Cul es el mecanismo molecular de infeccin bacteriana en clulas vegetales?

Durante el proceso de infeccin A. tumefaciens introduce en la clula vegetal una parte de su

ADN (ADN de transferencia) el cual es integrado dentro del genoma de la planta. Los genes del
ADN-T son expresados en su hospedero e inducen la formacin de tumores y la sntesis de
unos derivados de aminocidos llamados opinas los cuales son aprovechados por la bacteria. El
ADN-T esta localizado en el plsmido
Ti (Plsmido inductor de tumor), que adems contiene los genes vir que son necesarios para la
transferencia e incorporacin del fragmento de ADN en el genoma de la planta. La especie A.
rhizogenes produce el crecimiento vigoroso de las races infectadas mediante un mecanismo
semejante al de A. tumefaciens. En este caso el plsmido que contiene el ADN-T es llamado Ri
(plsmido inductor de races).
Un hallazgo crucial que permiti el diseo de vectores para la transformacin gentica de
plantas mediante el uso de especies de Agrobacterium es el hecho que slo las secuencias
borde del ADN-T son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo
( Garfinkel et al., 1981; Zambryski et al., 1983). Algunos o todos los genes bacterianos del ADN-
T pueden ser removidos originando vectores desarmados, los cuales pueden transformar
clulas vegetales sin los sntomas generales de la infeccin bacteriana.

Mecanismo de transferencia de ADN-T mediado por Agrobacterium. El mecanismo de
transferencia del ADN-T a la clula vegetal esta determinado por la interaccin molecular entre
la bacteria y la planta, especialmente por el intercambio de seales de tipo proteico. Aunque el
proceso de transferencia del ADN-T de A. tumefaciens ha sido ampliamente estudiado, an no
han sido descifrados completamente los mecanismos moleculares por los cuales ste es
transferido a la planta. Se han obtenido mutantes de Arabidopsis thaliana que son resistentes
a la transformacin con Agrobacterium (mutantes rat) con los cuales se espera entender el
papel de los genes y protenas de la planta que median el proceso de transformacin (Zhu et
al., 2003). Tzfira y Citovsky (2000) describen siete eventos fundamentales para la interaccin A.
tumefaciensplanta:(i) reconocimiento y adherencia; (ii) identificacin de seales de la planta;
(iii) activacin de genes vir; (iv) generacin del ADN-T; (v) exportacin del ADN-T hacia la
planta; (vi) importacin del ADN-T dentro del ncleo de la planta; (vii) integracin del ADN-T
dentro del genoma del hospedero.

Identifique y describa cuales son las tcnicas mediante reacciones bioqumicas y
marcadores moleculares para la identificacin de bacterias y hongos fitopatolgicos

Bacterias
En la literatura especializada no se encontr referencia sobre un medio de cultivo con
selectividad para el aislamiento de bacterias ( P. syringae pv. tabaci.)


Se seleccion el medio MSP (Mohan & Schaad, 1987), con la siguiente composicin: sacarosa (20
g/L), peptona (5 g/L), K
2
HPO
4
(0,5 g/L), MgSO
4
.7H
2
O (25,0 mg/L), agar (20 g/L), cicloexamida (200
mg/L), cefalexina (80 mg/L), vancomicina (10 mg/L) y bromotimol azul (15 mg/L). De los tres
antibiticos que lo integran se retir el vancomicina, quedando como suplementos los primeros dos
(ciclohexamida y cefalexina) y el bromotimol azul, sin alterar las concentraciones primarias. El medio
ser denominado a partir de este punto MSP-M (MSP Modificado).
Para conocer el crecimiento de P. syringae pv. tabaci en el medio, se prepar una suspensin en el
tampn PBS estril de la cepa Emb.D 135 (IBSBF 766), cultivada por 24 h en el medio KB [King et al.
(1954), con la siguiente composicin: proteosa peptona (20 g/L), K
2
HPO
4
(1,5 g/L), MgSO
4
7H
2
O (1,5
g/L), glicerol (15,0 ml/L), agar (15 g/L)] y se realizaron diluciones decimales seriadas hasta 10
-6
ufc/mL.


En las placas con medio de cultivo MSP-M, a las 48 h las colonias de P. syringae pv. tabaci
pueden definirse como elevadas, brillantes, con bordes enteros de color amarillo claro, que, a las 72 h se
torna ms oscuro casi anaranjado, con cambio de color del medio entorno de las colonias, de verde a
amarillo (Figura 1). La recuperacin de 2,3x10
7
ufc/mL en medio de cultivo MSP-M a partir de la
suspensin bacteriana, se situ en el mismo rango de sensibilidad que el registrado en el medio de cultivo
testigo (2,5x10
7
ufc/mL), lo cual demuestra que las drogas utilizadas para mejorar la selectividad no
reducen el crecimiento de la bacteria objeto de estudio.



En los Laboratorios de Microbiologa se utiliza una gran variedad de medios de cultivos para
mantener las cepas, aislar o identificar microorganismos con varias finalidades: determinar la
existencia de contaminacin de alimentos, medicamentos o cosmticos; diagnosticar alguna
enfermedad, elaboracin de vacunas bacterianas, etc.

los medios de cultivo
segn su estado fsico puede ser
liquidos
solidos
Segn la naturaleza de sus constituyentes
medios naturales o complejos
medios sintticos o qumicamente definidos
Segn su propsito de uso
medios de enriquecimiento
medios selectivos
medios diferenciales
medios selectivos diferenciales

manual de prcticas de microbiologa FCFA UNCP. ing. cristina Herrera D. 19-22p

Ketchum Paul A. Microbiology. 1988. Concepts and Applications. John Wiley and sons.


La Huella Dactilar de Plasmidos (PF)
La huella dactilar de plasmidos fue la primera tcnica molecular utilizada como una
herramienta de tipificacin. Los plasmidos son elementos de ADN extracromosmico que
estn presentes en muchos aislamientos clnicos y pueden ser identificados por simples
procedimientos de lisis de clulas seguidos de electroforesis en gel de los lisados. El nmero y
tamao de los plasmidos presentes es utilizado como base para la identificacin de cepas. Esta
tcnica de tipificacin de cepas ha sido utilizada con xito en el anlisis de brotes de
infecciones nosocomiales y en infecciones adquiridas en comunidad causadas por una
variedad de especies de bacterias gram-negativas (Tenover et al., 1997).
En general esta tcnica es ms utilizada para estudios epidemiolgicos que estn limitados
tanto temporalmente como geogrficamente y puede complementar otras tcnicas como la
PFGE, para proporcionar una base para diferenciar aislamientos que estn relacionados
genotpicamente pero que estn separados epidemiolgicamente por periodos moderados de
tiempo, como a varios meses (Tenover et al., 1997).
Anlisis de Endonucleasas de Restriccin de ADN de Plasmidos (REAP).
En la actualidad esta tcnica es utilizada principalmente como una alternativa para los
aislamientos de estafilococos que contienen frecuentemente plasmidos mltiples, y para
seleccionar especies de Enterobacteriaceae que tienen a menudo grandes plasmidos
caractersticos.
Algunas cepas de bacterias contienen solamente un plasmido grande, de un rango de tamao
de 100 a 150 Kilobases (kb). Debido a que es difcil de diferenciar plasmidos en este rango de
tamao, especialmente los que varan solamente de 10 a 15 kb, algunos investigadores han
adicionado una endonucleasa de restriccin para aumentar el poder de discriminacin de la
electroforesis en gel de agarosa. Esto puede ser til cuando los plasmidos grandes producen
muchos fragmentos de restriccin que puede hacer la interpretacin ms difcil, especialmente
cuando estn presentes plasmidos mltiples grandes (Tenover et al., 1997).
Actualmente, la REAP ha mejorado en su reproducibilidad y poder de discriminacin por lo que
es la tcnica preferida de tipificacin de plasmidos y es de particular inters para la realizacin
de estudios epidemiolgicos de infecciones institucionales con organismos resistentes a
mltiples antibiticos. Utilizado conjuntamente con delineacin clonal por tipificacin de ADN
cromosmico, es esencial para localizar la diseminacin de genes de resistencia antibitica
mviles como los que codifican los beta-lactamasa de amplio espectro (Struelens, 2001).
Anlisis del Polimorfismo de Largos Fragmentos Amplificados (AFLP)
Una de las tcnicas nuevas y ms promisorias es el AFLP desarrollado por Keygene BV,
Wageningen, de Nueva Zelanda. Este mtodo combina una aplicabilidad universal con alto
poder de discriminacin y reproducibilidad. Un gran nmero de reportes describen el uso de
esta tcnica para plantas y mapeo gentico animal, diagnsticos clnicos, estudios
filogenticos, y tipificacin de bacterias (Savelkoul et al., 1999).
Est basada en la deteccin de fragmentos de restriccin genomica por amplificacin con
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y puede ser utilizada para ADNs de cualquier origen
o complejidad. La tcnica comprende tres pasos: 1) la restriccin del ADN y la ligazn de
adaptadores oligonucletidos, 2) la amplificacin selectiva de juegos de fragmentos de
restriccin, y 3) anlisis del gel de los fragmentos amplificados (Vos et al., 1995; Savelkoul et
al., 1999; Struelens, 2001).
El ADN es cortado con enzimas de restriccin, y los adaptadores de la doble hebra estn
ligados al final de los fragmentos del ADN para generar la plantilla de ADN para amplificacin.
La secuencia de los adaptadores y el sitio de restriccin adyacente sirve como sitios de unin
de los primer para la subsecuente amplificacin de los fragmentos de restriccin (Vos et al.,
1995).
Para el anlisis del AFLP solamente se necesita una pequea cantidad de ADN genomico
purificado; este es digerido como ya se menciono con dos enzimas de restriccin , una con una
frecuencia media de corte (como la EcoRI) y una segunda con una alta frecuencia de corte
(como la MseI o TaqI) (Savelkoul et al., 1999). La infrecuente restriccin de los sitios de
amplificacin, o IRS-PCR, es otra variacin de esta propuesta que esta basada en la
amplificacin selectiva de secuencias de ADN con sitios de restriccin infrecuentes a los lados.
Tiene un alto poder discriminatorio que se ajusta fcilmente y un muy buen nivel del patrn de
reproducibilidad para un amplio rango de bacterias patgenas tanto Gram positivas como
negativas (Struelens, 2001).
Tcnica de electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE)
La electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE por sus siglas en ingls) fue descrita en
1984 como una herramienta para examinar el ADN cromosmico de organismos eucariotas. Ha
sido uno de los progresos ms tiles de la epidemiologa molecular en las dcadas pasadas;
emerge en los 90s como una tcnica de la huella dactilar considerada el estndar de oro para
la tipificacin molecular de microorganismos, ya que ha demostrado que es altamente efectiva
para muchas especies bacterianas tanto gram-positivas como los estafilococos, enterococos, y
mycobacterias y gram-negativas como la E. coli, otras Enterobacteriaceae, y pseudomonas
(Maslow et al, 1993; Goering, 1993; Tenover et al., 1994; Struelens y MESGEM, 1996; Tenover
et al., 1997; Goering, 2000; Struelens, 2001; Warner y Onderdonk, 2003).
En general, la PFGE es una de las tcnicas de tipificacin ms reproducibles y altamente
discriminatorias en comparacin con otras tcnicas moleculares (Maslow et al, 1993; Goering,
1993; Tenover et al., 1994; Struelens and MESGEM, 1996; Tenover et al., 1997; Warner and
Onderdonk, 2003).
En esta tcnica, el genoma bacteriano, que tpicamente es de 2,000 a 5,000 pares de kb en
tamao, es digerido con una enzima de restriccin que es relativamente de pocos sitios de
reconocimiento y que genera aproximadamente de 10 a 30 fragmentos de restriccin que van
de 10 a 800 kb. Todos estos fragmentos pueden ser separados como un patrn de distintas
bandas por PFGE, usando una cmara diseada especialmente que cambia de posiciones en el
gel de agarosa entre tres juegos de electrodos que forman un hexgono alrededor del gel
(Tenover et al., 1997; Warner y Onderdonk, 2003).
La preparacin del ADN genomico y la macrorestriccin son llevados a cabo en bacterias que
se ensamblan en los pozos de agarosa. Utilizando unidades de electroforesis programables
especiales, los cambios de orientacin peridica de los campos elctricos o electroforesis en
gel de campos pulsantes, permiten la separacin y determinacin del tamao de los
fragmentos de macrorestriccin.
La PFGE escanea ms del 90% del cromosoma para reordenar fragmentos de gran tamao
tales como duplicaciones, cancelaciones, o inserciones de secuencias que se detectan como un
cambio en el tamao o nmero del fragmento (Struelens, 2001).
Los patrones de restriccin del ADN de los aislamientos en estudio son comparados unos con
otros para determinar sus relaciones. Algunos resultados con esta tcnica pueden llevar a
conclusiones diferentes entre laboratorios, como por ejemplo, que los aislamientos puedan ser
designados como relacionados con brotes o no relacionados con brotes de alguna enfermedad
(Tenover et al., 1995).
Las principales dificultades asociadas con esta tcnica son las relacionadas a las demandas
tcnicas del procedimiento y costos iniciales del equipo. La preparacin de ADN genomico
apropiado requiere de 1 a 3 das, dependiendo de los organismos a examinar, y los costos del
equipo requerido (incluyendo el aparato de electroforesis y el transiluminador) varia entre 10,
000 y 20,000 dlares. Sin embargo, el mtodo es operacional en el laboratorio, y puede ser
aplicado a un amplio rango de especies con solo un mnimo de modificaciones (Tenover et al.,
1997).
La Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR)
La Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingls) es una tcnica que se
utiliza comnmente en los laboratorios de investigacin mdicos y biolgicos para amplificar
(crear copias mltiples de) el ADN, sin utilizar un organismo vivo, tal como la E. coli o una
levadura. Asimismo, se emplea en una variedad de tareas, tales como la deteccin de
enfermedades hereditarias, la identificacin de huellas digitales genticas, diagnstico clnico,
anlisis forense del ADN, deteccin de patgenos en el hombre, animales, plantas, y alimentos,
e investigacin en biologa molecular (Saunders et al., 2001).
La PCR fue inventada a principios de los 80s por Kary Mullis, al cual le fue otorgado el premio
Nobel en qumica en octubre de 1993 por este logro, siete aos despus de haber publicado
sus primeras ideas. La idea de Mullis fue la de desarrollar un proceso a travs del cual el ADN
se pudiera multiplicar artificialmente a travs de ciclos repetidos duplicados llevados a cabo
por una enzima llamada ADN-Polimerasa.
La ADN-Polimerasa se produce naturalmente en los organismos vivos, donde funciona para
duplicar el ADN cuando las clulas se dividen. Trabaja unindose a una sola hebra de ADN y
creando una hebra complementaria.
El proceso original de PCR actualmente ha sido mejorado mediante el uso de la ADN-
Polimerasa que procede de una bacteria termofilica que vive a temperaturas arriba de 110 C
(en aguas termales). La ADN-Polimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es
termoestable (estable en las altas temperaturas).
Actualmente la Taq polimerasa se utiliza frecuentemente en la prctica de PCR. Una
desventaja de la Taq es que incurre a veces en equivocaciones al copiar el ADN, conduciendo a
mutaciones (errores) en la secuencia del ADN (Saunders et al., 2001).
La PCR que ha sido utilizada por varios aos para la deteccin directa de muchos tipos de
agentes infecciosos en muestras clnicas, ha sido adaptada para ser usada como una
herramienta de tipificacin. La ventaja de la PCR es su habilidad para producir literalmente
millones de copias de un segmento de ADN particular con alta fidelidad en un tiempo de 3 a 4
horas (Tenover et al., 1997).
El procedimiento requiere una plantilla de ADN que puede estar presente en la muestra en
pequeas cantidades; dos primers oligonucletidos que flanquean las secuencias de la plantilla
de ADN que va a ser amplificado; y una DNA-polimerasa estable al calentamiento.
Un ensayo tpico de PCR requiere aproximadamente de 3 horas para completar 30 ciclos,
donde cada ciclo consiste de una fase de desnaturalizacin, en donde la doble hebra de ADN
es fundida en hebras nicas; una fase de alineacin, en donde los primers se unen a las
secuencias blanco en las hebras separadas; y una fase de extensin, en donde la sntesis de
ADN procede de los primers a partir de cada hebra de la plantilla de ADN, generando dos
nuevas copias de la doble hebra de la plantilla original. Despus de cada 30 ciclos , una sola
copia inicial de la plantilla de ADN tericamente puede ser amplificado a 1 billn de copias
(Tenover et al., 1997; Saunders et al., 2003).
El uso vlido de esta tcnica es crtico para mantener la calidad de muchas bases de datos de
ADN producidas. Es un hecho establecido que diversos factores pueden influenciar la validez
de los resultados obtenidos por PCR, incluyendo la presencia de componentes inhibitorios, la
calidad de la plantilla de DNA, y la carencia de optimizacin con respecto a componentes de la
reaccin y las condiciones de los ciclos termales.
Todos estos factores pueden comprometer la especificidad y sensibilidad de la reaccin,
pudiendo llevar a resultados falsos-negativos, falsos-positivos, o no reproducibles. Pero menos
conocido, sin embargo, es la variacin de los resultados en la PCR atribuidos debido al
subptimo funcionamiento de los termocicladores, siendo este el aspecto particular de la
tcnica que constituye las bases de los estudios interlaboratorios (Saunders et al., 2003).
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa con Primers Arbitrarios (AP-PCR)
Esta tcnica simple y rpida ha sido sucesivamente aplicada para la delineacin de cepas
genotpicas y anlisis de poblaciones genticas de un amplio rango de patgenos microbianos,
incluyendo bacterias, hongos y protozoarios (Struelens, 1998).
La discriminacin es buena y puede correlacionarse con otras tcnicas de genotipificacin. El
poder discriminatorio es variable de acuerdo al nmero y secuencia de los primers arbitrarios y
a las condiciones de amplificacin. Aunque requiere de varios factores tcnicos para ser
estrictamente estandarizado para una reproducibilidad ptima.
La tipificacin con esta tcnica, y con mtodos similares como el RAPD y el DAF, estn basados
en la amplificacin por PCR de baja astringencia utilizando un primer simple de secuencia
arbitraria, tpicamente de 10 pares de bases. Despus de varios ciclos adicionales, se obtiene
una cepa especfica de segmentos de ADN amplificados de varios tamaos (Struelens, 1998).
Los productos resultantes del PCR pueden representar una variedad de fragmentos de ADN de
diferentes tamaos que son visualizados a travs de electroforesis en gel de agarosa. Reportes
recientes han descrito condiciones y primers especficos para analizar aislamientos de
Staphylococcus aureus (Ternover et al., 1997).
En la actualidad es considerado el mtodo ms adecuado para una tipificacin comparativa
rpida, pero inadecuado para bibliotecas de tipificacin en programas de vigilancia
epidemiolgica.
Anlisis de la secuencia de los nucletidos
La secuenciacin de nucletidos de genes amplificados por PCR es el medio ms preciso y
sensitivo de indexar el polimorfismo del ADN localizado para la tipificacin de cepas
bacterianas. Sin embargo, el tiempo requerido y los costos del procedimiento actualmente
limitan el uso de este mtodo cuando se ha aplicado a varios tipos de virus como el de la
hepatitis y el VIH, pero tambin a bacterias como los Streptococcus pyogenes. Con el rpido
progreso de la automatizacin, es probable que en los siguientes aos la resecuenciacin con
PCR pueda ser utilizada para la tipificacin epidemiolgica de virus, bacterias y otros
patgenos (Struelens, 1998).


Hongos

Isoenzimas:
Desde mediados de la dcada del 60, los genetistas han explotado el polimorfismo observado
en la movilidad electrofortica de las enzimas solubles como marcadores genticos (33).
El descubrimiento de las isoenzimas ha favorecido la creacin de marcadores genticos ms
eficientes que los morfolgicos ya que por lo general permite distinguir genotipos
homocigticos de heterocigticos (29). Son un mtodo conveniente para la deteccin de
cambios genticos, y de hecho, se han utilizado ampliamente en la caracterizacin de la
diversidad gentica en aislamientos de Beauveria bassiana (46, 50), de Metarhizium anisopliae
(39), entre otras cepas de hongos entomopatgenos (40).
No obstante, a pesar de su carcter prctico, valor informativo, capacidad de procesar gran
nmero de muestras y bajo costo, presentan como desventajas principales el escaso
polimorfismo encontrado en algunos casos, su limitacin slo a regiones del genoma que
codifican para protenas solubles y el estar sujeta a las variaciones ontognicas (33, 34, 47).

Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP): El descubrimiento
de las endonucleasas de restriccin de bacterias, a finales de la dcada del 60, las cuales
cortaban el ADN en secuencias definidas de usualmente 4-8 pb, conlleva al desarrollo de
tcnicas para el aislamiento y manipulacin dirigida de fragmentos de ADN.
Entre los mtodos basados en la hibridizacin, el RFLP es de los primeros ampliamente
reportado, revelando la variacin en la secuencia de ADN en un diverso rango de organismos
(23).
Esta tcnica explota las variaciones en la secuencia del ADN por la creacin o abolicin de
sitios para el corte de las endonucleasas de restriccin, dadas por la adicin o delecin de
fragmentos de ADN entre estos sitios. Adems, algunas endonucleasas son incapaces de cortar
el ADN si la secuencia de
reconocimiento contiene uno o ms sitios de citosina metilada, por lo tanto, tales enzimas
pueden detectar polimorfismo si existen variaciones en los patrones de metilacin.
De esta forma, la variacin gentica en la secuencia nucleotdica del ADN de individuos
diferentes, o sea, el polimorfismo a este nivel, significa que la distribucin especfica de los
sitios de corte en los ADN respectivos es diferente tambin; por lo tanto, un sitio de restriccin
polimrfico a nivel del ADN, ser detectado como un polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restriccin a nivel fenotpico (33).
El uso de los RFLPs en el genoma nuclear o mitocondrial puede ser muy til para el aislamiento
de genes relacionados con la patogenicidad y la virulencia a travs de chromosome walking
(20, 28) y por otro lado el polimorfismo en el ADN ribosomal (ADNr) logra ser informativo
hasta el nivel de especie para muchos hongos (1, 2, 10, 12, 14, 17, 21, 32, 42, 44, 48, 58).
Algunas de las extensivas aplicaciones de esta tecnologa en los hongos entomopatgenos, son
los estudios de discriminacin de especies (8, 26), patotipos (razas) (9), grados de virulencia
(11), estudio de orgenes geogrficos
(15), de poblacin y mecanismos de recombinacin gentica (18).

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR):
Desde su primera descripcin por Saiki en 1985, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
ha tenido un efecto importante en muchos de los campos de investigacin de la Biologa (25).
Su principio es muy simple y se basa en la amplificacin in vitro del ADN, lo que trae como
resultado la replicacin exponencial de la secuencia blanco hasta en un milln de veces, aun en
presencia de gran cantidad de molculas de ADN no relacionadas, obtenindose como
producto un ADN altamente homogneo que se convierte en fuente excelente para diversas
manipulaciones moleculares. La eleccin del programa de temperatura es un importante
criterio para el control del PCR, no obstante los factores ms importantes en a repetibilidad de
los l resultados son la pureza relativa y el ajuste correcto de la concentracin de la muestra de
ADN y la concentracin de los cebadores amplificadores (32, 41).
Para profundizar sobre esta temtica podemos consultar a (Hegedus, et al.
1996) y (Fegan, et al. 1993), quienes explotan esta tcnica para lograr identificar y diferenciar
aislados de B. bassiana, as como revelar el alto grado de diversidad gentica en M. anisopliae
var. anisopliae, respectivamente.
Tecnologa MAAP ( Perfiles mltiples de amplificacin arbitraria):
A partir de la reaccin de PCR, se han realizado diferentes modificaciones a la reaccin inicial,
las cuales se agrupan bajo el nombre general de tcnicas MAAP (6, 7, 35).
Una de las caractersticas que distinguen a estas tcnicas es la longitud de los cebadores
utilizados. En el DAF (DNA Amplification Fingerprinting), lo ms usual es la utilizacin de
cebadores de 5-8 bases de longitud, mientras que en el RAPD (Random Amplified Polymorfic
DNA) se emplean oligos de 10 mer de secuencia arbitraria, y en el PCR-AP (Arbitrarily Primed-
PCR), los cebadores son de 18-24 mer, similares a los usados en la reaccin de PCR.
El numero de productos amplificados tambin vara y se obtienen perfiles ms complejos y de
mayor informacin en el DAF (6).
Otra caracterstica diferenciadora es el mtodo usado para separar los productos de la
amplificacin y la forma de deteccin. Segn la descripcin original de las diferentes tcnicas,
el DAF y el PCR-AP utilizan la electroforesis en geles de poliacrilamida como mtodo para la
separacin, mientras que el RAPD emplea geles de agarosa. La deteccin de los productos, sin
embargo se efecta a travs de autorradiografa (PCR-AP), tincin de plata (DAF) o tincin con
bromuro de etidio (RAPD). No obstante, en la actualidad hay gran profusin de tcnicas
hbridas para ambos procedimientos, en los que prima el mayor poder resolutivo de los geles
de poliacrilamida (PAGE) o la electroforesis desnaturalizante de gradientes (DGGE) y la mayor
sensibilidad y rapidez de la tincin de plata (33).
Los RAPD basados en la incorporacin de desoxinucleotidos fluorescentes proveen una
herramienta til para la identificacin de hongos entomopatgenos y esta tcnica es
especialmente aplicable para el screening de muchos aislados en el estudio de poblaciones (3,
4, 51).

Polimorfismo en longitud de los fragmentos amplificados (AFLP):
ltimamente se han desarrollado estrategias adicionales encaminadas a
incrementar el nivel de polimorfismo en el ADN. Se ha reportado por ejemplo la amplificacin
con ms de un cebador conocida como MAAP mltiple. Tambin con este objetivo, se ha
acoplado a estas tcnicas la digestin del ADN molde con endonucleasas para su posterior
amplificacin (AFLP) y desarrollada por Keygene B.V, Wageningen, The Netherlands (5, 59, 60).
El anlisis por AFLP en los hongos ha premitido discriminar variacin gentica interespecfica
as como intraespecfica de Cyphomyrmex minutus, mycorhizas y Fusarium spp. (24, 31, 43).
Esta tcnica se ha empleado tambin en el estudio de Aspergillus fumigatus y Candida spp, los
cuales son hongos de gran importancia desde el punto de vista mdico (55) y Van der Lee et al
(54) emple la tcnica para elaborar el mapa gentico del hongo patgeno a plantas
Phytophtora infestans.
El anlisis de AFLP, combina aplicabilidad universal con altos poderes de discriminacin y
reproducibilidad (19) teniendo varias aplicaciones en taxonoma, diagnsticos y epidemiologa.
Su reproducibilidad puede permitir la compilacin de una base de datos de genotipos y el
intercambio de estos entre laboratorios
(45).

Apoyndose en el empleo de las tcnicas antes mencionadas, existen una serie de mtodos
que analizan el genoma completo para lograr la identificacin de los organismos (19), o bien se
apoyan en el anlisis de genes especficos, como por ejemplo:
-ADN mitocondrial:
Este ADN es esencialmente haploide y no sufre recombinacin por lo que tiene las ventajas
propias de ser molcula multicopia y tiene un profundo impacto en la reconstruccin de
genealogas y rboles filogenticos

-Polimorfismos de nucletido simple:
Es el tipo de polimorfismo ms simple dado por el remplazamiento, prdida o adicin de un
solo nucletido. La inmensa mayora son slo biallicos y tienen un futuro impacto con
tcnicas de hibridacin en microchips.


-Anlisis de la secuencia del ADNr/ARNr 16S:
Se usa en determinar relaciones entre los taxa, tambin permite establecer relaciones
filogenticas al comparar secuencias de ADNr/ARNr 16S entre un grupo desconocido y una
cepa ya descrita.
Tener la secuencia del ADNr 16S de todas las especies vlidas de un gnero particular es
especialmente importante, ya que por comparacin entre secuencias se estudia la
heterogeneidad filigentica de un gnero.

-Anlisis de restriccin del ADN ribosomal amplificado (ARDRA):
Basado sobre la localizacin de sitios de restriccin dentro del ADNr 16S permite una
comparacin rpida de un gran numero de cepas.
El ADNr 16S amplificado por PCR es digerido con enzimas de restriccin y luego se hace una
electroforesis de los fragmentos resultantes.
La comparacin de los patrones generados permite la diferenciacin de los aislados y permite
indicar cuales tienen la secuencia ADNr 16S. Sin la construccin de una base de datos para un
amplio rango de taxa, este mtodo es de uso limitado para una identificacin rutinaria.

-Anlisis de la secuencia del ADNr/ARNr 23S:
El ADNr/ARNr 23S es dos veces mas largo que el ADNr/ARNr 16S y contiene mayor cantidad de
informacin gentica. Sin embargo, la base de datos disponible (sobre estas secuencias) es
relativamente limitada y es menos til para los propsitos de identificacin comparado con
ADNr/ARNr 16S.
En una situacin donde dos cepas tengan idntica secuencia de ADNr/ARNr 16S, la
comparacin parcial o completa con la secuencia ADNr/ARNr 23S puede ayudar a la
diferenciacin entre las cepas porque el ADNr 23S contiene mayor nmero de regiones
variables.
El primer o sonda especfica al taxn puede ser diseado sobre la base de datos de secuencias
de ADNr 16S y 23S, y estos pueden ser tiles para un screening rpido de un gran nmero de
aislados por ensayos en PCR o hibridizacin. La especificidad de un primer o sonda particular
no puede ser garantizada con absoluta confidencia debido a la posible existencia de sitios de
unin con cepas no relacionadas al organismo en estudio y para el cual el dato de la secuencia
todava no est disponible.

Microsatlites (tambin conocidos por STR): Los microsatlites son unidades de 2 a 6 pb
de longitud, muy abundantes, con cinco a cientos repeticiones por locus (gen ubicado en una
regin cromosmica) y de 104-105 loci (dos o ms genes ubicados en el mismo o en diferentes
cromosomas) por genoma. Dado su origen, intrnsecamente son muy polimrficos, distribuidos
aleatoriamente por todo el ADN, cada 30 Kb como promedio, incluido incluso en unidades de
transcripcin activas. Son extremadamente tiles para identificacin personal, gentica
poblacional, evolucin y mapeo gentico. Debido a estas caractersticas se aplica en el
establecimiento de genealogas (genticas, poblacionales) y patrones evolutivos cercanos.
Tambin en el estudio de eventos temporales pasados y presentes que afectan la
diferenciacin de poblaciones y finalmente el proceso mismo de especiacin, por lo que se
pueden hacer inferencias filogenticas y permite el estudio de la asociacin entre estructura
gentica y estructura geogrfica (Filogeografa).

Minisatlites (tambin conocidos por VNTR): En este caso el grado de repeticin es
moderado (de decenas a cientos), dispersos por todo el genoma abundando en las regiones
telomricas y estn asociados a polimorfismos del tipo RFLP. El largo de la unidad repetitiva es
de (9 a 100 pb) y fueron los primeros en explotarse en tcnicas de identificacin individual tipo
fingerprinting.

En fin, ya que el nmero de descriptores tiles en algunas especies es limitado, que adems de
ser descriptores morfolgicos son caracteres continuos, es decir la expresin de estos es
afectada por los factores ambientales, vamos a encontrar en los marcadores moleculares y/o
bioqumicos una alternativa altamente potente, ya que constituyen sin duda una importante
herramienta en los programas de mejoramiento, y de forma general en la taxonoma,
establecimiento de rboles filogenticos, en el aislamiento de genes de inters y en poder
diferenciar organismos por el grado de virulencia, patotipos, etc