GaTELab

Genomicsand Transposable Elements

Transformao gentica e suas
aplicaes em pesquisa e
biotecnologia
Profa. Dra. Magdalena Rossi
Que um organismo
geneticamente modificado
(OGM)?
So aqueles que recebem um ou mais genes de
outro organismo e passam assim a expressar uma
nova caracterstica de interesse.
OGMs= melhoramento gentico clssico.
-cruzamentos naturais ou forados com seleo humana
(milho/teosinte?)
-introgresso de genes de espcies selvagens em S.
lycopersicum.
OGMs= to antigos quanto a agricultura
(mas no so produzidos por
transformao).
DNA
Genes de interesse:
existem na natureza, no so
inventados nem sintetizados.
Clula:
animal, vegetal, bactria, etc
Que um transgnico?
Melhoramento gentico:
Caracterstica de
interesse
Planta de interesse
Estabilidade da
informao transferida
Gene de interesse
Planta de interesse
Estabilidade da
informao
transferida
Ambos dependemda seleo das cultivares
para uso comercial emetapassubsequentes.
CLSSICO TRANSFORMAO
DIRETA
As transgnicas e o melhoramento gentico
Tcnicasde transformao gentica de
plantas:
Aplicaesna pesquisa bsica e aplicada
AplicaesBiotecnolgicas(produtos
transgnicos)
Tcnicasde transformao gentica de
plantas:
Agrobacterium(mtodo biolgico)
Bombardeamento (mtodo fsico)
Eletroporao )mtodo fsico)
Aplicaesna pesquisa bsica e aplicada
AplicaesBiotecnolgicas(produtos
transgnicos)
Agrobacterium: Angiospermas (eudicotiledneas,
mono) e Gimnospermas)
Rhizobiaceae (Rhizobium, Bradyrhizobium)
A. tumefaciens
(galha-da-coroa)
A. rhizogenes
A. tumefaciens
Histrico
1907; descreve-se a doena
1930; caracteriza-se o agente: Agrobacterium
1970; constata-se a correlao entre a doena
e um plasmdeo
1979; transferncia de um fragmento de DNA
da bactria para a clula vegetal
A. tumefaciens
pTi
tumor: tecido
mosaico!
Porque forma o
tumor?
A. tumefaciens
A. rhizogenes
pRi
raizesso clones
celulares
porque surgem
raizes?
Uma interao peculiar ...
Agrobacterium
- Transfere um fragmento
de DNA, o T-DNA, do
plasmdio Ti no genoma
vegetal.
- Insero em posio
aleatria dentro do
genoma.
- Induz a proliferao
celular originando
tumores ou razes a partir
da clula transformada.
- As clulas vegetais
transformadas sintetizam
substncias chamadas
opinas que so a fonte de
C e N das bactrias.
Organizao de pTi ou pRi
sntese de opinas e oncogenes (sntese de
citocininas, auxinas ou sensibilidade para auxinas)
(conjugao
entre
agrobactrias
do solo)
(origem de replicao
e regio de
incompatibilidade)
(catabolismo
de opinas)
(transferncia
do T-DNA:
genes de
virulncia)
200Kb
Borda
esquerda
Borda
direita
Regio
transferida
PLANT CELL
AGROBACTERIUM
Phenolics
Produced by
Wounded
Plant cell
VirA VirG
Phenolics
detected by the
VirA/VirGtwo
component
sensor system.
VIP1 associates with
the complex to target
it to the nucleus
VIP2 associates the
complex to
transcriptionally
active DNA
T-DNA integrates into plant DNA
and gall production is initiated.
Gall Formation!
Vir Gene
expression
induced
Bacterial
Plasmid
Formation of T-Pilus(VirB and VirD4
T-DNA
Vir D1 & D2 cut
T-DNA at right
and left borders
and starts T-DNA
synthesis (VirC)
VirD2 attaches to
exposed 5
I
end
Formation of T-complex
VirE2
Transferncia do T-DNA
Transformao via Agrobacterium
-Obteno da construo contendo o gene de interesse e
um marcador de seleo.
-Introduo da construo na bactria.
-Introduo da construo na clula vegetal pela bactria.
-Desenvolver a tecnologia para a regenerao da espcie
vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Organizao de pTi ou pRi
GENE DE I NTERESSE + MARCADOR DE SELEO
(conjugao
entre
agrobactrias
do solo)
(origem de replicao
e regio de
incompatibilidade)
(catabolismo
de opinas)
(transferncia
do T-DNA:
genes de
virulncia)
200Kb
Borda
esquerda
Borda
direita
Regio
transferida
Transformao de explantes
T-DNA: Gene de interesse + Gene de resistncia para seleo de transformantes
SEM GENES DE OPINAS E SEM ONCOGENES
Clulas 3-4 dias em cultura liquido
4 ml
Bactrias de 1-2
dias em cultura
50 100 ul
3 dias de co-
cultivo
Replaqueamento Replaqueamento em em
meio meio seletivo seletivo
Meio + antibiticos
para seleo
Aps 7 dias
1
2
3 4 5 6
7 8 9 10
11 12
Transformao de clulas
Replaqueamento Replaqueamento
em em meio meio seletivo seletivo
Meio MS30 slido Carb +
Vanc + Higro
1
2
3 4 5 6
7 8 9 10
11 12
U3A3MR::GUS U3A2MR::GUS Controle -
Transformao de clulase seleo
Clulas crescendo em
meio seletivo
Clulas que no cresceram
em meio seletivo
U3B::GUS
O processo de regenerao:
Seleo de linhagensportadorasdo gene
de interesse.
Transformao via bombardeamento
(canho gnico)
-Obteno da construo contendo o gene de
interesse e um marcador de seleo.
-Introduo da construo de interesse por um
mecanismo fsico.
-Desenvolver a tecnologia para a regenerao da
espcie vegetal a ser transformada (cultura de
tecidos).
Gene de interesse Prom
VETOR
Bombardeador
Partculas de tungstnio
carregando DNA
Transformao gentica de plantas: bombardeamento
Gene de i nt er esse
+
Gene de r esi st nci a
par a sel eo de
t r ansf or mant es
Bombardment
Diferna com vetor de Agro!
Transformao via eletroporao
-Obteno da construo contendo o gene de interesse
e um marcador de seleo.
-Introduo da construo de interesse por um mtodo
fsico.
-Desenvolver a tecnologia para a regenerao da
espcie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
D
E
F
Transformao gentica de plantas: eletroporao
Gene de i nt er esse
+
Gene de r esi st nci a par a sel eo de
t r ansf or mant es
Gene de interesse Prom
VETOR
E
Tcnicasde transformao gentica de plantas:
Agrobacterium(mtodo biolgico)
Bombardeamento (mtodo fsico)
Eletroporao )mtodo fsico)
Aplicaesna pesquisa bsica e aplicada
Conhecero padro temporal de expresso de um gene (?)
Conhecero padro espacial de expresso de um gene (?)
Conhecera resposta de um gene a diferentesestmulos
Estudarosgenes envolvidosnosdiferentesprocessos
fisiolgicos(ex. resistncia a patgenos, florao, etc)
AplicaesBiotecnolgicas(produtostransgnicos)