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Essay / Artigo
Extraction of -galactosidase by ultrasonic method
Ailton Cesar Lemes, Gabriel Teixeira lvares, Susana Juliano Kalil
BBR - Biochemistry and Biotechnology Reports
DOI 10.5433/2316-5200.2012v1n2p7
Extracton of -galactosidase from Kluyveromyces marxianus CCT 7082 by ultrasonic method
Extrao de -galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 por mtodo ultrassnico
Ttulos abreviados:
Extracton of -galactosidase by ultrasonic method
Extrao de -galactosidase por mtodo ultrassnico
Ailton Cesar Lemes
1
*, Gabriel Teixeira lvares
1
, Susana Juliano Kalil
1
ABSTRACT
The -galactosidase is an intracellular enzyme obtained from the yeast Kluyveromyces
marxianus and its role is hydrolyse lactose and therefore, is important in the dairy
industry. However, for their efectve use is necessary to beter understand the
extracton methods available. The ultrasonic disrupton method has been applied as a
separaton step of intracellular products on laboratory scale and consists of ultrasonic
waves dissipaton in the soluton through cavitaton bubbles and produce velocity
gradient that creates a force capable of breaking the cells. The aim of this study was
to evaluate the rupture ultrasonic extracton of the enzyme -galactosidase obtained
from the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7082 compared with abrasion method
using glass beads. The method using ultrasonic ruptor (150 W) with an intermediate tp
(70% power) was efectve for cell disrupton of yeast, showing high enzyme actvity and
yield, similar values to the extracton method using abrasive glass beads.
Keywords: cell disrupton, enzyme, ultrasound, abrasion.
1
Universidade Federal do Rio Grande - RS
* Autor para correspondncia ailtonelemes@hotmail.com
RESUMO
A enzima intracelular -galactosidase, obtda a partr da levedura Kluyveromyces
marxianus, utlizada na hidrlise da lactose e importante na indstria de produtos
lcteos. No entanto, para sua efetva utlizao, faz-se necessrio entender melhor os
mtodos de extrao disponveis. O mtodo de ruptura ultrassnico tem sido aplicado
como etapa de separao de produtos intracelulares em escala laboratorial e consiste
na dissipao de ondas ultrassnicas na soluo atravs de bolhas de cavitao que
produzem um gradiente de velocidade, criando uma fora capaz de romper as clulas.
O objetvo deste trabalho foi avaliar a ruptura ultrassnica para extrao da enzima
-galactosidase, obtda da levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082, em comparao
com mtodo de abraso com prolas de vidros. O mtodo, utlizando ruptor ultrassnico
(20 kHz) com ponteira intermediria (70% de potncia), mostrou-se efciente para
ruptura das clulas da levedura, pois apresentou altos valores de atvidade enzimtca e
rendimento, similares ao mtodo de extrao por abraso, utlizando prolas de vidro.
Palavras-chave: ruptura celular, enzima, ultrassom, abraso.
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INTRODUO
A -galactosidase uma enzima que cataliza a hidrlise da lactose, sendo
importante na indstria de produtos lcteos (GEKAS e LPEZ-LEIVA, 1985).
Pode ser produzida pela levedura Kluyveromyces marxianus, que reconhecida
e considerada como segura (GRAS), podendo ser utlizada na produo de
alimentos e frmacos sem oferecer riscos (CABALLERO et al., 1995). No entanto,
a produo da enzima ocorre intracelularmente e, assim como qualquer outro
produto intracelular, requer uma etapa de ruptura das clulas para sua liberao,
etapa esta crucial nos processos de downstream, pois qualquer dano causado
ao produto que ocorra nesta fase inicial, pode comprometer e invalidar todos os
processos subsequentes (NEVES, 2003).
Dentre os mtodos de ruptura destacam-se o rompimento mecnico com
esferas de vidro e o rompimento por ultrassom (GURPILHARES; PESSOA-JR;
ROBERTO, 2003), mtodos efcientes que so utlizados durante o estabelecimento
de processos de downstream, e ainda, no acompanhamento da produo de
determinado bioproduto em escala laboratorial.
O rompimento manual com prolas de vidro um mtodo mecnico que no
necessita de grande aparato operacional. Utliza basicamente prolas de vidro e
o procedimento consta da adio das mesmas em um tubo, contendo suspenso
celular. O tubo agitado vigorosamente por um tempo determinado, obtendo-
se a enzima extrada pela fora do atrito devido moagem com pequenas esferas
como abrasivos (MEDEIROS et al., 2008).
O rompimento ultrassnico tem sido aplicado em diversos processos de
separao, seja como uma etapa de pr-tratamento ou como processo integral, e
tambm como mtodo potencial para acompanhamento de cultvos microbianos.
A maior parte das ondas ultrassnicas dissipada no sistema lquido atravs
de bolhas de cavitao, as quais formam uma espcie de campo, onde ocorre
aumento de massa e consequente transferncia de calor para o meio lquido,
produzindo um gradiente de velocidade e a criao de uma fora capaz de romper
as clulas (BOSSIO, HARRY E KINNEY, 2008) e liberar a enzima.
O objetvo deste trabalho foi avaliar o mtodo de ruptura ultrassnico
para utlizao em escala laboratorial em comparao ao mtodo que utliza
abraso com prolas de vidro para extrao da enzima -galactosidase obtda
intracelularmente a partr da levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082.
MATERIAL E MTODOS
Produo da enzima
A enzima -galactosidase foi produzida a partr da levedura Kluyveromyces
marxianus CCT 7082, selecionada como a maior produtora da enzima (MANERA
et al., 2008) e mantda em gar extrato de malte e levedura. O inculo foi
preparado utlizando o meio de cultura, conforme descrito por Pinheiro et
al. (2003), e mantdo a 30C, 180 rpm por 24 horas. A enzima foi obtda por
fermentao submersa utlizando meio de cultura otmizado por Manera et al.
(2008), mantdo a 30C, 180 rpm por 96h.
Extrao da enzima por abraso com prolas de vidro e mtodo ultrassnico
Os processos de extrao foram realizados a partr de uma suspenso
celular da levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082 em tampo fosfato de
potssio 50 mM pH 6,6 (MEDEIROS; BURKERT; KALIL, 2012)

com concentrao
equivalente a 40 mg de clula seca por mL.
O processo de abraso foi realizado em agitador tpo vrtex utlizando
prolas de vidro, 1,1 g de prola de vidro com dimetro entre 0,6 e 0,8 mm
para cada mililitro de suspenso celular. A suspenso foi agitada por 40 min, com
intervalos de 2 min de repouso em banho de gelo, obtendo-se o extrato bruto
com clulas (MEDEIROS et al., 2008).
A ruptura pelo mtodo ultrassnico foi realizada atravs de um
homogeneizador ultrassnico (Sonic Ruptor 250) com frequncia de 20 kHz
e potncia mxima de 150 W, onde 40 mL da suspenso celular mantda sob
constante refrigerao foi submetda s ondas ultrassnicas constantes por
at 30 minutos, utlizando uma micro ponteira (Mp) (40% de potncia) e uma
ponteira intermediria (Pi) (70% de potncia), ambas de ttnio.
Para obteno do extrato enzimtco clarifcado, a suspenso celular, obtda
a partr dos diferentes processos de ruptura, foi centrifugada sob refrigerao
(4700xg, 4C, 10 min). Os mecanismos de ao dos mtodos empregados esto
apresentados na Figura 1.
A efcincia dos mtodos de ruptura foi avaliada atravs da determinao
da atvidade enzimtca e protena total. Alm disso, foi determinada a atvidade
especfca, estabelecida pela relao entre a atvidade enzimtca (U/mL) e
a concentrao de protena (mg/mL) e o rendimento do processo, relao da
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atvidade enzimtca total (U) e biomassa utlizada no processo de extrao (g).
As anlises foram realizadas atravs da retrada de alquotas a cada 2 minutos
durante o processo de extrao por ultrassom utlizando a micro ponteira, a cada
1 minuto para a ponteira intermediria e no tempo fxo de 40 minutos para o
processo de abraso, conforme estabelecido por Medeiros et al. (2008).
Determinao da atvidade enzimtca
A atvidade enzimtca foi determinada usando o-nitrofenil--D-
galactopiranosdeo (ONPG) como substrato (INCHAURRONDO; YANTORNO;
VOGET, 1994). Uma unidade de atvidade enzimtca (U) defnida como a
quantdade de enzima necessria para liberar 1 mol de o-nitrofenol por minuto,
a 37C e pH 6,6.
Determinao da protena total
A determinao da protena foi realizada segundo metodologia de Bradford
(1976), utlizando albumina de soro bovino (BSA) como protena padro.
RESULTADOS E DISCUSSO
Os resultados obtdos a partr da ruptura pelo mtodo ultrassnico esto
apresentados na Figura 2 que mostra a atvidade de -galactosidase (A), protena
total (B) e atvidade especfca (C) ao longo do tempo, utlizando as duas diferentes
ponteiras (Pi e Mp) no processo de extrao.
A utlizao da ponteira intermediria no ruptor ultrassnico, que fornece
uma potncia de 105 W, alcanou valores de atvidade enzimtca equivalentes
aos obtdos pelo mtodo de ruptura por abraso. Isto confrmado pelo fato
de que neste processo a atvidade enzimtca foi apenas 10% menor do que em
relao ao mtodo por abraso, que foi de 39,1 U/mL com atvidade especfca
de 8,8 U/mg.
J a micro ponteira, que fornece uma potncia menor, (60 W), resultou
em valores bem inferiores de atvidade enzimtca, at 50% menor em relao
ao mtodo de extrao que utliza prola de vidro e 45% em relao ponteira
intermediria, de maior potncia.
Figura 1 Mecanismo de ruptura celular pelo mtodo ultrassnico (A) e pelo mtodo
por abraso utlizando prola de vidro (B).
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(A) Mtodo de ruptura ultrassnico (B) Mtodo de ruptura por abraso
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Figura 2 Atvidade enzimtca (A), protena total (B) e atvidade especfca (C).
( Ponteira intermediria; Micro ponteira).
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (min)
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25
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(B)
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Tempo (min)
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(
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/
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)
(C)
A utlizao das diferentes ponteiras no processo que utliza ultrassom foi
positvamente favorvel na efcincia da extrao enzimtca, principalmente no
comparatvo entre o grau de ruptura celular da levedura, que aumentou com o
incremento da potncia e das ondas ultrassnicas dissipadas no meio contendo
as clulas. A ponteira intermediria mostrou-se mais efciente na ruptura
celular para liberao da enzima e das demais protenas (Figura 2A e 2B). No
entanto, a micro ponteira proporcionou em alguns pontos maiores atvidades
especfcas devido menor liberao de protenas do interior da clula da
levedura, resultando em certo momento do processo em uma maior atvidade
especfca (Figura 2C). Ou seja, a ponteira que fornece menor potncia foi, em
um ponto especfco do processo (8 minutos), capaz de liberar menor quantdade
de protena do interior da clula, aumentando a atvidade especfca da enzima
alvo. Alm disso, o menor aquecimento conferido, j que por limitao tcnica
fornece uma potncia menor ao meio, pode ter reduzido o grau de desnaturao
enzimtca, resultado da menor dissipao de ondas ultrassnicas e consequente
reduo da dissipao de calor. Ainda em relao atvidade especfca possvel
verifcar que esta se manteve pratcamente constante durante o processo,
quando se utlizou a ponteira intermediria, resultado da liberao simultnea
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da enzima e demais protenas do interior da clula da levedura. J o ensaio
com a microponteira apresentou uma queda drstca da atvidade especfca,
ocasionada pela desnaturao enzimtca aps 22 minutos de processo e da
ininterrupta liberao de protenas para o meio contendo a enzima.
No presente estudo, o rendimento do processo com ultrassom foi superior
quando se utlizou a ponteira intermediria, 876 U/g, quase duas vezes superior
ao rendimento proporcionado pela utlizao da microponteira, 480 U/g (Tabela
1). J o rendimento, utlizando mtodo de abraso com prolas de vidro, foi de
977,5 U/g, demonstrando que o processo ultrassnico apresenta-se como uma
alternatva analtca efciente para extrao da enzima produzida pela levedura
Kluyveromyces marxianus. O rendimento do processo que por muitas vezes
negligenciado deve ser levado em considerao, pois em muitos casos, pode
inviabilizar e limitar o desenvolvimento e implementao de novas metodologias.
Diversos trabalhos publicados reportam a utlizao efciente do ruptor
ultrassnico para os mais variados bioprodutos obtdos a partr de micro-
organismos. Medeiros et al. (2008) estudaram a extrao da -galactosidase
de Kluyveromyces marxianus CCT 7081, utlizando sistema de sonicao em
combinao com o processo de abraso com prolas de vidro em uma carga
de 1,1 g de prolas de vidro por mL de suspenso celular (dimetro entre 0,95
- 1,05 mm), por um perodo de 40 min, o que proporcionou um rendimento do
processo de extrao de 550,4 U/g. O mtodo combinado foi efciente para a
extrao da enzima em escala laboratorial.
Gerde et al. (2012) utlizaram o mtodo de extrao ultrassnico
para extrao de lipdeos do interior da clula de microalgas autotrfcas e
heterotrfcas, o qual se mostrou efciente. Em ambos os tpos de algas, a extrao
de material intracelular aumentou com o aumento do tempo e da energia
dissipada. No entanto, foi constatado que as condies operacionais devem ser
bem estabelecidas e controlados, pois o processo sem controle pode resultar na
formao de radicais livres que prejudicam a qualidade do leo extrado neste
processo.
Michelon et al. (2012) estudaram a extrao de carotenides de Phafa
rhodozyma, utlizando diversos mtodos de extrao, entre eles, a utlizao
de ultrassom. Este processo em conjunto com o congelamento da biomassa
proporcionou uma extrao de 88,3 g/g de carotenides.
Fonseca et al. (2011) tambm realizaram a extrao de astaxantna de
Phafa rhodozyma NRRL-Y 17268, utlizando ondas de ultrassom. O mtodo
mostrou-se efcaz na ruptura da parede celular da levedura quando utlizado em
conjunto com a secagem como pr-tratamento, alcanando atvidade especfca
de astaxantna de 2198,4 g/g. Alm disso, o mtodo foi apontado como
alternatva potencial em relao a outros mtodos para determinao analtca.
Tabela 1 Atvidade, protena, atvidade especfca e rendimento do processo de
extrao com a utlizao de mtodo ultrassnico.
Mtodo de ruptura
Atvidade
(U/mL)
Protena
(mg/mL)
Atvidade especfca
(U/mg)
Rendimento
(U/g)
Ultrassom
(Micro ponteira) *
19,2 4,3 7,7 480,0
Ultrassom (Ponteira
intermediria) *
35,04 6,2 6,0 876,0
Abraso**
(Prola de vidro e
vrtex)
39,1 4,4 8,8 977,5
* valores mximos obtdos no acompanhamento do processo de extrao utlizando ultrassom.
** valores no tempo de 40 minutos.
A ruptura das clulas da levedura foi verifcada atravs da visualizao por
microscpica ptca, utlizando corante (combinao de cristal violeta/fucsina) e
ampliao de 1000 vezes. Pela microscopia apresentada na Figura 3, possvel
verifcar que o mtodo de extrao, utlizando abraso com prolas de vidro
(3B), resultou em maior ruptura das clulas em relao clula da levedura
sem tratamento (3A), confrmado pela maior atvidade enzimtca, seguido
pelo mtodo de ruptura, utlizando ponteira intermediria (3C) e, por ltmo, a
microponteira, que explica tambm a menor atvidade enzimtca.
Apesar dos tmos resultados apresentadas por este mtodo de extrao,
a temperatura, durante o processo, deve ser controlada, j que a dissipao das
ondas na suspenso celular gera calor e pode resultar na desnaturao da enzima
e consequente perda da efcincia do processo.
Se por um lado o aumento da temperatura deva ser observado com cautela
e possa parecer um fator negatvo utlizao deste mtodo de extrao, por
outro temos que considerar e destacar as vantagens, j que o mtodo mostrou-
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se potencialmente efciente para escala laboratorial, pois, alm de resultar em
atvidade enzimtca similar tcnica por abraso, uma tcnica muito menos
laboriosa, por no necessitar de trabalho manual constante. Alm disso, a
utlizao da tcnica de extrao com ultrassom apresenta como vantagem o
menor consumo de solvente, quando comparada aos mtodos de extrao com
solventes, e a no exigncia de equipamentos de alto custo (MELLO, LOBO E
YABE, 2009) que, na maioria das vezes, inviabiliza a obteno de determinado
bioproduto.
Figura 3 Clulas da levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082 sem nenhum
pr-tratamento (A); (B) Clulas aps ruptura por abraso; (C) Clulas aps ruptura
ultrassnica utlizando ponteira intermediria (D); clulas aps ruptura ultrassnica
utlizando micro ponteira.
Outra vantagem que ao fnal do processo necessrio realizar apenas
uma centrifugao para retrada do material celular disperso na soluo aquosa,
enquanto que no processo por abraso necessria uma etapa de fltrao
adicional para retrada do material abrasivo e posterior centrifugao para separar
o material celular (Figura 1). Por mais simples que parea a etapa adicional,
qualquer alterao do processo pode prejudicar e at mesmo inviabiliz-lo, em
razo de perdas do composto de interesse e aumento do custo de obteno.
Assim, o desenvolvimento e aperfeioamento dos processos de extrao
dos compostos de interesse devem ser constantemente abordados de modo
a reduzir tempo de extrao e, principalmente, aumentar o rendimento do
processo.
Desta forma, conclumos que o mtodo de extrao, utlizando ruptor
ultrassnico (frequncia de 20KHz e potncia mxima de 150 W) com ponteira
intermediria (70% de potncia), mostrou-se efciente para utlizao em escala
laboratorial no processo de extrao de -galactosidase do interior das clulas
da levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082, pois apresentou valores de
atvidade enzimtca e rendimentos similares ao mtodo de extrao por abraso
que utliza prolas de vidro.
AGRADECIMENTOS
Ao apoio fnanceiro das entdades: CAPES, CNPq e FAPERGS.
REFERNCIAS
BOSSIO, J. P.; HARRY, J.; KINNEY, C. A. Applicaton of ultrasonic assisted extracton of chemically diverse
organic compounds from soils and sediments. Chemosphere, v. 50, n. 9, p. 858-864, 2008.
BRADFORD, M. A Rapid and Sensitve Method for the Quanttaton of Microgram Quanttes of Protein
Utlizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytcal Biochemistry, v. 72, p. 248-254, 1976.
CABALLERO, R.; OLGUIN, P.; CRUZ-GUERRERO, A.; GALLARDO, F.; GARCIA-GARIBAY, M.; GBMEZ-RUIZ, L.
Evaluaton of Kluyveromyces marxianus as bakers yeast. Food Research Internatonal, v. 28, p. 37-41,
1995.
FONSECA, R. A. S.; RAFAEL, R. S.; KALIL, S. J.; BURKERT, C. A. V.; BURKERT, J. F. M. Diferent cell disrupton
methods for astaxanthin recovery by Phafa rhodozyma. African Journal of Biotechnology, v. 10, p.
1165-1171, 2011.
GEKAS, V.; LPEZ-LEIVA, M. Hydrolysis of lactose: a literature review. Process Biochemistry, v. 20, p. 1-12,
1985.
GERDE, J. A.; MONTALBO-LOMBOY, M.; YAO, L.; GREWELL, D.; WANG, T. Evaluaton of microalgae cell
disrupton by ultrasonic treatment. Bioresource Technology, v. 125, p. 175181, 2012.
GURPILHARES, D. B.; PESSOA- JR, A.; ROBERTO, I. C. Obteno de glicose-6-Fosfato desidrogenase a partr
de Clulas de Candida guilliermondii cultvadas em Hidrolisado Hemicelulsico de Palha de Arroz. In: XIV
Simpsio Nacional de Fermentaes. 2003, Florianpolis: Simpsio Nacional de Fermentaes, p. 1-7.
INCHAURRONDO, V. A.; YANTORNO O. M.; VOGET, C. E. Yeast growth and -galactosidase producton
during aerobic batch cultures in lactose-limited synthetc medium. Process Biochemistry, v. 29, p. 47-54,
1994.
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Extraction of -galactosidase by ultrasonic method
Ailton Cesar Lemes, Gabriel Teixeira lvares, Susana Juliano Kalil
MANERA, A. P.; ORES, J. C.; RIBEIRO, V. A.; BURKERT, C. A. V.; KALIL, S. J. Optmizaton of the culture
medium for the producton of -galactosidase from Kluyveromices marxianus CCT 7082. Food Technology
Biotechnology, v. 46, p. 66-72, 2008.
MEDEIROS, F. O.; BURKERT, C. A. V.; KALIL, S. J. Purifcaton of b-Galactosidase by Ion Exchange
Chromatography: Eluton Optmizaton Using an Experimental Design. Chemical Enginering Technology,
n. 35, v. 5, p. 911-918, 2012.
MEDEIROS, F. O.;ALVES, F. G.; LISBOA, C. R.; MARTINS, D. S.; BURKERT, C. A. V.; KALIL, S. J. Ondas ultrassnicas
e prolas de vidro: um novo mtodo de extrao de -galactosidase para uso em laboratrio. Qumica
Nova, v. 31, n. 2, p. 336-339, 2008.
MELLO, P. C. M.; LOBO, I.; YABE, M. J. S. Optmizaton of ultrasonic extracton and analyses methodology
by HPLC for determinaton of diuron and its metabolites in soil cultvaton of sugar cane. Semina: Cincias
Exatas e Tecnolgicas, v. 30, n. 2, p. 107-116, 2009.
MICHELON, M.; BORBA, T. M.; RAFAEL, R. S.; BURKERT, C. A. V.; BURKERT, J. F. M. Extracton of Carotenoids
from Phafa rhodozyma: A Comparison between Diferent Techniques of Cell Disrupton. Food Science
Biotechnology, v. 21, n. 1, p. 1-8, 2012.
NEVES, L.C.M. Obteno de Glicose-6-Fosfato Desidrogenase a partr de S.cerevisiae W303-181.
Ribeiro Preto, 2003, 284 f. Dissertao (Mestre em Tecnologia de Fermentaes), Faculdade de Cincias
Farmacutcas, Universidade de So Paulo (USP).
PINHEIRO, R.; BELO, I.; MOTA, M. Growth and b-galactosidase actvity in cultures of Kluyveromyces
marxianus under increased air pressure. Leters in Applied Microbiology, v. 37, p. 438-442, 2003.
Received 19 October 2012
Accepted 26 March 2013