INSTITUTO TECNOLOGICO DE ACAPULCO

DPT. DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOQUIMICA

INGENIERIA BIOQUIMICA


ANALISIS INSTRUMENTAL


CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION
(HPLC)


CAMPOS BARONA JULIO CESAR Nc. 12320313


M.C. ING. ZARATE JUAREZ MONICA





10/ oct/ 2014
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CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCION
El HPLC (HIGH PERFORMACE LIQUID CROMATOGRAPHY) o cromatografa
lquida de alta resolucin, es una tcnica cromatogrfica usada para separar
componentes usando una variedad de interacciones qumicas entre el analito y la
columna cromatogrfica.
Bsicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase mvil, bomba,
inyector, columna de separacin y detector.
El analito se pasa a travs de una columna de la fase estacionaria bombeando la
fase mvil liquida con alta presin. La muestra se introduce en pequeos
volmenes a la corriente de la fase mvil y all se retarda por medio de
interacciones qumicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna. El
retardo se conoce como tiempo de retencin, nico para analito. Depende de la
naturaleza del analito, de la fase estacionaria y de la composicin de la fase mvil.
Los solutos ms comunes usados en la fase mvil son combinaciones de agua
purificada con lquidos orgnicos, los ms comunes son Metanol y Acetonitrilo,
tambin suelen usarse sales y bufferes para contribuir a la separacin de
componentes. Tambin se usa el cido Trifluoroacetico para actuar como
formador de pares inicos.
Estas combinaciones introducen el concepto de gradiente de elucin. Consiste en
la variacin de la composicin de la fase mvil, para adaptarse a los diferentes
analitos y conseguir mejores resultados
El gradiente separa la matriz del analito en funcin de la afinidad del analito por la
composicin de la fase mvil. Cada analito tiene un gradiente de elucin para
obtener la mxima separacin de picos en el detector.

Existen varios tipos de HPLC
Cromatografa de fase normal:
Fue el primer tipo de HPLC, separa analitos basndose en la polaridad. Este
mtodo usa una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar que se usa
cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria
polar. La adsorcin aumenta con la polaridad del analito y la interaccin entre
analito y fase estacionaria.

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Cromatografa de fase inversa:
Este tipo de HPLC es el ms comn. En esta tcnica se usa una fase estacionaria
no polar y una fase mvil moderadamente polar. La fase estacionaria tpica es
silicio con RMe2SiCl, donde R es una cadena lineal con un grupo alcalino.
Las caractersticas del analito son importantes para sus propiedades de retencin.
El pH tambin es importante porque modifica la hidrofobia del analito. Por eso se
suele usar un buffer como fosfato sdico para controlar el pH.
Cromatografa de exclusin por tamao:
Tambin conocida como cromatografa de gel permanente o cromatografa de gel
filtrante. Separa las partculas en funcin del tamao. Es una cromatografa de
baja resolucin y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternarias de
protenas y es la tcnica comn para averiguar el peso molecular de polmeros
sintticos y naturales.
Cromatografa de intercambio inico:
La retencin est basada en la atraccin entre los iones del soluto y la carga
complementaria de la fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase
estacionaria tienen la misma carga, son excluidos. Algunos intercambios de iones
son:
Resinas de poliestireno
Celulosa

Cromatografa de bioafinidad:
Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos
estables especficos y reversibles. La formacin de los complejos implica fuerzas
moleculares como Van der Waals, electrosttica, dipolo-dipolo, hidrofbicas y
puentes de hidrogeno. Una unin bioespecfica se forma por accin simultnea de
estas fuerzas en los sitios de unin.




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Instrumentacin
Bombas:
La bomba tiene la funcin de proveer un flujo continuo del eluyente a travs del
inyector, la columna y el detector. Los requisitos de una bomba para HPLC son:

Rango de flujo: de 0.01 a 10 ml/min.

Rango de presin: de 1 a 5000 psi.

Pulsos de presin: menos del 1% para HPLC normal e inverso y menos del
0,2% para el HPLC de exclusin de tamao.

Existen distintos tipos de bombas:

De presin constante: son fciles de usar y con bajo mantenimiento, adems
evitan los pulsos de presin. El problema es que requiere una vigilancia constante
del flujo, puesto que las variaciones pueden producir fallos.

De flujo constante: son capaces de mantener el flujo, existen varios tipos:

- Pistn recproco: un pistn expela lquido a travs de una vlvula
anti-retorno.

- Pistn dual: Usando dos pistones, provee un fllujo constante y libre de
pulsos.

- Desplazamiento positivo (jeringuilla): un pistn controlado por motor que
provee un flujo suave y sin pulsos.


Gradiente de elucin:
Para crear el gradiente de la fase mvil, es necesaria una mezcla de los
componentes. La capacidad de mezcla es vital para obtener el eluyente ptimo.

Existen dos mtodos:

- Mezcla de alta presin: se usan bombas de alta presin individuales para
cada lquido. Las salidas se conectan en una cmara de mezcla Se usa un
controlador electrnico para asegurar que la mezcla es ptima.

- Mezcla de baja presin: la mezcla ocurre antes de pasar por la bomba, el
controlador electrnico regula la cantidad de lquido que pasa por los tubos.


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Inyectores:

Los inyectores deben introducir muestras liquidas en un rango de volumen desde
0,1 ml a 100 ml con una alta precisin y alta presin. Normalmente se usan
inyectores Rheodyne que poseen vlvulas de 6 puertos con un bucle que
permite no solo la inyeccin de muestra sino tambin la purga del sistema y la
eliminacin de burbujas.

Columna:

Normalmente compuesta de acero inoxidable del tipo 316, con dimetros internos
desde 2,6 a 5 mm, normalmente con filtros de acero poroso.

Tubos conectores:

Todos aquellos tubos que transportan las sustancias de columna a columna, de
columna a detector o de detector a detector. No deben superar los 0,634 mm de
dimetro interno o causaran picos en las mediciones.

Filtros:

Situados entre la bomba y el inyector de muestras, para evitar la entrada de
ciertas sustancias y evitar el colapso de la columna. Normalmente estos filtros
estas compuestos de acero poroso.

Medidores de presin:

Son indicadores de fallos en el sistema, nos indica cuando un flujo continuo falla
por motivos de presin y si existe alguna fuga en la infraestructura del sistema.

Termostatos de columna:

Son importantes para mantener la columna a una temperatura optima, sobretodo
en anlisis cualitativo, puesto que las variaciones de temperatura pueden cambian
la viscosidad del eluyente e influir en el volumen retenido.

Detectores:

De conductividad electroltica: el flujo pasa a travs de un capilar con dos
electrodos, la conductividad vara en funcin de la composicin del eluyente y se
miden. Muy comn en combinacin con el HPLC de intercambio inico.

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Electroqumicos: se basa en la reaccin de oxidacin/reduccin del analito con un
electrodo, el nivel de reaccin es proporcional a la concentracin de analito,
midiendo esto y comparndolo con el electrodo de referencia nos da datos que
podemos usar para cuantificar.

De fluorescencia: es el detector ms usado y el mas preciso, nos permite hacer un
anlisis cualitativo, puesto que las sustancias al ser excitadas con ciertas
longitudes de onda, emiten en longitudes de onda en el espectro ultravioleta
nicas para cada sustancia.

De ndice de refraccin: la deteccin implica la medida del cambio del ndice de
refraccin de la columna de eluyente. Se mide la diferencia entre el ndice de
refraccin de la fase mvil y la muestra.

De luz visible/ultravioleta: el detector es bsicamente un espectrofotmetro que
mide el cambio que sufre un haz luminoso al atravesar la muestra, midiendo la
absorbancia de las sustancias.

De dispersin de luz evaporativa: se nebuliza la muestra de la columna hasta
formar un aerosol, despus se vaporiza el disolvente y se forman gotas de soluto,
despus la clula de dispersin de luz detecta su composicin.












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Aplicaciones al anlisis de alimentos
Conservantes antioxidantes.
Anlisis de carbohidratos en bebidas.
Ismeros de carotenoides.
Flavonoides y fenoles.
Lpidos.
cido lipoico y cido dihidrolipoico en suplementos alimenticios.
Hidroxinomenal y otros aldehdos.
Surfactantes no inicos.
Carbohidratos no inicos.
Catequinas del t.
Triglicridos


BIBLIOGRAFIA

1. Skoog, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Anlisis Instrumental, Madrid:
McGraw-Hill.

2. Mc Master, Marvin (1994) HPLC: A Practical User's Guide. Wiley-VCH.