REPBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD CATLICA ANDRS BELLO NUCLEO GUAYANA

ESCUELA DE INGENIERIA CIVIL
LABORATORIO INGENIERIA SANITARIA








TINCIN GRAM Y MANEJO DEL MICROSCOPIO OPTICO









Profesor gua: Ing. Antonio Seijas.
Autores: Barbosa Daniel, Dugarte Sofa, Valdez Miguel.
Fecha de realizacin: 15 de Octubre del 2014
Fecha de entrega: 22 de Octubre del 2014

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN

En esta prctica de laboratorio, se determin si las bacterias presentes en la
muestra de agua(Planta de Tratamiento de aguas servidas de la UCAB GUAYANA)
eran Gram Positivas o Negativas, por medio de la Tincin de Gram; donde a travs de
los diferentes productos entre ellos, el cristal violeta, lugol y etanol (los que se
vertieron en el portaobjetos con la muestra de agua), se logr observar (microscopio
ptico) que los microorganismos(bacterias) eran Gram positivas, pues al ser aplicado a
la muestra esta no se decolor permaneciendo teida color violeta (color caracterstico
de las Gram Positivas). Esto quiere decir en pocas palabras que las bacterias presentes
en las muestras poseen un pared celular gruesa, densa y uniforme.
Cabe destacar que las medidas de seguridad que se tomaron para las muestras,
son de vital importancia (guantes, desinfeccin de las manos, mascarilla), ya que as
podemos dar fe que la muestra que estamos evaluando en el microscopio est
prcticamente inalterada.

























INTRODUCCIN
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin
diferencial empleado en Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular
bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin
bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de
color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o
grosella.

El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las
clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared
bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI
(yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y
actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la
pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en
solucin acuosa con el cristal violeta.

Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza
una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la
safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas
son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una
tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del
protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern
rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).






Se pueden observar las diferencias estructurales y qumicas de los dos tipos de
pared bacteriana:

Pared Gram +
capa densa y uniforme de
200 a 800 A)
glicopptido (50% del peso
seco)


Pared Gram -
capa interna delgada de 20 a
30
A cubierta por capas
externas de densidad menor)
lipopolisacridos
lipoprotenas
protenas
glicopptido (10% del peso
seco)










OBJETIVOS
1. Iniciacin en las tcnicas del estudio de microorganismos: cultivo,
tincin y morfologa.
2. Diferenciar morfolgicamente los grupos de bacterias Grampositivos de
los Gramnegativos, mediante la tincin gran.
3. Usar el microscopio como herramienta para la diferenciacin de los
grupos de bacterias.










PARTE EXPERIMENTAL
Equipos y material:
Microscopio: instrumento que permite observar partculas u objetos muy
pequeos, contiene dos o ms lentes que permiten obtener una imagen aumentada del
objeto y funciona por refraccin.
Portaobjetos: fina placa de plstico sobre el cual se disponen objetos para
su examen microscpico.
Asas de cultivo: Las asas permiten tomar una siembra de un lquido
gracias a la tensin superficial.
Mechero: instrumento utilizado para calentar o esterilizar muestras
o reactivos qumicos.
Vaso precipitado.
Piseta.
Cronometro.
Reactivos y medios de cultivo:
Cultivo de bacterias
Cristal violeta

, Lugol (

).
Alcohol 95.
Safranina

.
Procedimiento:
1. Fijar un frotis (mecanismo que consiste en el extendido de una gota de
cierta sustancia en la superficie de un portaobjetos). Haciendo uso de una asa,
previamente flameada, se tom una muestra del cultivo y cuidadosamente se extendi
en el portaobjeto. Para secar la muestra se paso el portaobjeto cuidadosamente por la
llama del mechero para que el calor no fuese directo.
2. Tincin: mediante un gotero, se agreg cristal violeta sobre la muestra, al
transcurrir un minuto, se procedi a lavar la muestra con agua destilada, teniendo
especial cuidado en que el chorro no cayera directamente sobre la muestra, sino
alrededor de ella.
3. Mordiente: para la ejecucin de este paso, se aplico Yodo o Lugol
mediante un gotero y se dejo actuar por un minuto para determinar su fijacin a las
bacterias. Seguidamente se aplico Etanol al 95% para la decoloracin.
4. Lavado y secado: para eliminar los restos del decolorante, se lavo con
agua y seguidamente se dejo secar al aire libre.
5. Anlisis en el microscopio.





















ANLISIS DE RESULTADOS
Se observ la muestra por el microscopio .Se utiliz un ojo ocular de 18x/10 y
ojos ptimos de 4x (rojo), 10x (amarillo), 40x (azul) y 100x (blanco), donde se pudo
observar que:
-Lente 4x: Identificamos el tipo de bacteria presente en la muestra, porque se
tio de color morada.
-Lente 10x: Se ve ms definido, y se puede detallar mejor la estructura de la
bacteria (como una pequea hoja con ramificaciones).
-Lente 40x: No se observa muy bien, ya que la densidad bacteriana es muy
grande.
-Lente 100x: Debido a que la densidad bacteriana es muy grande, no se observa
bien.
La primera muestra se observ una pigmentacin morada, dando como resultado
que son Gram Positivas, no solo por el color sino que al observar su
peptidoglicano(envoltura celular) tena un leve grosor; adems de eso estas se
presentaban agrupadas, en un solo sector de la muestra y su forma era irregular .
La segunda muestra no presento ningn tipo de bacteria.









CONLUSIONES
Se logr aprender las diferentes tcnicas de estudio de microorganismos, desde
cmo se debe manejar una muestra (las precauciones a tener en consideracin como: el
uso de los guantes, de la mascarilla y la desinfeccin de las manos con cloro diluido),
pasando por la esterilizacin del aza de cultivo mediante el mechero, y finalmente la
correcta manipulacin del portaobjetos para as evitar accidentes y/o alterar los
resultados.
Se determin que las bacterias presentes en la muestra de agua (Planta de
Tratamiento de aguas servidas de la UCAB GUAYANA), eran Gram Positivas, por una
sencilla razn, pues cuando se agrego el violeta cristal, el lugol (despus) y por ltimo
el etanol las clulas no se decoloraron, sino que las mismas quedaron teidas de color
violeta.
A travs del microscopio se pudo visualizar la forma, y la asociacin de las
bacterias presentes en las muestras, pero principalmente permiti definir si era Gram
positiva o negativa mediante su coloracin.
Cabe resaltar que la segunda muestra no presento ningn tipo de
microorganismo, porque quizs los procedimientos experimentales no se siguieron a
cabalidad.