1

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO ACADMICO
DE
CIENCIAS BSICAS



ASIGNATURA: BIOQUMICA


GUA DE PRCTICA



SEGUNDO AO

II Semestre


Lima - Per

2014




2
PRACTICAS DE LABORATORIO N1:
INSTRUMENTACIN, CENTRIFUGACION Y
ESPECTROFOTOMETRIA


1.- CENTRIFUGACIN

rocedimiento por el cual se aplica la FUERZA CENTRFUGA para
separar partculas que se encuentran en suspensin en un
medio lquido. El incremento de la fuerza centrifuga
condicionar que las partculas migren alejndose del eje de
rotacin de la centrifuga. El proceso migratorio de las partculas se
denomina sedimentacin y la velocidad con que sedimentan es
proporcional a la fuerza centrifuga expresada como incrementos de
la gravedad (G).

La constante gravitatoria es proporcional a la velocidad de giro del
rotor soporte del medio que se centrifuga y del radio del mismo.
El radio del rotor de la centrifuga depende si sta es del tipo ngulo
fijo o flotante. En el primer caso es un promedio entre el radio
mnimo y el mximo, y en el segundo es la distancia entre fondo del
tubo y el eje.











La velocidad de la sedimentacin se altera por la fuerza centrfuga,
pero adems por la forma de las partculas, y por la viscosidad del
medio lquido que las suspende. Tambin depende de la
temperatura en cuanto sta altere la viscosidad del medio o de las
cargas elctricas de las partculas.


Los equipos que permiten la centrifugacin se llaman centrfugas y
constan de un motor con controles, que mueven un rotor que
P
3
sostiene los tubos de centrifugacin. Los rotores son de dos clases,
de ngulo fijo y flotante, tal como se ve ms arriba.

La mayora de la centrfugas de laboratorio alcanzan las 5000 rpm,
aunque algunas alcanzan los 16 000 rpm. Algunas centrfugas
tienen refrigeracin lo que permite separar partculas
biolgicamente activas tales como factores de coagulacin,
enzimas, etc.

Las ultracentrfugas son centrfugas con vaco, refrigeracin y
velocidades de ms de 500 000 x g. Permiten la separacin de los
componentes tisulares, tal como se aprecia en el cuadro adjunto y
poder estudiar cada uno de ellos a partir del homogenizado de un
tejido cualquiera.

Para evaluar con certeza la capacidad de una centrfuga para
separar los componentes celulares debemos manejar gravedades
en lugar de revoluciones por minuto, por lo que frecuentemente
usamos el nomograma de Dole y Cotziar que presentamos a
continuacin.























Suspender el tejido al 10%
Homogenizar en Potter E.
Centrifugar a 600g x 10
Sedimento: ncleos, restos
celulares
Centrifugar el sobrenadante
a 4000g x 15
Sedimento:
mitocondrias
Centrifugar el sobrenadante
a 16 500g x 15
Sedimento:
lisosomas
Centrifugar el sobrenadante
a 100 000g x 40
Sedimento:
microsomas
Sobrenadante: citosol

4



TIPOS DE CENTRIFUGACIN

1. Diferencial: separa de acuerdo a las diferentes velocidades
de sedimentacin de distintas partculas. La usamos en la
clnica para separar sedimentos de orina, o componentes del
plasma.
2. Zonal: usando una gradiente de densidad lograda con un
soluto denso, la ms usada la sacarosa, las molculas
sedimentan de acuerdo a su coeficiente de sedimentacin. La
sacarosa densa evita que las bandas se mezclen.

La gradientes pueden ser discontinuas preparadas mediante la
colocacin de soluciones de diversa densidad una sobre otra- y
continuas preparada mediante un equipo de mezcla de
soluciones, que va incrementando la densidad progresivamente.

























5



TUBOS DE CENTRIFUGACIN:

Existen tubos de centrfuga de diversa composicin:
1. Policarbonato: vidrio transparente, autoclavable y resistente
a los cidos y bases de baja dilucin.
2. Borosilicato: vidrio muy resistente a qumicos de alta
concentracin .
3. Polietileno: plstico muy resistente a los qumicos, pero
sensible a la temperatura.
4. Propileno: plstico bastante resistente a la temperatura
autoclavable- y resistente a casi todos los qumicos.

PORTATUBOS
Son de plstico o de metal y poco resistente a cidos y bases
fuertes. Deben ser conservados muy limpios.

2.- COLORIMETRA
Es el anlisis de la concentracin de una muestra por el color que
presenta. Todos hemos tenido la experiencia de valorar la
concentracin de sustancias coloreadas en solucin, por
observacin directa, una taza de caf o t, un vaso de refresco, son
apreciados de esa manera. El examen se funda en la mayor o
menor absorcin de luz de acuerdo al mayor nmero de molculas
y tonalidad depender de la capacidad de absorber una u otra
longitud de onda de luz, especficamente. La fotocolorimetra
manipula las variables de este fenmeno controlando la luz
incidente proveniente de un foco luminoso y su pureza, de modo tal
que slo incida aquella luz que es especficamente absorbida por la
partcula que medimos.











NOMOGRAMA DE CALCULO VELOCIDAD Y RADIO DE CABEZAL DE CENTRFUGA
450nm
540nm
640nm
Ultravioleta:
400nm a 1nm
Rayos X
1nm a 1pm
Rayos
< 1pm
Infrarrojo:
750nm a 25 um
Microondas:
25um a 1mm
Ondas de radio
> 1mm
6


Los cuerpos luminosos como el sol o las lmparas elctricas emiten
un gran espectro electromagntico que comprende amplias
longitudes de onda, de las cuales muy pocas corresponden al
espectro visible. En el cuadro anterior se aprecian todas las
radiaciones electromagnticas conocidas.

Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de
onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible
(colores complementarios) Esta luz reflejada es la que observamos
como color propio del cuerpo coloreado. No interesa
particularmente los colores que absorbe la solucin que queremos
medir. La selectividad de absorcin que queremos medir. La
selectividad de absorcin de una partcula por una longitud de onda
se basa en el hecho de que cada longitud de onda de luz
corresponde a un distinto nivel de energa, y para excitar los
electrones de cada partcula necesitamos un particular nivel de
energa.

Si consideramos que cada molcula absorbe luz de acuerdo a la
concentracin en que se encuentre dentro de la solucin, a mayor
absorcin de luz y menor luz trasmitida. Estos factores estn
considerados en la ley de Lambert y Beer.


Longitud de onda Color Colores complementarios
400-435 violeta amarillo-verde
435-480 azul amarillo-verde
480-490 verde-azul anaranjado
490-500 azul-verde rojo
500-560 verde purpura
560-580 amarillo-verde violeta
580-595 amarillo-verde azul
595-610 anaranjado verde-azul
610-750 rojo azul-verde




Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de
onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible
(colores complementarios). Esta luz reflejada es la que observamos
como color propio del cuerpo coloreado. Interesa particularmente
7
los colores que absorben la solucin que queremos medir. La
selectividad de absorcin de una partcula por una longitud de onda
se basa en que cada longitud de onda de luz corresponde a un
distinto nivel de energa y para excitar los electrones de cada
partcula se necesita un particular nivel de energa.

S consideramos que cada molcula absorbe luz de acuerdo a la
concentracin en que se encuentre dentro de la solucin, a mayor
concentracin de sustancia, mayor absorcin de luz y menor luz
trasmitida. Estos factores estn considerados en la Ley de Lambert
y Beer, que es la siguiente:

Log I
o
/I
t
= e.l.c
Donde: I
o
= Luz incidente, I
t
= Luz transmitida, C = concentracin,
L = longitud de paso, e = constante.

3.- FOTOCOLORIMETRIA ESPECTROFOTOMETRIA

La fotocolorimetra es la medida de la luz absorbida por una
solucin mediante un aparato que es un fotocolormetro. El equipo
consta de una fuente de luz artificial, un monocromador que separa
exclusivamente luz de una sola longitud de onda (la que sea
preferente para la medida), un recipiente o tubo de vidrio (que
alberga la solucin a medir), una clula fotoelctrica que transforma
la luz trasmitida en corriente elctrica y una unidad de medida de la
corriente elctrica o galvanmetro.











La calificacin de colormetro o espectrofotmetro depende del
monocromador, s ste es un filtro tendremos un fotocolormetro,
pero si es un prisma, o cualquier aditamento que proporcione luz de
diversas longitudes de onda tendremos un espectrofotmetro.

Luz Incidente I
o

Luz trasmitida I
t

8













Los fotocolormetros y los espectrofotmetros reportan sus
resultados bajo dos formas: absorbancia o luz absorbida por las
partcula de la solucin y transmitancia a o luz transmitida luego de
atravesar el tubo con la solucin. La transmitancia se expresa en
valores numricos entre 0 y 100%, es decir que una solucin que no
tiene particular trasmitir el 100% y una perfectamente opaca el 0%.
La absorbancia, tambin llamada densidad ptica DO, se expresa
en valores semilogartmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a
aquella solucin que no tiene partculas y por lo tanto no absorbe la
luz.

Para encontrar la concentracin de una solucin problema,
debemos comparar su lectura frente a un blanco agua destilada o
reactivos sin modificarse con la lectura de un patrn o solucin
estndar bajo las mismas condiciones. Una solucin estndar es
generalmente una que contiene el problema con una concentracin
perfectamente medida en el laboratorio.

CLCULO DE LA CONCENTRACIN DE UN PROBLEMA

Para hallar la concentracin de una muestra problema tenemos dos
procedimientos:

1. Factor de Calibracin
2. Curvas de calibracin

Factor de calibracin: es la concentracin de sustancia que
corresponde a una unidad de medida, generalmente 0,001 de
absorbancia.

Fuente de luz
blanca
Muestra: Absorcin
Celda
Galvanmetro
Monocromador
9



Se obtiene Factor de calibracin:
concentracin del patrn

Lectura del patrn (en absorbancia)

Esta frmula deriva de la densidad ptica o absorbancia del
problema:

DO
P
= e
P
l
P
c
P

Si el coeficiente de extincin (e) es el mismo en ambos casos y el
dimetro del tubo de lectura(l) es el mismo, la nica diferencia est
en la concentracin. Luego:

DO
st CS
=
DO
p CP

Despejando la concentracin del problema cp, obtenemos la
siguiente formula:


cs

cp=Dp x --------
Dost

Concentracin del problema = Densidad ptica del Problema X
Factor de calibracin

La curva de calibracin consiste en la obtencin de las lecturas de
absorcin 0 de % de trasmitancia que corresponde a una secuencia
creciente de concentraciones, estas son graficadas en un papel
milimtrico si se trata de absorbancia o densidad ptica y de papel
semilogartmico si se trata de % de transmitancia.

4.- POTENCIOMETRA

La potenciometra es el procedimiento de eleccin para la medida
del pH. El pH en una expresin numrica que corresponde al
logaritmo de la inversa de la concentracin de iones H+. La
potenciometra se basa en la diferencia de potencial (voltaje) entre
dos electrodos, el de medida y el de referencia, ambos sumergidos
en la solucin y bajo condiciones de equilibrio.

10
Batera
0V 1V
AAg.Aa
HclgCl.HCl.Vidrio
KCl.Hg2Cl2.Hg
Solucin
Problem
a.
El instrumento consta de un ELECTRODO DE REFERENCIA que
se mantiene constante durante la medida, un ELECTRODO DE
MEDIDA que varia de acuerdo a la concentracin de hidrgeno de
la solucin y un dispositivo o potencimetro que mide la
diferencia de potencial. El electrodo de referencia puede ser de dos
clase: de calomel, mercurio metlico y cloruro mercurioso y de plata
plata y cloruro de plata. El potencial de ese electrodo depende de la
solucin de cloruro de potasio en que est sumergido internamente.

El electrodo de medida, es tambin llamado electrodo de vidrio, est
constituido por un tubo de vidrio cuyo extremo es particularmente
selectivo al paso de iones hidrgeno. En su interior hay cido
clorhdrico HCl 0,1 M y un alambre de plata, cloruro de plata,
















En el potencimetro, un voltaje variable se opone al de la celda de
medida. Un galvanmetro acta como detector del punto nulo para
indicar que es igual al voltaje opuesto de la celda de medida.
Conectando la celda desconocida al circuito se produce un desnivel
de voltaje que debe corregirse hasta alcanzar el punto nulo. La
magnitud de la correccin puede leerse como fuerza electromotriz o
como pH directamente.

En la prctica se ha usado los electrodos de pH para medir la
concentracin de otros iones. Los electrodos tienen una membrana
adicional que slo es selectiva al paso de determinado electrolito,
sodio, potasio, calcio son medidos bajo esta manera con facilidad.
Tambin existe el electrodo de CO2 que deja pasar molculas se
11
este gas las que modifican el pH y por lo tanto son medidas con el
electrodo de vidrio de pH.

5.- ESPECTROFOTOMETRIA

EXPERIMENTO.- Preparacin de una curva de calibracin: el
experimento consiste en preparar tubos de concentracin creciente
de un colorante y leerlos al fotocolormetro o al espectrofotmetro,
llevando a cero (0) el aparato con agua destilada. Construir una
grfica usando papel milimetrado para las lecturas hechas en DO
(densidad ptica) o papel semilogartmicos para las lecturas
hechas en % transmitancia.
Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer
las soluciones al espectrofotmetro a 540 nm de longitud de onda.
Practicar esta lectura tanto en DO como en % de transmitancia.
Construir dos curvas de calibracin, una en papel milimetrado y otra
en papel semilogartmico.

Contenido
Tubo N
1 2 3 4 5
mL Azul metileno al (5 mg/Ml) 2 4 6 8 10
mL Agua destilada 8 6 4 2 0

Concentracin (mg/mL) % T A (A=2-logT%)





Desconocido 1
Desconocido 2












0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
%

F
o
r
m
a
c
i

n

p
r
o
d
u
c
t
o
pH
Experimento: Efecto del pH
12


COMENTARIO

...
Usando los valores obtenidos en % de trasmitancia, grafique
usando el papel semilogartmico de esta pgina.















COMENTARIO

.



Firma del alumno Firma del profesor







NOTA

Fecha Hora
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7
Concentracin (mg/mL)
%

T

(
5
4
0

n
m
)
13
PRACTICAS DE LABORATORIO N2: POTENCIOMETRIA

EXPERIMENTO: Titulacin de un cido dbil con una base
fuerte.
Se trata de determinar el pH de un grupo de tubos con varios
niveles de titulacin de cido actico con hidrxido de sodio.
Cuando se titula un cido dbil con una base fuerte se produce un
aumento de pH inicialmente rpido para luego hacerse lento, dentro
de ciertos mrgenes y al final se alcaliniza rpidamente. La
identificacin del cambio de pH en cierto perodo de la titulacin, se
debe a la formacin transitoria de una combinacin de cido dbil y
la sal correspondiente. En el caso del experimento ser la
combinacin de cido actico y acetato de sodio y son los
componentes ordinarios de una solucin amortiguadora o solucin
buffer.Para la experiencia preparar 11 tubos de acuerdo al
siguiente esquema:
Tubo No mL actico 0,1 N mL NaOH 0,1 N mL agua
destilada
1 5,0 0,0 5,0
2 5,0 0,5 4,5
3 5,0 1,0 4,0
4 5,0 1,5 3,5
5 5,0 2,0 3,0
6 5,0 2,5 2,5
7 5,0 3,0 2,0
8 5,0 3,5 1,5
9 5,0 4,0 1,0
10 5,0 4,5 0,5
11 5,0 5,0 0,0
Leer los tubos en el potencimetro y graficar los resultados











NOTA

Fecha Hora


0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
4 5 6 7 8 9 10 11 12
p
H

Volumen (mL)
14
PRACTICAS DE LABORATORIO N3
CINTICA ENZIMTICA: EFECTO DEL Ph y LA TEMPERATURA

Las enzimas son protenas que aceleran las reacciones qumicas
hasta su punto de equilibrio.
La ecuacin general de las enzimas es:


E + S ES E + P
C C


La actividad enzimtica se manifiesta y mide por:

Desaparicin de sustrato
Formacin de producto
Modificacin de cofactor

Muchos factores modifican la actividad enzimtica:

pH
Temperatura
Concentracin de sustrato
Concentracin de enzima
Tiempo de incubacin

En nuestra prctica observamos el efecto de la pepsina sobre la
albmina del huevo. La actividad enzimtica se apreciar por la
prdida de la turbidez proteica.

EXPERIMENTO.- Efecto del pH

El pH acta sobre los grupos ionizados que pertenecen a los
centros activos de las enzimas. Los grupos que pierden la
ionizacin pierden la capacidad de interaccionar con el sustrato.
Cada enzima tiene un pH ptimo de trabajo.

Preparar cinco tubos con:
TUBO N 1 2 3 4 5
Ph 1,0 1,5 6,0 9,5 11
mL albmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
mL HCL 1N 2,0 0,5 0,0 0,0 0,0
mL CO
3
Na
2
0,0 0,0 0,0 0,5 2,0
mL agua destilada 0,0 1,5 2,0 1,5 0,0

15

Preincubar los cinco tubos ms un tubo conteniendo 20 mL de
pepsina al 1% a 37C por 5 minutos. Luego aadir rpidamente 3
mL de la pepsina preincubada a cada uno de los tubos 15. Mezclar
e incubar a 37C por 10 min. Observar la diferencia o leerla en
fotocolormetro con filtro azul (420 nm).

EXPERIMENTO: Efecto de la temperatura.

Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimtica
por aumento de la energa de activacin. Pero paralelamente se va
produciendo una desnaturalizacin parcial de la enzima que la
inactiva.

Preparar cinco tubos con:
TUBO N 1 2 3 4 5
mL albmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL agua destilada 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

Preparar otros cinco tubos con:
TUBO N 6 7 8 9 10
mL pepsina 1% 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura:
TUBO N 1 y 6 2 y 7 3 y 8 4 y 9 5 10
Temperatura O C Amb. 37 C 70 C 37

C 100 C

Agregar los respectivos tubo N 6 al N 10 a los que hay que incubar a las
temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 5.












Experimento: Efecto del pH
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH
%

F
o
r
m
a
c
i

n

p
r
o
d
u
c
t
o
Experimento: Efecto de la
temperatura
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
Temperatura (C)
%

F
o
r
m
a
c
i

n

p
r
o
d
u
c
t
o
16








PRACTICAS DE LABORATORIO N4
CINETICA ENZIMATICA: EFECTO CONCENTRACION, ENZIMA Y
SUSTRATO

EXPERIMENTO. -Efecto de la concentracin de la enzima

Aunque las enzimas no se destruyen ni con las reacciones, el
aumento de ellas en la cubeta de reaccin incrementa la velocidad.

Preparar 5 tubos con:
TUBO N 1 2 3 4 5
mL albmina 5,0 5,0 5.0 5,0 5,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0.5 0,5 0,5
mL agua destilada 1,5 2,5 3.5 4,0 4,5
mL pepsina 0,0 0,0 0.0 0,0 0,0

Incubar los 5 tubos a 37C por 5 minutos y enseguida aadir:
Comentario:







Firma del alumno



NOTA

Fecha Hora


Comentario:







Firma del profesor




17
TUBO N 1 2 3 4 5
mL pepsina incubada 3,0 2,0 1,0 0.5 0,1
Incubar por cinco minutos a 37C. Observar al fotocolormetro a 420 nm
(filtro azul), contra una lectura de agua.

EXPERIMENTO.-Efecto de la concentracin del sustrato

Si es una reaccin enzimtica incrementamos progresivamente la
concentracin del sustrato, aumentar la velocidad enzimtica
(velocidad inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una
meseta plana que no modifica aunque sigamos aumentando el
sustrato, habremos saturado la enzima.

Preparar 6 tubos con:

TUBO N 1 2 3 4 5 6
mL albmina 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL agua destilada 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0
mL pepsina 1% 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37C.
Colocar 0,5 mL que pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5
minutos a 37C. Leer al fotocolormetro a 420 nm (filtro azul). Restar
la segunda lectura de la primera. Graficar y comentar los
resultados.


















Experimento: Efecto de la
concentracin de enzima
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12
Concentracin enzima (mg/mL)
%

F
o
r
m
a
c
i

n

p
r
o
d
u
c
t
o
Experimento: Efecto de la
concentracin de sustrato
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
Concentracin de sustrato
%

F
o
r
m
a
c
i

n

p
r
o
d
u
c
t
o
18







Comentario:






Comentario:








Firma del alumno




NOTA

Fecha Hora



Firma del profesor












PRACTICAS DE LABORATORIO N5
DIGESTIN DE CARBOHIDRATOS

El carbohidratos ms importante en la alimentacin es la glucosa, la
cual ingerimos bajo la forma de disacridos (maltosa, sacarosa y
lactosa) o de almidn, polisacridos formado por muchas molculas
de glucosa. El almidn es el constituyente esencial de cereales,
leguminosa, tubrculos y races. La digestin del almidn se
produce en el intestino delgado gracias a la presencia de enzimas
digestivas producidas por las glndulas salivares, el pncreas y la
pared intestinal. Estas enzimas son:
La alfa amilasa salivar
La alfa amilasa pancretica
La amilo 1,6 glucosidasa de la pared intestinal

Las alfa amilasas son enzimas que actan a pH neutro y en
presencia de iones cloro. Rompen los enlaces amilo 1,4 dando
como resultado oligosacridos y glucosa.
Existe dos formas de evaluar la actividad enzimtica de la amilasa:
19
Por desaparicin de sustrato: forma como desaparece el
almidn el que se aprecia por la reaccin del lugol.
Por formacin de producto: forma como aparecen
carbohidratos reductores (glucosa) en el medio, los que se
aprecian por reduccin del cobre.

En nuestra prctica evaluaremos la actividad enzimtica de la
amilasa sobre el almidn mediante la reaccin del remanente de
almidn frente al yodo a mayor decoloracin, mayor actividad
enzimtica.

EXPERIMENTO.- Digestin del almidn por la amilasa salivar.

Para la experiencia preparar cuatro tubos de ensayo de acuerdo al
siguiente esquema.

TUBO
1 2 3 4
ml almidn 1% 2 2 2 2
ml Buffer fosfato pH 6,6 1 1 1 0
ml HCL 0,3N 0 0 0 3,4
ml Suero fisiolgico 3 2,4 0 0
ml Agua destilada 0 0 2,4 0
Colocar en bao de Mara a 37C por 5 minutos. Agregar:
ml solucin de saliva 0 0,6 0,6 0,6
Colocar en bao de mara a 37C por 20 minutos
Pasado este tiempo tomar 0,5ml de cada tubo y preparar cuatro tubos ms de acuerdo al
esquema


TUBO
1 2 3 4
ml digestin tubo 1
0, 5 0 0 0
ml digestin tubo 2
0 0,5 0 0
ml digestin tubo 3
0 0 0,5 0
ml digestin tubo 4
0 0 0 0,5
ml HCL 0,05N
5 5 5 5
ml Solucin yodada
0,5 0,5 0,5 0,5
Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolormetro con filtro rojo (660nm)

20

INFORME DE LA PRCTICA

Nombre:
Grupo : Fecha:

Experimento.- Digestin del almidn por la amilasa salivar























COMENTARIO:

.


Firma del alumno Firma del profesor



NOTA

Fecha Hora









0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
0.75
0.90
1.05
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
A
b
s

21
PRACTICAS DE LABORATORIO N6:
ABSORCIN DE CARBOHIDRATOS

Despus de la digestin de los carbohidratos por efecto de amilasas
salivar y pancretica, amilo 1,6 glucosidasa, y disacarasas tenemos
como resultado monosacridos: glucosa, fructosa, galactosa, que
debern ser absorbidos por la mucosa intestinal para su ingreso a la
circulacin sangunea. Los carbohidratos se absorben en el yeyuno
mediante dos mecanismos, la simple difusin favorecida por la
gradiente de concentracin y el transporte activo, an contra la
gradiente. El orden de facilidad en la absorcin es de galactosa
glucosa: ribosa.

El borde en cepillo de las clulas intestinales tiene varios sistemas
trasportadores. Un transportador de glucosa dependiente del sodio
(SLGT1) se enlaza tanto a la glucosa como al sodio en sitios
separados aumentando el tenor de sodio intracelular. La energa
necesaria para este transporte se obtiene de la hidrlisis del ATP
vinculado a una bomba de sodio que intercambia sodio con potasio



Tambin participa un transportador facilitador independiente del
sodio llamado GLUT 5. La hidrlisis de los polisacridos,
oligosacridos y disacridos es muy rpida por lo que usualmente
los procedimientos de absorcin se saturan con rapidez.

22
EXPERIMENTO.-Absorcin de la glucosa por el intestino de la
rata

1. Se usan ratas con 24 a 36 horas de ayuno. Se les anestesia
con eter bajo una campana de vidrio. Abrirles el abdomen y se
retira una porcin de 5 cm de intestino, de modo que no
puede mesenterio adherido.
2. Se lava la luz intestinal varias veces mediante una jeringa con
solucin Ringer Fosfato pH 7,4 Mediante el uso de una
baqueta de vidrio se empuja un extremo del intestino dentro
del mismo buscando evertir la porcin mucosa hacia fuera.
Mantener el intestino en solucin Ringer Fosfato pH 7,4 a
temperatura ambiente.
3. Cerrar un extremo del intestino con hilo y dejar otra ligadura
suelta en el otro extremo del intestino.
4. Introducir en el saco intestinal formato 2 ml de solucin Ringer
Fosfato pH 7,4 con 0,2% de glucosa. Cerrar la ligadura suelta
y revisar que no haya prdida de lquido.
5. Introducir el saco lleno en un tubo con 2 ml solucin Ringer
Fosfato pH 7,4 con glucosa 0,2% Incubar a 37C por 30
minutos. Pasado del tiempo sacar el saquito, secarlo por fuera
con papel de filtro. Cortarlo con tijera y vaciar el contenido en
u tubo de ensayo.
6. Diluir 1:10 con agua destilada, tanto el contenido del saquito,
como el del tubo que lo recibi durante la incubacin. Luego
proceder a preparar 4 tubos de acuerdo al siguiente esquema.
TUBO
1 2 3 4
ml reactivo para glucosa
2 2 2 2
l agua destilada
50 0 0 0
l patrn 20 mg/dL
0 50 0 0
l solucin diluida intra saco
0 0 50 0
l solucin diluida extra saco
0 0 0 50
Incubar a 37C por 10 minutos. Enfriar y leer en el fotocolormetro a 520nm. Usando el
tubo 1 como blanco

COMENTARIO: .

Firma del alumno Firma del profesor




NOTA Fecha Hora
23

PRACTICAS DE LABORATORIO N7:
GLICLISIS

La va metablica ms importante para la glucosa es la va
glicoltica o de Embden Meyehof. Esta presente, naturalmente, en
todos los tejidos y es responsable del aprovechamiento energtico
de la glucosa y an de otros carbohidratos. Tiene dos formas de
manifestarse: la forma anaerbica cuando la concentracin de
oxgeno es baja, produce cido pirvico y cido lctico, y genera
escasamente dos molculas de ATP, tal como se aprecia en la
siguiente frmula global.


GLUCOSA + 2ADP + Pi 2 lactato + 2ATP + 2H2O

Cuando la gliclisis transcurre en presencia abundante de
oxgeno, tiene como producto final el cido pirvico, el cual se
transforma en actil CoA mediante el proceso de decarboxilacin
oxidativa, en ingresa al Ciclo de Krebs donde produce 38
molculas de ATP.




24
EXPERIMENTO.- Gliclisis.

La gliclisis anaerbica (parcialmente) se demuestra por el aumento
de compuestos cidos (pirvico y lctico) en el tubo de reaccin.
Para el efecto preparar cuatro tubos de acuerdo al esquema.




TUBO
1 2 3 4
ml solucin de Potter pH 7,4
2,5 2,5 2,5 2,5
ml Glucosa 0,1 m
0,5 0,5 0,5 0,5
ml NAD 10m g/ml
0,2 0,0 0,2 0,2
ml ATP 5m g/ml
0,2 0,2 0 0,2
ml Nicotinamida 0,4m
0,1 0,1 0,1 0,1
ml Yodoacetato 0,1m
0 0 0 0,1
ml Agua destilada
0,1 0,3 0,3 0
Colocar en bao de mara 37C por 5 minutos
Gotas de rojo de fenol
Ii Ii ii Ii
ml homogenizado de hgado
0,5 0,5 0,5 0,5
Tapar e incubar 1 hora a 37C
Titular cada tubo con NaOH 0,01N hasta el color original

COMENTARIO:

.


Firma del alumno Firma del profesor



NOTA

Fecha Hora






25
PRACTICAS DE LABORATORIO N8:
RESPIRACIN TISULAR

La respiracin tisular es el proceso
por el cual se aprovecha la energa
almacenada en los nutrientes (glucosa,
cidos grasos, aminocidos) a travs del
Actil CoA, mediante procesos de
oxidacin.
Durante el proceso de oxidacin del Acil
Coa se forman equivalentes reductores
en forma de hidrgeno o electrones que
ingresan a la cadena respiratoria,
localizada en las mitocondrias y genera
muchas molculas de ATP. Como puede
apreciarse en el esquema adjunto hay
tres fuentes de generacin de electrones
que producen 3 molculas de ATP, el
isocitrato, el cetoglutarato y el malato y
una que slo proporciona dos ATP que
es el succinato, debido a que ingresa al
ciclo de Krebs a nivel de la Coenzima Q y
no del NAD como las otras.
El punto final del transporte de los electrones por la cadena
respiratoria es el oxgeno. Dos tomos de hidrgeno se unen a
molcula de oxgeno para forma una molcula de agua. El
proceso oxidativo de los nutrientes se puede seguir por el
consumo de oxgeno.


EXPERIMENTO: Respiracin Tisular

El experimento estudia la respiracin tisular mediante la
manometra. Un manmetro es un instrumento que mide los
cambios en la presin de los gases. Esta basado en el principio
de vasos comunicantes, si colocamos un lquido en dos
recipientes que se comunican entre s, ambas ramas sern
iguales siempre que sobre ellas exista la misma presin sobre
una de ellas disminuye los niveles de lquido se desigualan. Los
equipos que usaremos sern iguales o semejantes a los que se
observan en el grfico, es decir constan de un ambiente cerrado
para la reaccin, un medio de absorcin de CO
2
que puede
combinar
26

Preparar dos frascos de acuerdo al siguiente esquema:
FRASCO N 1
ml Solucin de Potter pH 7,4
3
ml Succinato de potasio 0,5m
0,3
ml Agua destilada
0,7
ml Homogenizado
0,5

Cerrar bien los frascos. Incubar a temperatura ambiente. Medir cada 2 minutos
la modificacin del nivel del manmetro. Prepara un grfico de consumo de
oxgeno vs tiempo.
















Comentario:

Firma del alumno Firma del profesor



NOTA

Fecha Hora



Consumo de oxgeno en el tiempo
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Tiempo (Minutos)
V
o
l
u
m
e
n

O
2

c
o
n
s
u
m
i
d
o

(
c
m
3
)
27
PRACTICAS DE LABORATORIO N9:
COLESTEROL DE LAS FRACCIONES LIPOPROTECAS

Las protenas son lpidos complejos resultado de unir la grasa con
protenas. Los lpidos sanguneos se encuentran bajo esta forma y
divididos en cuatro tipos de lipoprotena:

Alfa lipoprotena (HDL) ricas en protenas y fosfolpidos
Pre beta lipoprotenas (VLDL): ricas en triglicrido
Beta lipoprotenas (LDL): ricas en colesterol
Quilomicrones (Q): ricos en triglicridos dietticos

Toda las lipoprotenas tienen colesterol, triglicridos, fosfolpidos y
protenas, pero en distinta concentracin relativa.

El colesterol es la grasa que genera la arterioescleroris al
depositarse en las paredes de los vasos sanguneos. El colesterol
de las betalipoprotenas est en actitud de depositarse en los vasos
constituye la mayor parte del colesterol sanguneo. El colesterol de
las alfa lipoprotenas (HDL) es aquel que est siendo retirado de los
vasos, por lo que su presencia es beneficiosa.
Para investigar el colesterol de las alfa lipoprotenas usamos un
reactivo precipitante (fosfotngstico-cloruro de calcio) que precipita
a las betas y prebetalipoprotenas dejando en solucin a las alfa,
sobre las que se realiza la reaccin de color tpica del colesterol.



28
EXPERIMENTO: Dosaje colesterol total y colesterol HDL en sangre.


Se toma una muestra de sangre del paciente en ayuno de por lo
menos 24 horas. La sangre se coloca en tubo limpio sin
anticoagulante.

Preparar un tubo al que se le coloca:

1ml de suero lmpido
0.1 ml de reactivo precipitante HDL o II gotas

Agitar y dejar en reposo por minutos al ambiente Centrifugar a 3
000 por 10 minutos separar el sobrenadante.

Preparar cuatro tubos lmpidos y colocar:


TUBO N 1 2 3 4
ml Suero lmpido

0,02 0 0 0
ml Sobrenadente anterior

0 0,02 0 0
ml Patrn de colesterol

0 0 0,02 0
ml Agua destilada

0 0 0 0,02
ml Reactivo de color

2 2 2 2


Agitar: Incubar por 15 minutos a 37C.

Leer al fotocolormetro a 520 mu los tubos 1,2 y 3, llevando a cero
con el blanco (tubo4)

Clculos


200
Colesterol mg/dl= -------- X D.O.(1 2)
D.O (3)




29

EXPERIMENTO : Dosaje de triglicridos

Preparar tres tubos con:

TUBO N 1 2 3
ml Suero

0 0,02 0
ml Patrn de triglicridos

0 0 0,02
ml Reactivo de color

2 2 2

Agitar, incubar a 37C por 15 minutos




Leer al fotocolormetro a 520 nm los tubos 2 y 3 llevando a O con el tubo 1



Conc. Patrn
Triglicridos mg/dl = ------- x D.O.(2)
D.O (3)



INFORME DE LA PRCTICA : RIESGO CORONARIO

Nombre:
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
..........................................................................................

Experimento: Dosaje de colesterol total y colesterol HDL en sangre

Patrn:
Lectura:
Concentracin:
Factor de Calibracin:
Colesterol total:



30
PRACTICAS DE LABORATORIO N10:
LIPIDOS: ELECTROFORESIS DE PROTEINAS


La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas
(protenas o cidos nucleicos) sobre la base de su tamao
molecular y carga elctrica. Los cidos nucleicos ya disponen de
una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo,
mientras que las protenas son molculas cuya carga neta depende
del contenido de una serie de aminocidos (fundamentalmente
cido glutmico, cido asprtico, lisina, arginina e histidina). Para la
separacin se usa un gel de agarosa, poliacrilamida o acetato de
celulosa. Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo
elctrico, stas se movern y debern ir pasando por el papel, por
la que las pequeas se movern mejor y rpidamente. As, las ms
pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del
lugar de partida.
En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se
coloca en un campo elctrico se mover hacia uno u otro electrodo
dependiendo de:
1) su carga elctrica
2) su tamao
3) la intensidad del campo elctrico y
4) la temperatura del medio.
Las protenas estn compuestas de aminocidos que poseen
grupos ionizables (principalmente -COO
-
y -NH3
+
), pueden
encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer
elctricamente neutras segn la proporcin de los diversos grupos
ionizados a un determinado pH.


En suero humano la composicin normal es:
Protena total: 6,4 a 8,3 g/dL
Albmina: 3,5 a 5,0 g/dL
Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dL
Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dL
Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dL
Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dL

ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
Se usa para la separacin y caracterizacin de protenas y otras
molculas. El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de
celulosa, con propiedades de adsorcin mnimas, por lo que se
31
evita la formacin de colas y los solutos pueden ser separados en
bandas bien definidas. Otras ventajas son:
1) La separacin es muy rpida
2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeas
3) Las tiras pueden hacerse transparentes
4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes
separados
5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos
radiactivos

MATERIAL Y REACTIVOS
Material
- Tiras de acetato de celulosa (Cellogel)
- Papel de filtro para secar las tiras de acetato
- Cubeta de electroforesis
- Aplicador
- Fuente de electroforesis
Reactivos
-Tampn Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=8,6
-Solucin de tincin: 0.1% (p/v) ponceau S stain en cido actico
1%
-Solucin de lavado: cido actico 1%
-Suero

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Electroforesis:
- Humedecer en tampn las tiras de acetato de celulosa 10 minutos
antes de su uso, para su equilibrado.
- Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la
superficie
- penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el
que se ve cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros
con el corte en la esquina inferior derecha
- Depositar la muestra de suero en la tira de acetato de celulosa, en
el extremo prximo al ctodo.
- Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 100
voltios durante 60 minutos.
Revelado:
- Finalizada la separacin, depositar las tiras en una cubeta con
solucin de tincin, de modo que queden cubiertas por el lquido,
durante 10 minutos.
- Lavar las tiras en solucin de distincin hasta que se observen
bien las bandas de protena (rojo) sobre un fondo blanco.
32

TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS
Dibujar el patrn de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis
de protenas sricas, indicando la posicin de nodo y ctodo as
como el punto de aplicacin de la muestra. Identificar las protenas
que corresponden a cada banda y justificar el orden.

Comentario:

Firma del alumno Firma del
profesor



NOTA

Fecha Hora
















33
PRACTICAS DE LABORATORIO N11:
TRANSAMINACIN

Una de las reacciones generales de los aminocidos es la
transaminacin o trasporte de un grupo amino de un aminocido a
un cetocido, trasformado al primero en cetocido y al segundo en
aminocido.
Esta transformacin posibilita la formacin de carbohidratos a partir
de aminocidos, esto es el fenmeno de la neoglucognesis.

LA ecuacin general de estas reacciones es:

R=CH-COOH + R-C-COOG R-C-COOH+R-CH-COOH

Nh2 O O NH2

En el caso de nuestro experimento la transaminasa que
estudiaremos es la transaminasa glutmico pirvica que transforma
el alfa cetoglutrico (cetocido) en glutmico (aminocido) y a la
alanina (animocido) en pervico (cetocido).
Esa enzima que es particularmente rica en el tejido heptico es un
excelente herramienta de estudio clnico de ese rgano, en
problemas como la hepatitis o la cirrosis heptica.
El procedimiento de anlisis se llevar a cabo mediante la
cromatografa en capa fina.













PROCEDIMIENTO CROMATOGRFICOS

La cromatografa es un procedimiento de anlisis por el cual una
mezcla de molculas es separada en sus componentes mediante el
uso de una fase estacionaria y una mvil.

34
La fase estacionaria o soporte da nombre al tipo de cromatografa:
papel, columna, capa fina y la fase mvil es lquida o gaseosa.

La separacin de componentes se produce por el fenmeno de
particin por solventes, esto es ante una mezcla de lquidos no
miscible entre s, algunos componentes tendrn mayor posibilidad
de localizarse en uno u otro componente, aquellos que se localicen
en el componente ms lejano del soporte migraran ms y aquellos
cercanos sern adsorbidos por el soporte.

Existen una forma identificatoria de medir la migracin de las
molculas analizadas y es el Rf. Este valor corresponde a la
relacin entre los cm migrados por la molcula y aquellos migrados
por el medio mvil.


EXPERIMENTO: Demostracin de transaminacin por
cromatografa

Preparar 4 tubos de acuerdo la esquema:

TUBO N 1 2 3 4
ml cetoglutarato 0,2 M

0,3 0,3 0 0
ml alanina 0,2M

0,3 0,3 0 0
ml piruvato 0,2M

0 0 0,3 0,3
ml glutamato 0,2M

0 0 0.,3 0,3
ml arsenito 0,1M

0,4 0,4 0,4 0,4
ml Enzima activa

0 1 0 1
ml Enzima inactiva

1 0 1 0










RF =-----------------
a
b
a
b
a
35

Incubar todos los tubos por 45 minutos a 37C. Retirar los tubos del
bao de Mara y agregar 6ml de alcohol etlico a cada tubo. Agitar y
esperar por dos minutos. Centrifugar y usar los sobrenadantes para
la cromatografa.

Cromatografa
Marcar a 3 cm del borde una lnea suave con un lpiz, tratando de
no daar la slica gel. Marcar en esa lnea seis puntos separados
por 2 cm cada uno. Colocar en cada punto cinco gotas del
respectivo sobrenadante y en las dos ltimas 5 gotas de alanina y
cinco de glutamato respectivamente. Dejar secar Colocar la
cromatoplaca en una cmara de cromatografa con una mezcla de
propanol: agua en la proporcin de 8: Dejar correr hasta que el nivel
lquido le falte 1 cm para llegar al extremo de la placa. Marcar el
nivel al que alcanz el lquido con un lpiz y dejar secar.

Aplicar con un spray una solucin de ninhidrina al 0,1% e butanol.
Colocar a la estufa por 10 minutos. Marcar las manchas obtenidas.

Obtener el Rf de cada mancha mediante la frmula:

Distancia de origen al punto medio de la mancha
Rf:

Distancia de origen al nivel mximo del solvente


Comentario:

.


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NOTA

Fecha Hora





36
PRACTICAS DE LABORATORIO N12:
EVALUACIN NUTRICIONAL

Experimento .- Manejo de Tablas de Composicin de Alimentos


La forma ms exacta de evaluar la ingesta de nutrientes por un
sujeto es a travs del clculo de la ingesta alimentaria, bien
documentada y exacta y mediante las Tablas de Composicin de
Alimentos. En la presente prctica analizaremos:


1. Las necesidades calricas de un sujeto: tomando en cuenta,
peso y trabajo. As conocemos que una persona gasta como
Metabolismo Basal 1 kcalora /kg. Peso/hora. A ello aadimos
aproximadamente un 50% por trabajo de mediana intensidad.
2. Las necesidades protecas de un sujeto: tomado su peso,
aceptamos una necesidad de 1g/kg de peso/da( en
condiciones mnimas 0,5/kg peso/da).

3. Las necesidades de nutrientes (protena, carbohidratos y
grasa) de un da al azar. Con ello podemos establecer su
ingesta calrica y proteca y por lo tanto su dficit o
adecuacin.

Para el efecto usaremos la siguiente Tabla de Composicin de
Alimentos resumida.



TABLA DE COMPOSICIN DE ALIMENTOS
g/100g de alimento

Alimento Protena Lpido Carbohidratos

Atn (conserva) 29,0 4,8 0,0
Bacalao (seco) 81,8 2,8 0,0
Calamar 16,4 0,9 0,0
Camarn 17,3 0,2 2,5
Carne (cerdo) 15,0 15,1 0,0
Carne (Pavo) 20,1 20,2 0,0
Carne (pollo) 18,2 10,2 0,0
Carne (pulpa) 21,3 1,6 0,0
Carne Seca 48,1 9,4 0,0
Chicharrones 11,3 61,4 0,0
Cojinova 20,2 0,7 0,0
37
Corvina 19,9 0,9 0,0
Hgado 19,5 6,6 3,6
Huevo (total) 12,8 11,8 1,0
Jamn del Pas 15,9 26,6 0,0
Jamn Ingls 25,8 20,5 0,0
Leche fresca 2,9 3,3 7,0
Lenguado 19.0 0,5 0,0
Merluza 19,3 0,8 0,0
Pejerrey 18,7 1,2 0,0
Queso Fresco 16,0 10,3 3,7
Queso mantecoso 25,8 20,2 7,4
Tocino 9,1 65,0 1,6
Trucha 18,2 1,0 0,0









Alimento Protena Lpido Carbohidratos

Arroz (seco) 6,5 0,7 78,1
Arveja (verde) 8,3 0,7 24,2
Avena 10,6 0,9 68,5
Bizcocho 8,8 6,9 64,4
Camote 1,2 0,2 27,1
Fideos 8,7 0,3 78,3
Frejol negro 21,2 1,7 53,3
Frejol soya 33,4 16,4 35,5
Frejol tarhui 40,9 13,4 27,3
Galletas (soda) 9,4 14,7 67,9
Galletas (Vainilla) 6,0 12,7 75,0
Garbanzo 19,1 5,1 61,4



Alimento Protena Lpido Carbohidratos


Lentejas 22,8 1,2 59,4
Maz (cancha) 6,7 2,7 79,8
Maz (choclo) 3,3 0,8 27,8
Man 28.8 46,9 18,1
Nuez 13,7 67,2 13,2
Olluco 0,8 0,1 14,2
Pallares 19,9 1,1 61,8
Pan (frances) 9,2 0,3 68,2
38
Papa blanca 2,1 0,3 22,4
Papa Seca 8,3 0,5 73,2
Quinua 11,9 4,7 67,6
Yuca 0,8 0,2 39.3
Aceitunas 1,2 33,2 6,8
Blanquillo 0,6 0,1 17,1
Cebolla 0,9 0,1 7,4
Coco 3,8 18,9 19,7
Col 1,4 0,0 5.2
Coliflor 2,0 0,6 5,8
Lechuga 1,4 0,2 3,3
Nabo 0,8 0,2 5,2
Pepina 0,5 0,1 2,7
Rabanitos 0,8 0,0 3,1
Tomate 0,8 0,2 4,0
Zanahoria 0,6 0,4 9,5
Zapallo 0,7 0,2 6,4










Alimento Protena Lpido Carbohidratos

Aceite 0,0 100 0,0
Azucar 0,0 0,0 99,5
Chocolate 2.0 30,0 60,0
Cocoa 9,0 19,0 31,0
Gelatina(seca)* 85,6 0,1 0,0
Limn 0.5 0,0 11,2
Maizena 8,0 3,0 74,0
Margarina 0,6 81 0,4
Naranja 1.2 0,0 11,2
Palta 1,7 12,6 6,5
Papaya 0,4 0,1 8,3
Platano isla 0,8 0,2 23,8
Uva negra 0,3 0,1 17,9


* Se usan al 3-4g%




GASTOS DE ENERGIA DE ACUERDO A ACTIVIDAD Y SEXO

ACTIVIDAD MUJER : HOMBRE :
39
Kcal /kg/hora Kcal /k Kg/hora
Durmiendo 1,1 1,0 1,2 ,9-
Muy Ligera: manejo de auto,
laboratorio, mecanografa, coser y
planchar
2,0 1,2 2.5 1,1-
Ligera: caminar, carpintera,
mecanica, lavado de ropa
3,9 2,5-4,9 2,0-
Moderada: fregar pisos, ciclismo,
tenis, baile
5,9 5,0-7,4 4,0-
Pesada: albail, natacin, ftbol,
bsquetbol.
10,0 7,5-12,0 6,0-








Firma del alumno Firma del profesor



NOTA

Fecha Hora







PRACTICAS DE LABORATORIO N13:
LABORATORIO DE LIQUIDOS CORPORALES. Examen de
orina. Examen Fisico-Quimico

EXAMEN FI SI CO- QU MI CO
El anlisis de orina de rutina incluye pruebas qumicas para pH, protenas, glucosa, cetonas y sangre
oculta. Algunos laboratorios tambin incluyen pruebas de bilirrubina, urobilingeno y nitrito, segn el
tipo de tira reactiva que utilice.
Desde la introduccin de tiras reactivas simples y mltiples, cintas de prueba y tabletas, el examen
qumico de la orina se ha convertido en un procedimiento sensible y rpido. Actualmente es posible
analizar hasta nueve pruebas diferentes en menos de 60 segundos. Existen dos marcas bsicas de tiras
reactivas y cada una posee tiras reactivas con posibilidad de medir desde una hasta nueve reacciones
diferentes.
La compaa Bayer fabrica el producto Multistix y la Boehringer Mannheim Corporation (BMC) fabrica
el Combur-10. ambas tiras miden pH, protenas, glucosa, cetonas, sangre oculta, bilirrubina,
urobilingeno, nitritos, leucocitos y gravedad especfica.
Pero qu es una tira reactiva? Esencialmente, es una banda angosta de plstico con pequeos tacos
adheridos. Cada taco contiene reactivos para una reaccin diferente, lo que permite la determinacin
simultnea de varias pruebas. Un requerimiento crtico es que las reacciones de las tiras sean ledas en el
momento prescrito despus de haber sido sumergidas en la muestra, luego deben ser comparadas
cuidadosamente con la carta de colores proporcionada por el fabricante. Con el objeto de obtener
resultados exactos y confiables con las tiras reactivas, deben tomarse ciertas precauciones para ayudar a
mantener la reactividad de los reactivos. Las tiras no deben estar expuestas en medios hmedos, a la luz
40
directa del sol, al calor ni a sustancias voltiles, debiendo ser almacenadas en su envase original. Dicho
envase no debe ser guardado en el refrigerador no ser expuestos a temperaturas superiores a 30C. Estos
envases contienen un desecante, pero aun as las tiras no deben quedar expuestas a la humedad. Sacar slo
la cantidad de tiras necesarias por vez y luego cerrar hermticamente el envase. Si los bloques de color de
la tira no se parecen a los bloques "negativos" de la carta de colores, si ha pasado la fecha de vencimiento
impresa en el envase, las tiras deben ser descartadas. Si la muestra de orina fue refrigerada debe dejarse
que alcance la temperatura ambiente antes de efectuar las pruebas.
El procedimiento para usar las tiras reactivas es el siguiente:
Sumergir completamente las reas de prueba de la tira en orina fresca, bien mezclada y sin
centrifugar y retirar la tira en forma inmediata. Debe tenerse cuidado de no tocar las reas
reactivas.
Eliminar el exceso de orina de la tira tocando con el borde de ste el frasco que contiene la
muestra. Las tiras deben sostenerse en posicin horizontal.
En el tiempo determinado comparar las reas reactivas con la correspondiente carta de colores
del envase, la lectura deben hacerse con buena iluminacin para lograr una comparacin exacta
del color.
Al mismo tiempo que se introducen mejoras en las caractersticas de las tiras reactivas pueden
modificarse las indicaciones para su uso. Esto puede significar una diferencia en los tiempos o en los
reactivos utilizados; por eso es importante seguir siempre las ltimas indicaciones del fabricante.
An con el amplio uso de estos rpidos y convenientes procedimientos de anlisis, sigue siendo necesario
comprender los principios bsicos de las pruebas, as como la tcnica correcta en que deben de usarse. A
continuacin se mencionarn brevemente los principios en que se basan dichos estudios, con las tiras
reactivas.
pH
En las tiras reactivas utilizan dos indicadores, el rojo de metilo y el azul de bromotimol, que cubren la
escala de pH entre 5 y 8,5 o 9. Los colores van del anaranjado al amarillo y del verde al azul. Los
resultados pueden informarse en unidades enteras o bien valores intermedios (media unidad). Si se
necesita una lectura ms precisa, pueden hacerse las mediciones utilizando un potencimetro con
electrodo de vidrio. El momento de lectura del pH no es un elemento crtico; sin embargo, es
recomendable que el pH sea ledo en forma inmediata ya que de este modo se evitarn lecturas errneas
por rebosamiento (run-over).
PROTENAS
Este mtodo colorimtrico se basa en el concepto conocido como "error proteico de los indicadores", un
fenmeno que se caracteriza por que el punto de cambio de color de algunos indicadores de pH es
diferente en presencia de protenas. Por lo general el indicador cambia del amarillo al azul (o verde) entre
pH 3 y pH 4, pero en presencia de protena el cambio de color se produce entre el pH 2 y el pH 3. en
consecuencia, en presencia de protena se produce un "error" en el comportamiento del indicador. El
indicador que se utiliza en el Multistix es el azul de tetrabromofenol 3, 3, 5, 5-
tetrabromofenolsulfonftalena, y el indicador del Combur-10 es el 3, 3, 5 5-tetraclorofenol-3, 4, 5, 6-
tetrabromofenolsulfonftalena.
En el rea reactiva se agrega un amortiguador cido para mantener un pH constante de 3, que en ausencia
de proteinuria de un color amarillo. La aparicin de color verde o azul indica la presencia de protena con
el Multistix; en el Combur-10, el color cambia al verde, la intensidad del color es proporcional a la
cantidad de protena presente. El tiempo de lectura en el Multistix no es un factor crtico, y puede leerse
en forma inmediata. Para obtener una lectura semicuantitativa en el Combur-10, efectuar la lectura a los
60 segundos (seguir las ltimas indicaciones del fabricante) el color del rea reactiva debe compararse
cuidadosamente con la carta de colores proporcionada. Los resultados por lo general pueden informarse
como negativos o hasta 3+ o 4+.
Las dos marcas de tiras reactivas poseen diferentes reas blanco, de modo que no son clnicamente
intercambiables. Los valores de las diferentes lecturas se muestran en la tabla 2.



Tabla 2. Valores de protenas en diferentes tiras reactivas
Multistix Combur-10
Trazas 5-20 mg/dL 6-20 mg/dL
1+ 30 mg/dL 30 mg/dL
2+ 100 mg/dL 100 mg/dL
41
3+ 300 mg/dL 500 mg/dL
4+ Mas de 2,000 mg/dL
GLUCOSA
Con tiras reactivas impregnadas con la enzima glucosa oxidasa puede detectarse slo glucosa. Estas tiras
utilizan las dos reacciones enzimticas secuenciales siguientes:
Glucosa + O
2 GLUCOSA OXIDASA
cido glucnico
H
2
O
2
+ cromgeno
PEROXODASA
cromgeno oxidado + H
2
O
El cromgeno que se utiliza vara con las diferentes tiras reactivas.
CETONAS
El Multistix contiene reactivos el nitroprusiato de sodio y un amortiguador alcalino. La reaccin con el
cido diactico de la orina forma un color castao. Esta tira no reacciona con acetona ni con el b -
hidroxibutrico. El Multistix se lee a los 15 segundos y permite detectar niveles de cido diactico hasta
de 5-10 mg/dL. El cambio de color es de rosado ante a castao, y la reaccin se informa como: negativa,
trazas, cantidad moderada, gran cantidad, o como 5, 15, 40, 80 o 160 mg/dL.
Con el Multistix pueden ocurrir resultados positivos falsos (trazas o menos) en los casos en que la
muestra de orina sea muy pigmentada o cuando posee grandes cantidades de metabolitos de la levodopa.
Algunas muestras con elevada densidad y pH pueden dar reacciones positivas falsas (trazas, 5 mg/dL).
Debido a la especificidad del nuevo Multistix para determinacin del cido diactico, el reactivo para
cetonas no da resultados positivos con controles que tienen acetona.
El Cumbur-10 contiene los siguientes reactivos: nitroferrocianuro sdico, glicina y un amortiguador
alcalino. El nitroferrocianuro de sodio y glicina reaccionan con el cido diactico y con la acetona en
medio alcalino formando un complejo color violeta. Esta tira reactiva es ms sensible al cido actico que
la acetona; no permite detectar cido b -hidroxibutrico. El Combur-10 se lee a los 60 segundos y permite
detectar niveles de cido diactico de 5-10 mg/dL y de acetona de 40-70 mg/dL. El color cambia desde el
beige al violeta, y la reaccin se grada de la siguiente forma: negativa, 1+ (5-40 mg/dL), 2+ (40-100
mg/dL), o 3+ (>100 mg/dL).
SANGRE OCULTA
El procedimiento de deteccin de sangre oculta con tiras se basa en la actividad tipo peroxidasa de la
hemoglobina y de la mioglobina, que catalizan la oxidacin de un indicador por la accin de un perxido
orgnico. En el Multistix el indicador es el 3, 3, 5, 5-tetrametilbencidina y el perxido orgnico. En el
Multistix el indicador es el 3, 3, 5, 5-tetrametilbencidina y el perxido de hidroperxido de cumeno. El
Combur-10 utiliza el indicador tetrametilbencidina y el perxido es el 2,5-dimetil-2, 5-dihidro-
peroxihexano.
Ambas marcas de tiras reactivas permiten la deteccin de eritrocitos intactos, as como la hemoglobina
libre y mioglobina. Los hemates intactos de la orina se hemolizan al contactar con el taco reactivo. La
hemoglobina liberada reacciona con el reactivo dando puntos verdes sobre un fondo amarillo o
anaranjado. Entonces, la presencia de hemates intactos da una reaccin de color verde punteado, mientras
que la de hemoglobina libre y la mioglobina dan una coloracin uniforma de color verde o del verde al
azul oscuro.
El Multistix se lee a los 25 segundos, y el color cambia del anaranjado al azul oscuro pasando por el
verde. Por lo general permite detectar 5 a 15 hemates intactos por microlitro o bien 0,0015 a 0,0060
mg/dL de hemoglobina libre. Los resultados se informan en una escala que va desde trazas hasta 3+ o
gran cantidad.
El Combur-10 se lee a los 60 segundos y el color cambia del amarillo al verde. La concentracin ms baja
que puede detectarse es de unos 5 hemates intactos/m L, o la cantidad de hemoglobina libre equivalente a
20 hemates/m L.
BILIRRUBINA Y UROBILINGENO
Las tiras reactivas se basan en la reaccin de acoplamiento de una sal de diazonio con la bilirrubina en un
medio cido. Difieren, sin embargo, en la sal de diazonio utilizada y en el color que aparece.
El Multistix contiene la sal 2, 4-dicloro-anilina diazonio, se lee a los 20 segundos y el color vara del ocre
a diferentes tonos de canela (tostado) o prpura. Se miden as 0,2- 0,5 mg/dL de bilirrubina.
El Combur-10 contiene 2,6-dicloro-benceno-diazonio-tetrafluorborato, se lee a los 30-60 segundos, y el
color cambia del rosado al rojo-violeta segn la concentracin de bilirrubina. La prueba permite detectar
concentraciones de 0,5 mg/dL de bilirrubina.
Los resultados con ambos tipos de tiras pueden informarse como 1+, 2+, 3+ o cantidad pequea (dbil),
moderada o grande (fuerte). Para obtener resultados exactos el color de la tira debe ser comparado
cuidadosamente con el de la carta de colores.
NITRITO
42
En el Multistix, en el medio cido del rea reactiva el nitrito reacciona con el cido p-arsanlico formando
un compuesto de diazonio. Este compuesto se une luego con la 1, 2, 3, 4-tetrahidro-benzo (h) quinolina-3-
ol produciendo un color rosado. La tira se lee a los 40 segundos. Cualquier grado de color rosa uniforme
debe interpretarse como prueba de nitrito positiva y sugiere la presencia de 10
5
o mas organismos por mL.
De orina. El desarrollo de color rosa no debe considerarse como prueba positiva. Si el color rosado
uniforme es dbil es mejor verlo colocando la tira sobre el fondo blanco.
En el Combur-10, una amina aromtica, la sulfanilamida, reacciona con nitrito en presencia de un
amortiguador cido produciendo una sal de diazonio. Esta sal de diazonio se une luego con la 3-hidroxi-1,
2, 3, 4-tetrahidroxibenzo-(h)-quinolina, formando un colorante azico. La intensidad del color rojo refleja
la concentracin del nitrito presente, pero no constituye un ndice de la gravedad de la infeccin. La
prueba se lee a los 30 segundos, y el color cambia del blanco al rojo pasando por el rosa plido.






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Practica N 13
Urianalisis

Objetivo
Realizar los procedimientos generales del urianalisis

Materiales
Muestras de orina
Tiras reactivas para anlisis de orina
Tubos de ensayo
Centrifuga
Laminas portaobjeto
Laminas cubre objeto
Microscopio binocular
Guantes descartables
Tips descartables
Pipeta automtica

Procedimientos
1. Colquese los guantes

2. Observe los aspectos fsicos de las muestras seleccionadas por el
profesor: Color, Aspecto; anote los resultados en la tabla adjunta

3. Tome una tira reactiva y sumerja la zona de anlisis dentro de cada
muestra por un lapso de 10 a 15 segundos

4. Retire la tira reactiva con cuidado, elimine el exceso y compare el color
de cada uno de los parmetros contra el cuadro de valores
correspondiente. Anote los resultados en la tabla adjunta

5. Elimine la tira en la bolsa de bioseguridad correspondiente


URIANALISIS
Aspecto fsico
Color
Aspecto
Densidad
Evaluacin Qumica









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PRACTICAS DE LABORATORIO N14:
LABORATORIO DE INVESTIGACION
Exposicin de Equipamiento BASICO Y ESPECIALIZADO del Laboratorio de Investigacin, metodos
empleados.