciar cualquier genoma sin la necesidad de realizar mapas
cromosmicos previos. El mtodo de Weber llamado "El mtodo del escopetazo" rompe todo
el DNA de un genoma, luego secuencia estos fragmentos y por ltimo con poderosos medios
informticos se ensambla la secuencia, los algoritmos para ensamblar la secuencia fueron
diseados por Gen Myers investigador de la universidad de Arizona en Tucson.
Este mtodo ha sido utilizado con mucho xito por la empresa privada Celera Genomics,
fundada por Craig Venter, para secuenciar el genoma humano, est empresa adems ha
secuenciado completamente el genoma de la mosca de la fruta y ha manifestado tener el 90%
de la secuencia del genoma humano.
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Ejercicios de refuerzo:

1. Dibujar la autoradiografa que corresponde a la siguiente secuencia de DNA de acuerdo a
Sanger:

3' AGCTCTCCCTTTAGTTAAGACACTTGCTATTAGGTCA 5'

2. Obtener la secuencia de DNA en cada caso:

a. (A G T C)













b.
















c. Mtodo automatizado: (n = G, r = T, v = A, a = C)









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Simulacin de un test de paternidad

Objetivos:
Simular algunas tcnicas de Ingeniera Gentica
Conocer algunas aplicaciones de Ingeniera Gentica
Discutir acerca de cuestiones bioticas

Caso:
Una pareja que no puede tener hijos, por ser estril la mujer, decide buscar una madre
sustituta para tener un hijo. La madre de alquiler es inseminada artificialmente con el
esperma del hombre. Cuando nace el beb, la madre de alquiler decide quedrselo.
Reclama al beb diciendo que la pareja no tiene ningn derecho sobre el nio puesto que el
verdadero padre es su propio marido y no el donante de esperma. El caso es llevado al juzgado
y se realiza un test gentico para decidir quin es el padre biolgico del beb.

Se sabe que cada individuo tiene una secuencia de bases de ADN nica y diferente a la de
cualquier otro, como resultado de la combinacin de los genes de sus padres: La mitad
proceden de la madre y la otra mitad del padre. Por tanto, el beb que ha nacido tendr mitad
de los genes maternos y la otra mitad paternos.

Material necesario:
Tiras de papel con la secuencia de bases de una cadena de ADN de cada uno de los
personajes.
Un rotulador fosforescente que representa el marcaje fluorescente.
Unas tijeras representarn la enzima de restriccin
Una hoja blanca ser el gel de agarosa

Mtodo:

1. Obtencin de la muestra de ADN: Se ha obtenido una muestra de sangre del nio, de la
madre de alquiler, de su marido y del donante esperma.
2. Aislamiento del ADN: Mediante centrifugacin de las muestras de sangre se separa el ADN
celular.
3. Separacin de las cadenas de ADN: Se somete al ADN a elevadas temperaturas que han
separado las molculas de ADN en sus dos cadenas. Ahora tenemos cadenas simples de
ADN (desnaturalizacin).
* (Recorta los trozos de ADN de cada individuo y pgalos de manera que consigas una sola
cadena larga de ADN).
4. Fragmentacin de las cadenas de ADN: Cada tubo de ensayo contiene las cadenas de ADN
de cada uno de los individuos que hay que analizar. Cada muestra es tratada con una
enzima de restriccin que reconocer y corta la secuencia GG/CC en las cadenas de ADN.
* (Recorta la secuencia nucleotidica en la zona de corte de la enzima de restriccin y se
obtendran fragmentos de ADN de distintos tamaos).
5. Separacin de los fragmentos de ADN: a travs de la tcnica llamada electroforesis en gel
de agarosa.
* (Ubicar los fragmentos obtenidos de acuerdo a su peso molecular en el papel blanco
que represente el gel de agarosa).
6. Identificacin de los fragmentos de ADN: los fragmentos de ADN dispuestos en la placa
deben ser marcados con la sonda fluorescente de secuencia GTA.
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* (Pega las sondas fluorescentes GTA junto a todas y cada una de sus secuencias
complementarias que aparezcan en los fragmentos de ADN).
7. Revelado de las sondas: las sondas fluorescentes brillan cuando estn bajo luz ultravioleta.
As se observa un patrn de bandas que corresponden al lugar exacto donde hay una
secuencia CAT en el ADN.
* (Pinta con el rotulador dichas zonas)
8. Comparacin de los patrones de ADN de todas las muestras y obtencin de conclusiones.
Ahora se trata de comparar los patrones de bandas que aparecen en las muestras de los
supuestos padres, de la madre de alquiler y de nio para descubrir semejanzas. La mitad
de los marcajes del nio deben coincidir con los de la madre de alquiler y la otra mitad
coincidirn con los del padre biolgico. Marido


RESULTADO























Hijo Madre Marido Demandante
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Conclusiones:

1. Quin es el padre biolgico del beb? Por qu?

El seor que pago a la madre de alquiler porque, tienes un fragmento de ADN de igual
peso molecular que el nio y esto significa que es el padre.

2. Si fueras el juez, a qu pareja le daras la custodia del beb? Fundamenta tu respuesta.

Ala madre verdadera y a su esposo pro que creo que un nio estara mejor con la madre
bilgica.

3. Por qu es necesario emplear sondas fluorescentes o marcadores de otro tipo en los
anlisis de ADN?

Es necesario para identificar en el gel a los nucletidos que sufrieron hibridacin, porque
solo estos van a emitir florescencia.

4. Qu simula el papel con las columnas pertenecientes a cada individuo que se ha utilizado
para pegar los fragmentos utilizados?

Los fragmentos de ADN de cada individuo, que fueron digeridos por enzimas de restriccin
y liego sometidas a electroforesis.

5. Qu simula el pegamento que hemos utilizado para pegar las sondas?

Enlaces que unen los nucletidos especficos entre sonda y fragmento de ADN en estudio.