Evaluacin de la produccin de 1,3-

propanodiol por cepas nativas de Clostridium

sp. mediante fermentacin a partir de glicerol
USP y glicerol industrial subproducto de la
produccin de biodisel
Diana Paola Crdenas, Carolina Pulido, scar Leonardo Aragn, Fabio Anczar
Aristizbal
1
, ulma !oco "urez
#
$ Doll$ %onto$a
#
1
Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, &ni'ersidad (acional de
Colombia, )ogot D.C, Colombia.
#
*rupo de )ioprocesos $ )ioprospeccin, +nstituto de )iotecnologa, &ni'ersidad
(acional de Colombia, A.A. 1,,-., )ogot D.C, Colombia. Fa/0 1123,13.
!ecibido para e'aluacin0 marzo 4 de #..2
Aceptado para publicacin0 5unio 13 de #..2
RESUE!
Este traba"o tuvo como propsito evaluar la produccin de 1,3 propanodiol #1,3-
P$% a partir de glicerol en trece cepas nativas de Clostridium spp, aisladas de
suelos colombianos. Se evaluaron dos medios de cultivo con glicerol USP #&1' y
&1(% con diferentes concentraciones de P'(', biotina y )stoc*+ de minerales, y
un medio con glicerol industrial proveniente de la produccin del biodisel y se
determin la productividad volumtrica de 1,3 P$ en las cepas nativas, en los
tres medios- En promedio se pudo observar .ue las cepas nativas presentaron
una productividad 1,/ veces superior cuando fueron cultivadas en el medio &1( y
un rendimiento de 1,3-P$ #0p1s% 1234 mas alto con el medio &1(- 5a cepa nativa
6(U!13' present una productividad volumtrica 784 superior a la cepa de
referencia Clostridium but$ricum $S723 en medio &1' e increment su
productividad en un 234 en un medio con glicerol industrial #&2%- 5os resultados
de este traba"o sugieren .ue el glicerol industrial sin puri9cacin podr:a ser usado
para la produccin de 1,3-P$ a nivel industrial, mediante la optimi;acin de las
condiciones de fermentacin- 5a transformacin de este residuo en un producto
rentable, podr:a dar valor agregado a la produccin de biodisel en <olombia-
Palabras clave= 1,3-P$, Clostridium, glicerol, productividad volumtrica,
biodisel-
SU'R0
E>'5U'?6!&
Clostridium

sp.
!'?6>E S?R'6!S 1,3-PR@P'!E$6@5
PR@$U<?6@! (0 AERE!?'?6@! AR@ &50<ER@5 USP '!$ R'B
&50<ER@5 AR@ (6@$6ESE5 PR@$U<?6@!
?Cis Dor* Das aimed at evaluating 1,3 Propanediol #1,3-P$% production from
glycerol in tCirteen Clostridium sp. strains isolated from <olombian soils- ?Do
culture media containing USP glycerol #&1' and &1(% and variable concentration
of P'(', biotin and mineral stoc*, and a tCird medium containing raD glycerol
from biodiesel production Dere evaluated- >olumetric productivity for 1,3-P$ Das
determined in native strains in tCree media- 6n average native strains sCoDed 1,/
greater volumetric productivity and a yield 1234 CigCer DCen groDn in &1(
medium in comparison to tCose obtained in &1' medium- !ative 6(U!13' strain
Cad 784 greater volumetric productivity #E1,3 P$F 8,8/8 mg m5
-1
C
-1
% tCan tCe
Clostridium but$ricum $S723 reference strain #E1,3 P$F 8-838 mg m5
-1
C
-1
% and
tCe same parameter Das increased by 234 in raD-glycerol medium #&2%
regarding tCat obtained in &1 medium- ?Cese results suggest tCat raD glycerol
obtained from tCe biodiesel process DitCout any puri9cation may be used for
producing 1,3-P$ at industrial level by optimising fermentation conditions-
?ransforming tCis Daste into an added-value product sCould become pro9table
tCe biodiesel production process in <olombia-
Gey Dords= 1,3-P$, Clostridium, glycerol, volumetric productivity, biodiesel-
6!?R@$U<<6H!
El 1,3 propanodiol #1,3 P$% o trimetilenglicol se emplea para producir
pol:meros tipo politrimetilentereftalatos #P??% reconocidos por sus
eIcelentes propiedades de elasticidad #3, 2J%- 5os atributos ideales del P??
se conocen desde 1KL8 pero los altos costos de produccin di9cultaron su
entrada al mercado- ' comien;os de la dcada del noventa se desarroll
una ruta biotecnolgica basada en procesos fermentativos a partir del
glicerol .ue Ci;o posible la produccin de P?? para aplicaciones de alto valor
agregado #18%- Estos procesos atra"eron la atencin de empresas como
$uPont, $oD <Cemical <ompany y ?ate 5yleMs para desarrollar 9bras con
propiedades ideales como la suavidad, adaptacin, facilidad de tincin y
resistencia, .ue Can superado fNcilmente al nylon en el desarrollo de cierres,
sellos, conectores, cubiertas de eItrusin y empa.ues tipo blister #L, 2/,
L1%- El impacto del desarrollo de aplicaciones y procesos relacionados al 1,3
P$ se reOe"a en las LKK patentes generadas entre 1KJ8 y el 288/, 71 de las
cuales se relacionan con su produccin por v:as biotecnolgicas #13%-
'dicional a su uso para el P??, el 1,3 P$ puede reempla;ar a los glicoles
tradicionales en la fabricacin de otros sistemas polimricos, me"orando la
estabilidad trmica e Cidrol:tica sin afectar otras propiedades claves- Entre
sus aplicaciones mas frecuentes estN el disePo de refrigerantes y tintas
acuosas #L1%- 5a amplia variedad de aplicaciones Ca permitido estimar .ue
para el aPo 2828 el 1,3 P$ tendrN un mercado potencial de 238-888
toneladas mtricas por aPo #13%-
El 1,3-P$ se Ca sinteti;ado tradicionalmente por v:as .u:micas tales como la
Cidrlisis de la acrole:na y la reaccin de Iido de etileno con monIido de
carbono e Cidrgeno #12%- Sin embargo, ademNs de ser altamente costosas
para la industria, estas rutas mane"an reactivos tIicos y generan
rendimientos inferiores al L34 #13, 22%- Este CecCo Ca impulsado el estudio
de la conversin de glicerol a 1,3-P$ por diferentes especies de bacterias,
entre las .ue se encuentran 6lebsiella pneumonie, Citrobacter 7reundii y
Clostridium but$ricum #9gura 1%- Para Cacer esta ruta econmicamente
competitiva se re.uiere tanto de cepas de alto rendimiento como de
sustratos econmicos, lo cual Ca motivado la bQs.ueda de nuevas cepas
capaces de emplear subproductos con alto contenido de glicerol como
fuentes de carbono para la fermentacin #12, 28, LL%-
Aigura 1- Ruta de asimilacin de glicerol en Clostridium but$ricum- 6- &licerol
desCidratasa, 66- activador de la glicerol desCidratasa, 666- 1,3-P$ desCidrogenasa,
6>- glicerol desCidrogenasa, >- diCidroIiacetona *inasa, Ad- AerredoIina-
El biodisel como fuente energtica renovable, tiene el 374 del potencial
energtico del disel #L3% y durante su proceso productivo es posible obtener
glicerol como subproducto principal en concentraciones entre 18-L84 #28%-
Esta condicin Ca posicionado la produccin de 1,3-P$ y 3-
CidroIipropionaldeCido #3-RP'% a partir de glicerol como una estrategia para
dar mayor valor agregado a los subproductos durante la produccin, y de
esta forma rentabili;ar el proceso #L2%-
En este traba"o se presentan los resultados de la evaluacin del potencial
productor de 1,3-P$ a partir de glicerol obtenido del proceso de biodisel
por cepas colombianas de Clostridium sp- caracteri;adas molecularmente
como relacionadas con Clostridium but$ricum #7, 2L, 33, L8%-
E?@$@5@&S'
<epas utili;adas= se evaluaron 13 cepas nativas= 6(U! 13', 6(U! 13', 6(U!
13E, 6(U! 13S, 6(U! 22', 6(U! /2(, 6(U! /2A, 6(U! /L', 6(U! K7(, 6(U!
127<, 6(U! 13JG, 6(U! 1L8(, 6(U! 173(, las cuales fueron aisladas por su
produccin de solventes y caracteri;adas molecularmente #31, 33%- Se
incluyeron como cepas de referencia para la produccin de 1,3-P$=
Clostridium acetobut$licum '?<< 32L, Clostridium but$ricum $S 2LJ3 y
Clostridium but$ricum $S 723 #1, 11, 1K%- ?odas las cepas fueron
cultivadas y conservadas en las condiciones descritas previamente por
ontoya y col- #31%- Se reali;aron las curvas de crecimiento por duplicado,
para cada cepa en medio R< #erc*% a 288 rpm y 3J T< por J2 Coras-
edios y condiciones de fermentacin= el medio de cultivo empleado para la
produccin de 1,3-P$ fue disePado previamente para la fermentacin
acetobut:lica #31%, pero se sustituy la fuente de carbono por glicerol USP
78g15 #medio &1% o glicerol industrial #/34 p1p% proveniente de la
produccin de biodisel #medio &2%- Se determin la edad del inculo para
obtener la mayor produccin de 1,3-P$- Se probaron tres puntos de la curva
de crecimiento en el medio R<= la fase de crecimiento acelerado #?1%, la
fase eIponencial #?2% y la fase de crecimiento desacelerado #?3%- ?odos los
eIperimentos se reali;aron en las condiciones descritas anteriormente-
5os medios &1' y &2 se prepararon empleando como fuente de carbono
glicerol USP al 784 y glicerol industrial al /34 respectivamente, con la
composicin descrita a continuacin= GR
2
P@
L
1-3 g, eItracto de levadura 3 g,
biotina 8,L mg y P'(' 8,3 mg, y L,8 m5 del )stoc*+ de minerales preparado
con la siguiente composicin por litro= Un<l
2
J8 mg, n<l
2
-LR
2
@ 188 mg,
<o<l
2
-2R
2
@ 288 mg, R
3
(@
3
/8 mg, <u<l
2
-2R
2
@ 28 mg, !i<l
2
-/R
2
@ 27 mg,
!a
2
o@
L
-2R
2
@ 37 mg, R<l 3J4 8-K m5, de acuerdo a lo descrito por (iebl y
Pfenning #K%- Para la segunda prueba, en el medio &1(, las concentraciones
de P'(' y biotina fueron de 3 mg y L mg respectivamente y L ml del
)stoc*+ de minerales preparado con la siguiente composicin por litro=
gS@
L

JR
2
@ /L8 mg, <a<l
2

2R
2
@ 338 mg, AeS@
L

JR
2
@ 273 mg, n<l
2

LR
2
@
/8 mg, <o<l
2

/R
2
@ /8 mg, !ao@
L

2R
2
@ /7 mg de acuerdo a ontoya y col
#44%- En todos los casos el pR se a"ust a J,8 con G@R 2! #3L%-
Se crecieron todas las cepas nativas y de referencia en medio &1' y &1(
para seleccionar la cepa me"or productora de 1,3-P$ y emplearla en la
degradacin del glicerol industrial en medio &2- En la ?abla 1 se presentan
las composiciones 9nales de los medios evaluados y se comparan con los
rangos y valores promedios de otros traba"os #1, K,1L, 17,1/, 2K, 31%-
?abla 1- <omparacin composicin 9nal de medios de cultivo &1' y &1(-
Elemento edio &1' edio &1( Rango
#a%
Promedio
G #g15% 8,71J 8,71J 8,823 -1,7J1 8,33L
n #g15% 1,1 I18
-L
/,J I18
-7
3,3 I18
-7
- 7,7 I18
-7
L,L I18
-7
<o #g15% 1,K I18
-L
7,L I18
-7
1,K I18
-7
- 2,L I18
-3
1,2 I18
-3
o #g15% 7,7 I18
-L
1,8 I18
-L
II
#c%
2,J I18
-7
( #g15% L,2 I18
-7
-
#b%
2,1 I18
-7
- 3,J I18
-7
7,L I18
-7
!i #g15% 2,L I18
-7
- 1,2 I18
-7
V 3,7 I18
-7
2,L I18
-7
<u #g15% 2,K I18
-7
- J,8 I18
-/
- 1,LK I18
-7
1,8 I18
-7
Un #g15% 1,3 I18
-L
- II /,J I18
-7
<a #g15% - L,1 I18
-L
2,J I18
-3
- 7,L I18
-3
L,3 I18
-3
Ae #g15% - 2,8 I18
-L
3,8 I18
-L
- 7,/ I18
-3
2,8 I18
-3
g #g15% - /,L2 I18
-7
1,K V 2,L I18
-2
8,821
(iotina 8,888L 8,88L L I 18
-L
-8,88L
P'(' 8,8883 8,883 3 I 18
-L
-8,883
EItracto de
levadura
1,3 g 1,3 g
#a% ?omado de varias referencias= #1L, <ameron et al-, 1KKL, 17, <olin et al-, 2888,
2K, alaoui et al-, 2881, 12, (ielb, 1KKK%-
#b% Elemento no adicionado al medio-
#c% Solo un autor reporta la adicin del elemento-
$eterminacin de la fuente de carbono y per9les de Ncidos y solventes= el
glicerol, los Ncidos actico y but:rico, y el 1,3-propanodiol fueron
cuanti9cados por cromatograf:a de gases #<&%- Para ello, las muestras se
9ltraron por membranas de 8,22 m y se anali;aron en un cromatgrafo
>'R6'! 3L88, empleando una columna semicapilar $(-B'W, con un
detector de ioni;acin de llama #A6$%, con 1,2-propanodiol como estNndar
interno #788 ppm%- Se tomaron 8,2 5 de la me;cla y se inyectaron a una
temperatura de 218 X< y en la columna se utili; una rampa de temperatura
de 78 X< a 118 X< a 13,7 X<1min y de 118 X< a 217 X< a 38 X<1min- Se
emple el programa >'R6'! S?'R L-7 para el procesamiento de los datos-
5a biomasa fue determinada por el mtodo de peso seco con una muestra
de 1 m5, la cual se centrifug a 12-888 rpm por 17 min, se elimin el
sobrenadante y se sec a 7K X< Casta obtener peso constante- 5a densidad
ptica se determin a una longitud de onda de /38 nm en un
espectrofotmetro >'R6'! $S188-
RESU5?'$@S 0 $6S<US6H!
<ondiciones del inculo= Se consider conveniente establecer la me"or edad
para la preparacin del inculo por.ue se Ca demostrado en diferentes
especies .ue la edad del inculo inOuye signi9cativamente en el
crecimiento, la productividad y la reproducibilidad de la fermentacin,
debido a .ue los microorganismos asumen de manera Ceterognea las
Ouctuaciones de pR y las condiciones de estrs .ue representa el cambio de
medio dependiendo de sus estados 9siolgicos asociados a su crecimiento
#23, 27%- 'dicionalmente, es conocido .ue en Clostridium la solventognesis
se dispara diferente dependiendo de la edad del inculo- 5as cepas nativas
6(U! 22', 6(U! /L', 6(U! 127< y la cepa patrn Clostridium but$ricum $S
723 fueron seleccionadas para determinar la edad del inculo- En este
traba"o, los resultados mostraron .ue la me"or fase para inocular es la fase
eIponencial #?2%, puesto .ue en todas las cepas present la mayor tasa de
crecimiento y una mayor produccin de 1,3-propanodiol en el medio &1'- En
la 9gura 2, se observa este comportamiento para la cepa nativa 6(U! 22 ',
inoculada en las tres diferentes fases del crecimiento- Estos resultados
concuerdan con lo enunciado por 'bbad-'ndaloussi y col-, y Saint 'mans et
al- #3, 3K%, .uienes sugirieron .ue el 1,3-P$ puede considerarse un
metabolito primario al estar asociado al crecimiento-
Aigura 2- <recimiento #arriba% y produccin de 1,3-propanodiol #aba"o% para la cepa
nativa 6(U! 22'% en medio &1' con inoculo en fase de crecimiento acelerado ?1 #%,
eIponencial ?2 #% y desacelerado ?3 #% -
Produccin 1,3-P$ en medio de cultivo &1' #glicerol USP%= en la tabla 2 se
presentan los rendimientos de sustrato en producto #0
P1S
% y la productividad
volumtrica #E
$
% de cada una de las cepas nativas y en cada uno de los
diferentes medios- ?anto en el medio &1' como en el medio &1( las cepas
nativas 6(U! 13E, 6(U! /2( e 6(U! /2A presentaron un crecimiento muy
limitado utili;ando glicerol USP como fuente de carbono y energ:a- 5as
restantes 18 cepas #6(U! 13', 6(U! 13', 6(U! 13S, 6(U! 22', 6(U! /L',
6(U! K7(, 6(U! 127<, 6(U! 13JG, 6(U! 1L8(, 6(U!173(% crecieron en
ambos medios- En el primero, los valores de productividad de / de ellas
fueron del mismo orden o superiores a la me"or cepa patrn Clostridium
but$ricum $S723 #E
1,3-P$
F 8,838 g 5
-1
C
-1
%, con los valores mNs altos en las
cepas 6(U! 22' e 6(U! 13'- En el medio de cultivo &1( nueve de las 18
cepas nativas presentaron mayor productividad .ue la me"or cepa patrn,
siendo las tres me"ores 6(U! 13J G, 6(U! 13' e 6(U! 173 (- En promedio se
pudo observar .ue las die; cepas nativas presentaron una productividad 1,/
veces superior cuando fueron cultivadas en el medio &1(- Respecto al
rendimiento del 1,3-P$ #0p1s%, el promedio de las 18 cepas nativas pas de
8,22K a 8,712 mol1mol con el medio &1(- 5os anteriores resultados
demuestran .ue las condiciones ofrecidas por el medio &1( son mNs
favorables para .ue las cepas nativas asimilen el glicerol y produ;can 1,3-
propanodiol-
?abla 2- Rendimiento de producto en sustrato #0
P1S
% y Productividades volumtricas
#E
$
% de 1,3-P$ en medio &1- ?iempo de incubacin J2 C, temperatura 3J X<,
agitacin 288 rpm-
EIperimento 1 V medio &1' EIperimento 2 V medio &1(
<epa 0
p1s
#mol-mol
-1
% E #g-5
-1
-C
-1
% 0
p1s
#mol-mol
-1
% E #g-5
-1
-C
-1
%
6(U! 13 ' 8,232 8,8/8 8,K71 8,8/K
6(U! 13 ' 8,23K 8,8L3 8,L/2 8,877
6(U! 127 < 8,2/8 8,833 8,7K3 8,8L8
6(U! K7 ( 8,233 8,83/ 8,3J8 8,8L1
6(U! 13 S 8,217 8,831 8,//8 8,87L
6(U! 13J G 8,122 8,82K 8,/2J 8,838
6(U! 173 ( 8,337 8,82/ 8,33L 8,8J3
6(U! /L ' 8,1K8 8,827 8,/8J 8,8J8
6(U! 1L8 ( 8,177 8,823 8,37J 8,8L/
6(U! 22 ' 8,283 8,8L/ 8,183 8,82K
6(U! 13E 8 8 8,823 8,882
6(U! /2( 8 8 8,821 8,881
6(U! /2A 8 8 8,812 8,882
$S 723 8,277 8,838 8,183 8,881
$S 2LJ3 8,831 8,817 8,338 8,83L
'?<< 32L 8,82J 8,883 - -
Se evaluaron dos niveles de concentracin de P'(' de 8,3 a 3 mg15 y de
biotina de 8,L a Lmg15 y el cambio en el )stoc*+ de minerales en los medios
&1' y &1( respectivamente #?abla 1%, por.ue se consider .ue estas
modi9caciones podr:an contribuir favorablemente en la produccin de 1,3
P$ de acuerdo a lo establecido por otros autores #28, 3J, 33, 3/%- Se Ca
estudiado la actividad de algunas de las en;imas involucradas en la ruta
metablica de asimilacin del glicerol y se Ca demostrado .ue la
concentracin de iones metNlicos dentro de la clula, inOuye en la actividad
Cidrogenasa y 1,3-propanodiol desCidrogenasa #2, 3J, 37%- Este CecCo
motiv la variacin de la composicin de minerales en el medio &1( con
respecto al medio &1'- El medio &1( de mayor produccin de 1,3 P$ fue
preparado con concentraciones mNs ba"as de manganeso, cobalto y
molibdeno, y se eIcluyeron boro, n:.uel, cobre y ;inc con respecto a la
composicin del medio &1', pero se adicion calcio, Cierro y magnesio- 5os
resultados revelaron .ue la composicin del medio &1( puede estar
relacionada con un incremento del 12L4 en la produccin de 1,3 P$ en las
die; cepas productoras con respecto al valor inicial obtenido en los ensayos
preliminares con medio &1' #tabla 2%- Reimman y col- #33% mostraron
resultados similares al determinar .ue la relacin R
2
1<@
2
estaba asociada a
la composicin de Cierro para aumentar la produccin de 1,3-propanodiol, y
propusieron un valor ptimo en el medio de cultivo de 7 mg15 de Ae<l
3
,
aproIimadamente 1,J mg15 de Ae, punto en el cual no se presenta limitacin
de este elemento para la formacin de biomasa #3J%-
<inticas de crecimiento en los medios de cultivo &1' y &1( #glicerol USP%=
se escogi la cepa nativa 6(U! 13' como representativa del
comportamiento en cada medio debido a .ue present los mayores valores
de rendimiento molar y la productividad volumtrica en medio &1'- 5a tabla
3 presenta una comparacin de las cinticas de crecimiento de esta cepa en
medio &1' y &1( respectivamente con la cepa Clostridium but$ricum (7K3
estudiada por Aorsberg en condiciones seme"antes a las de este traba"o
#1K%, en cuanto a sus parNmetros cinticos calculados entre la fase de
crecimiento acelerado, eIponencial y desacelerado inicial y tard:a de cada
cepa-
El medio &1' fue disePado con base en un medio generado para la
fermentacin acetobut:lica, ruta .ue compite naturalmente con la
produccin de 1,3-P$ #31%, mientras .ue en el medio &1( Qnicamente se
tomaron en consideracin los elementos .ue pudieran afectar la ruta de
asimilacin del glicerol- Para el caso de la cepa 6(U!13' se observ un
incremento del J/4 en la velocidad de crecimiento y un aumento del 174
en la productividad volumtrica del 1,3-P$ .ue revelan .ue ba"o esta
condicin no se presenta la inCibicin por sustrato .ue suele ser uno de los
principales factores .ue limitan la productividad del 1,3-P$, segQn lo
reportado por <olin y col- #17% #tabla 3%-
?abla 3- <omparacin de los parNmetros cinticos de la fermentacin en glicerol
para la cepa 6(U! 13' en los medios &1' y &1( y C. but$ricum (723 reportada por
Aorsberg y col- #1K% sin control de pR con glicerol como fuente de carbono y energ:a-
5os parNmetros se calcularon entre la fase de crecimiento acelerado y de
crecimiento desacelerado- Para la cepa 6(U! 13' la fase eIponencial estN
comprendida entre las 3 y L3 C de crecimiento y para la cepa (7K3 de las 2 a las 18
C, calculados en una fermentacin de J2 Coras-
<epa
6(U! 13'
#&1'%
6(U! 13'
#&1(%
(7K3
Aactores
?asa de crecimiento #C
-1
% 8,87J 8,188 8,3K8
0
1,3-propanodiol 1 glicerol
#mol-mol
-1
% 8,32K 8,JL/ 8,772
0
biomasa 1 glicerol
#mol-mol
-1
% 8,1KJ 8,2/K-
#a%
0
but:rico 1 glicerol
#mol-mol
-1
% 8,13K 8,1K3 8,387
0
actico 1 glicerol
#mol-mol
-1
% 8,883 8,813 8,177
E
1,3-propanodiol
#g pdo -5
-1
-C
-1
% 8,13L 8,1J/ 8,78K
E
glicerol
#g glicerol -5
-1
-C
-1
% 8,LKL 8,23/ 1,113
E
but:rico
#g but:rico -5
-1
-C
-1
% 8,8// 8,87L 8,32/
E
actico
#g actico -5
-1
-C
-1
% 8,883 8,818 8,113
E
1,3-propanodiol
#g pdo1#g glicerol
- C%%
8,88K 8,83L 8,8L/
#a% !o aplicable
5a formacin de acetato y butirato estNn involucrados con la produccin de
'?P y con la liberacin de e.uivalentes reductores !'$R
2
.ue son
regenerados a travs de la ruta del 1,3 P$ tipo a !'$ #9gura 1%#L7%- Por ello,
la relacin butirato1acetato es uno de los parNmetros metablicos de mayor
incidencia en la fermentacin de glicerol a 1,3-propanodiol- 'lgunos autores
sugieren .ue un incremento en la formacin de acetato conlleva a un
aumento en el rendimiento molar de 1,3-P$, mientras .ue un aumento en la
formacin de butirato produce un incremento en la produccin de '?P y
biomasa #K, 17, 22%- En este traba"o se obtuvo un incremento en la
concentracin de acetato y una reduccin en /74 en la relacin
butirato1acetato con el cambio de medio &1' a &1( para la cepa 6(U!13',
lo cual pudo Caber favorecido la produccin de 1,3 P$-
En la 9gura 3 se presentan los per9les de produccin de Ncido actico de la
cepa 6(U!13' en los dos medios evaluados &1' y &1(- 6nicialmente
present un aumento de la concentracin con un valor mNIimo a las L Coras
de fermentacin y posteriormente una disminucin acelerada- En las Coras
siguientes la concentracin se mantuvo por deba"o del nivel de deteccin
del mtodo anal:tico- 'l cambiar a medio &1( el per9l de formacin de
acetato fue variable y dependiendo el tiempo de fermentacin fue producido
o consumido, aun.ue mantuvo una tendencia creciente de la concentracin
neta- Este comportamiento puede estar asociado con la actividad de
en;imas involucradas en la s:ntesis del Ncido actico, la cual puede ser
reversible, abriendo la posibilidad de .ue sea reasimilado dependiendo de
las relaciones de acetil-<o'1<o' y '?P1'$P #3K, L7% #9gura 3%- Este
metabolismo adaptativo es una oportunidad para la aplicacin de ingenier:a
metablica en estas cepas, puesto .ue se Ca establecido .ue el mayor
rendimiento de 1,3-propanodiol se presenta slo cuando eIiste produccin
de Ncido actico acompaPada de la generacin de R
2
y <@
2
#1K%, de forma
.ue las dos molculas de !'$R
2
.ue son invertidas en la formacin de
butirato #3L% sean redirigidas Cacia la produccin del diol de inters-
#% (iomasa, #% 1,3-propanodiol, #% acetato, #% (utirato, #% &licerol residual, #%
pR-
Aigura 3- Per9les de fermentacin para la cepa 13' en el medio &1' #derecCa% y
&1( #i;.uierda% en glicerol-
Aermentacin en el medio de cultivo &2 #glicerol industrial%= la cepa 13' fue
cultivada ba"o las mismas condiciones del medio &1', pero la fuente de
carbono fue glicerol industrial proveniente de la produccin de biodisel a
partir de aceite de palma, sin ningQn tratamiento de puri9cacin (13)- 5os
resultados obtenidos muestran una reduccin del 124 en el rendimiento
molar de 1,3-propanodiol, aun.ue la productividad obtenida con la misma
cepa se increment en 23,34 con respecto al medio &1' #tabla L%- ?ambin
present mayor generacin de Ncido actico y la concentracin de Ncido
but:rico se mantuvo constante- Este resultado concuerda con lo reportado
por diferentes autores .uienes a9rman .ue el glicerol crudo es un sustrato
conveniente para la produccin biotecnolgica de 1,3-P$- <abe resaltar .ue
no se observ una disminucin en la e9ciencia de fermentacin a pesar de
utili;ar un producto industrial con gran cantidad de impure;as dentro de las
.ue se encuentran inCibidores del crecimiento como metanol o etanol,
metales pesados y sales de sodio, por tanto estas cepas nativas son una
alternativa para la bioconversin del residuo en 1,3 P$ #1/, 28, 21%-
?abla L- Resultados fermentacin por J2 Coras de la cepa 13 ' en medio &2-
<ompone
nte
&licerol industrial &licerol USP
<oncentra
cin
#mmol15%
Rendimient
o molar
0p1s
#mol-mol
-1
glicerol
consumido
%
Productivid
ad
>olumtric
a
Ep #g -5
-
1
-C
-1
%
<oncentrac
in
#mmol15%
Rendimien
to molar
0p1s
#mol-mol
-1
glicerol
consumido
%
Productivid
ad
>olumtric
a
Ep #g -5
-1
-C
-
1
%
&licerol
inicial
3/K,28L 7L2,K78
&licerol
9nal
12,338 2K7,LL8
1,3-
propanod
iol
J2,3L8 8,28L 8,8JJ 7J,388 8,232 8,8/8
Ycido
but:rico
1J,L/8 8,8LK 8,821 1/,3L8 8,8// 8,828
Ycido
actico
3,778 8,818 8,883 8,888 8,888 8,888
'un.ue los resultados de este traba"o son prometedores, se re.uieren
estudios posteriores con control de condiciones de fermentacin y pR, .ue
permitan incrementar rendimientos para establecer la rentabilidad del
proceso en trminos de negocio y con ello estimar si es posible Cacer viable
la produccin de biodisel dando valor agregado a uno de sus subproductos-
$e esta forma serN posible Cacer .ue los rendimientos de la fermentacin
sean comparables con los presentados por cepas utili;adas actualmente a
nivel industrial- 'dicionalmente, se re.uiere un mayor conocimiento de la
estructura gentica .ue regula la asimilacin de glicerol para considerar la
posibilidad de Cacer cambios genticos .ue favore;can la produccin de 1,3
P$ y disminuyan otros subproductos como el Ncido but:rico y el etanol, lo
cual podr:a rentabili;ar mNs el proceso-
<@!<5US6@!ES
En este traba"o se demostr .ue las cepas nativas 6(U! 13', 6(U! 13',
6(U! 13S, 6(U! 22', 6(U! /L', 6(U! K7(, 6(U! 127<, 6(U! 13JG, 6(U!
1L8(, 6(U!173(, Clostridium acetobut$licum '?<< 32L, Clostridium
but$ricum $S 2LJ3 y Clostridium but$ricum $S 723, tienen la capacidad
de crecer en un medio .ue contiene glicerol como Qnica fuente de carbono y
producir 1,3-propanodiol- $e estas, la cepa 6(U! 13' es capa; de emplear el
glicerol industrial proveniente de la produccin de biodisel sin puri9cacin
como Qnica fuente de carbono para produccin de 1,3-P$- Por otra parte se
determin .ue los componentes del medio &1( aumentan la produccin de
1,3-propanodiol de las cepas nativas con respecto a los del medio &1'-
Ainalmente se con9rmo .ue el inculo en medio R<, debe prepararse en la
fase eIponencial de crecimiento-
'&R'$E<66E!?@S
Este traba"o fue desarrollado dentro del marco del proyecto )Produccin de
1,3-propanodiol a partir de glicerol generado del proceso productivo de
biodisel, empleando cepas nativas de Clostridium sp= estudio del opern
condiciones de produccin por fermentacin y su viabilidad econmica+,
cdigo 1181-12-1J3L3 9nanciado por el 6nstituto <olombiano Arancisco Zos
de <aldas, <olciencias, y la Universidad !acional de <olombia- 5os autores
agradecen a la empresa S6KK, (ogotN-<olombia por el suministro de glicerol
industrial para el desarrollo de este proyecto-
(6(56@&R'AS'
1- S- 'bbad-'ndaloussi, <- $[rre, Z- 'mine, E- Petitdemange, R-
Petitdemange, 6solation and cCaracteri;ation of Clostridium but$ricum
$S 7L31 mutants DitC increased resistance to 1,3-propanediol and
altered production of acids, Applied and 8n'ironmental %icrobiolog$,
/1, LL13#1KK7%
2- S- 'bbad-'ndaloussi, E- &uedon, E- Spiesser, R- Petitdemange, &lycerol
deCydratase activity= ?Ce limiting step for 1,3-propanediol production
by Clostridium but$ricum $S 7L31, Letters in Applied %icrobiolog$,
22, 311#1KK/%-
3- S- 'bbad-'ndaloussi, <, $[rre, &- Raval, R- Petitdemange, <arbon and
electron OoD in Clostridium but$ricum groDn in cCemostat culture on
glycerol and on glucose, 9ournal o7 %icrobiolog$, 1L2, 11LK #1KK/%-
L- ?- 'mes, <-R- (aboDic;, $evelopment of a Aermentation-(ased Process
for 1,3-Propanediol=RigCligCts of a Successful PatC from <orn to ?eItile
Aiber, En )Proceedings of tCe ?Denty-AiftC Symposium on (iotecCnology
for Auels and <Cemicals+, por - Ain*elstein y (-R- $avison, Rumana
Press Editors, pp- 3J/, #288L%-
7- <- 'rvalo, )<ontribucin a la caracteri;acin molecular de cepas
nativas de Clostridium spp- con potencial biotecnolgico+, ?esis de
grado para optar al t:tulo de ag:ster Scientiae en icrobiolog:a-
Universidad !acional de <olombia, 2881, pp 1-188-
/- A- (arbirato, <- <amarasa-<alaret, (- &rivet, '- (ories, ', &lycerol
fermentation by a neD 1,3-propanediol-producing microorganism=
8nterobacter agglomerans, Applied %icrobiolog$ and )iotec:nolog$,
L3,J3/ #1KK7%-
J- A- (arbirato, P- Soucaille, '- (ories, PCysiologic mecCanisms involved in
accumulation of 3-CydroIypropionaldeCyde during fermentation of
glycerol by 8nterobacter agglomerans, Applied 8n'ironmental
%icrobiolog$, /2,LL87 #1KK/%-
3- A- (arbirato, E-R- Rassan,?- <onte, '- (ories, 1,3-Propanediol production
by fermentation= 'n interesting Day to valori;e glycerin from tCe ester
and etCanol industries, +ndustrial Crops and Products, J ,231, #1KK3%-
K- R- (iebl, !- Pfenning, En )?Ce Procaryotes= ' Candboo* on Cabitats,
isolation and identi9cation of (acteria+, Ed- por -P- Starr et al.,
Springer->erlag, (erlin, 1K31, >ol-1, pp- 2/J-2J3-
18- R- (iebl, &lycerol fermentation to 1,3-propanediol by Clostridium
but$ricum- easurement of product inCibition by use of a pR-auIostat,
Applied %icrobiolog$ and )iotec:nolog$, 37, J81 #1KK1%-
11- R-(iebl, S- arten, R- Rippe, B-$- $ec*Der,- &lycerol conversion to 1,3-
propanediol by neDly isolated clostridia, Applied %icrobiolog$ and
)iotec:nolog$, 3/, 7K #1KK2%
12- R- (iebl, G- en;el, '-P- Ueng, B-$- $ec*Der, icrobial production of
1,3-propanediol, Applied %icrobiolog$ and )iotec:nolog$, 72, 23K
#1KKK%-
13- $- <Nrdenas y <- Pulido, )Evaluacin del potencial de las cepas nativas
de Clostridium spp- para producir 1,3-Propanodiol por medio de la
fermentacin de glicerol+, ?esis de &rado, Universidad !acional de
<olombia- (ogotN $-<-, <olombia- 288L-128p-
1L- $- <ameron, Z- Gouts*y, <onversion of glycerol from soy diesel
production to 1,3-propanediol- Ainal report, !ational (iodiesel
$evelopment (oard- UB V adison, adison, 1KKL-UR5=
Cttp=11www.biodiesel.org/resources/reporsd!!b!se/ repors/ge#/1$$41%%1&ge#'243.pd(,
noviembre , #2887%-
17- ?-<olin, '- (ories, &- oulin, 6nCibition of Clostridium but$ricum by 1,3-
propanediol and diol during glycerol fermentation, Applied %icrobiolog$
and )iotec:nolog$, 7L, 281 #2888%-
1/- (-$abroc*, R- (aCl, &- &ottscCal*,- Parameters a\ecting solvent
production by Clostridium pasterianum, Applied 8n'ironmental
%icrobiolog$, 73, 1233 #1KK2%-
1J- B-$- $ec*Der, icrobial conversion of glycerol to 1,3 Propanediol, F8%"
%icrobiolog$ !e'ie;s, 1/,1L3#1KK7%-
13- - Ain*elstein, (-R- $avison, )Twenty-Fifth Symposium on
Biotechnology for Fuels and Chemicals, Rumana Press Eds-, !eD
Zersey, 288L, pp 1223-
1K- <- Aorsberg, Production of 1,3-propanediol from &lycerol by Clostridium
acetobut$licum and otCer Clostridium species, Applied 8n'ironmental
%icrobiolog$,73, /3K #1K3J%-
28- - &on;Nle;VPa"uelo, Z-<- 'ndrade, Z-Z- >asconcelos, Production of 1,3-
propanediol by Clostridium but$ricum >P6 32// using a syntCetic
medium and raD glycerol- 9ournal o7 +ndustrial %icrobiolog$ and
)iotec:nolog$, 31, LL2 #288L%-
21- - &on;Nle;-Pa"uelo, Z-<- 'ndrade,6- >asconcelos, Production of 1-3
Propanediol by Clostridium but$ricum >P6 32// in continuos cultures
DitC CigC yield and productivity, 9ournal o7 +ndustrial %icrobiolog$ and
)iotec:nolog$,32,1 #2887%-
22- E-R- Rimmi, '- (ories, A- (arbirato, !utrient re.uirements for glycerol
conversion to 1, 3 Propanediol by Clostridium but$ricum, )ioresource
<ec:nolog$, /J,123-123- #1KKK%-
23- ?- Rornb]*, '-G- !ielsen, Z- $ynesen, - Za*obsen- ?Ce e\ect of
inoculum age and solid versus li.uid propagation on inoculum .uality of
an industrial )acillus lic:eni7ormis strain,
F8%" %icrobiolog$ Letters, 23/ , 1L7-171- #288L%-
2L- <-P- Zaimes, A-'- 'risti;abal, - (ernal, U-R- SuNre;, $- ontoya, 'A5P
9ngerprinting of <olombian Clostridium spp strains, multivariate data
analysis and its taIonomical implications, 9ournal o7 %icrobiological
%et:ods, /J,/L-/K #288/%-
27- E-R- GasC*et, U-0- <ao- 6solation of a $egeneration-Resistant utant of
Clostridium acetobutylicum !<6( 3872- Applied 8n'ironmental
%icrobiolog$, 7K #12%=L1K3VL282 #1KK3%-
2/- Z->- Gurian, ' neD polymer platform fro tCe future- Sorona^ from corn
derived 1,3-Propanediol, 9ournal o7 Pol$mers and t:e
8n'ironment,13,17K-1/J #2887%-
2J- 0- 5iu, )!eD biodegradable Polymers from reneDable resources+,
$epartment of polymer ?ecCnology, Royal 6nstitute of ?ecCnology #G?R%,
SDeeden, 3 #2888%-
23- A- 5uers, - Seyfried, R- $aniel, &- &ottscCal* &, &lycerol conversion to
1,3-propanediol by Clostridium pasteurianum= cloning and eIpression of
tCe gene encoding 1,3-propanediol deCydrogenase, F8%" %icrobiolog$
Letters, 17L, 33J #1KKJ%-
2K- R- alaoui, R- arc;a*, 6nOuence of glucose on glycerol metabolism by
Dild-type and mutant strains of Clostridium but$ricum E7 groDn in
cCemostat culture, Applied %icrobiolog$ and )iotec:nolog$, 77, 22/
#2881%-
38- G- en;el, '-P- Ueng, B-$- $ec*Der, RigC concentration and
productivity of 1,3-propanodiol from continuous fermentation of glycerol
by 6lebsiella pneumoniae, 8nz$me %icrobial <ec:nolog$, 28, 32 #1KKJ%-
31- $- ontoya, Z- Sierra, E- Silva, &- (uitrago, Z- Ramos, @ptimi;acion de un
medio de cultivo industrial para la fermentacin acetobut:lica, !e'ista
Colombiana de )iotecnologa,2, 3J#1KKK%-
32- $- ontoya, S- Espitia, E- Silva, B- ScCDar;, 6solation of mesopCilic
Solvent producing <lostridia from <olombian sources= PCysiological
cCaracteri;ation, solvent producing and polysaccCaride Cydrolysis,
9ournal o7 )iotec:nolog$, JK, 11J#2888%-
33- $- ontoya, <- 'rvalo, S- &on;Nles, A-'- 'risti;Nbal, B-R- ScCDar;, !eD
solvent-producing Clostridium sp- Strains, Cydroly;ing a Dide range of
polysaccCarides, are closely related to Clostridium but$ricum, 9ournal o7
+ndustrial %icrobiolog$ and )iotec:nolog$, 2J, 32K #2881%-
3L- S- Papani*olaou, P- Rui;, (- Pariset, A- (lancCard, - Aic*, RigC
production of 1,3-propanediol from industrial glycerol by a neDly
isolated Clostridium but$ricum strain, 9ournal o7 )iotec:nolog$, JJ, 1K1
#2888%-
37- S- Peguin, P- Soucaille, odulation of carbon and electron OoD in
Clostridium acetobut$licum by 6ron limitation and etCyl viologen
addition, Applied and 8n'ironmental %icrobiolog$, /1, L83 #1KK7%-
3/- <- Raynaud, P- Sar_abal, 6- eynial-Salles, <- <rouI, P- Soucaille,
olecular cCaracteri;ation of tCe 1,3-propanediol #1,3-P$% operon of
Clostridium but$ricum , Proceedures o7 t:e (ational Academ$ o7
"ciences &"A, 188, 7818 #2883%-
3J- '- Reimann, R- (iebl, B-$ $ec*Der, 6nOuence of iron, PCospCate and
metCyl viologen on glycerol fermentation of Clostridium but$ricum,
Applied %icrobiolog$ and )iotec:nolog$, L7, LJ#1KK/%-
33- '- Reimann, S- 'bbad-'ndaloussi, R- (iebl, R- Petitdemange, 1,3-
propanediol formation DitC product-tolerance mutants of Clostridium
but$ricum $S 7L31 in continuous culture= productivity, carbon and
electron OoD, 9ournal o7 Applied %icrobiolog$, 3L, 1127 #1KK3%-
3K- S- Saint-'mans, l- &irbal, Z- 'ndrade, G- 'Crens, P- Soucaille, Regulation
of carbon and electron OoD in Clostridium but$ricum >P6 32// groDn on
glucose-glycerol miItures, 9ournal o7 )acteriolog$, JJ, 1K1#2881%-
L8- U- SuNre;, (- <CNves, A-'- 'risti;Nbal, $- ontoya, )PolypCasic approacC
to tCe taIonomy of tCirteen Clostridium spp- strains by means of
multivariate data analysis= Strategy for describing a neD species+-
Proceedings of tCe 173
tC
S& eeting - BarDic* University- England-
#288/%-
L1- U-S;eD;y*, ?- &riebe, S-Stra*er, PolyuretCanes EIpo 1KKK= <onference
Proceedings, <R< Press, @rlando, 1KKK, pp- 1-/23-
L2- S- >ollenDeider, <-5acroiI,3-RydroIypropionaldeCyde='pplications and
perspectives of biotecCnological production, Applied %icrobiolog$ and
)iotec:nolog$, /L,1/ #288L%-
L3- - Uappi, R- RernNnde;, $- Spar*;, Z- Rorne, - (rougC, S- 'rora, $-
ontsenbac*er, ' revieD of tCe engineering aspects of tCe biodiesel
industry, UR5= Cttp=11DDD-mississippi-org1programs1energy1(iodiesel
428Study1Eng`'spects<C1-pdf, noviembre 2887-
LL- '-P- Ueng, R- (iebl, (ul* <Cemicals from (iotecCnology= ?Ce <ase of 1,3
propanediol production and tCe !eD ?rends, Ad'ances in )ioc:emical
8ngineering, JL, 2L8 #2882%-
4). *.+. ,e#g- +!.w!/ !#d 0i#eic !#!l/sis o( 1-3'+rop!#ediol producio# (ro1
gl/cerol (er1e#!io# b/ Clostridium butyricum- Bioprocess Engineering,14-12$
(1$$2).