UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL

PROGRAMA DE PS-GRADUAO
MESTRADO EM CINCIAS DO MOVIMENTO HUMANO






Instalao e Evoluo do Estado Inflamatrio em Ratos
Diabticos Destreinados Submetidos a uma Sesso de
Exerccio Fsico Extenuante


ANTONIO JOS DE ALMEIDA SILVA JNIOR

Orientadora: Profa. Dra. Elaine Hatanaka

Dissertao apresentada ao Mestrado em
Cincias do Movimento Humano, da
Universidade Cruzeiro do Sul como parte
dos requisitos para obteno do ttulo de
Mestre em Cincias do Movimento Humano.





SO PAULO
2010








AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL
DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU
ELETRNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.











FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA CENTRAL DA
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL



















Silva Junior, Antonio Jos de Almeida.
S58i Instalao e evoluo do estado inflamatrio em ratos diabticos
Destreinados submetidos a uma sesso de exerccio fsico
extenuante/
Antonio Jos de Almeida Silva Junior. So Paulo; SP: 2010.


Orientadora: Elaine Hatanaka.







UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PS-GRADUAO


Instalao e Evoluo do Estado Inflamatrio em Ratos
Diabticos Destreinados Submetidos a uma Sesso de
Exerccio Fsico Extenuante


Antonio Jos de Almeida Silva Junior
Dissertao de mestrado defendida e aprovada
pela Banca Examinadora em 27/05/2010


BANCA EXAMINADORA:


Profa. Dra. Elaine Hatanaka
Universidade Cruzeiro do Sul
Presidente


Profa. Dra. Renata Gorjo
Universidade Cruzeiro do Sul



Profa. Dra. Adriana Cristina Levada Pires
Universidade de So Paulo


DEDICATRIA














Ao meu Deus que me permitiu concretizar este trabalho.


Aos meus familiares que sempre estiveram ao meu lado em todos os
momentos.


A todas as pessoas que convivem dia a dia com diabetes que so minha
Grande inspirao.








AGRADECIMENTOS


A professora Dra. Elaine Hatanaka, por sua excelente competncia
profissional e dedicao na realizao desta obra.
Ao Prof. Dr. Rui Curi pela credibilidade em abrir as portas do seu
laboratrio me permitindo aprender e desenvolver parte de minha
dissertao.
minha Me e meus irmos Ronaldo e Gregrio pelo incentivo e
dedicao em minha formao acadmica.
A dona Iandara Jardim Barros pelo carinho em todos estes anos.
Aos colegas de ps-graduao pela convivncia nesses vinte e quatro
meses.
Ao amigo e colega de pesquisa Nivaldo Ribeiro pelo empenho,
dedicao e companheirismo em nossas superaes, vivncias e
conquistas.
Aos meus mdicos Dr. Flvio Scarelli e Dr. Reinaldo Barros (in
memorian) que so os grandes articuladores desta conquista.
A todos meus professores desta jornada pela minha formao
profissional.
A FAPESP e ao CNPq pelo suporte financeiro para a realizao da
pesquisa.
Enfim, a todos que de uma forma direta ou indireta contriburam para a
realizao deste trabalho.
E, acima de tudo, ao meu Deus que permitiu esta grande conquista, pois
sem Ele nada do que fiz seria possvel.



































A sabedoria o principal; adquire, pois, a sabedoria: sim com tudo o que
possuis, adquire o conhecimento.
(Provrbios 4.7).







Silva Junior AJA. Instalao e evoluo do estado inflamatrio em ratos
diabticos destreinados submetidos a uma sesso de exerccio
extenuante. [dissertao]. So Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2010.



RESUMO


Atletas diabticos podem sofrer leses musculares resultantes de fadiga e
ou trauma fsico. Aps uma leso, as concentraes citocinas pro-
inflamatrias (TNF-, IL-1, IL-6) aumentam no plasma. Esses mediadores
podem causar hiperglicemia, ativar macrfagos e contribuir para o dano
tecidual, bem como aumentar a susceptibilidade a microrganismos
invasores, afetando o desempenho e a sade do diabtico. Neste estudo,
avaliamos a instalao e resoluo do processo inflamatrio em ratos
controles e diabticos destreinados submetidos a uma sesso de exerccio
fsico extenuante. Amostras de sangue foram coletadas dos grupos antes,
imediatamente aps, 2 horas e 24 horas aps a exausto fsica. TNF-, IL-
1, IL-6, IL-10 e VEGF-/ foram quantificados no plasma por ELISA. A
glicose foi quantificada por mtodo enzimtico colorimtrico. A morte de
macrfagos (necrose e apoptose) foi analisada por citometria de fluxo.
Nossos resultados indicam que o exerccio fisco exaustivo diminui a
glicemia de forma tempo-dependente (r=0,97) no grupo controle. O grupo
diabtico permaneceu em hiperglicemia constante. Vinte e quatro horas
aps a exausto, os ratos diabticos ainda continuam com aumento de IL-
1 (r=0,9 p< 0,05) e de TNF- enquanto o grupo controle retornou ao valor
basal desses mediadores. O grupo controle apresentou um pico de
produo de IL-6 duas horas aps a exausto (p= 0,049). No se observou
alteraes nas concentraes de IL-6 no grupo diabtico. A exausto fsica
alterou a porcentagem de macrfagos provenientes de ratos diabticos em
necrose (r=0,9) de forma tempo dependente. Em concluso, ratos
diabticos destreinados apresentam inflamao 24 horas aps o exerccio
extenuante, enquanto o grupo controle retorna ao estado basal em relao
quantificao de citocinas proinflamatrias e a perda de integridade de
membrana.
Palavras-chave: Diabetes, Exerccio extenuante, Macrfagos, Inflamao e
Citocinas.












Silva Junior AJA. Installation and evolution of inflammatory state in destrained
diabetic mouses submited to a strenuous exercise.
[dissertao]. So Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2010.



ABSTRATC


Diabetic athletes may suffer muscular injuries resulting from muscle fatigue and
collision among the players. After an initial lesion, the levels of pro-inflammatory
cytokines (TNF-, IL-1, IL-6) increase in plasma. These mediators may
increase glucose serum levels, activate macrophages and contribute to tissue
damage, as well as increase susceptibility to invasive microorganisms, thus
affecting the performance and health of diabetics. In this study we evaluated
installation and resolution of inflammation in control and diabetic rats submitted
to a session of exhaustive exercise. Blood samples were taken from diabetic
and control rats before, immediately after, two hours after and twenty and four
hours after a session of exhaustive exercise. TNF-, IL-1, IL-6, IL-10 VEGF-
were measured by ELISA. The glucose was measuremed by the enzymatic
spectrophotometric method. Macrophages death (necrosis and apoptosis) were
assessed by using a flow cytometry. It was observed that, in control group,
exhaustive exercise diminished serum glucose in a time dependent manner
(r=0.97). The diabetic group remained in hyperglycemia, presented a light
glycemia increasing immediately after the exhaustive exercise followed by fall
after two hours of exhaustion (p< 0.05). Our results indicate that 24 hours after
the exhaustion, diabetic rats still continue with increase in the concentration of
IL-1 and TNF- (r=0.9 p< 0.05) in a time dependent manner, while control
return the serum levels of these mediators. The control group presented a peak
production of IL-6 two hours after exhaustion (p = 0.049). Changes in IL-6
concentrations were not observed in diabetic group. Also differences were
found for statistics in relation to the concentration of IL-10 of control group with
increase to keep of evaluated. The physical exhaustion increased the proportion
of diabetic macrophages in necrosis (r=0.9) (loss of plasma membrane integrity)
in a time dependent manner. We concluded that untrained diabetic rats had
induced injury twenty four hours after the exhaustive exercise, while control
return the serum levels of lesion and inflammation and cellular necrosis ratio at
basal condition.
Key Words: Diabetes, Strenuous exercise, Macrophages, Inflammation and
citokines.








SUMRIO
1 REVISO DA LITERATURA ...... ................................................................. 10
1.1 Diabetes................................ .....................................................................10
1.2 Sistema Imunolgico e Inflamao ...... .................................................... 12
1.3 Citocinas ........................................... .... ................................................... 16
1.4 Exerccio Fsico e Sistema Imune ........ ..................................................... 23
1.5 Leses Musculares e Controle Glicmico ................................................. 26
2 JUSTIFICATIVA DO TRABALHO ................................................................ 29
3 OBJETIVO GERAL ....................................... ............................................... 31
3.1 Objetivos Especficos ................................ ................................................ 31
4 MATERIAIS E MTODOS ........................... ................................................ 32
4.1 Reagentes ................................................. ............................................... 32
4.2 Estudos in Vivo .......................................... .............................................. 32
4.2.1 Procedimentos com animais .................... .............................................. 32
4.2.2 Induo do diabetes mellitus ...................... ........................................... 33
4.2.3 Protocolo de treinamento ......................... .............................................. 33
4.2.4 Coleta de Plasma ..................................... .... ........................................ 34
4.2.5 Determinao de glicose no plasma (ELISA) ................. ....................... 34
4.2.5 Determinao de citocinas no plasma (ELISA) ............. ........................ 35
4.2.6 Coleta de Macrfagos ............................................... ............................ 35
4.2.7 Anlise para Determinao do Tipo de Morte Celular ... ........................ 36
4.2.8 Ensaios de Viabilidade Celular .................................. ............................ 36
4.2.9 Ensaios de Fragmentao do DNA ......................... .............................. 36
5 ANLISE ESTATSTICA ...................................... ....... ................................ 38
6 RESULTADOS ............................................................ ................................ 39
6.1 Glicemia ................................................................... ................................. 39
6.2 Morte Celular por Necrose ....................................... ................................. 41
6.3 Morte Celular por Apoptose ..................................... ................................. 42
6.4 Concentrao plasmtica de IL-1 ........................... ................................ 43
6.5 Concentrao plasmtica de TNF- ........................ ................................. 44
6.6 Concentrao plasmtica de IL-6 ............................. ................................ 45


6.7 Concentrao plasmtica de IL-10 .............................. ............................. 47
6.8 Concentrao plasmtica de VEGF-/ .................................................... 47
7 DISCUSSO ................................................................................................. 49
CONCLUSO .................................................................................................. 54
REFERENCIAS ............................................................................................... 55
ANEXO A ....................................................................... ................................ 65
ANEXO B ................................................................................. ....................... 65
APNDICE A ................................................................................................... 68





























10
1 REVISO DA LITERATURA


1.1 Diabetes

O diabetes uma sndrome caracterizada por distrbio no metabolismo
de carboidratos, resultando em hiperglicemia. A doena classificada em
diversos tipos abrangendo duas grandes classes, as primrias e as
secundrias. As primrias so classificadas como Tipo 1 e Tipo 2 e esto
correlacionadas ausncia e/ou diminuio de secreo de insulina e/ou
resistncia ao da mesma. Os casos de diabetes secundrios ocorrem
em decorrncia de outras condies ou patologias associadas ao paciente
como, por exemplo: gravidez (Diabetes Gestacional), disturbios na secreo
do hormnio antidiurtico (Diabetes Insipidus) pancreatite crnica, tumores
de origem hormonal, hemocromacitose e utilizao de drogas e
medicamentos hiperglicemiantes (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION,
2007).
Segundo o National Institutes of Health (INH) quando as clulas -
pancreticas no secretam insulina tem-se o diabetes mellitus insulino
dependente, tambm conhecido como diabetes mellitus Tipo 1 ou mellitus
juvenil. Nesse tipo de diabetes, o individuo desenvolve auto-anticorpos
contra as prprias clulas pancreticas. O diabetes mellitus Tipo 2
caracterizado por disfuno na sinalizao da insulina e ou pela resistncia
dos tecidos mesma, estando normalmente associado ao estilo de vida
sedentrio, hbitos alimentares e obesidade (ADA, 2008).
Segundo a organizao mundial de sade no ano de 2000 existiam
cerca de 171 milhes de pessoas com diabetes no mundo e a estimativa
para o ano de 2030 de 366 milhes de pessoas com diabetes (WHO,
2006). O aumento da prevalncia do diabetes, principalmente do Tipo 2,
est associado a crescente alta na incidncia de obesidade. Atualmente
sabe-se que mediadores inflamatrios liberados pelo tecido adiposo



11

(adipocinas) resultam na resistncia insulina (DE CARVALHO; COLAO;
FORTES, 2006).
De uma forma geral, a inatividade fsica pode colaborar para o
desenvolvimento da obesidade. Essa por sua vez, contribui para o
desenvolvimento de um quadro inflamatrio subclnico crnico que, por sua
vez, interfere na ativao completa da via de sinalizao da insulina (efeito
cascata), resultando em resistncia insulnica e colaborando para se
originar o diabetes mellitus do Tipo 2 (MONTANI, et al 2002; DE LUCA;
OLEFSKY, 2008). Nesse sentido, a diminuio nos ndices de obesidade e
conseqentemente da concentrao de mediadores inflamatrios liberados
pelo tecido adiposo tais como TNF., Il-1 e adipocinas, hoje um dos
importantes focos no combate a gnese e progresso do diabetes.
O controle glicmico o maior objetivo no tratamento do diabetes. A
manuteno da glicemia colabora para o controle metablico e
homeosttico (RIDDELL; PERKINS, 2006). A toxicidade da glicose, a
quantidade excessiva de radicais livres e decrscimo nas propriedades
antioxidantes so reportados como causadores das complicaes crnicas
macro e micro vasculares em diabticos como a aterosclerose, catarata,
retinopatia diabtica, neuropatia diabtica, nefropatia entre outras (OTTON;
MENDONA; CURI, 2002).
Atualmente sabe-se que o estresse causado pela hiperglicemia
interfere com a resposta imune, levando pacientes diabticos a um quadro
inflamatrio subclnico crnico. Adicionalmente a presena elevada de
glicose leva a formao de protenas glicadas (AGEs, do ingls Advanced
Glycation End Products) e altera as concentraes de cidos graxos livres
circulantes que ativam clulas do sistema imune e tambm alteram as
funes de outros tipos celulares como clulas endoteliais e fibroblastos
(VAN CROMPHAUT et al., 2009; BROWNLEE, 2005)
(Esquema 1).





12



Esquema 1: Efeitos deletrios da hiperglicemia crnica no aparecimento de
complicaes diabticas em indivduos diabticos (HATANAKA et. al., 2007).


1.2 Sistema Imunolgico e Inflamao
Define-se inflamao como uma reao complexa do tecido conjuntivo
vascularizado, que envolve o plasma, as clulas circulantes (leuccitos,
plaquetas e hemcias) e as clulas do tecido conjuntivo. Didaticamente, a
inflamao dividida em dois padres ou fases: a aguda e a crnica
(ABBAS et al, 2003). A fase aguda apresenta durao relativamente curta,
de minutos a alguns dias, e suas principais caractersticas so a exudao
de lquidos e protenas plasmticas e a emigrao de leuccitos,
predominantemente, neutrfilos e moncitos. A inflamao crnica, por
outro lado, tem durao maior e associa-se com a presena de linfcitos e
macrfagos e com a proliferao dos vasos sanguneos e do tecido
conjuntivo (ABBAS et al, 2003). Tanto na inflamao aguda, como na
crnica existe uma fina regulao orquestrada que envolve diferentes tipos
celulares (neutrfilos, moncitos/macrfagos, clulas endoteliais) e
mediadores solveis (citocinas, quimiocinas, protenas de fase aguda,





13

sistema complemento) que fazem parte de um complexo sistema
denominado de sistema imune.
Os componentes do sistema imune inato e adaptativo so classificados
em celulares e humorais. A parte humoral composta por citocinas e
anticorpos e a celular composta por clulas que atuam na regulao da
resposta imune como linfcitos, macrfagos, neutrfilos entre outros (PARK;
BARBUL, 2004) (Esquema 2).


Esquema 2: Diviso e Componentes do Sistema Imune Inato e Adaptativo. A resposta
imune dividida didaticamente em inata (ou natural) e adaptativa (ou adquirida). A
resposta imune inata compreende os eventos que fazem parte da primeira linha de
defesa do organismo contra microorganismos invasores e composta por
compontentes clulares como, por exemplo, neutrfilos e moncitos/macrfagos,
compontentes humorais como, por exemplo, protenas do sistema complemento (C3
e C4) e clulas das paredes epiteliais de revestimento entre outras estruturas. A
resposta imune adaptativa ou adquirida uma resposta mais dirigida e especfica do
organismo ao microorganismo invasor, compreendendo uma intrincada rede de
sinais e respostas coordenadas por linfcitos T (CD4+, CD8+, reguladores), citocinas
entre outros (HATNANAKA, PHITON-CURI, 2010 in press).

Neutrfilos so clulas que fazem parte da resposta imune inata e tm
potente capacidade de fagocitar e matar microorganismos invasores.


14

Na inflamao aguda, o nmero de neutrfilos no sangue perifrico e
no foco inflamatrio aumenta rapidamente, isto ocorre devido ao aumento
na hematopoese e alto potencial de diapedese dos neutrfilos que resulta
na migrao dessas clulas para o foco inflamatrio (PARK; BARBUL,
2004). Os eventos que iniciam a resposta inflamatria so caracterizados
pelo reconhecimento do stio de injria por clulas inflamatrias e o
recrutamento especfico de leuccitos ao tecido lesionado. A regulao
molecular deste complexo sistema fisiolgico envolve a interao entre
clulas da superfcie, da matriz extracelular e mediadores solveis como as
citocinas e quimiocinas (citocinas com capacidade quimioatraente).
Assim como os neutrfilos, os moncitos provenientes do sangue
migram para o stio de inflamao e diferenciam-se em macrfagos. Os
macrfagos migram para o foco inflamatrio cerca de 48 a 96 horas aps
ter-se desencadeado a leso inicial. Essas clulas so essenciais para o
reparo tecidual, desempenhando funes importantes na imunidade inata e
adaptativa (ABBAS, 2003).
Os microorganismos invasores so reconhecidos por receptores de
superfcie de macrfagos que reconhecem estruturas conservadas do
invasor, permitindo que este seja englobado e fagocitado (KOHUT et al,
2004). Assim que o patgeno fagocitado, os macrfagos ativam uma
diversidade de mecanismos para destru-lo. Os lisossomos e outros
grnulos citoplasmticos, em contato com o fagossomo, liberam lisozimas e
hidrolases cidas capazes de degradar as protenas e a parede celular da
bactria. Alm disso, os fagcitos quando ativados, disparam a cascata de
aes do complexo NADPH oxidase, que catalisa a produo de espcies
reativas de oxignio (ROS, do ingls Reactive Oxygen Species), como o
nion superxido, radical hidroxila, perxido de hidrognio (H2O2), entre
outros (KOHUT et al, 2004).
Os macrfagos so fagcitos clssicos e so importantes como clulas
apresentadoras de antgenos (APC). Aps a fagocitose, o interferon gama
(INF-), citocina produzida por linfcitos da classe T helper (Linfocitos T



15

axiliares), estimula a fuso dos lisossomos com o fagossomo para que haja
a digesto intracelular. Aps a digesto do microorganismo, os eptopos do
microorganismo so levados at a superfcie do macrfago e apresentado
ao linfcito T e/ou ao linfcito B. Essa apresentao. do antgeno ir
estimular todo o sistema imune do organismo e "convocar" as clulas para o
ataque ao microorganismo invasor.
No stio inflamatrio, quando uma clula sobrecarregada por
estmulos diversos (como excessiva produo citocinas, ROS e proteases) a
mesma pode ser danificada, fato que pode resultar na morte celular. Essa
pode ocorrer de forma agressiva como por rompimento de membrana
(morte por necrose celular) e assim, causando inflamao local ou ainda de
forma controlada e sem grandes danos para os tecidos vizinhos, como a
morte por apoptose, onde a mesma no causa danos aos tecidos
adjacentes (BONINI; MOURA; FRANCO, 2000).
A apoptose, morte celular programada, leva a degradao limpa da
clula e sua eliminao do organismo. Quando a apoptose desencadeada
ocorre uma srie de reaes em cadeia que no danificam o tecido. A
apoptose identificada morfologicamente atravs de alterao da
membrana celular (estrangulamento de vesculas, chamados de corpos
apoptticos.), diminuio do ncleo celular, condensao da cromatina e
fragmentao do DNA.
Os macrfagos e outras clulas fagocitrias reconhecem a clula
apopttica e as eliminam atravs de fagocitose, sem que ocorram sinais de
inflamao (KOHUT et al, 2004).
A injria leve pode estimular a clula a morrer por apoptose, porem
quando ocorre ao inflamatria (local ou sistmica) intensa as clulas
podem morrer por necrose (MARGARET et al, 1997; SAVILL, 1997;
HARRISON, 1988; SACHS; LOTEN, 1993).
Na necrose ocorre degradao tecidual em srie, danificando a clula
que sofreu necrose e as clulas ou tecidos vizinhos. Os estmulos que
causam a necrose (morte celular acidental.) so diretamente relacionados



16

exposio intensa e nociva da clula a estmulos como: ROS, proteases,
calor, radiao, toxinas e amnia. Tais estmulos nocivos clula
desencadeiam uma resposta inflamatria causada pelo extravasamento do
contedo intracelular (ALLEN; BUSTIN; NEWLAND, 1993). A lise de
membranas celulares gera uma quantidade excessiva de debris celulares
que necessitam ser removidos por fagcitos. A mensurao de morte celular
pode ser feita por diferentes tcnicas, entre elas pode-se citar a citometria
de fluxo que utilizando caractersticas celulares, como perda da integridade
de membrana (para verificar se est ocorrendo morte por necrose),
fragmentao do DNA (caracterstica da morte por apoptose) ou expresso
diferenciada de receptores ou protenas envolvidas nos eventos de morte
pode-se mensurar o tipo e porcentagem de morte (BERGAMASHI et al,
1994).









17

1.3 Citocinas
As citocinas fazem parte de uma classe de mediadores proticos
capazes de induzir inmeras respostas biolgicas. As citocinas representam
transmissores solveis essenciais de comunicao clula a clula. Alm de
coordenarem a resposta imune, tm papel essencial na transmisso de
sinais para proliferao, diferenciao e funo de vrias clulas alvo,
produzindo efeitos biolgicos quando ligadas a receptores especficos de
alta afinidade.
Diversas clulas/tecidos, sob estmulos apropriados, podem produzir
citocinas como: clulas do tecido adiposo (adipocinas), clulas do tecido
muscular (miocinas), clulas mononucleares (monocinas), entre outras.
Nesse sentido, as citocinas so classificadas segundo vrios critrios como
estrutura qumica, local de produo (monocinas, linfocinas, adipocinas,
miocinas), atividade biolgica (quimiocinas, fatores de crescimento,
atividade pr ou anti-inflamatria) (SMITH, 2000).
As citocinas podem apresentar efeitos sistmicos, autcrinos e
parcrinos. A secreo de citocinas um evento rpido e autolimitado.
Essas protenas no so usualmente armazenadas como molculas pr-
formadas e sua sntese normalmente iniciada pela transcrio gnica
como resultado de ativao celular.
A maioria das clulas apresentam um pequeno nmero de receptores
para citocinas, entretanto somente uma porcentagem deles precisa estar
ocupado para produzir uma resposta biolgica mxima. Portanto, mesmo
baixos nveis de citocinas podem induzir efeitos biolgicos in vivo (ABBAS
et al, 2003).
A concentrao de citocinas pro-inflamatrias dependente da
ativao de fatores de transcrio tal como o fator nuclear kB (NF-kB). NF-
kB um complexo multiproteco que pode ativar uma grande variedade de
genes envolvidos em reaes de defesa primria de organismos superiores.
Sua principal funo induzir rpida e coordenadamente os genes pr-



18


inflamatrios em resposta a estmulos patognicos externos. Em clulas
no estimuladas, NF-kB encontra-se no citoplasma em um complexo inativo
pela ligao a uma subunidade inibitria chamada IkB. Estmulos
patognicos provocam a liberao de IkB e a consequente entrada do NF-
kB no ncleo, induzindo assim, a sntese de mRNA para citocinas pro-
inflamatrias (DRATH; KARNOVSKY, 1975; BAEUERLE; HENKEL, 1994).
A ativao de NF-kB aumentada por uma grande variedade de
agentes, incluindo as citocinas IL-1 e TNF, vrus, LPS, steres de forbol, luz
UV e radiaes ionizantes. Baixas concentraes de H
2
O
2
ativam NF-kB e
vrios antioxidantes testados no somente suprimem a ativao de NF-kB
por H
2
O
2
, mas tambm por todos os outros indutores at ento testados
(PAHL; BAEUERIE, 1997).
A ativao de NF-kB aumenta significantemente quando ocorre
aumento na liberao de citocinas inflamatrias. NF-kB est envolvido na
liberao de citocinas por diferentes tipos celulares como neutrfilos,
linfcitos e macrfagos. Em macrfagos NF-kB, esta envolvido na
expresso das citocinas pro-inflamatrias como o TNF-, IL-1 e IL-6
(McDONALD; BALD; CASSATELA, 1997).
Dentre as diversas citocinas existentes apresentamos abaixo em uma
breve descrio das citocinas importantes para esse trabalho: TNF-, IL-1
e IL-6, VEGF-/ e IL-10 (ABBAS, et al, 2003).
O TNF- o principal mediador da resposta imune imediata a vrus e
bactrias, sendo tambm um dos principais responsveis pelas
complicaes sistmicas que ocorrem em infees severas. TNF-
secretado por moncitos e por macrfagos ativados, e por muitas outras
clulas incluindo neutrfilos, linfcitos e fibroblastos.
A principal funo fisiolgica do TNF- estimular o recrutamento de
leuccitos para o foco inflamatrio e ativar essas clulas a erradicar
micrbios. TNF- exerce seus efeitos por diferentes aes nas endoteliais e
leuccitos, entre elas pode-se citar a induo da expresso de molculas de



19

adeso (integrinas e selectinas). Nos hepatcitos, TNF- age aumentando a
sntese de protenas sricas como a PCR e o fibrinognio. A combinao
destas protenas hepticas induzidas por TNF- , IL-1 e IL-6, quem
constituem a resposta de fase aguda a um estmulo inflamatrio (ABBAS, et
al, 2003).
Embora existam muitas semelhanas entre TNF - e a IL-1 , esta no
ativa diretamente os leuccitos, mas faz com que as clulas endoteliais
sintetizem quimiocinas que ativam os leuccitos. IL-1 tambm no causa
dano tecidual, nem induz a apoptose, podendo apenas potencializar os
danos causados por TNF- .
Mesmo em concentraes sistmicas altas IL-1 no letal (ABBAS,
et al, 2003). Os efeitos biolgicos de IL-1 so semelhantes ao de TNF-
dependem da quantidade de citocina liberada. Em baixas concentraes IL-
1 , atua como mediador local da inflamao, atuando sobre fagcitos
mononucleares e endotlio vascular, aumentando ainda mais a sntese de
IL-1 e induzindo a sntese de IL-6. IL-1 atua sobre clulas endoteliais
aumentando a expresso de molculas de superfcie que medeiam
adeso leucocitria. Quando secretada em quantidades maiores, IL-1
entra na corrente sangunea e exerce efeitos endcrinos. IL-1 sistmica
compartilha com o TNF- febre, induzir a sntese de
protenas de fase aguda e iniciar a caquexia (ABBAS, et al, 2003).
A IL-6 uma citocina com propriedade pro e antiinflamatria.
Considera-se a IL-6 como pro-inflamatria quando essa se encontra
associada ao aumento de TNF- , IL-1 ou protenas de fase aguda como a
PCR (protena C reativa) e/ou a SAA (Amilide Srica A). Nesses casos,
assim como o TNF- e IL-1 , a IL-6 tambm esta relacionada
inflamao, resistncia a insulina e controle do metabolismo. A IL-6, como
citocina pro-inflamatria ativa a expresso de protenas de fase aguda.
Em indivduos saudveis a concentrao plasmtica de IL-6 de
pg/mL, porem durante a spsis pode elevar-se agudamente em at 1000
vezes (FRIENLAND, et al., 1992). Neste processo a IL-6 muito importante,



20

pois contribui na ativao dos mecanismos de defesa do organismo (AKIRA;
TAGA; KISHIMOTO, 1993). IL-6 tambm atua na contrarregulao da
hematopoiese (FEBBRAIO; PEDERSEN, 2002).



O efeito antiinflamatrio da IL-6 esta associado prtica de exerccio
fsico de moderada intensidade e sem leso muscular inflamatria. Nesses
casos, a liberao de IL-6 pelas fibras musculares ocorre por mecanismo
independente da produo de TNF-. A contrao muscular, independente
de leso, aumenta a concentrao de IL-6, tanto no tecido muscular como
no fluido intersticial. A IL-6 liberada pelas clulas musculares estimula o
aparecimento na circulao de citocinas antiinflamatrias como o receptor
antagonista de IL-1 (IL-1ra), interleucina- 10 (IL-10) e dos receptores para
TNF (sTNF-r1 e sTNF-r2). IL-10 que inibe a liberao de TNF- e IL-1
induz a produo de IL-1ra. Ou seja, no exerccio fsico, na ausncia de
leso muscular, ocorre aumento na concentrao de IL-6 que desencadeia
a liberao de marcadores antiinflamatrios (PEDERSEN, 2000).





21

A IL-10 um fator antiinflamatrio que entre outras funes inibe
macrfagos, e conseqentemente produz efeitos inibidores nas clulas T e
natural killer. Ela tambm regula o crescimento e/ou diferenciao das
clulas B, granulcitos, clulas dendriticas, queratincitos e clulas
endoteliais. Adicionalmente, IL-10 aumenta a sobrevivncia das clulas B,
proliferao e produo de anticorpos (FIORENTINO et al, 1991; DOKKA et
al, 2001).
Acredita-se que o efeito antiinflamatrio da IL-10 ocorra atravs da
inibio do NF-kB, por mecanismo ainda no totalmente compreendido (DE
VRIES, 1995), porm ainda no existe um consenso cientifico: enquanto
alguns pesquisadores afirmam que a IL-10 inibe o NF-kB, outros grupos
afirmam completamente o oposto. Sendo que o NF-kB ativa a via de
transcrio das defesas primrias e por fim ativando as citocinas envolvidas
nesse processo de defesa primria (DOKTER; KOOPMANS; VELLENGA,
1996).
Alm das citocinas pro e antiinflamatrias citadas acima, na inflamao,
no diabetes, cncer entre outras doenas, destacam-se outra classe de
citocinas com atividade de fator de crescimento. Esses estimulam a
proliferao celular mediante a regulao do ciclo celular. Adicionalmente
atua na manuteno da sobrevivncia celular, estimulando a migrao, a
diferenciao e tambm a apoptose em diversos tipos celulares. O sucesso
do sistema vascular mantido pela angiognese que o crescimento de
novos vasos a partir de vasos sanguneos j existentes (DE FREITAS et al,
2009).
O VEGF (Fator de crescimento Vasculo-Endotelial) um potente fator
de crescimento responsvel pelo aumento da permeabilidade vascular e
angiognese. O VEGF um dmero protico que atua na sinalizao
autcrina e parcrina ativando receptores transmembranares (DE FREITAS
et al, 2009). O crescimento anormal de novos vasos colabora para
desencadear doenas como tumores e a retinopatia diabtica. A retinopatia
diabtica um processo de micro hemorragia retiniana que ocorre pelo



22

rompimento de vasos endoteliais na retina. O diabetes compromete a
funo vascular da retina e pode ocasionar crescimento anmalo dos vasos
numa fase mais avanada da doena, principalmente devido liberao
no controlada de VEGF (DE FREITAS et al, 2009).
A melhora do controle glicmico contribui para a reduo significante na
concentrao plasmtica de VEGF em diabticos. VEGF desempenha uma
funo importante na neovascularizao intraocular em pacientes diabticos
com doenas da retina (AIELLO et al, 1994).
Diversas doenas crnicas como arteriosclerose, obesidade,
dislipidemia, tabagismo, sndrome metablica e diabetes mellitus Tipo 2
apresentam um status inflamatrio sub-clinico crnico (BRUUNSGAARD et
al, 1999; RIDKER et al, 2000; DE LEMOS et al, 2007; KRIKETOS et al,
2004). Diabticos apresentam disfuno significativa no sistema imune
envolvendo alteraes nas concentraes sricas de citocinas, disfunes
leucocitrias e problemas na cicatrizao (HATANAKA et al, 2006).
Adicionalmente, indivduos com diabetes tipo 2 apresentam um quadro
de inflamao crnica caracterizado pelo aumento das concentraes de
citocinas proinflamatrias (TNF-, IL-6, IL-8) e protenas de fase aguda (DE
LEMOS et al, 2007; OBERBACH et al, 2006; HATANAKA et al, 2006).
Sabe-se que a inflamao local ou sistmica alm de contribuir de
forma significante para a resistncia a insulina contribuindo para o
desenvolvimento das complicaes crnicas associadas ao diabetes (KING,
2008; DE LEMOS et al, 2007; CUNHA; RIBEIRO; OLIVEIRA, 2006).
A insulina, nas clulas liga-se ao seu receptor transmembranar do tipo
tirosina quinase, desencadeando uma cascata de sinalizao intracelular.
Esta sinalizao inicia-se com uma alterao da estrutura do receptor que
ir fosforilar os resduos de tirosina encontrados nos dominios intracelulares
do receptor. Os receptores ativados fosforilaram o substrato IRS-1 (do
ingls Insulin Receptor Substrate-1, substrato do receptor de insulina 1) que
resultar na ativao da PI-3K e de outros substratos intracelulares e ter




23

como resultado final a translocao de transportadores de glicose (GLUT)
para a membrana plasmtica (IVY, 2000).
Os mediadores inflamatrios (TNF-, IL-6 e IL-1) colaboram para inibir
a eficincia da sinalizao insulnica. Reduzindo a atividade da tirosina-
quinase por fosforilar resduos de serina do IRS-1 (CARVALHO; COLAO,
2006). Adicionalmente, as complicaes diabticas como aterosclerose,
catarata, retinopatia, nefropatia e neuropatia esto diretamente relacionadas
a um estado inflamatrio permanente encontrado em diabticos que
propiciam o dano tecidual. A neuropatia perifrica, por exemplo,
caracterizada pela diminuio da conduo do impulso nervoso,
degenerao axonal e regenerao prejudicada. Citocinas neuropoiticas
como IL-1, IL-6 e TNF- exibem efeito pleiotopico na homeostase da glia e
no sistema nervoso central, perifrico e autnomo que exercem uma funo
importante na regenerao e degenerao do nervo. A desregulao nos
nveis locais com o aumento da produo de citocinas inflamatrias
influncia na progresso da doena (KRIKETOS et al, 2008).
Hoje se sabe que o exerccio fsico regular de baixa e mdia
intensidade e praticado com frequncia pode reduzir ou retardar o
aparecimento de complicaes diabticas, sendo esse efeito, em partes,
atribudo a capacidade reguladora da atividade fsica sobre o sistema imune
(BELOTTO et. al, 2010).

1.4 Exerccio Fsico e Sistema Imune
Segundo Capersen, (1985) o exerccio fsico compreende toda
atividade estruturada e planejada que visa melhorar um ou mais
componentes da aptido fsica e que resulta no gasto energtico superior ao
basal. O exerccio pode causar estresse (metablico ou mecnico)
resultando em alteraes para o organismo (COYLE, 2000; PEDERSEN;
HOFFMAN-GOETZ, 2000). A atividade fsica um potente modulador do
sistema imunolgico (GOKHALE; CHANDRASHEKARA


24

VASANTHAKUMAR, 2007). A resposta imunolgica frente ao exerccio
depende de fatores como: (a) a intensidade do esforo (leve, moderada ou
intensa); (b) durao (minutos, horas ou dias); (c) tipo do exerccio (aerbio,
anaerbio), (d) variaes nas concentraes hormonais; (e) variaes nas
concentraes de citocinas pr e anti-inflamatrias, (f) mudanas na
temperatura; (g) mudanas no fluxo sanguneo; (h) hidratao entre outros
(PEDERSEN; PEDERSEN, 2005).
A prtica de exerccio fsico de moderada intensidade oferece proteo
aoorganismo principalmente por reduzir a inflamao sistmica, melhorar a
funo celular e humoral dos componentes do sistema imune. Em
indivduos saudveis, o exerccio fsico contribui para o aumento da
liberao de citocinas anti-inflamatrias como: IL-10; sTNF-R; IL-1ra; e IL-6
(PEDERSEN; PEDERSEN, 2005).
Recentemente, nosso grupo demonstrou que o exerccio aerbio de
baixa intensidade e praticado regularmente diminui a inflamao sistmica
crnica no diabetes e melhora algumas das funes leucocitrias. Sendo
investigado o efeito de trs semanas de treinamento em esteira ergomtrica
(60% do VO 2Max , 30 min/dia, 6 dias/ semana sobre as concentraes
sricas de citocinas inflamatrias e de PCR. O exerccio fsico moderado
melhorou a resposta imune dos ratos diabticos quando comparado com
ratos diabticos no exercitados no experimento, pois o grupo DM
exercitado apresentou reduo significante na concentrao de citocinas
inflamatrias e que o protocolo de treinamento utilizado no causou leso
no tecido muscular (BELOTTO, 2010). Tambm foi observado nesse
trabalho que o exerccio fsico de moderada intensidade pode modular a
funo de leuccitos (neutrfilos e macrfagos) diminuindo a produo
basal de espcies reativas de oxignio por essas clulas (BELOTTO, 2010).
Porm, se sabe que o exerccio fsico extenuante promove
imunossupresso, aumentando a possibilidade de infeces, notadamente
das vias areas superiores (PEDERSEN; PEDERSEN, 2005).
Adicionalmente, no diabetes, deve-se considerar a possibilidade da



25
leso/inflamao resultante do exerccio ser um fator hiperglicemiante. No
desporto o desenvolvimento de um programa de treinamento fsico tem
como objetivo maximizar o desempenho fsico (performance) (AMERICAN
COLLEGE OF SPORTS MEDICINE, 2000; BOMPA, 2002). Contudo, caso
no ocorra uma periodizao do treinamento fsico adequada, o seu
praticante pode desenvolver o fenmeno denominado overtraining
(sobretreino). O overtraining definido como um distrbio neuroendcrino,
que ocorre no eixo hipotlamo-hipfise, resultado do desequilbrio entre a
demanda do exerccio fsico e a capacidade de resposta do organismo. No
overtraining, as citocinas inflamatrias, enzimas intracelulares, (marcadoras
de leso celular) e alguns hormnios como cortisol e catecolaminas tem sua
concentrao aumentada (CUNHA; RIBEIRO; OLIVEIRA, 2006).
O exerccio fsico pode alterar as concentraes de diversos hormnios
entre eles endorfinas, cortisol, adrenalina, noradrenalina. De uma forma
geral os hormnios alteram o nmero e funo das clulas do sistema
imune e vice versa, ou seja, a presena de mediadores do sistema imune
afeta a liberao de hormnios e tanto a presena de hormnios
hiperglicemiantes quanto de mediadores inflamatrios, no diabetes podem
acarretar no descontrole glicmico.
O sistema imunolgico e o sistema neuroendcrino apresentam um
repertrio comum de mediadores qumicos. Citocinas como IL-1, TNF-, IL-
6, IL-2 e INF afetam a liberao de hormnios atravs da ao sobre o eixo
hipotlamohipfise. Em contrapartida, os hormnios liberados pelas
glndulas deste mesmo eixo atuam sobre o nmero de clulas do sistema
imune circulantes e a funo das mesmas (HADDAD; SAADE;
GARABEDIAN, 2002). Por exemplo, as concentraes sricas de cortisol
aumentam durante o exerccio proporcionalmente com a intensidade do
esforo, principalmente nas modalidades realizadas em intensidade superior
a 75 % do VO2Mx. O cortisol, a adrenalina e o glucagon apresentam potente
efeito hiperglicemiante e imunossupressor (HADDAD; SAADE;
GARABEDIAN, 2002). No individuo diabtico alteraes nas concentraes


26

de TNF-, IL-1 e IL-6 so particularmente importante, pois todos os
mediadores expressos apresentam funo hiperglicemiante e induzem
resistncia a insulina (ROGERO; MENDES; TIRAPEGUI, 2005; PERASO,
2005). Por exemplo, a IL-6 liberada durante a contrao muscular, por
mecanismo independente de leso inibe a sntese de glicognio heptico e
promove a liberao de glicose. No tecido adiposo, induz a liplise e o
aumento das concentraes de cidos graxos circulantes. No msculo, a IL-
6 estimula oxidao de cidos graxos a captao de glicose e a sntese
de glicognio (HOENE; WEIGERT, 2007). A Figura 1 mostra os possveis
efeitos biolgicos desencadeados pela IL-6.
























27



1.5 Leses Musculares e Controle Glicmico
A leso muscular induz a resposta inflamatria no especifica com
elevao da concentrao de citocinas inflamatrias (GOKHALE;
CHANDRASHEKARA; KASANTHAKUMAR, 2007). Quando ocorre dano
muscular ou excesso de atividade metablica, algumas enzimas
intracelulares so liberadas para o meio extracelular podendo ativar a
cascata de sinalizao do sistema imune e ser quantificadas no plasma. A
determinao da atividade da enzima CK (creatina quinase) um bom
indicador de leso de clulas musculares e da intensidade do exerccio
fsico (LAZARIM, 2007). Elevaes da atividade enzimtica da CK em




28

indivduos saudveis so correlacionadas com o nvel de treinamento fsico,
porm, se estes permanecerem elevados no repouso, pode ser um sinal de
leso muscular. A concentrao de CK apresenta correlao com o nvel de
performance ou treinabilidade de um individuo, desta forma quanto melhor
treinado for o individuo menor ser a atividade enzimtica de CK. Quando
indivduos fisicamente destreinados so submetidos a uma sesso de
exerccio intenso a atividade de CK permanece elevada por cerca de cinco
dias, atingindo um pico cerca de trinta e trs horas ps-exerccio fsico, em
contrapartida indivduos treinados quando submetidos a uma sesso de
exerccio intenso apresentam elevao da atividade de CK cerca de vinte e
quatro horas aps a sesso de exerccio extenuante (PEDERSEN, et
al,1998). Cannon et al. (1986) apresentou uma tima correlao entre a CK
e a atividade plasmtica de IL-1 (BRUUNSGAARD et al., 1997).
As atividade enzimtica total de CK, alm de ser alterada no exerccio
fsico depende da idade, gnero, raa, massa muscular, condicionamento
fsico, orientao do exerccio fsico realizado e condies climticas
(BRAMCACCIO; MAFFULLI, 2008). Por exemplo, as mulheres apresentam
atividade enzimtica de CK diferenciadas em relao aos homens. Aps o
exerccio, o estrognio que um hormnio esteride um fator importante
que mantm a estabilidade de membrana, limitando o extravasamento de
CK do msculo lesionado (BRANCACCIO; MAFFULLI, 2008).
Um dos grandes desafios em relao a pratica de exerccios fsicos
para diabticos a manuteno do controle glicmico. Em diabticos, a
hiperglicemia leva o organismo a alteraes metablicas que resultam num
limiar de fadiga mais expressivo em relao a pessoas que no tm
diabetes (BELLI, et al, 2007). Diabticos apresentam disfunes
metablicas que alteram a resposta ao exerccio influenciando o limiar
ventilatrio e a concentrao de lactato e VO2 max.
Diabticos podem apresentar durante e aps a atividade fsica resposta
hipo ou hiperglicemia. O controle glicmico depende de uma srie de
fatores incluindo: (a) presena ou no de complicaes diabticas; (b)



29

quantidade de hormnios contra-regulatrios liberados durante o exerccio
(adrenalina, cortisol e glucagon); (c) e induo ou no de leses e presena
de mediadores inflamatrios; (d) estado das trocas de gases pulmonares;
(e) do equilbrio cido-bsico sanguneo, (f) da concentrao de lactato,
entre outros.


















30
2 JUSTIFICATIVA DO TRABALHO

O exerccio fsico um potente modulador do metabolismo e do
sistema imune. A atividade fsica regular e moderada melhora a resposta
imune, reduz a inflamao sistmica, a gnese e a progresso de doenas
crnicas, caracterizadas por inflamao sistmica. Recentemente, o nosso
grupo demonstrou que o exerccio fsico moderado apresenta efeitos
antiinflamatrios em ratos diabticos e melhora a funo de leuccitos
podendo ser uma importante ferramenta no farmacolgica para o controle
da gnese e progresso do diabetes (BELOTTO et al, 2010).
No entanto, o exerccio fsico exaustivo pode ser prejudicial sade do
diabtico, devido ao fato de estimular a liberao de hormnios
hiperglicemiantes causar danos oxidativos a protenas e lipdios, aumentar a
concentrao de enzimas citoslicas musculares e de citocinas inflamatrias
o que levaria ao descontrole glicmico. A Associao Americana de
Diabetes, e a Associao Europia para o Estudo de Diabetes recomendam
o exerccio aerbico regular e de resistncia para as pessoas com diabetes,
sem grandes complicaes. No entanto, as orientaes e os protocolos de
treinamento/descanso so extremamente gerais e no fornecem
informaes sobre o tipo mais especfico de exerccio, intensidade ou tempo
de descanso entre treinos visando a melhorar a resposta imune. Na
literatura existem pouqussimos estudos disponveis sobre as palavras
chaves: exerccios, diabetes e leso (Tabela 3). Adicionalmente, pouco se
sabe sobre leses ocasionadas durante diferentes protocolos de
treinamento em diabticos, tempo de recuperao e estratgias de
preveno visando a melhorar a performance e a sade do diabtico.







31


Hoje, existem provas que o sistema imunolgico importante no
controle metablico do diabetes e que a liberao no controlada de
marcadores inflamatrios afeta a gnese e progresso da doena. Sabe-se
tambm que a resposta imunolgica de diabticos frente a um
microorganismos ou leso prejudicada. Assim como a distribuio de
oxignio e a sensibilidade a dor e que juntos esses fatores podem contribuir
para a leso e a recuperao de tecidos lesionados, contribuindo para o
descontrole glicmico, progresso de complicaes diabticas e diminuio
da performance. Neste sentido, acreditamos na importncia da realizao
de estudos que forneam informaes sobre a instalao e evoluo do
processo inflamatrio durante e aps a pratica de exerccios fsicos. Com
esses dados, pretende-se no futuro definir protocolos de
treinamento/descanso para diabticos praticantes de exerccio e ou atletas
que se baseiem em parmetros imunolgicos.

















32

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral desse estudo foi avaliar a instalao e evoluo do
estado inflamatrio em ratos diabticos submetidos a uma sesso de
exerccio extenuante.

3.1 Objetivos Especficos
1.Acompanhar nos grupos diabtico e controle e nos tempos zero (sem
exerccio); imediatamente aps a sesso de exerccio extenuante; duas
horas aps e vinte e quatro horas aps a sesso de exerccio extenuante o
comportamento dos seguintes marcadores:
2. Concentrao srica de glicose;
3. Concentrao srica das citocinas pro-inflamatrias TNF-, IL1- e IL-6;
4. Concentrao srica da citocina antiinflamatria, IL-10;
5. Concentrao srica do fator de crescimento VEGF /;
6. Ocorrncia da morte de macrfagos por necrose (visualizao da
integridade de membrana);
7. Ocorrncia da morte de macrfagos por apoptose (visualizao da
fragmentao do DNA).








33
4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 Reagentes
Os reagentes bicarbonato de sdio, cloreto de sdio, fosfato de sdio
dibsico, fosfato de potssio monobsico, cloreto de potssio, foram obtidos
da empresa Merk (Darmstadt Hessen, Alemanha). Iodeto de propdio foi
adquirido da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Os kits Duo Set para
determinao das citocinas de ratos foram adquiridos da R&D Systems
(Minneapolis, MN, USA). O kit para determinao de glicose monoreagente
foi adquirido da Bioclin (Bioclin Diagnostics, So Paulo, Brasil).

4.2 Estudos in Vivo
4.2.1 Procedimentos com animais
Participaram do estudo 60 ratos Wistar, com 60 dias de idade, pesando
180 20g, provenientes do Biotrio Central do Instituto de Cincias
Biomdicas I (ICB-I) da Universidade de So Paulo (USP). Os animais
foram mantidos em gaiolas sob temperatura de 23 2C, com rao e gua
a vontade. Os animais foram separados aleatoriamente em grupos diabtico
e controle: Cada grupo foi subdividido, o grupo diabtico foi subdividido em
diabtico sem exerccio (n = 8); diabtico imediatamente aps a exausto (n
= 7); diabtico duas horas aps a exausto (n = 8) e diabtico vinte e quatro
horas aps a exausto (n = 7). O grupo controle foi subdivido em: controle
sem exerccio (n = 8); controle imediatamente aps a exausto (n = 7);
controle duas horas aps a exausto (n = 8) e controle vinte e quatro horas
aps a exausto (n = 7). Esse estudo teve consentimento do Comit de
tica para Anlise de Projetos de Pesquisa da Universidade Cruzeiro do




34
Sul, protocolo registrado sob n 017/2009, para uso de animais em
experimentao (Anexo A).

4.2.2 Induo do diabetes mellitus
Para a induo do diabetes, foi administrado nos animais
estreptozotocina, intraperitonealmente (65mg/Kg de peso) em tampo
citrato, pH 4,5. Esta soluo, nessa dose aplicada causa a destruio de
aproximadamente 70% das clulas pancreticas, que so as clulas
produtoras de insulina. Para confirmao do diabetes, foi analisada a
glicemia no 3 dia aps administrao de estreptozotocina. Os animais com
glicemia igual ou superior a 250mg/dL foram considerados diabticos. A
glicemia foi determinada em sangue coletado na veia caudal atravs de kit
comercial (Boehringer Mannhein, Eli Lilly do Brasil, SP, Brasil).

4.2.3 Protocolo de treinamento
No 7 dia aps a induo do diabetes, os animais foram adaptados em
ciclo invertido com 3 sesses em dias diferentes na esteira ergomtrica
programvel 12 minutos cada sesso de treinamento com intensidade
moderada entre 50% 60% do consumo mximo de oxignio. Com
velocidade de 0.03 km/h e com inclinao de 5%. A esteira utilizada (10400
. Inbramed ) apresenta capacidade para 10 animais divididos em 10 raias
individuais de ao inox, providas de orifcios para ventilao e cobertas
individualmente por tampas mveis de acrlico transparente. No primeiro dia
de exerccio fsico na fase de adaptao esteira ergomtrica os animais
foram selecionados aleatoriamente para compor os respectivos subgrupos.
Os animais que foram exercitados realizaram as sesses da fase adaptativa
a cada 24 horas totalizando 3 sesses em 3 dias respectivamente. No
quarto dia os animais permaneceram em repouso por 48 horas e sendo no
6 dia realizado a sesso de exerccio fsico extenuante na esteira
ergomtrica. Sendo determinado o total de 10 estgios que compreendiam


35
um aumento gradual de velocidade de 0.03 km/h a cada 3 minutos. O
protocolo foi iniciando com 0.03 km/h e com 20% de inclinao. O protocolo
de exerccio fsico intenso utilizado foi adaptado de Leandro et al, (2007). A
exausto foi determinada no momento em que o rato no apresentava
condies de executar passos coordenados na esteira.
Tabela 4: Protocolo de exerccio fsico extenuante com indicao dos
estgios, de esforo fsico, velocidade da esteira e tempo de durao do
estgio.



Aps a exausto, os ratos foram sacrificados por meio de
decapitao. Nesse momento foi realizada a coleta de sangue total e de
macrfagos do peritnio.

4.2.4 Coleta de Plasma
As amostras de sangue total foram obtidas em tubos heparinizados. O




36
plasma foi separado por meio da centrifugao a 400 x g durante 10
minutos a 25 C. Aps a separao, as amostras foram congeladas a 70 C
para posterior determinao de citocinas e glicose.

4.2.5 Determinao de glicose no plasma (ELISA)
O procedimento adotado para determinao de glicose foi o descrito
nas instrues fornecidas pelo fabricante do kit para glicose monoreagente
da Bioclin (Bioclin Diagnostics, So Paulo, Brasil). O kit continha os
reagentes: enzimtico 1 contendo tampo (pH 7,0) 100 mmol/L, Fenol 2
mmol/L, 4- Aminoantipirina 0,3 mmol/L, Azida sdica 8 mmol/L, Glicose
Oxidase > 10.000 U/L, Peroxidase > 700 U/L. E reagente 2 que contem
Glicose 100 mg/dL (5, 6 mmol/L) cido benzico 20,5 mmol/L. A
metodologia utilizada foi a enzimtica colorimtrica e a leitura efetuada em
espectrofotmetro.

4.2.5 Determinao de citocinas no plasma (ELISA)
Citocinas foram mensuradas por imunoensaio quantitativo atravs de
kits DuoSet da R&D Sysrem (Minneapolis, MN, USA). O principio bsico do
teste consiste na imobilizao de um dos reagentes numa fase slida,
enquanto outro reagente pode ligar-se a uma enzima, preservando tanto a
atividade enzimtica como a imunolgica do antgeno. Em nosso
experimento, fase slida, ou seja, o anticorpo de captura formado por anti-
TNF-, IL-1, IL-6, IL-10 e VEGF-/ diludo em PBS e o anticorpo de
deteco utilizado no experimento foi anti-TNF-, IL-1, IL- 6, IL-10 e VEGF-
/ de ratos. Na revelao da reao foi utilizado estreptavidina conjugada
com peroxidase de raiz forte (HRP) com diluio de 1:200. O substrato
utilizado foi a mistura de 1:1de soluo A (TMB) e soluo B (H2O2). A
reao enzimtica colorimtrica foi parada com a adio de cido sulfrico
(H2SO4). A leitura foi realizada em 450 nm e realizamos uma leitura de
correo em 540 nm. A leitura de correo importante para excluir




37
qualquer interferente presente na placa. A concentrao de citocinas
presentes nas amostras foram expressas em picograma por mL (pg/mL).

4.2.6 Coleta de Macrfagos
Os macrfagos foram obtidos na cavidade peritoneal aps injeo i.p.
de 20 mL de tampo fosfato . salina (PBS). O lavado peritoneal foi coletado
com pipetas Pasteur e centrifugado a 4 C durante 10 minutos. O
sobrenadante foi descartado e as clulas ressuspensas em 1 mL de PBS
para contagem celular na cmara de Neubauer no microscpio ptico
(Nikkon, Japo).


4.2.7 Anlise para Determinao do Tipo de Morte Celular
O processo de morte celular de macrfagos foi avaliado por meio dos
seguintes parmetros: integridade de membrana celular (viabilidade) e
fragmentao de DNA. Todos os experimentos foram realizados no
citmetro de fluxo (FACSCalibur da Becton & Dickison System, San Juan,
Califrina, EUA). Os resultados foram avaliados no Cell Quest Software
(Becton & Dickison System).

4.2.8 Ensaios de Viabilidade Celular
Os macrfagos em (2,6 x 106 / mL) foram ressuspensos em 500 L de
PBS (pH 7,4). Sendo posteriormente adicionado 50 L de soluo de iodeto
de propdio (PI) (2g / mL), as clulas foram analisadas no citmetro de
fluxo. O PI um composto fluorescente solvel em gua que no atravessa
a membrana celular se a mesma estiver intacta. Desta forma, permitindo
identificar as clulas que perdem a integridade de sua membrana
plasmtica. O PI se liga ao DNA intercalando-se com as bases
nitrogenadas. Nas clulas com membranas integras apresenta baixa
fluorescncia. J as clulas com membrana plasmtica no integras permite


38
a entrada de PI, que se liga ao DNA e desta forma, emite uma elevada
fluorescncia quando excitadas pelo laser. A fluorescncia determinada
no canal FL2 (fluorescncia laranja-avermelhada . 585/42 nm). Foram
consideradas viveis as clulas que emitiram baixa intensidade de
fluorescncia. Foram adquiridos dez mil eventos por amostra.

4.2.9 Ensaios de Fragmentao do DNA
A fragmentao do DNA de macrfagos foi avaliada por meio da
citometria de fluxo de acordo com o mtodo descrito por Nicoletti, et al
(1991). Os macrfagos (1 x 106/ mL) foram ressuspensos em 300L de
soluo hipotnica de PI contendo iodeto de propdio 2g/mL, 0,1% de
citrato de sdio e 0,1% de triton X- 100. Na condio presente as clulas
foram incubadas 45 minutos a temperatura ambiente com ausncia de luz.
Neste ensaio a membrana celular rompida pelo triton X-100, permitindo a
entrada de iodeto de propdio, que ir se ligar com o DNA da clula. As
clulas que apresentam DNA integro emitem alta fluorescncia, porem as
clulas que apresentam DNA fragmentado apresentaram baixa
fluorescncia, significando desta forma que as clulas apresentam DNA
rompido. A fluorescncia foi determinada no canal FL2 (fluorescncia
laranja-avermelhada 585/42 nm). Foram consideradas em estado de
apoptose as clulas que apresentaram baixa fluorescncia. Dez mil eventos
foram adquiridos por amostra.








39
5 ANLISE ESTATSTICA

Os dados foram expressos como mdia Erro Padro da Mdia de no
mnino sete animais por grupo. As comparaes foram efetuadas entre os
grupos distintos por meio do Teste ANOVA ONE-WAY. Com nvel de
significncia de p< 0,05. Foram utilizados os softwares SPSS verso 10.0
(Statistical Package for the Social Sciences . anlise estatstica), e Origin
6.0 (plotagem dos grficos).















40
6 RESULTADOS
6.1 Glicemia
O controle glicmico um dos objetivos da pratica de exerccios fsicos
para diabticos. Quadros de hipoglicemia ou de hiperglicemia durante e/ou
aps a prtica do exerccio desencadeiam processos deletrios em
diabticos. Nesse sentido, estudamos o comportamento glicmico dos
grupos (controle (C) e diabtico (DM)) em diferentes momentos (antes da
sesso de exerccio extenuante (0), imediatamente aps (IA), duas horas
aps (2) e vinte e quatro horas aps a exausto (24)) (Figura 2). O grupo
diabtico apresenta aproximadamente 30% das clulas pancreticas
funcionantes e no recebeu insulina exgena. Nesse grupo, observa-se
hiperglicemia constante, quando comparado ao grupo controle. Duas horas
aps o exerccio extenuante, observa-se uma queda de 24% na glicemia do
grupo diabtico quando comparamos com a glicemia imediatamente aps o
exerccio extenuante. A glicemia no grupo diabtico voltou aos valores pr-
exerccio em vinte e quatro horas aps a exausto (Figura 2A). No grupo
controle nota-se queda gradativa na glicemia aps a sesso de exerccio
(r=0,97) que permanece em declnio at vinte e quatro horas aps a sesso
de exerccio extenuante (Figura 2B).














41



Figura 2: (A) Variao glicmica dos grupos controle e diabtico nos tempos: antes
do exerccio (0), imediatamente aps (IA), duas horas aps (2) e vinte e quatro horas
aps o exerccio fsico (24). (B) Correlao entre tempo e glicemia do grupo controle.
Os valores so expressos em mdia e # e.p.m de no mnimo 7 animais por grupo. ***
p<0,001 para comparao entre a glicemia do grupo controle com o grupo diabtico;
# p<0,05 para comparao entre a glicemia do grupo DMIA e DM2. ## p<0,05 para
comparao da glicemia do grupo controle entre o tempo 0 e 24. Observa-se no
grupo controle uma correlao perfeita negativa, ou seja, conforme aumenta o tempo
aps o exerccio fsico ocorre queda na glicemia (r=0,97).

6.2 Morte Celular por Necrose
Alteraes na osmolaridade sangunea e/ou a presena de mediadores




42
inflamatrios podem desencadear eventos de morte celular como a
apoptose ou a necrose em clulas do sistema imune. Nesse sentido,
avaliamos a ocorrncia de apoptose e necrose em macrfagos residentes
no peritnio dos grupos em estudo. Aps a sesso de exerccio extenuante
observa-se diferena na porcentagem de morte de macrfagos por necrose
entre os grupos controle e o grupo diabtico (Figura 3).
No grupo controle, observa-se que a morte de macrfagos elevou-se
gradativamente imediatamente aps o exerccio e duas horas aps, com
reduo significativa vinte e quatro horas aps a sesso de exerccio
intenso (Figura 3A), diferentemente do grupo diabtico que mostrou uma
elevao na porcentagem de morte celular por necrose discreta, porem
contnua (r=0,9) at a ultima medida realizada (Figura 3B).
O grupo diabtico apresentou maior ndice de morte por necrose,
quando comparada ao grupo controle na ausncia de exerccio, ou seja, no
estado basal, o grupo diabtico apresentou morte por necrose 33% maior
que o grupo controle, no mesmo perodo avaliado (Figura 3). Imediatamente
aps a sesso de exerccio extenuante o grupo controle (CI) apresentou um
aumento de 59% na morte celular por necrose quando comparado ao grupo
controle antes da sesso de exerccios (C0). O grupo DMI apresentou
aumento de 9.2% no tempo imediatamente aps a sesso de exerccio
extenuante na morte celular por necrose quando comparado ao DM0
(Figura 3). No tempo 24 horas observa-se que a sesso de exerccio
extenuante aumenta o numero de clulas em necrose no grupo diabtico
em relao ao grupo controle (p<0,03) (Figura 3), desta forma evidencia-se
que no grupo diabtico continua ocorrendo morte por necrose em
macrfagos vinte e quatro horas aps a sesso de exerccio extenuante.
Nesse tempo o grupo DM apresentou morte por necrose de 358% maior
que o grupo C (Figura 3).







43




Figura 3: Porcentagem de macrfagos em necrose celular nos grupos controle (A) e
diabtico (B) nos tempos: antes do exerccio fsico extenuante (0), imediatamente
aps (IA), duas horas aps (2) e vinte e quatro horas apos o exerccio fsico (24). (A)
Correlao entre tempo e viabilidade de macrfagos do grupo controle: observa-se
que o grupo controle apresenta morte por necrose nas duas horas que sucedem o
exerccio extenuante voltando ao normal em 24 horas. (B) No grupo de animais
diabticos exercitados, observa-se correlao positiva entre tempo e morte celular
por necrose (r=0,9). Os valores so expressos em mdia e # e.p.m de no mnimo 7
animais por grupo. ## p<0,03 para comparao entre o grupo controle e o grupo
diabtico no tempo 24h. ## p<0,05 para comparao entre os tempos 0 e 24horas do
grupo controle.

6.3 Morte Celular por Apoptose

A fragmentao do DNA um dos eventos que indicam a presena de
morte celular programada, ou seja, apoptose. Nos ensaios que visavam a
verificar a morte de macrfagos por apoptose, nota-se que no se houve
diferenas estatsticas entre os grupos controle e diabtico nos tempos
estudados estudadas (Figura 4).








44



Figura 4: Porcentagem de clulas com o DNA integro nos grupos controle
(C) e diabtico (DM) nos tempos: antes do exerccio fsico extenuante (0),
imediatamente aps o exerccio fsico extenuante (IA), duas horas depois
(2) e vinte e quatro horas depois do exerccio fsico (24). Os valores so
expressos em mdia e # e.p.m de no mnimo 7 animais por grupo. No se
observou diferenas estatsticas entre os grupos.

6.4 Concentrao plasmtica de IL-1
A Figura 5 ilustra as concentraes plasmticas de IL-1. No grupo
controle, observa-se que a concentrao plasmtica de IL-1 elevou-se
imediatamente e duas horas aps a sesso de exerccio fsico extenuante,
tendo queda significativa em vinte e quatro horas aps a sesso de
exerccio (Figura 5A). J no grupo DM, observa-se elevao gradual e
constante nas concentraes de IL-1 aps a sesso de exerccio (Figura
5B). Vinte e quatro horas aps a sesso de exerccio fsico extenuante o
grupo C24 apresentou uma queda significativa de 105% quando comparada
ao grupo C2. Entretanto vinte e quatro horas aps a sesso de exerccio
extenuante o grupo DM24 apresentou um aumento na concentrao
plasmtica de IL-1 de 30% que o grupo DM2 (Figura 5B). No mesmo
perodo avaliado observamos que o grupo DM quando comparado ao grupo
C apresentou um aumento na concentrao plasmtica de IL-1 de 64%.
No grupo DM observou-se uma elevao gradual e constante nas
concentraes de IL-1 aps a sesso de exerccio fsico extenuante, j o



45
grupo C imediatamente e duas horas aps a sesso de exerccio fsico
extenuante atingiu os maiores picos de concentrao de IL-1, porem
apresentando uma queda significante vinte e quatro horas aps (Figura 5).




Figura 5: Concentrao plasmtica de IL-1 nos grupos controle e diabtico
nos tempos antes do exerccio fsico extenuante (0), imediatamente aps o
exerccio fsico extenuante (IA), duas horas depois (2) e vinte e quatro horas
depois do exerccio fsico (24). (A) Variao na concentrao de IL-1 no espao
temporal analisado no grupo controle. (B) Variao na concentrao de IL-1 no
espao temporal analisado no grupo diabtico. Os valores so expressos em mdia e
e.p.m de no mnimo 7 animais por grupo. Grupo p<0,05 quando comparamos a
concentrao de IL-1 no tempo 24h entre o grupo controle e diabtico.


6.5 Concentrao plasmtica de TNF-
A concentrao plasmtica de TNF- evidenciada por um
comportamento diferenciado quando comparamos os grupos controle e
diabtico no espao temporal de vinte e quatro horas (Figura 6). O grupo
controle apresentou uma elevao discreta na concentrao plasmtica de
TNF- imediatamente aps a sesso de exerccio intenso, atingindo um pico
duas horas aps a sesso de exerccio. Tendo por fim uma queda vinte e
quatro horas aps a sesso de exerccio intenso apresentando uma
concentrao com concentrao inferior ao tempo zero. Imediatamente
aps a sesso de exerccio fsico intenso quando comparado ao perodo




46

basal o grupo controle apresentou uma elevao na concentrao
plasmtica de TNF- de 7%. No mesmo perodo avaliado o grupo diabtico
apresentou um aumento na concentrao plasmtica de TNF- de 20%.
Vinte e quatro horas aps a sesso de exerccio fsico intenso o grupo C
apresentou uma queda na concentrao plasmtica de TNF- de 43%, o
grupo DM no mesmo perodo avaliado apresentou uma elevao na
concentrao plasmtica de TNF-, de 17%. Quando avaliamos uma
comparao no perodo de vinte e quatro horas do grupo diabtico em
relao ao grupo controle observamos um aumento na concentrao
plasmtica de TNF- de 28%.




Figura 6: Concentrao plasmtica de TNF- dos grupos controle (A) e
diabtico (B) nos tempos antes do exerccio fsico extenuante (0), imediatamente
aps o exerccio fsico extenuante (IA), duas horas depois (2) e vinte e quatro horas
depois do exerccio fsico extenuante (24). Os valores so expressos em mdia e
## e.p.m de no mnimo 7 animais por grupo. p<0,05 quando comparamos a
concentrao de TNF- nos tempo 24h entre o grupo controle e diabtico.



6.6 Concentrao plasmtica de IL-6
A figura 7 mostra a anlise da concentrao srica de IL-6 nos grupos
estudados. Observa-se que o grupo controle apresentou um pico na
concentrao plasmtica de IL-6 duas horas aps o exerccio fsico



47
extenuante. Na comparao entre os tempos antes da exausto e
imediatamente aps a exausto com o tempo duas horas aps a exausto
observa-se valores de P igual a 0,049 e 0,055, respectivamente (Figura 7A).
O grupo diabtico apresentou a concentrao plasmtica de IL-6 constante,
no ocorrendo diferenas significativas em nenhum perodo estudado
(Figura 7B).




Figura 7: Concentrao plasmtica de IL-6 dos grupos controle e diabtico nos
tempos antes do exerccio fsico extenuante (0), imediatamente aps o exerccio
fsico extenuante (IA), duas horas depois (2) e vinte e quatro horas depois do
exerccio fsico extenuante (24). Os valores so expressos em mdia e ## e.p.m de no
mnimo 7 animais por grupo e significncia de p>0,05 na comparao entre o tempo
imediatamente aps a exausto e duas horas aps a sesso de exerccio fsico
extenuante.



6.7 Concentrao plasmtica de IL-10
No foram observadas diferenas nas concentraes plasmticas de
IL-10 entre o grupo controle e diabtico nas condies estudadas (Figura 8).










48



Figura 8: Concentrao plasmtica de IL-10 dos grupos controle e diabtico
nos tempos antes do exerccio fsico intenso (0), imediatamente aps o exerccio
fsico extenuante (IA), duas horas depois (2) e vinte e quatro horas
depois do exerccio fsico extenuante (24). Os valores so expressos em mdia e
## e.p.m de no mnimo 7 animais por grupo p> 0,05.


6.8 Concentrao plasmtica de VEGF-/
A concentrao plasmtica de VEGF-/ apresentou um
comportamento estvel no grupo C no espao temporal de vinte e quatro
horas, atingindo um pico duas horas aps a sesso de exerccio
extenuante. Apresentando por fim uma queda acentuada porem a
concentrao plasmtica no perodo ps vinte e quatro horas foi superior
concentrao plasmtica de VEGF- / no perodo basal. Vinte e quatro
horas aps a sesso de exerccio fsico extenuante o grupo C apresentou
uma queda na concentrao plasmtica de VEGF- / de 15%. No mesmo
perodo avaliado o grupo DM apresentou um aumento na concentrao
plasmtica de VEGF- / de 28.7%. Interessantemente avaliamos a
concentrao plasmtica de VEGF- / no perodo de vinte e quatro horas
aps a sesso de exerccio fsico extenuante do grupo DM em relao ao
grupo C e observamos um aumento de 55.4%. O grupo DM apresentou um
comportamento diferenciado quando comparado ao grupo C, pois
apresentou uma ligeira elevao constante da concentrao plasmtica de




49
VEGF- / atingindo pico de concentrao vinte e quatro horas aps a
sesso de exerccio extenuante.



Figura 9: Concentrao plasmtica de VEGF-/ dos grupos controle (A) e diabtico
(B) nos tempos antes do exerccio fsico extenuante (0), imediatamente aps o
exerccio fsico extenuante (IA), duas horas depois (2) e vinte e quatro horas depois
do exerccio fsico extenuante (24). Os valores so expressos em mdia e ## e.p.m de
no mnimo 7 animais por grupo e significncia de p=0,007 na comparao entre o
grupo C24 e DM24.





























50
7 DISCUSSO
A melhora da aptido fsica ocorre quando o exerccio fsico realizado
causa determinado estresse homeostase do atleta (BOMPA, 2002). Aps
o estresse inicial, o descanso entre uma sesso de exerccio e outra ou
entre uma determinada fase da periodizao do treinamento fsico e outra
um perodo importante para a melhora da aptido fsica e sade do atleta
(LA ROSA, 2001). Entretanto quando o descanso no ocorre de forma
adequada, o organismo sobrecarregado resultando no overtraining. Essa
condio caracterizada por elevado estresse fisiolgico e psquico
(ROGERO; MENDES, 2005) (HADDAD; SAADE; GARABEDIAN, 2002).
Sabe-se que a intensidade do exerccio fsico diretamente
relacionada ao nvel de aptido fsica do praticante. Por exemplo, para um
indivduo destreinado uma caminhada, que apresentaria como uma
atividade fsica de intensidade leve, na verdade, poder vir a ser uma
atividade fsica intensa (PEDERSEN et al, 1998). Embora existam muitos
artigos cientficos focando na importncia das alteraes imunes durante e
aps o exerccio fsico, bem como sobre preveno e tratamento de leses
musculares em atletas saudveis, pouco se sabe sobre o aspecto
fisiopatolgico de leses musculares em diabticos e o tempo de
recuperao necessrio para o organismo se recompor aps uma atividade
fsica intensa.
O aumento da concentrao plasmtica de citocinas pro e inflamatrias
esta associado com a intensidade e durao do exerccio fsico. De forma,
direta ou indireta, a concentrao plasmtica de hormnios influenciar na
concentrao de citocinas e na glicemia. Na realidade, bem conhecido
que o sistema imune interage diretamente com o sistema neuroendcrino e
metablico (HADDAD; SAADE; GARABEDIAN, 2002). Por exemplo, a
epinefrina (adrenalina), um hormnio hiperglicemiante, tem suas
concentraes alteradas em diferentes situaes, incluindo durante a
pratica de exerccios fsicos e em inflamaes agudas (STAINECKER et al,
2004). Durante o exerccio fsico alteraes na concentrao de adrenalina


51
podem ser prejudiciais para o atleta, principalmente se o mesmo apresentar
disfunes no metabolismo de carboidratos (SIGAL et al, 2007). Dessa
forma, faz-se necessria a compreenso do mecanismo envolvido no
comportamento imune e metablico e a interao entre os sistemas para
que desta forma seja possvel a otimizao do treinamento fsico. Hoje a
Associao Americana de Diabetes, e a Associao Europia para o Estudo
de Diabetes recomendam o exerccio fsico aerbio regular e de resistncia
para as pessoas com diabetes, sem grandes complicaes. No entanto, as
orientaes e os protocolos de treinamento/descanso so extremamente
gerais e no fornecem informaes que visem a evitar leses sub-clinicas e
melhorar a resposta imune.
O comportamento glicmico aps uma sesso de exerccio fsico
depende de uma srie de fatores como: intensidade e durao do exerccio,
condicionamento fsico, concentrao de hormnios hiperglicemiantes,
presena ou no de leso tecidual e da intensidade da ativao do processo
inflamatrio, presena ou ausncia de insulina exgena (no caso de
diabticos), entre outros (CAMACHO et al, 2005). Nesse estudo, observou-
se que o grupo controle aps o exerccio extenuante apresentou uma
reduo glicmica gradual. Uma possvel explicao para a queda na
glicemia o fato do exerccio fsico poder promover aumento na atividade
dos glicotransportadores intracelulares de glicose, mesmo que na ausncia
de insulina (TABATA et al, 1999), fato que poderia levar a diminuio da
glicemia observada.
A glicemia do grupo diabtico foi maior que a do grupo controle em
todos os momentos avaliados nesse estudo. Segundo Camacho et al,
(2005); Marliss; Vranic, (2002) entre outros, o aumento da intensidade do
exerccio fsico reduz, de forma proporcional, liberao de insulina,
enquanto aumenta a liberao de glucagon, catecolaminas, tendo como
objetivo aumentar a gliconeognese heptica e favorecer a utilizao de
glicose por clulas musculares (RAUCH et al, 2003; SIGAL et al, 2007;
STAEHR et al, 2007).Camacho et al (2005) apontam ainda que na
realizao do exerccio fsico extenuante ocorra um aumento na liberao


52
de glicose heptica podendo exceder o consumo de glicose muscular,
tambm resultando em hiperglicemia.
Durante o exerccio no s alteraes hormonais e/ou em
transportadores de glicose podem afetar a glicemia. Hoje se sabe que
alteraes resultantes de leses teciduais e uma elevada ativao da
inflamao influenciam no metabolismo de carboidratos. Assim que um
processo lesivo ocorre, o processo inflamatrio iniciado, com alterao no
perfil de sntese heptica com sntese e liberao de grandes quantidades
de protenas de fase aguda e citocinas pro-inflamatrias como o TNF-, IL-
1 e IL-6 (ABBAS, 2003) Nesse estudo se observa que a concentrao
plasmtica de IL-1 no grupo controle elevou-se imediatamente e duas
horas aps a sesso de exerccio fsico extenuante, tendo queda
significativa em vinte e quatro horas aps a sesso do mesmo. J no grupo
diabtico, observa-se elevao gradual e constante nas concentraes de
IL-1 aps a sesso de exerccio fsico extenuante, indicando que vinte e
quatro horas aps a exausto fsica os ratos diabticos continuam com
sinais de inflamao sistmica. Embora no foi observada diferena entre o
grupo diabtico e controle, o comportamento da concentrao de IL-1 em
relao aos diferentes tempos analisados foi diferente entre os grupos. No
grupo diabtico observamos elevao gradual e constante nas
concentraes de IL-1 aps a sesso de exerccio fsico extenuante, j o
grupo controle imediatamente e duas horas aps a sesso de exerccio
fsico extenuante atingiu os maiores picos de concentrao de IL-1 , porem
apresentando uma queda significante vinte e quatro horas aps, indicando
que o perodo de um dia o suficiente para ratos controles voltarem ao
estado basal (pr-exausto) e no foi suficiente para os ratos diabticos.
Os resultados do presente trabalho indicam o mesmo padro de
resposta para o TNF-, ou seja, aps vinte e quatro horas da exausto
fsica, o grupo diabtico parece no se recuperar da resposta inflamatria
inicial ao exerccio fsico realizado. Segundo Evans et al, (1986) o nvel de
aptido fsica influncia na concentrao de IL-1, ou seja, quanto melhor
treinado for o individuo menor ser o estresse fisiolgico causado pelo


53
exerccio fsico, e menor ser a concentrao plasmtica de IL-1. Segundo
Ostrowski et al, (1999) o exerccio fsico extenuante colabora para o
aumento da concentrao plasmtica de IL-1 e TNF-. Esse
comportamento foi observado nos nossos experimentos, entretanto o grupo
diabtico apresentou ineficincia quanto recuperao da resposta
inflamatria aguda do exerccio fsico extenuante no perodo de vinte e
quatro horas.
Nossos resultados indicam que diabticos apresentam um dficit na
recuperao do estado inflamatrio, adicionalmente, apresentam um
elevado percentual de morte de macrfagos por necrose. Vinte e quatro
horas aps a sesso de exerccio extenuante o grupo diabtico continuou
apresentando necrose celular, no acompanhando o padro de resposta do
grupo controle que recuperou a degradao promovida pelo exerccio fsico
extenuante.
A liberao de citocinas inflamatrias no plasma se faz necessria para
a ativao do sistema imune, entretanto o que difere implicaes nesse
processo a intensidade da liberao de tais citocinas. Onde observamos
que diabticos apresentam maior concentrao de citocinas inflamatrias
quando comparada ao grupo controle. Num quadro inflamatrio elevado das
implicaes fisiolgicas desencadeadas chamamos a ateno para a
influncia no comportamento glicmico, pois com o aumento na
concentrao de citocinas tambm se observado aumento de
catecolaminas, alem de implicar a atuao dos receptores de insulina. E
que o quadro hiperglicmico apresenta por fim um efeito toxicolgico para o
organismo acentuando ainda mais o quadro inflamatrio (OTTON;
MENDOA; CURI, 2002).
Durante um processo inflamatrio, citocinas interagem com receptores
na superfcie de clulas circulantes ou no, interferindo na sua atividade
funcional e na evoluo da resposta inflamatria. Nesse sentido,
concentraes elevadas de citocinas pro-inflamatrias como TNF-, IL-1 e
IL-6 podem induzir tanto morte celular por necrose, como a morte por
apoptose.


54
Nossos resultados indicam que diabticos apresentam um dficit na
recuperao do estado inflamatrio, adicionalmente, apresentam um
elevado percentual de morte de macrfagos por necrose. Vinte e quatro
horas aps a sesso de exerccio fsico extenuante o grupo diabtico
continuou apresentando necrose celular, no acompanhando o padro d
resposta do grupo controle que recuperam a degradao promovida pelo
exerccio fsico extenuante quanto integridade de membrana celular.
























55
CONCLUSO
Em concluso, ratos diabticos sedentrios no insulinizados
apresentam ainda um quadro inflamatrio elevado vinte e quatro horas aps
o exerccio fsico exaustivo, enquanto o grupo controle retorna ao estado
basal. Desta forma faz-se necessrio diabticos sedentrios no
insulinizados um tempo maior de recuperao da prtica de exerccio fsico
extenuante. E o mesmo ainda apresenta um estado hiperglicmico
constante quando sedentrio e no insulinizado, porem necessrio
observar o comportamento glicmico principalmente quando insulinizado,
pois o mesmo apresenta queda glicmica significante duas horas aps a
pratica de uma sesso de exerccio fsico extenuante.


















56
REFERENCIAS

Abbas KA et. al. Imunologia celular e molecular. 4a.ed. Rio de Janeiro:
Revinter; 2003.

Aiello LP et al. Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of patients
with diabetic retinopathy and other retinal disorders. New England Journal
Medicine. 1994;331: 1480-7.

Allen PD, Bustin SA, Newland AC. The role of apoptosis (programmed cell
death) in haemopoiesis and the immune system. Blood Review. 1993;7:63-
73.

AMERICAN COLLEGE OF SPORTS MEDICINE ACSM. Guidelines for
exercise testing and prescription. 6a. ed. Batimore ; 2000.

AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Diagnosis and classification.
Diabetes Care. 2008;31(1):S55-S60.

AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Standards of medical care in
diabetes Diabetes Care. 2007; 30 (1): S4 . S41.

Akira, S, Taga T, Kishimoto T. Interleukin: 6 in biology and medice. Advance
Immunolology.1993;54:1-78.

Apirkko PT, Komi VPH. Plasma catecholamine responses and neural
adaptation during short-term resistance training. European Journal Apply
Physiology. 2000;82:68-75.

BElli T et al. Lactate and ventilatory thresholds in type 2 diabetic women.
Diabetes Research and Clinical Practice. 2007;76:18-23.

Belotto FM. Efeito do treinamento fsico sobre o estado inflamatrio de ratos
submetidos ao diabetes mellitus experimental [dissertao]. So Paulo:
Universidade Cruzeiro do Sul; 2009.






57

Bergamaschi .et al Apoptosis: biological and clinical aspects.
Haematologica. 1994;79: 86-93.

Bompa TD. Periodizao: teoria e metodologia do treinamento. So Paulo:
Phorte; 2002.

Bonini LA, Moura RAL, Franco M. Apoptose em glomerulopatias. Jornal
Brasileiro Nefrologia. 2000;22 (2):70-7.

Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications a unifying
mechanism Diabetes. june, 2005;54:1615-25.

Bruunsgaard H. et al. A high plasma concentration of TNF- alpha is
associated with dementia in centenarians. Journal Gerontology A Biology
Science Medicine Science. 1999;54:M357.M64.

Bruunsgaard H. et al. Exercise induced increase in interleukin-6 is related to
muscle damage. Journal Physiology (London).1997;499:833-41.

Camacho RC. et al. Glucorregulation during and after exercise in health and
insulindependente diabetes. Exercise in Sports Sciense Review.
2005;33(1):17-23. Cannon JG. et al. Physiological mechanisms contributing
to increased interleukin-1 secretion. Journal Apple Physiology
1986;61:1869-74.

Capersen CJ. Physical activity, exercise and physical fitness: definitions, and
distinctions for health related research. Public Health Reports. 1985;100
2):126-31.

CARVALHO CHM, Colao LA, Fortes BZ. Citocinas, disfuno endotelial e
resistncia insulina. Arquivo Brasileiro Endocrinologia Metabolismo.
2006;50 (2):304-12.

Coppack SW. Pro-inflammatory cytokines and adipose tissue. Proctology
Nutrition Society. 2001;60:349-56.

Coyle, F. E Physical activity as a metabolic stressor American Journal
Clinical Nutrition. 2000;72:512S- 20S.



58


Crowther JG.. et al. Altered energetic properties in skeletal muscle of men
with wellcontroled insulin- dependente (type 1) diabetes American Jornal
Physiology Endocrinology Metabolism. 2003;284(04):655-62.

Cunha S, Ribeiro LJ, Oliveira RA. Overtraining: theories, diagnosis and
markers.Revista Brasileira Medicina Esporte. Set/Out 2006:12(05):267e-
271e.

CARVALHO CHM, Colao LA, Fortes BZ. Citocinas, disfuno endotelial e
resistncia insulina. Arq. Bras. Endocrinol Metab. Abril 2006;50(02):304
12.

Evans WJ. et al. Metabolic changes following eccentric exercise in trained
and untrained men. Journal Apply Physiology. 2000;61:1864.8.

Febbraio AM, Pedersen KB. Muscle derivated interleukin-6 mechanisms for
activation and possible biological roles. The FASEB Journal. 2002;16:1335-
47.

Fitzgerald L. Exercise and the immune system. Immunology Today.
1988;9:337-9.

Freitas BLG. et al. Sistema VEGF, um alvo multi-teraputico. Revista Virtual
de Qumica. 2009;3(01):257-69.

Friedland JS .et al. Prolonged elevation of interleukin . 8 and interleukin . 6
concentrations in plasma and of leukocyte interleukin . 8 mRNA levels during
septicemic and localized pseudomonas pseudomallei infection. Infection
Immunology. 1992;60:2402-8.

Glesson M Exercise and inflammation immune function in sport and
exercise. Journal Apply Physiology. 2007;103:693-9.

Gokhale R, Chandrashekara S, VAsanthakumar CK. Cytokine response to
strenuous exercise in athletes and non- athletes an adaptive response.
Cytokine. 2007;40:123-7.





59
Haddad JJ, Saad EN, Garabedian SB. Cytokines and neuro-immune-
endocrine interations: a role for the hypothalamic-pituitary-adrenal revolving
axis. Jornal of Neuroimmunology. 2002;133:1-19.

Harrison DJ. Cell death in the diseased glomerulus. Histopathology.
1988;12:679- 83.

Hatanaka E. et al Neutrophils and monocytes as potentially important
sources of proinflammatory in diabetes. Clinical and Experimenta
Immunology. 2006;146:443-7.

Hoene M, Weigert C. The role of interleukin: 6 in insulin resistance, body fat
distribuition and energy balance. Obesity Reviews. 2007:9:20-9.

Ivy JL. Optimizaton of glucogen stores in: nutrition in sports The
encyclopaedia of sports medicine. Edited by Maughan, R, J Blackwel
Science; 2000.

Kamimura D, Ishihara K, Hirano T. IL . 6 signal transduction and its
physiological roles: the signal orchestration model. Physiology Biochemical
Pharmacology. 2003;149:1 . 38.

Keller C. et al. Exercise normalises overexpression of TNF- in knockout
mice. A Biochemical and Biophysical Research Communications.
2004;321:179-82.

Kern PA. et al. Adipose tissue tumor necrosis factor and interleukin . 6
expression in human obesity and insulin resistance. American Journal
Physiology Endocrinology Metabolism. 2001;280:E745-E51.

King LG. The role of inflammatory cytokines in diabetes and its
complications. J. Periodontology. 2008;79:1527-34.

Kivela R. et al. Exercise . induced expression of angiogenic growth factors in
skeletal muscle and capillaries of healthy and diabetic mice. Cardiovascular
Diabetology. 2008;7(13):1-10.




59


60
Kohut LM. et al. Age effects on macrophage function vary by tissue site,
nature of stimulant, and exercise behavior. Experimental Gerontology.
2004;39:1347-60.

Kriketos DA, et al Inflammation, insulin resistance, and adiposity. Diabetes
Care. August 2008;27(8):2033- 40.

Lemos TE. et al. Exercise training is associated with improved levels
of C-reactive protein and adiponectin in ZDF (type 2) diabetic rats. Medicine
Science Monitorament. 2007;13(8):BR168-74.

Liu T, Li G. Inflammation: another potential mechanism between diabetes
mellitus and trial fibrillation. The American Journal of Cardiology
2008;06(04):1681-2.

Luca C, Olefsky,M. J Inflammation and insulin resistence. The Febs Letters.
2008; 508:97-105.
Margaret C. et al. Apoptosis. American Journal Surge Pathology.
1997;21:88-101.

Marliss EB, Vranic M. Intense exercise has unique effects on both insulin
realise and its roles in glucorregulation. Diabetes. 2002;51:S271-S83.

May T. et al. Marked cell . type . specific differences in glycosylation of
human interleukin . 6. Cytokine. 1991;3:204-11.

May LT. et al. Phosphorylation of secreted forms of human beta 2 .
interferon/ hepatocyte stimulating factor interleukin . 6. Biochemical and
Biophysical Research Communications. 1988;152:1144-50.

MCdonald PP, Bald A, Cassatela MA. Activation of the NF-KB pathway by
inflammatory stimuli in human neutrophils. Blood Review. 1997;89:3421-33.
Montani J.P et al. Pathways from obesity to hypertension: from the
perspective of a vicious triagle. Intercity Journal Obesity. 2002;26:S28-S38.

Moran RM, Romero GF. Increased levels of c-reactive protein in
noncontrolled typeII diabetic subjects. Journal of Diabetes and Its
Complications. 1999;13(4):211.5.




61

Mokhtar N, Rousseau-Migneron S,Tancrde G, Nadeau A. Partial correction
of impaired creatine kinase activity in diabetic rat heart by physical training.
Metabolism. 1992;41 (9):1004- 8.

NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH. Janeiro 2005;5:4642.
Nieman DC, Pedersen BK. Exercise and immune function: recent
development. Sports Medicine. 1999;27:73.80.

Northoff H, Berg A. Immunologic mediators as parameters of the reaction to
strenuous exercise. Intercity Journal Sports Medicine. 1991;12:S9-15.

Oberbach A. et al. Effect of 4 week physical training program on plasma
concetrations of inflammatory markers in patientes with abnormal glucose
tolerance. European Journal of Endocrinology. 2006;154:577-85.

Oliveira CJ . et al. Identificao do limiar de lactato e limiar glicmico em
exerccios resistidos. Revista Brasileira Medicina Esporte. nov/dez.
2006;12(6):1-6.

Ostrowski K. et al. Pro- and anti-inflammatory cytokine balance in strenuous
exercise in humans. Journal Physiology (Lond.). 1999;515:287-91.

Otton R, Mendona JR, Curi R. Diabetes causes marked changes in
lymphocyte metabolism. Journal of Endocrinology. 2002;174:55-61.

Pahl HL, Baeuerie PA. The ERO overload response: activation of NF-kB.
TIBS. 1997; 22:63-7.

Pedersen WMA, Pedersen KB. The anti-inflammatory effect of exercise.
Journal Apply Physiology. 2005; 98:1154-62.

Pedersen KB. Exercise and cytokines. Immunology and Cell Biology.
2000;78:532.5.

Pedersen KB, Dyhr A. Toft effects of exercise on lymphocytes and cytokines.
Britch Journal Sports Medicne. 2000;34(4):246-51.

Pedersen BK, Hoffman-Goetz L. Exercise immune system: regulation,
interation and adaptation. Physiology. 2000;80:1055-81.




62

Pedersen BK .et al. The cytokine response to strenuous exercise. Canadian
Journal Physiology Pharmacology. 1998;76:505-11.

Penkowa M. et al. Immunohistochemical detection of interleukin . 6 in human
skeletal muscle fibers following exercise. FASEB Journal. 2003;17:2166-8.
Peraso ANM. Atividade fsica. Congresso Anual da ADJ So Paulo: Anais
2005: 26- 27.

Rajesh P. et al .Effetcs of exercise on the absorption of insulin glargine in
patients with type 1 diabetes. Diabetes Care. 2005;28(3):560- 5.

Rauch HJ. et al. A signalling role for muscle glycogen in the regulation of
pace during prologed exercise. Britch Jornal Sports Medicine. 2003;39:34-8.

Riddell CM, Perkins AB. Type 1 diabetes and vigorous exercise: applications
of exercise physiology to patient management. Canadian Journal Diabetes.
2006;1(30):63-71.

Ridker PM. et al. C Reactive protein and other markers of inflammation in
the prediction of cardiovascular disease in women. New England Journal
Medicine. 2000;342:836-43.

Rogero MM, Mendes RR, Tirapegui J Aspectos neuroendcrinos e
nutricionais em atletas com overtrainig. Arquivo Brasileiro Endocrinologia
Metabolismo. Junho 2005;49(3):359-68.

Rosa CPFL, Vaisberg M. Influncias do exerccio na resposta imune.
Revista Brasileira Medicina Esporte. Jul/Ago 2002;8,(4):167-72.

Rosendal L. et al. Increace in interstitial interleukin . 6 of human skeletal
muscle with repetitive low . force exercise. Journal Apply Physiology.
2004;182:379-88.

Sachs L, Loten J. Control programmed cell death in normal and leukemic
cell: new implications for therapy. Blood Review. 1993;82:15- 25.

Shoelson ES, Herrero,L, Naaz A. Obesity, inflammation, and insulin
resistance. Gastroenterology. 2007;132:2169-80.




63
Shulman RG. Glycogen turnover forms latctate during exercise. Exercise
and Sports Sciences Reviews. 2005;33(04):157-62.

Sigal RJ. et al. Glucorregulation during and after intense exercise: effects of
- adrenergic blockade in subjetcs with type 1 diabetes mellitus. The Jornal
of Clinical Endocrinology & metabolism. 2007;84(11):3961-71.

Silveira NE. Atividade fsica para diabticos. Rio de Janeiro: Sprint; 2000.

Somers W, Stahl M, Seehra JS. A crystal structure of interleukin 6:
implications for a novel mode of receptor dimerization and signaling. Journal
EMBO. 1997;16:989-97.

Sondergaard SR .et al. Changes in plasma IL-6 and IL-1ra in response to
adrenaline. European Journal Apply Physiology. 2000;83:95-8.

Staehr P. et al. Hepatic autorregulation: response of glucose prodution and
gluconeogenese to incresed glycogenolyses. American Jornal Physiology
Endocrinology Metabolism. 2007;292(01):E1265- E1269.

Steensberg A. et al. Plasma interleukin-6 during strenuous exercise: role of
epinephrine. American Journal Physiology Cell Physiology 2001;281:C1001-
C1004.

Steinacker MJ .et al. New aspects of the hormone and cytokine response to
training. European Journal Apply Physiology. 2004;91:382-91.

Tabata I. et al. Resistance training affetc glut 4 content in skeletal muscle of
humans after 19 days of head-down bed rest. Journal of Apply Physiology.
1999;86(3):909-14. U.S. National Library of Medicine National Institutes of
Health (PUMED) [citado 17 maio 2010]. Disponvel em www.nci.nlm.nih.gov/
.
Van Cromphaut SJ. Hiperglycaemia as part of the stress response: the
underlying mechanisms. Best Pract Review Clinical Anaesthesiology.
2009;23(4)375-86.

WHO (World Health Organization) Diabetes mellitus. Fact Sheets, n 312,
2006. [citado 15 set 2009]. Disponivel em:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/em/idex.html.




64

Witte MB, Barbul A. General principles of wound healing. Sur Clinical North
American. 1997;77:509-28.

Wyngarden F, Smith J, Bennet F. Tratado de medicina interna. 19a. ed. Rio
de Janeiro: Guanabara Koogan; 1993.

Zimmerman RB, Walker EA. Guia completo sobre diabetes da american
diabetes association. Rio de Janeiro: ANIMA; 2002.























65






ANEXO A



Parecer do Comit de tica em Experimentao Animal


















66







67







ANEXO B



Manuscrito em fase de preparo/submisso


















68
APNDICE A


Assessment of markers of glycaemia and inflammation after exhaustive
exercise in the normal and diabetic rat

Bortolon JR*, Silva Junior AJA*, Moura SS, Newsholme P, Curi R, Hatanaka
E
1 Post-Graduate Program in Human Movement Science, Cruzeiro do Sul
University, 2 Department of Physiology and Biophysics, Institute of
Biomedical Sciences, University of So Paulo, So Paulo, Brazil
*Both authors contributes equally for the study

Corresponding author: Elaine Hatanaka
Instituto de Cincias da Atividade Fsica e Esportes,
Universidade Cruzeiro do Sul,
Avenida Galvo Bueno,
Liberdade, So Paulo, SP, Brazil
e-mail: ehata@usp.br
elaine.hatanaka@cuzeirodosul.edu.br
Phone (55-11) 3385 3103
FAX (55-11) 3091 7285








69
Abstract

Diabetic athletes may suffer muscular injuries resulting from muscle fatigue.
After an initial lesion, the levels of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-1,
IL-6) increase in plasma. These mediators may alter hormonal homeostasis,
increase glucose serum levels, activate macrophages and contribute to
tissue damage, as well as increase susceptibility to invasive
microorganisms, thus affecting the performance and health of diabetics. In
this study we evaluated installation and resolution of inflammation in control
and diabetic rats submitted to a session of exhaustive exercise. Blood
samples were taken from diabetic and control rats before, immediately after,
two hours after and twenty and four hours after a session of exhaustive
exercise. Pro-inflammatory cytokines (TNF-, IL-1, IL-6), antiinflammatory
cytokine, IL-10, and the growth factor, VEGF-/, were measured by ELISA.
The glycaemia was measured by the enzymatic spectrophotometric method.
Macrophages death (necrosis and apoptosis) were assessed by using Flow
Cytometry. It was observed that, in control group, exhaustive exercise
diminished serum glucose in a time dependent manner (r=0.97). The
diabetic group remained in hyperglycemia, in all conditions studied, showing
a slight decreased glucose levels at 2 hours after the exhaustive exercise
(p< 0.05). Our results indicate that 24 hours after the exhaustion, diabetic
rats still continue with increase in the concentration of IL-1 and TNF- in a
time dependent manner, while control return the serum levels of these
mediators. Changes in IL-6 concentrations were not observed in diabetic
group. The control group presented a peak production of IL-6 two hours after
exhaustion (p = 0.049). We don.t observe differences in IL-10 and VEGF-
measurements. The physical exhaustion increased the proportion of diabetic
macrophages in necrosis (r=0.9) (loss of plasma membrane integrity) in a
time dependent manner, no alterations were observed on apoptosis ratio.
We concluded that untrained diabetic rats had induced injury twenty four
hours after the exhaustive exercise while the control rats twenty four hours
after an exhaustive exercise, return to basal conditions.


70
INTRODUCTION
Moderate and high intensity exercise imposes major acute endocrine,
metabolic and immune functional changes which persist for a period of
several hours after the termination of exercise (1). Regular moderate
physical activity is considered to enhance glycaemic control, antioxidant and
immune capacities improving cardiovascular function and preventing the
genesis and progression of chronic diseases characterized by low grade
systemic inflammation e.g. diabetes mellitus (2-5). Recently our group
demonstrated that, moderate intensity physical exercise (60% VO2 Max) for
three week had marked anti-inflammatory effects in diabetic rats and
improves neutrophil and macrophages functions (6). However, exhaustive
exercise can be detrimental. Strenuous exercise causes hyperglycaemia,
immunossupression, oxidation of protein and lipid, release of cytosolic
enzymes from muscle and has a negative impact on the post-exercise
condition (7). The American Diabetes Association, the European Association
for the Study of Diabetes, and the American Heart Association recommend
regular aerobic and resistance exercise for people with diabetes without
major complications (8-10). However, the guidelines do not provide
information on the intensity or most beneficial type of exercise for specific
subpopulations of people with diabetes in order to maximize the benefit,
while maintaining minimal risk.Thus using markers of immune system
function and activation may be useful with respect to assessing appropriate
levels of diabetes associated exercise intensity and duration along with the
standard parameters of metabolic and hormonal responses. In this study, an
investigation was designed to determine the effects of an exhaustive
exercise program on the serum levels of interleukin-1beta (IL-1), tumor
necrosis factor-alpha (TNF-), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-10 (IL-10)
in streptozotocin-induced diabetic rats and control non-diabetic rats. Blood
samples were obtained before the defined exercise protocol, immediately
after, 2 hours after, 24 hours after and 48 hours after an exhaustive regimen
using a treadmill. The number of resident macrophages in peritoneum was



71

also evaluated. The proportion of macrophages with signs of necrosis or
apoptosis was also measured.



















72
MATERIALS AND METHODS
Animals
Male Wistar rats (180 20g) were kept in a room with an inverted 12-
hour light/dark cycle under standardized conditions of temperature and
humidity. Forty animals were divided into four groups: (i) control; (ii) control
exercise; (iii) diabetic; and (iv) diabetic exercise. The exercise groups were
subjected to an exhaustive physical training program on a treadmill. Non-
exercise rats were handled daily to mimic the handling conditions that the
exercise rats were subjected to. A standard animal laboratory chow (52%
carbohydrate, 21% protein, and 4% lipids; Nuvilab CR1-Nuvital) and water
were given ad libitum. The experiment was approved by the Ethical
Committee of the Cruzeiro do Sul University (n 017/2009) and followed the
Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals.
Induction of diabetes
The experimental type 1 diabetes was induced by peritoneal injection of
65 mg/kg b.w. streptozotocin dissolved in citrate buffer (pH 4.2). At 48 h after
streptozotocin injection, the diabetic state was confirmed by blood glucose
levels above 200 mg/dL, estimated with the aid of a glucose meter (Roche).
Blood samples were obtained from a cut at the tip of the animal.s tail. The
physical training was initiated seven days prior to the induction of diabetes.
Physical Training Protocol
The exercise protocol used in this study was adapted from a study
described previously (6). The study was divided into two parts: the
preliminary phase (one week of duration) and the main experiment (one day
of duration). Briefly, in the first week of the preliminary experiments, the rats
were adapted to the treadmill. The adaptation consisted of fifteen minutes of
exercise at a speed of 0.3 km/.h.



73
After the adaptation period, all the animals were subjected to a test of
maximal effort until exhaustion. The initial treadmill speed was 0.3 km/h. At
3-minute intervals, the speed was increased by 0.3 km/h. The maximal
speed was reached when the animal was able to run for at least 1.5 min at
the same speed and unable to run at an immediately higher speed. The non-
exercise group remained in their cages. Before the training protocol, at the
end, 2 hours and 24 hours of the training exhaustive program, the samples
were collected (blood and macrophages) of the groups. Macrophage
functions were immediately analyzed. Plasma was collected and stored at -
80C before determining cytokine levels. Enzyme activities were performed
immediately.
Determination of the creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH)
serum activity
Serum CK and LDH activities are markers of muscle injury. CK and LDH
activities were measured according to the methods established by Oliver
and colleagues (1955) and Zammit and colleagues (1976), respectively (11,
12).
Determination of plasma interleukin levels
Plasma levels of IL-6, IL-1, TNF-, IL-8, and IL-1ra were determined based
on the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using a DuoSet Kit
(Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), following the
manufacturer.s instructions.
Determination of serum CRP levels
CRP was determined by a highly sensitive immunoturbidimetric method
(Bioclin Diagnostics, So Paulo, Brazil) according to the manufacturer.s
instructions.
Cell viability assay (proportion of necrotic cells)
Viability of macrophages was assessed using a FACSCalibur Cytometer
(Becton Dickinson Systems, San Jose, CA, USA) (9). The percentage of
viable cells in each sample was determined using propidium iodide stain


74
(solution at 0.05% in PBS). Ten thousand events were analyzed per sample.
Fluorescence of the propidium iodide was measured using the FL2 channel
(orange-red fluorescence = 585/42 nm).
Proportion of cells with DNA fragmentation
DNA fragmentation was analyzed by flow cytometry after DNA staining
with propidium iodide. The presence of detergent in the solution
permeabilizes the cells, which promptly incorporate the dye into DNA.
Briefly, after the incubation period, the cells were centrifuged at 1000g for
15 min at 4C. The resulting pellet was carefully resuspended in 300 L
hypotonic solution containing 50 g/mL propidium iodide, 0.1% sodium
citrate, and 0.1% Triton X-100. The cells were then incubated for 2 h at
4C. Fluorescence was measured and analyzed as described above.

STATISTICAL ANALYSIS
Comparisons were made using one-way ANOVA and Tukey.s test. The
significance was set at p<0.05. Results were obtained from three to four
separate experiments and expressed as means SD.

RESULTS
Glycaemic control
There was a significant decrease in blood glucose in control rats,
immediately following exercise, 2 hours and 24 hours after the exhaustive
treadmill regimen (Figure 1). However, the blood glucose levels in diabetic
rats remained high at all time points following exercise. There was a
significant decrease (24%) in blood glucose 2 hours post-exercise in the
diabetic animals (Figure 1).
Macrophage viability
Necrotic death of macrophages increased gradually immediately after
exercise and two hours after exercise in the control rats, but a significant


75
reduction in death was observed twenty-four hours after termination of the
intense exercise session (Figure 2A). Macrophage necrotic cell death in the
diabetic rats continued to increase up to 24hr after exercise termination
(Figure 2B). While the control group were associated with an average of
97.8% viable cells in the basal state, the diabetic group were associated with
91.5% viable cells (Figure 2). Apoptosis levels were not significantly different
between groups following exercise (Figure 3).

Plasma cytokine levels
Plasma concentration of IL-1 increased immediately and two hours
after the exhaustive exercise but decreased twenty-four hours after the
session terminated. In the diabetic rats, plasma IL-1 increased for up to
24hr after the exercise was terminated (Figure 4). The same pattern of
response was observed for TNF- (Figure 5). The control rats plasma IL-6
reached a peak two hours after strenuous exercise. The diabetic group were
associated with a constant plasma concentration of IL-6 with no differences
at any time point following the termination of exercise (Figure 6). At condition
herein studied, no alterations were observed in IL-10 and VEGF
determination (Figure 7 and 8).















76

FIGURES














77











79















80














81






















82
DISCUSSION
Accumulating evidence supports the recommendation of regular
physical activity for prevention and treatment of diabetes and other chronic
diseases that present a constant pro-inflammatory status. The practice of
regular physical activity is known to bring health benefits such as increasing
insulin sensitivity and glycemic control, decreasing of body weight and
percentage of body fat, lowering blood pressure, and reduction of overall risk
of vascular disease (1-6).
Although many scientific articles focus on importance of the immune
alterations during and the physical exercise, little is known about the
physiopathology aspect of diabetic muscular injuries and the necessary time
to diabetics athletes recovery from the initial tissue damage.
Increased levels of inflammatory mediators such as pro-inflammatory
cytokines have been reported in diabetic states to be a consequence and/or
cause of hyperglycemia (13, 14). Pro-inflammatory cytokines and free fatty
acids have been considered the link between inflammation and insulin
resistance. At a molecular level, exposure of cells to TNF-, IL-1 or IL-6
stimulated inhibitory phosphorylation of serine residues of insulin receptor.
This effect is directly involved in insulin resistance.
Additionally, abnormal levels of pro-inflammatory cytokines participate in the
development of vascular complications and increasing susceptibility to
invasive microorganisms (15). Recently our group demonstrated that
moderate exercise improves leukocyte function and decreases inflammation
in diabetes rats (6). We demonstrated that three-week moderate exercise
regimen on a treadmill decreased serum levels of TNF-, CINC-2/, IL-1,
IL-6, CRP and FFA in diabetic rats when compared with sedentary diabetic
animals. Exercise also attenuated the increased responsiveness of
leucocytes from diabetics when compared to controls, diminishing the
release of ROS release by neutrophils and macrophages (6). Neutrophils
and monocytes/macrophages from diabetic patients show impaired functions
such as migration to inflammatory sites, phagocytosis, release of lytic
proteases, production of ROS and apoptosis (16, 17). The impaired


83

responsiveness of neutrophils and macrophages of diabetics are considered
part of the scenario of diabetes physiopathology.
The combined effect of an increment in the production of TNF- and IL-
1 in diabetic patients may intensify the inflammatory response and
contribute to hyperglycemic behavior and genesis of diabetic complications.
Additionally, the overtraining in diabetics can also increase serum levels of
hyperglycemic hormones such as adrenalin (18). Therefore, the prescription
of exercise for these patients need be done carefully and individually.
Additionally several studies have shown that exhaustive physical exercise
leads to immunosuppressive, in diabetics, the immunosuppressive phase
may be different from non diabetic person.

Acknowledgements
This research was supported by the Brazilian research funding agencies
FAPESP (Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo) and
CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico).


REFERENCES:

1. Mathur N, Pedersen BK. Exercise as a mean to control low-grade
systemic inflammation. Mediators Inflamm 2008;2008:109502.
2. Madden KM, Lockhart C, Cuff D, Potter TF, Meneilly GS. Short-term
aerobic exercise reduces arterial stiffness in older adults with type 2
diabetes, hypertension, and hypercholesterolemia. Diabetes Care
2009;32:1531-35.




84

3. Williams PT. Reduced diabetic, hypertensive, and cholesterol medication
use with walking. Med Sci Sports Exerc 2008;40:433-43.

4. Pedersen BK. The anti-inflammatory effect of exercise: its role in diabetes
and cardiovascular disease control. Essays Biochem 2006;42:105-17.
5. Bruce CR, Hawley JA. Improvements in insulin resistance with aerobic
exercise training: a lipocentric approach. Med Sci Sports Exerc
2004;36:1196-1.
6. Belotto MF, Magdalon J, Rodrigues HG, Vinolo MAR, Curi R, Pithon-Curi
TC, Hatanaka E.Moderate exercise improves leukocyte function and
decreases inflammation in diabetes. Clinical and Experimental Immunology
2010 (in press).
7. Gleeson M. Immune function in sport and exercise. J Appl Physiol. 2007
Aug;103(2):693-9.
8. Association AD: Standards of medical care in diabetes--2009. Diabetes
Care 2009, 32:S13-S61.
9. Marwick T, Hordern M, Miller T, Chyun D, Bertoni A, Blumenthal R,
Philippides G, Rocchini A: Exercise Training for Type 2 Diabetes.
10. Mellitus Impact on Cardiovascular Risk: A Scientific Statement From the
American Heart Association. Circulation 2009, 119:3244-3262.
11. Oliver IY. A spectrophotometric method for the determination of creatine
phosphokinase and myokinase. Biochem J 1995;61:116-22.
12. Zammit VA, Newsholme EA. The maximum activities of hexokinase,
phosphorylase, phosphofructokinase, glycerol phosphate dehydrogenases,


85

lactate dehydrogenase, octopine dehydrogenase, phosphoenolpyruvate
carboxykinase, nucleoside diphosphatekinase, glutamate-oxaloacetate
transaminase and arginine kinase in relation to carbohydrate utilization in
muscles from marine invertebrates. Biochem J 1976;160: 447.62.
13. Tilg H, Moschen AR. Inflammatory mechanisms in the regulation of
insulin resistance. Mol Med 2008;14:222-31.
14. Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying
mechanism. Diabetes 2005;54:1615-5.
15. Bensinger SJ, Tontonoz P. Integration of metabolism and inflammation
by lipid-activated nuclear receptors. Nature 2008;454:470-7.
16. Hatanaka E, Monteagudo PT, Marrocos MS, Campa A. Interaction
between serum amyloid A and leukocytes - a possible role in the
progression of vascular complications in diabetes. Immunol Let
2007;108:160-6.
17. Hatanaka E, Monteagudo PT, Marrocos MS, Campa A. Neutrophils and
monocytes as potentially important sources of proinflammatory cytokines in
diabetes. Clin Exp Immunol 2006;146:443-7.
18. Jensen J, Lai YC. Regulation of muscle glycogen synthase
phosphorylation and kinetic properties by insulin, exercise, adrenaline and
role in insulin resistance. Arch Physiol Biochem. 2009 Feb;115(1):13-21.