Digestin con enzimas de restriccin

Las enzimas de restriccin, tambin conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los
enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen. Estas enzimas
reconocen una secuencia de 4-8 pares de bases en una secuencia de AD de doble banda! este sitio
de reconocimiento se denomina sitio de restriccin,
Estas enzimas se encuentran en muc"as especies de bacterias, donde funcionan in vivo como parte
de un sistema de restriccin # modificacin. Este sistema es an$logo a un sistema inmune, # le
permite distinguir a la bacteria entre su propio AD # el AD e%geno, siendo este &ltimo
degradado por la enzima de restriccin. El AD propio no es reconocido por sus enzimas de
restriccin, puesto que pre'iamente lo "a modificado por mutilacin a tra's de la accin de una
metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde )-adenosilmetionina a bases
espec*ficas+.
La ma#or*a de las enzimas de restriccin reconocen secuencias palindrmicas (secuencias que se
leen igual en direccin ,--.- en cualquiera de las / "ebras+ (0ig. 1+
0igura 1. E2emplo de secuencia palindrmica
E%isten . tipos de enzimas de restriccin3
4ipo 5 # 4ipo 5553
a. 4ienen acti'idad de restriccin (cortan+ # modificacin (metilan+.
b. 6ortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las 4ipo 5 cortan le2os de
la secuencia de reconocimiento, #a sea corriente arriba o corriente aba2o. Las 4ipo 555
5'- G A A T T C -3'
3'- C T T A A G -5'
cortan de ,-8 bases antes o despus de la secuencia que reconocen.
c. ecesitan A47 para mo'erse a tra's de la molcula de DA, desde el lugar de
reconocimiento "asta el sitio del corte.

4ipo 553
a. )lo tienen acti'idad de restriccin.
b. 6ortan de manera consistente # predecible dentro de la secuencia que reconocen.
c. )lo requieren 8g
99
como cofactor.
d. o necesitan A47.
Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son e%tra*das, su nombre est$
dado seg&n el gnero # la especie de la bacteria de donde se aisl por primera 'ez esta enzima. La
primera letra representa el gnero de la bacteria, las pr%imas dos indican la especie, una cuarta
letra indica la cepa, # un n&mero al final indica la cantidad de enzimas que se "an aislado de esa
cepa. E23
Eco :5
E ; gnero Esc"eric"ia
co ; especie coli
: ; cepa :< 1.
5 ; primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las enzimas de restriccin al cortar el DA pueden producir / tipos de cortes3
1. 6o"esi'os o con puntas pega2osas3
/. Abruptos o con puntas roma3
E%isten 'arios factores que son cr*ticos al traba2ar con enzimas de restriccin # que pueden afectar
la acti'idad de las mismas3
1. 7ureza del DA = la reaccin de enzimas es mu# dependiente de la pureza, contaminantes como
prote*nas, fenol, cloroformo, etanol, ED4A, )D), altas concentraciones de sal, etc. in"iben la
endonucleasa.
/. 4emperatura # p> = las enzimas son mu# sensiti'as a temperatura # p> en lo que respecta a su
estabilidad # acti'idad.
.. ADasas = Las ADasas degradan el DA en presencia de 8g
99
.
4. 6ontaminantes con carga (-+.
,. DA contaminado con otro DA.
?. @rados de metilacin = algunas endonucleasas son in"ibidas por metilacin.
A. 4ipo de molcula de DA = si el DA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima
accesible, esta no puede cortar el material gentico (e2. si el DA est$ superenrrollado el lugar de
restriccin no 'a a estar accesible para la enzima+.
8. Buffer adecuado = este pro'ee el ambiente que necesita la enzima para traba2ar en condiciones
ptimas.
C. 4iempo de digestin = un tiempo mu# corto de digestin puede resultar en una digestin parcial
(no total+ de la enzima.
Las enzimas de restriccin son una "erramienta b$sica de la biolog*a molecular # tienen muc"as
aplicaciones. Algunas de ellas son3
1. >acer mapa de restriccin de un pl$smido o bacterifago.
/. 0ragmentar DA genmico para separacin de electroforesis # D)out"ern BlotE.
.. @eneracin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en D)out"ernE# Dort"ernE
blotting.
4. @eneracin de fragmentos para ser subclonados en los 'ectores apropiados, creacin de DA
recombinante.
,. Diagnstico molecular
5mportante3 Fna unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita para
cortar 1Gg de DA en 1 "ora.
Metodologa
En la pr$ctica de "ar$ una digestin del bacterifago lambda con tres enzimas de restriccin3 7st5,
Eco:5 # >ind555.