Tiroides, Maestria 2013

H
2
O
2
Gen de la TG Transcripcin
ARNm
Traduccin
I
-
Gen de la TPO
TSH
receptor de TSH
protena G
GDP
GS
TG
TPO
NIS
Pendrina
RXR
Zn
TR
Zn
Co-activador
TRE
O HO CH2 OH
NH2
COOH
I
I
I
TATA
Gen Blanco
TF IIB
TBP
Membrana basolateral
Membrana apical
Transcripcin
T
3
I
-
RNA pol
TTF-1, TTF-2, PAX8
ThOX
Gentica Molecular de las Patologas
Tiroideas
Prof. Dra. Carina M. Rivolta
H
2
O
2
ARNm
Traduccin
I
-
Gen de la TPO
TSH
receptor de TSH
protena G
GDP
GS
TG
TPO
NIS
Pendrina
RXR
Zn
TR
Zn
Co-activador
TRE
O HO CH2 OH
NH2
COOH
I
I
I
TATA
Gen Blanco
TF IIB
TBP
Membrana apical
Transcripcin
T
3
I
-
RNA pol
TTF-1, TTF-2, PAX8
ThOX
Hipotiroidismo Congnito con Bocio
Hipotiroidismo Congnito
Incidencia: 1/1900 - 1/3000 recin nacidos.
Hipotiroidismo sin bocio (75 %)
Hipotiroidismo con bocio (15-20 %)
Hipotiroidismo transiente: < 10% de los casos con HC diagnosticado.

Pesquisa Neonatal de Hipotiroidismo Congnito
Provincia de Crdoba

Muestras Procesadas en el Hospital de
Nios desde 1996: 252599

Pacientes diagnosticados: 124

Pac. derivados de otros Centros: 44

Total de pacientes en el programa:168

Lnea de Corte de TSH 10 UI/ml
Incidencia 1/2122
Clasificacin Etiolgica de hipotiroidismo congnito
n=168 pacientes
Disgenesias
105 pacientes
Glndulas eutpicas
58 pacientes
2pac no
determ
3 pac
transitorio
62.5%
34.5%
12%
23%
3%
62%
Con TG baja
Con TG normal
Con TG alta
Otros
Glndulas eutpicas n=58
6 pacientes (4 flias no
relacionadas).
19 pacientes (15 flias no
relacionadas).
Muestras analizadas
I
+
I
-
H
2
O
2
Mit
Dit
Mit
Dit
T
3
T
4
TG
TG
Lumen folicular
Pendrina
Duox TPO
NIS
I
-
Na
+
Circulacin sangunea
Esquema simplificado de la sntesis de hormonas tiroideas
hAIT: transportador de yodo apical
RXR
Zn
TR
Zn
Co-activador
OH
NH2
I
I
I
Gen Blanco
TRE
O HO CH2
COOH
TATA
TF IIB
TBP
Transcripcin
T
3
RNA pol
H
2
O
2
Gen de la TG

Transcripcin
ARNm
T raduccin
I
-
Gen de la TPO
TSH
receptor de TSH
protena G
GDP
GS
TG
TPO
NIS
Pendrina
Membrana apical
I
-
TTF-1, TTF-2, PAX8
ThOX
Fisiologa molecular
Diagnstico bioqumico de bocios congnitos
Por defecto de TG
Por defecto de
Organificacin
T3 y T4
TSH
TG srica
Descarga de perclorato Negativa Positiva
Defecto de
organificacin
Normal
ClO4
-
2
30
20
C
a
p
t
a
c
i
n

d
e

Y
o
d
o

R
a
d
i
a
c
t
i
v
o

(
%

d
e

l
a

d
o
s
i
s

a
d
m
i
n
i
s
t
r
a
d
a
)

Prueba de descarga de perclorato
10
horas 5
TSH TSH TSH TSH TSH
T
4
T
3

T
4
T
3

T
4
T
3

T
4
T
3

T
4
T
3

TG TG
TG TG TG
TG TPO
DUOX2
DUOXA2
TTF1
TTF2
PAX8
NKX2.5
TSHR
DEHAL1
TSH srica y

TT
4
y TT
3
srica

TG srica

Tamao de la Tiroides
Test de descarga de
Perclorato
Gene(s) involucrados
Disgenesias
Tiroideas y
Resistencia a
TSH

Defecto de la
Organificacin
del Ioduro
Defecto de la
Sntesis de la
Tiroglobulina

Defecto del
reciclado del
Ioduro
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
Descarga de Perclorato
H
2
O
2
ARNm
Traduccin
I
-
Gen de la TPO
TSH
receptor de TSH
protena G
GDP
GS
TG
TPO
NIS
Pendrina
RXR
Zn
TR
Zn
Co-activador
TRE
O HO CH2 OH
NH2
COOH
I
I
I
TATA
Gen Blanco
TF IIB
TBP
Membrana apical
Transcripcin
T
3
I
-
RNA pol
TTF-1, TTF-2, PAX8
ThOX
Bsqueda de mutaciones en el gen de TPO
1 2 3 4 5 6 7 8* 9* 10* 11 12 13 14 15 16 17
5
3
Gen: 131 Kb
5 3
NH
2
COOH
ARNm: 3048 nts
Protena: 933 aa
2p24-p25
Cromosoma 2
Representacin esquemtica del gen de TPO y su protena
S
S
S
S
G 307
G 342
H 407
478 G
H (494,511,520,586) (Distal)
G 569
G: sitios de glicosilacin
H: residuos histidina
Membrana Apical
Lumen
Citoplasma
G 129
NH
2
Leu 933
(Proximal)

dH239 pH494
An peroxidase CCP EGF
COOH NH
2
TM ICD ECD
SP
D238 E399
1 125 250 375 500 625 750 875 933
wild type
aa
Representacin esquemtica de la TPO
Ex. 5-12 Ex. 13 y 14
Ex.14
Ex.15
Ex.16 y 17
CCP: prot. control del complemento
Exn Posicin
a
Cambio nucleotdico Naturaleza de la mutacin
1 -35 A G Polimorfismo (Promotor)
1 11 G A Polimorfismo (5-utr)
2 141 ins 20 pb Frameshift, conduciendo a una seal de terminacin
temprana en el exn 3.
3 247 G C Ala 53 Pro
intrn 4 T C Polimorfismo
4 439 G C GG/gt GC/gt (posiblemente afecte al splicing)
7 808 G A Asp 240 Asn
7 859 G T Polimorfismo (Ala Ser)
8 1066 G A Ala 326 Thr
8 1207 G T Polimorfismo (Ala Ser)
8 1277 ins GGCC Frameshift , conduciendo a una seal de terminacin
8 1283 G C Polimorfismo (Ser Thr)
8 1425 del C Frameshift , conduciendo a una seal de terminacin
9 1429 A T Ile 447 Phe
9 1463 T C Leu 458 Pro
9 1447 T G Tyr 453 Asp
9 1562 G A Arg 491 His
9 1567 G A Gly 493 Ser
9 1671 G T Trp 527 Cys
10 1708 C T Arg 540 stop
10 1818 G A Polimorfismo (Ala Ala)
10 1858 G A AG/gt AA/gt (posiblemente afecte el splicing)
+1 intrn 10 G A AG/gt AG/at (posiblemente afecte el splicing)
11 2033 G A Arg 648 Gln
11 2068 C G Gln 660 Glu
11 2088 C T Polimorfismo (Asp Asp)
Intrn 11 C T Polimorfismo
12 2167 C T Arg 693 Trp
12 2235 C T Polimorfismo (Pro Pro)
12 2243/2244 del TT Frameshift , resultando directamente en una seal de
terminacin temprana: Phe 718 stop.
12 2263 A C Polimorfismo (Thr Pro)
13 2333 del T Frameshift , conduciendo a una seal de terminacin
13 2358-2359 ins T Frameshift , conduciendo a una seal de terminacin
13 2476 G T Asp 796 Tyr
14 2485 G A Glu 799 Lys
14 2505-2511 ins C Frameshift , conduciendo a una seal de terminacin
14 2512 del T Frameshift , conduciendo a una seal de terminacin
17 2973 G C Polimorfismo (3-utr)
17 3007 G T Polimorfismo (3-utr)

Mutaciones y polimorfismos en el gen de TPO
Numeracin de
posicin segn
nomenclatura de
Kimura (1989).
Frameshift
Missense
Splicing
CTP

Frecuencia mutaciones
+
-
Objetivo
Identificar nuevas mutaciones en el
gen de TPO y desarrollar nuevas
herramientas diagnsticas
moleculares.
Muestras de Sangre Perifrica

Purificacin ADNg
Tcnica de CTAB

PCR

Productos con patrn diferencial de migracin

Secuenciacin

Materiales y Mtodos
RFLP
Poblacional
Poliacrilamida 8-10%
Tincin Argntica
Agarosa 3%
16 Familias
SSCP
Clonado
Homo sapiens TPO p.R595K VLSNSSTLDLASINLQRGRDHGLPGYNEWKEFCGLPRLETPADLSTAIASRSVADKILDLY
Homo sapiens TPO VLSNSSTLDLASINLQRGRDHGLPGYNEWREFCGLPRLETPADLSTAIASRSVADKILDLY
Pan troglodytes TPO VLSNSSTLDLASINLQRGRDHGLPGYNEWREFCGLPRLETPADLSTAITSRSVADKILDLY
Macaca mulatta TPO VLSNSSTLDLASINLQRGRDHGLPGYNEWREFCGLPRLETPADLSTAIASRSVADKILDLY
Bos taurus TPO VLSDAGTLDLASINLQRGRDHGLPGYNEWRQFCGLSRLETRADLGAATANGSMADRILDLY
Rattus norvegicus TPO VLSNVGTLDLASLNLQRGRDHGLPGYNEWREFCGLSRLDTGAELNKAIANRSMVNKIMELY
Mus musculus TPO VLSNVGTLDLASLNLQRGRDHGLPDYNEWREFCGLSRLETPAELNKAIANRSMVNKIMDLY
Canis familiaris TPO VLGSSGSLDLGSINLQRGRDHGLPGYNAWREFCGLGRLHTRAELRSAVANATLAGRIMDLY
Homo sapiens MPO QVMRI-GLDLPALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLPQPETVGQLGTVLRNLKLARKLMEQY
Pan troglodytes MPO QVMRI-GLDLPALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLPQPETVGQLGTVLRNLKLARKLMEQY
Macaca mulatta MPO QVMRI-GLDLPALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLPQPNTVGELGTVLRNLELARKLMEQY
Bos taurus MPO QVMRI-GLDLPALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLPVPNTVGELGTVLRNLDLARRLMKLY
Rattus norvegicus MPO QVMRI-GLDLPALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLPQPSTVGELGTVLKNLELARKLMAQY
Mus musculus MPO QVMRI-GLDLPALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLPQPSTVGELGTVLKNLELARKLMAQY
Canis familiaris MPO QVMRI-GLDLPALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLPQPSTVGELATVLRNLDLAQKLMQQY
Homo sapiens LPO PTHRIHGFDLAAINTQRCRDHGQPGYNSWRAFCDLSQPQTLEELNTVLKSKMLAKKLLGLY
Bos taurus LPO PTHKIHGFDLAAINLQRCRDHGMPGYNSWRGFCGLSQPKTLKGLQTVLKNKILAKKLMDLY
Rattus norvegicus LPO PTHTIHGFDLASINIQRCRDHGMPGYNSWRAFCGLSQPKTLEELSAVMENEVLAKKLLDLY
Mus musculus LPO PNHTIHGFDLASINIQRSRDHGQPGYNSWRAFCGLSQPKTLEELSAVMKNEVLAKKLMDLY
Homo sapiens EPO QVRRI-GLDLAALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLSQPRNLAQLSRVLKNQDLARKFLNLY
Pan troglodytes EPO QVRRI-GLDLAALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLSQPRNLAQLSRVLKNQDLARKFLNLY
Macaca mulatta EPO QVRRI-GLDLAALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLSQPRNLAQLSRVLKNQDLARKFLNLY
Rattus norvegicus EPO QVRRI-GLDLAALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCGLSQPRNLAQLSRVLKNRNLARKFLNLY
Canis familiaris EPO QVRRI-GLDLAALNMQRSRDHGLPGYNAWRRFCSLSQPRNLAQLSRVLRNQDLARKFLNLY
Prediccin de Cambio en la Estructura Secundaria de TPO
Wilde Type
TERLFVLSNSSTLDLASINLQRGRDHGLPGYNEWREFCGLPRLETPADLSTAIASRSVADKILDLYKHPD
hheeeeeccccchhhhhhhhhcccccccccccchhhhcccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhcccc
p.R595K
TERLFVLSNSSTLDLASINLQRGRDHGLPGYNEWKEFCGLPRLETPADLSTAIASRSVADKILDLYKHPD
hheeeeeccccchhhhhhhhhcccccccccccchhcccccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhcccc

Anlisis
Bioinformtico
TPO
Promotor y
17 exones + regiones
intrnicas flanqueantes

TPO: p.R396fsX472
SSCP
Diseo de primers
PCR: 300 pb
Exn
Duplicacin en el exn 8B
c.1186_1187insGGCC
p.R396fsX472

Anlisis con ER
La duplicacin genera un
nuevo sitio de corte Nae I .
Gel de agarosa al 3 % . 1: Marcador de
PM; 2: PD sin digerir; 3: N14 incubado
con NaeI pero no digerido por la misma;
4: PD digerido; 5: PL digerido.
1 2 3 4 5
246 pb
214 pb
Exon 8 p.R396fsX472
Exon 11 p.R595K
Exon 11 p.R595K Exon 8 p.R396fsX472
II-1 II-2 II-3 II-4 II-5 II-6 II-7 II-8 II-9 II-10
I-1
I-2
Family 1
?
T G A G T G G A A G G A G T T C
G
G A G A C G G C C G C G C C A
G A G A C G G C C G G C C G C
Patient A Patient B
TPO gene
I-2 I-1
II-2
Family 2
Exon 8 p.R396fsX472
Exon 11 wild-type
T G G A G G G A G T T C T
Exon 8
Exon 11
A
Exon 8
Exon 11
A
II-1
A
Exon 11 p.R595K
Exon 8 p.R396fsX472
Exon 11 p.R595K
Patient C Patient D
Exon 11 wild-type
TPO gene
Exon 11 p.R595K
Family 3 I-1
II-1
II-2
III-1 III-2 III-3 III-4
I-2
II-3
?
?
G G A A G G A G G G A A G G A G G G A G G G A G
G G A A G G A G
G G A A G G A G
G
G G A A G G A G
G
G
G G A A G G A G
Paciente E Paciente F
TPO gene
I-1
II-2
Family 4
I-2
Exon 7 p.Q266X Exon 7 wild-type
Exon 7 p.Q266X

Exon 7 p.Q266X
Exon 11 p.G667D
T G C G G G A C G G T G A C T
Exon 11 p.G667D
T G C G G G A C G G T G A C T

Exon 11 p.G667D

T G A G A A C C A A A A C C C
T G A G A A C C A A A A C C C T G A G A A C C A A A A C C C
Exon 11 wild-type
T G C G G G A T G G T G A C T

T
A
T
T A
Patient G
TPO gene
I-2 I-1
II-2
Family 5
II-1
Exon 8 p.R396fsX472
Exon 8
Exon 8
TPO gene
I-2 I-1
Family 6
II-1
?
ESEFINDER2.0

Desaparicin de un Sitio Aceptor de Splicing
WT
MUT
WT MUT
T C T G C A T T T T T G C A G G A G A G T G C
C
Intron 16
T C T G C A T T T T T G C A G G A G A G T G C
C
Intron 16
Intron 16 g.IVS16-2AC
TPO gene
Prediccin de Cambio en la Estructura Secundaria de TPO
Wilde Type
TERLFVLSNSSTLDLASINLQRGRDHGLPGYNEWREFCGLPRLETPADLSTAIASRSVADKILDLYKHPD
hheeeeeccccchhhhhhhhhcccccccccccchhhhcccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhcccc

p.R595K
TERLFVLSNSSTLDLASINLQRGRDHGLPGYNEWKEFCGLPRLETPADLSTAIASRSVADKILDLYKHPD
hheeeeeccccchhhhhhhhhcccccccccccchhcccccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhcccc

http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html
Anlisis Evolutivo - Homologa Proteica
c.1874 G>A, p.R595K
Representacin de la estructura modelada de TPO.
Swiss Model
Modelado por homologa (Isoforma C de la mieloperoxidasa)
TYR 591
ARG 595
GLU 641
PRO 601
LYS 595
TYR 591
PRO 601
GLU 641
p.R595K
Superficies electrostticas de wt R595 y mut K595
Table 1: Laboratory data in patients with congenital goitrous
hypothyroidism and organification defect.

Families Patie
nts
Age
(years)
Mutations Age at
diagnosis
Serum
TSH
(uIU/ml)
Serum
FT4
(ng/dl)
Serum TT4
(ug/dl)
Serum
TT3
(ng/dl)
Serum TG
(ug/l)
1 A 17 p.R396fsX472/p.R595K 2 months,
24 days
> 50 0.02 0.42 31 605
1 B 9 p.R396fsX472/p.R595K

1 month >100 0.05 0.42 24 1000
2 C 15 p.R396fsX472/p.R595K 27 days 19 2.4 N/A N/A 145
2 D 13 p.R396fsX472/p.R595K

1 month 350 0.01 0.42 34 3500
3 E 11 p.R595K 2 month 420 0.01 0.42 35 1260
3 F 8 p.R595K

7 days 524 0.14 1.4 49.3 528
Reference
Range:
0.64-10.5
(0-15 days)
0.44-8.8
(15-30
days)
1.1 - 7.0
(30-60
days)
0.9 2.3 8.0-17
(1-4 weeks)
7.2-15.6
(1-12
months)
117-263
(1-4
weeks)
105-245
(1-12
months)
28.9-173
(<15 days)
6.44-82.8
(>15 days)
Families Patients TPO Mutation DUOX2
Mutation
Family 4 G p.V748M/ ?
Family 5 H p.R396fsX472/?
Family 6 I g.IVS16-2AC/?
Family 7 J p.A1088fs1100/
?

Table 2: TPO and DuoxA2 mutations in patients with congenital goitrous
hypothyroidism and organification defect.
Exn Cambio nucleotdico Consecuencia a nivel
proteico
N de
pacientes
Test de
Perclorato (%)
5 c.387delC Cambio de marco de
lectura p.N129fsX208
1 80
8 c.920A>C (AAC>ACC) Cambio de aminocido
(p.N307T)
2 69/80
8 c.1186_1187insGGCC Cambio de marco de
lectura p.R396fsX472
2 84/99
8 c.1297G>A (GTG>ATG) Cambio de aminocido
(p.V433M)
1 99
9 c.1496C>T (CCG>CTG) Cambio de aminocido
(p.P499L)
1 99
14 c.2422T>C (TGC>CGC) Cambio de aminocido
(p.C8O8R)
1 77

Exn Posicin Cambio nucleotdico Consecuencia a nivel proteico
1 -35 A G Polimorfismo (promotor)
1 11 A G Polimorfismo
intrn 3 -47 A C Polimorfismo
intrn 4 +31 T C Polimorfismo
8 1207 G T Polimorfismo (A373S)
8 1283 G C Polimorfismo (S398T)
9 1473 G A Polimorfismo (R461E)
11 2068 C G Polimorfismo (Q660E)
11 2088 C T Polimorfismo (D666D)
15 2630 T C Polimorfismo (V847A)
intrn 16 +44 G T Polimorfismo

Mutaciones identificadas en el gen de TPO
Polimorfismos identificados en el gen de TPO
8 c.1159G>A (GGG>AGG) Cambio de aminocido 1 80
(p.G387R)
4 c.215delA Cambio de marco de
lectura p.Q72fsX86 1 77
A
n
a
l
i
z
a
n
d
o

e
l

R
N
A
m

s
e

p
o
d
r
a

e
s
t
u
d
i
a
r

s
i

e
x
i
s
t
e

u
n

s
p
l
i
c
i
n
g

c
o
r
r
e
c
t
o
r

d
e
l

m
a
r
c
o
.

Transcriptos de TPO generados por splicing alternativo
TPO-2: sin ex. 10
TPO-3 (TPOzanelli): sin ex. 16
TPO-4: sin ex. 14
TPO-5: sin ex. 8
TPO 2/3: sin ex. 10 ni 16
TPO 2/4: sin ex. 10 ni 14
TPO-6: sin ex. 10, 12, 13, 14 ni 16.
dH239 pH494
An peroxidase CCP EGF
COOH NH
2
TM ICD ECD
SP
D238 E399
1 125 250 375 500 625 750 875 933
COOH NH
2
p.G387R
COOH NH
2
p.C808R
COOH NH
2
NH
2
COOH p.N129fsX208

p.Q72fsX86
wild type
p.C808R
p.G387R

aa
Representacin esquemtica de los dominios
en las TPO wild-type y mutadas
Podra estar alterado el mecanismo
cataltico, por dao en los sitios de
unin al hemo.
Desaparece una de las C que forman ptes disulturo alterando la
estructura 3 del dominio que une calcio del sitio EGF.

Debido a que el modo de herencia de este defecto de
organificacin es autosmico recesivo, anlisis adicional por
secuenciacin es necesario para el resto de los exones de TPO en
en los pacientes en los cuales se identific una mutacin con el
objeto de encontrar la otra. En aquellos pacientes en los cuales no
se identificaron mutaciones en el gen de TPO, debera hacerse
una bsqueda de mutaciones en el gen DUOX2
Las mutaciones identificadas en este estudio mejorn el
diagnstico de esta patologa gentica recesiva.
Conclusiones TPO
Deteccin de la actividad in situ con 3,3 diaminobenzidina
Lnea de clulas de insecto Mimic Sf9
Determinacin de la actividad de TPO por ensayos de expresin.
Detection of in situ Horseradish Peroxidase activity by plaque assay with
3,3diaminobenzidine.(Mendive FM, Segura MM, Targovnik HM, Cascone O,
Miranda MV. Brazilian Journal of Chemical Engineering 20: 33-38, 2003)
Baculovirus
Vector de
transferencia
Baculovirus ADN lineal

Cosecha del baculovirus recombinante
o
Baculovirus
ADN lineal 150 kb
Sistema del Baculovirus
Gen de la protena de la cubierta
Gen de inters
clonado en pAcGP67B
Vector de transferencia
Transfeccin en clulas de insecto
Recombinacin homloga
El virus provoca lisis celular
Las clulas captan el virus y
el vector
Infeccin de nuevas clulas con
virus recombinantes
Procesamiento
para comprobar
produccin de
protena
(fosfato de Calcio o liposomas)
Vector de transferencia y expresin del
+ ATG
+ TGA
Baculovirus
ADN lineal 150 kb
Gen de la protena de la cubierta
Gen de inters
clonado en pAcGP67B
Transfeccin en clulas de insecto
Recombinacin homloga
El virus provoca lisis celular
Las clulas captan el virus y
el vector
Infeccin de nuevas clulas con
virus recombinantes
Procesamiento
para comprobar
produccin de
protena
(fosfato de Calcio o liposomas)
Utilidades del Sistema del Baculovirus
Deteccin de la actividad in situ con 3,3 diaminobenzidina
Lnea de clulas de insecto Mimic Sf9
Expresin de alelos mutados de la TPO y determinacin de la
actividad enzimtica
Cosecha del baculovirus recombinante
Clonado de productos de PCR
X
X
X
X
X
X
X
X
Sntesis del vector mutado
obtenido de E. Coli dam+
Digestin del templado con Dpn1
la cual reconoce: 5 Gm
6
ATC-3
Transformacin de clulas XL1-
Blue supercompetent cells
pGEMT + inserto
Primer Foward: 5CCA TGA TTA CGC TAA
GCG CGC AAT TAA CCC TCA C 3
Primer Reverse: 5GTG AGG GTT AAT TGC
GCG CTT AGC GTA ATC ATG G 3
Introduccin de la mutacin deseada por medio de primers

TPO 5787pb
3015 pb
pGEMT
pGEMT easy
I
Digestin con EcoRI
recombinante
H
2
O
2
ARNm
Traduccin
I
-
Gen de la TPO
TSH
receptor de TSH
protena G
GDP
GS
TG
TPO
NIS
Pendrina
RXR
Zn
TR
Zn
Co-activador
TRE
O HO CH2 OH
NH2
COOH
I
I
I
TATA
Gen Blanco
TF IIB
TBP
Membrana apical
Transcripcin
T
3
I
-
RNA pol
TTF-1, TTF-2, PAX8
ThOX
Bsqueda de mutaciones en el sistema DUOX
eje pituitario
Origen del defecto:

terciario eje hipotalmico
secundario
primario
tiroides
Existencia de bocio:
Hipotiroidismo no bocioso (80 %)
Causas: agenesia, disgenesia o hipoplasia
Genes alterados: TSH-, TTF1, TTF2, PAX 8, RTSH
Hipotiroidismo con bocio (20 %)
Causa: defectos en la sntesis de hormonas tiroideas
Genes alterados: TG, TPO, Pendrina, NIS, DUOX2
Modo de herencia: Autosmico recesivo
5
3
Gen: 21,5 Kb
5 3
NH
2
COOH
ARNm: 6376 nts
Pre-Protena: 26+1522 aa
Cromosoma 15
Representacin esquemtica del gen de DUOX2 y su protena
(miembro de la familia NOX de NADPH oxidasas)
33 exones
Representacin esquemtica de la protena DUOX2
TPO - like
EF - hand
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
FAD
binding
site
NADPH
binding
site
I II III IV V V I VII
SP
TPO - like
EF - hand
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
FAD
binding
site
NADPH
binding
site
I II III IV V V I VII
SP
Y

Y

O
2
-
NADPH
FAD
hemo
hemo
N
C
Ca
2+
Ca
2+
wild type
1548aa
Primeras mutaciones inactivantes
identificadas en el gen de DUOX 2
-p.R434X
-p.Q686X
-p.R701X

-p.S965fsX994
Gen DUOX 1
-Codifica una protena de 1551 aas con 83% de
homologa con DUOX 2.

-No se han identificado mutaciones en el gen de
DUOX 1.

Objetivo
Identificar nuevas mutaciones en el
gen de DUOX2 y desarrollar nuevas
herramientas diagnsticas
moleculares.
Seleccin de 17 pacientes (descarga de perclorato 38 %)
PCR de los exones + uniones exn/intrn + el promotor
SSCP en geles de poliacrilamida al 8 % y 10 % con o sin 10 % glicerol
Pacientes
Metodologa
Purificacin de ADN genmico a partir de sangre perifrica.
Secuenciacin
Muestras con patrn de migracin diferencial en SSCP
B
I-1 I-2 II-1 II-2
I-1 I-2 II-1 II-2
I-1 I-2 II-1 II-2 II-3 II-4 III-1
I-1 I-2 II-1 II-2 II-3 II-4 III-1
c.108G>C;
p.Q36H
c.2895-
2898delGTTC;
p. S965fsX994
c.1253delG;
p.G418fsX482
g.IVS19-2A>C
A
II-4
I-1
I-2
II-1 II-2 II-3
III-1
II-2
I-1
I-2
II-1
Family 1 Family 2
46% de descarga
60% de descarga

Ex 2
Ex 11
Ex 21
(conocida)
Intrn 19
Anlisis de segregacin de los alelos mutados
Afectar el
splicing?
O
2
-
NADPH
FAD
hemo
hemo
N
C
Ca
2+
Ca
2+
c.2895-2898delGTTC;
p. S965fsX994
c.1253delG;
p.G418fsX482
Frameshift mutations identificadas en DUOX2
5 EcoR I Sac I Xho I Not I Pst I BamH I EcoR V 3
pSPL3
Sitio de
clonado
(SC)

5 SS 3 SS
Seal de poliadenilacin
6030 pb
SV40 origen y
promotor
Amp R
ori
Vector pSPL3 y estudios de splicing
In17F-NotI
In22R-BamH1
18 19 20 21 22
Intrn 17
Intrn 22
Prod. de 3900 pb (Elongasa)
Purificacin a partir del gel de agarosa
Purificacin con columna
Digestin con NotI y BamH1
Clonado direccional en el vector pSPL3 dentro de los sitios NotI y
BamH1 y cl DH5 competentes.
Purificacin del plsmido con columna y secuenciacin.
X
Mtodos 1
1- Clonar un fragmento de DNA genmico dentro del
sitio de clonado (mini gen).
2- Transfectar clulas COS o CV1.
3- Expresin desde el promotor SV40 producto de
RNA
4-Aislar el ARN y usarlo como templado para producir
cDNA
5- Amplificar por PCR usando los primers especficos
para los exones del vector.
Mtodos 2
Wild-Type RT-PCR product
Mutant RT-PCR product
g.IVS19-2A>C
e18 e19 e20 e21 e22
i17 i18 intrn 19 i20 i21 i22
Bam HI Not I
gt
ag
ag
cg
pSPL3
pSPL3
SV40
promoter
e18F e22R
exons: 18 19 22
exons: 18 19 20 22
gt
438 pb
241 pb
gt
MW WT Mut C (-)
438 pb
241 pb
Expresin in vitro de minigenes wild-type y mutante
Gel de agarosa al 2 %
QDALSLPWEVQRYDGWFNNLRHHERGAV

Duox2 [Homo sapiens] QDALSLPWEVQRYDGWFNNLRHHERGAV
Duox2 [Bos taurus] QDALSLTWEVQRYDGWFNNLRQHEHGA-
Duox2 [Sus scrofa] QDALSLTWEVQRYDGWFNNLRQHEHGA-
Duox2 [Rattus norvegicus] QDAPSLPREVQRYDGWFNNLKYHQRGA-
Duox2 [Gallus gallus] -------WEVQRYDGWYNNLQHRSRGSV
Duox2 [Mus musculus] QNSIS--WEVQRFDGWYNNL--------
Duox1 [Homo sapiens] QNPIS--WEVQRFDGWYNNL--------
Duox1 [Rattus norvegicus] QNPVS--WEVQRFDGWYNNL--------
Duox1 [Canis familiaris] -------WEVQRFDGWYNNL--------

Anlisis de Homologa Proteica
Conservacin del residuo glutamina involucrado en la
mutacin p.Q36H?.

A Wild-Type
NH
2
TPO-like
EF-hand
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
FAD
binding
site
NADPH
binding
site
I II III IV V VI VII
SP
B p.Q36H
TPO-like
EF-hand
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
FAD
binding
site
NADPH
binding
site
SP
COOH
C p.G418fsX482
Premature stop codon at
amino acid position 482
Y Y Y
TPO-like
SP
D g.IVS19-2A>C
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
TPO-like
EF-hand
I
SP
E p.S965fsX994
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
TPO-like
EF-hand
I
SP
A Wild-Type
NH
2
TPO-like
EF-hand
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
FAD
binding
site
NADPH
binding
site
SP
B p.Q36H
TPO-like
EF-hand
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
FAD
binding
site
NADPH
binding
site
SP
B p.Q36H
TPO-like
EF-hand
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
FAD
binding
site
NADPH
binding
site
SP
TPO-like
EF-hand
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
FAD
binding
site
NADPH
binding
site
SP
COOH
C p.G418fsX482
Y Y Y
TPO-like
SP
COOH
C p.G418fsX482
Y Y Y
TPO-like
SP
D g.IVS19-2A>C
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
TPO-like
EF-hand
I
SP
D g.IVS19-2A>C
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
TPO-like
EF-hand
I
SP
E p.S965fsX994
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
TPO-like
EF-hand
I
SP
E p.S965fsX994
NH
2 COOH
Y Y Y Y Y
TPO-like
EF-hand
I
SP
Efecto de las mutaciones sobre la estructura proteica
CTP Ex:12
CTP Ex: 22
TPO and DUOX2 mutations identified in patients with congenital goitrous hypothyroidism and organification defect.

Individuals
Perchlorate
discharge test,
%

TPO mutations

DUOX2 mutations

AE 69 p.N307T/ ? Buenos Aires/Argentina
CR 99 p.P499L/ ? Buenos Aires/Argentina
CS 46 p.Q36H/ p.S965fsX994 Buenos Aires/Argentina
GA 80 p.N129fsX208/p.G387R Buenos Aires/Argentina
GF 60 p.G418fsX482/g.IVS19-2A>C Buenos Aires/Argentina
LC 90 Buenos Aires/Argentina
OC 67 Buenos Aires/Argentina
PD 84 p.R396fsX472/? Buenos Aires/Argentina
SF 80 p.N307T/? Buenos Aires/Argentina
SA 66 Buenos Aires/Argentina
PL 99 p.R396fsX472/ p.V433M Buenos Aires/Argentina
TM 77 p.Q72fsX86/p.C808R Buenos Aires/Argentina
Reference values <10 Buenos Aires/Argentina

Perspectivas
Hasta el presente se analizaron en nuestra poblacin
de pacientes, los genes de TPO, DUOX2 y DUOX A2.
Los objetivos siguientes son: - buscar mutaciones en
los genes DUOX1, DUOX A1.
- continuar con el
desarrollo de los experimentos de expresin en TPO y
DUOX2
H
2
O
2
ARNm
Traduccin
I
-
Gen de la TPO
TSH
receptor de TSH
protena G
GDP
GS
TG
TPO
NIS
Pendrina
RXR
Zn
TR
Zn
Co-activador
TRE
O HO CH2 OH
NH2
COOH
I
I
I
TATA
Gen Blanco
TF IIB
TBP
Membrana apical
Transcripcin
T
3
I
-
RNA pol
TTF-1, TTF-2, PAX8
ThOX
Bsqueda de mutaciones en el gen de TG
Here comes your footer Page 65
El gen, ARNm y
protena
tiroglobulina (TG)
humana
8q24.2-
8q24.3
Cromosoma 8
Gen: 270 Kb
ARNm: 8,5 Kb
Monmero
proteico: 2749 aa,
330kDa
1- 1 1-2 1-3 1-4 1- 5 1-6 1-7 1-8 1-9 1-10 2-1 -2 -3 1-11 Unidad Repetitiva 3a-1 3b-1 3a-2 3b-2 3a-3
Tipo I
Tipo 3 Homologa ACHE
COOH NH 2
Tipo 2
3 5
20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 22 23 24 25 26 27 28 31 32 35 37 38 40 45 48 29 30 33 34 36 39 41 42 43 44 46 47
AAAAAAAAAAAAAAA
5 3
Flia Paciente
estudiad
o
Familiar
analizado
Variacin de
secuencia en el
ADN
Cambio en la
Protena TG
8 3 Hnos M, P,
A y T
c.886C>T/
c.886C>T
p.R277X/
p.R277X
9 3 Hnos M y Hna c.886C>T/
c.886C>T
p.R277X/
p.R277X
10 1 M, P y 4
Hnos
c.378C>A
/c.3842G>A
p.Y107X/
p.C1262Y
11 2 Hnos M, P y
2 Hnos
c.2736delG
/c.6701C>A
p.R893fsX946/
p.A2215D
12 1 M, P y
1 Hno
c.5466delA/
c.7006C>T
p.K1803fsX1833/
p.R2317X
Mutaciones identificadas en el gen de TG
p.R277X (Ex 7)
p.Y107X (Ex.4)
p.C1262Y (Ex 17)
p.R893fsX946 (Ex 10)
p.A2215D (Ex 38)
p.K1803fsX1833 (Ex 28)
p.R2317X (Ex 40)
1- 1 1-2 1-3 1-4 1- 5 1-6 1-7 1-8 1-9 1-10 2
-1 -2 -3
1-11 Repetitive units 3a-1 3b-1 3a-2 3b-2 3a-3
Type 1 Type 2 Type 3 ACHE-like domain
COOH NH
2
Wild Type
1- 1 1-2 1-3
COOH NH
2
p.R277X
II-3
I-1 I-2
II-1
II-2
WT/p.R277X
p.R277X/WT
p.R277X/p.R277X p.R277X/p.R277X p.R277X/p.R277X
Familia 8
5 3
20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 22 23 24 25 26 27 28 31 32 35 37 38 40 45 48 29 30 33 34 36 39 41 42 43 44 46 47
c.7920C
c.229G c.2200G
c.2334C
c.3082G
c.3474C
c.5512G
c.5995C
c.6695C c.7408T
c.7501C
c.7589A
c.3935G
c.4506T
c.2488C
p.R277X
Mutacin en TG y polimorfismos en familia 1
Exon
I
n
t
r
o
n

1- 1 1-2 1-3 1-4 1- 5 1-6 1-7 1-8 1-9 1-10 2
-1 -2 -3
1-11 Repetitive units 3a-1 3b-1 3a-2 3b-2 3a-3
Type 1 Type 2 Type 3 ACHE-like domain
COOH NH
2
Wild Type
1- 1 1-2 1-3
COOH NH
2
p.R277X
II-3
I-1 I-2
II-1
II-2
WT/p.R277X
p.R277X/WT
p.R277X/p.R277X p.R277X/p.R277X p.R277X/p.R277X
Familia 9
12%
23%
3%
62%
Con TG baja
Con TG normal
Con TG alta
Otros
Glndulas eutpicas n=58
Mutaciones gen TPO: 4 pac. complejos
heteroc; 2 pac. homoc. ; 3 pac. con
nica mutac. heteroc. hasta el momento.

Mutacin gen DUOX2: 2 mutac .heteroc.
hasta el momento
Mutaciones gen TG: 3
pac. complejos heteroc.
y 2 pac. homoc.
Resistencia a Hormonas Tiroideas
H
2
O
2
ARNm
Traduccin
I
-
Gen de la TPO
TSH
receptor de TSH
protena G
GDP
GS
TG
TPO
NIS
Pendrina
RXR
Zn
TR
Zn
Co-activador
TRE
O HO CH2 OH
NH2
COOH
I
I
I
TATA
Gen Blanco
TF IIB
TBP
Membrana apical
Transcripcin
T
3
I
-
RNA pol
TTF-1, TTF-2, PAX8
ThOX

Resistencia a Hormonas Tiroideas (RTH)

Diagnstico:
Elevados niveles de T3 y de T4 sricas
Niveles de TSH normales o levemente elevados

Incidencia: 1/50000 nacidos vivos

Sntomas y signos:
Indicativos de hipotiroidismo e hipertiroidismo

BOCIO
TAQUICARDIA
DEFICIT DE ATENCIN
HIPERACTIVAD/TRANSTORNOS EN EL
APRENDIZAJE
BAJO IQ
BAJA ESTATURA
RETRASO EN EL DESARROLLO SEO
PRDIDA DE AUDICIN
Manifestaciones de RTH
Objetivos Generales
Resistencia Generalizada a hormonas tiroideas

ESTUDIOS DIRECTOS:
Identificacin de mutaciones en el gen THR
Diagnstico racional para la aplicacin del
tratamiento adecuado
Modelo molecular para la represin basal por co-
represores en la ausencia de T3
Co-represores: NCoR, SMRT
RXR
Zn
TR
Zn
Gen Blanco
TRE TATA
TF IIB
TBP
Transcripcin
RNA pol
X
Co -represores
HDACs sin 3
Complejo co-represor
Deacetilacin de histonas
TAFs
Activacin transcripcional por co-activadores en la
presencia de T3

RXR
Zn
TR
Zn
Co -activador
Gen Blanco
TRE TATA
TF IIB
TBP
Transcripcin
OH
NH2
I
I
I
O HO
CH2
COOH
T
3
RNA pol
CBP/P300
P/CAF
Acetilacin
de histonas
Complejo SRC/p 160
TRAP 220/
DRIP205
Complejo DRIP/TRAP
TAFs
Genes que codifican a los Receptores de
Hormonas Tiroideas (TRs)
Gen Cromosoma Isoformas Localizacin del TR
TR 17
TR 1 Generalizada
TR 2 Generalizada
TR 3
TR 1 Generalizada
TR 2 Pituitaria/SNC
Estructura y funciones de las isoformas del receptor
de hormonas tiroideas
492
TR-2 DBD
LBD
1
514
1
461
100 100
TR-1
1
410
82 86 TR-1
1
82 86
c-erbA -2
DNA binding T3-binding Transactivacin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- -

Gen: 372 Kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5
171 72 64 261 101 148 206 147 259 269 pb
3
Protena: 461 aa COOH NH
2
DBD LBD
ARNm: 1.698 b 5 3
Cromosoma 3
3p22-24
Representacin esquemtica del gen TR y su protena TR 1
1 461 aa
Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3
Hinge
AF-2
NH
2
-

-COOH

DBD LBD
Localizacin de mutaciones en el gen TR
12 hlices
Unin a T3
Heterodimerizacin
con RXR
Interaccin con co-represores y
co-activadores
D216A P247L V284I C298A V319K R338L R383H K424A K443N F455L
E217R L266K V284R C298R R320C R338W P384R T426R V444R L456R
W219K A268D D285A E299A R320H Q340H V389A T426I C446R E457A
E220R F269A K288A I302A R320L K342I V389K D427A C446X E457D
K223A G251E K288I I302M Y321C G344A E390R L428R T448R E457K
T224R K274E K289A I302R D322H G344E E393R R429A E449R E457R
E227R I276L I302V D322N G345D Q396R R429Q E449X E457T
A228G T277R L305I E324R G345R L400R R429W L450H V458A
A228M V264D K306A L328F G345S L401R M430R F451A V458E
H229G A279V K306E T329N G345V Y406K I431T F451I V458G
H229M I280S C309A L330F L346V Y409K A433R F451X V458M
V230R I280K C309K L330S G347E R410A C434X P453A F459C
A231R I280M C309W G332E V348E H413R C434R P453E E460K
T232G T281V M310I E333D V348R V414K H435L P453H
T232M T281R M310L E333Q V349M H416R H435Q P453S
A234T T281Q M310T M334K D351A W418K S437R P453T
A234X T281L M313T M334R D355A P419R R438C P453X
Q235R T281I S314C M334T M358A K420A R438H L454A
R243Q R282S S314F V336M S361R L421R L440R L454R
R243W V283I S314Y T337A N364R L422R M442T L454S
V283M R316H T337H D366R M423R M442V L454T
V284A A317T T337I D367R K424R K443E L454V
Mutaciones identificadas en el gen TR
c.1297-
1304del
GCCTG
CCA
c.1305-
1306ins
T
c.1358-
1359ins
C
Exn
7
Exn
8
Exn
9
Exn
10
25% 75%
Tipo de mutacin: Germinal
Presencia allica: Heterocigota
Tipo de Herencia: Autosmica
dominante

Caractersticas
Unidad de transcripcin
c.1358C>T
(CCT>CTT)
p.P453L
c.1297-1304delGCCTGCCA p.A433fsX461
Nomenclatura
RTH
Fenotipo Normal
Tests de funcin tiroidea
normales
RTH
Evidencias genticas y clnicas para la actividad
dominante negativa ejercida por los TR mutados
TR heterocigota
TR
TR
Mutacin puntual
TR heterocigota
TR homocigota
X
Delecin
X
X
Doble delecin
H
e
r
e
n
c
i
a

a
u
t
o
s
m
i
c
a

d
o
m
i
n
a
n
t
e

H
e
r
e
n
c
i
a

a
u
t
o
s
m
i
c
a

r
e
c
e
s
i
v
a

Dicha actividad disminuye introduciendo mutaciones en el dominio DBD
Objetivo
Investigar la alteracin molecular en el gen TR en 5
familias con un cuadro clnico compatible con GRTH.
Metodologa
Purificacin de ADN genmico a partir de sangre perifrica.
PCR de los exones 9 y 10
Secuenciacin
SSCP para validar nuevas mutaciones

3
T
G
T
T
T
C
C/A
C
C
C
C
T
T
C
T
C
5

TCAG TCAG TCAG TCAG TCAG
Padre Madre F.B. Ve.B. Vi.B.
Mutacin en el exn 10
p.P453T
Familia 1
1357:
Alelo Normal Alelo Mutado
CCT ACT
Pro (453) Thr (453)
Nueva mutacin en el exn 10
p.I431M
Familia 2

3
G
T
C
C
G
A
G
G
A/G
T
A
G
T
A
5

TCAG TCAG TCAG TCAG
Control M.A Padre Madre
1293:
N1 N2 N3 Vi.B. M.A. N4 N5 N6 N7 N8
SSCP : Gel de poliacrilamida al 10 %.
Al. normal Al. mutado
ATA ATG
Ile (431) Met (431)
Origen de novo?
-TGrI29 y TGrI30
-HLA: Ex. 2 del gen DQ1
Alelo normal Alelo mutado
CGG TGG
Arg (338) Trp (338)
Mutacin en el exn 9
p.R338W
3
A
C
C
G
G
G
G
C/T
A
C
A
G
T
G
A
C
G
5

TCAG TCAG
M.A. J.A.
1012:
Familia 3
TCAG TCAG TCAG TCAG TCAG
Padre C.B. Madre Hna 1 Hna 2
3 3
G C
A C
C T
C T
G C
T G
A C
C C
C G
G A
T C
C C
C G
G T
A A
G G
G G
A A
T T
A A
G G
5 5

N M
Nueva delecin en el exn 10 : c.1297-1304delGCCTGCCA

Madre Padre C.B. Hna1 Hna2 Control
203 pb
201 pb
199 pb
197 pb
538 pb

Madre Padre C.B. Hna1 Hna2 Control
502 pb
Alelo Normal
1145 Exon 10
.................................................ATCGCCCGGGG
R P G
CTTGCCTGTGTTGAGAGAATAGAAAAGTACCAAGATAGTTTCCTGCTGGCCTTTGAACAC
L A C V E R I E K Y Q D S F L L A F E H
TATATCAATTACCGAAAACACCACGTGACACACTTTTGGCCAAAACTCCTGATGAAGGTG
Y I N Y R K H H V T H F W P K L L M K V
1297 1304
ACAGATCTGCGGATGATAGGAGCCTGCCATGCCAGCCGCTTCCTGCACATGAAGGTGGAA
T D L R M I G A C H A S R F L H M K V E
TGCCCCACAGAACTCTTCCCCCCTTTGTTCCTGGAAGTGTTCGAGGATTAGACTGACTGA
C P T E L F P P L F L E V F E D
*
1413
ATTCATTCTCATAATTCC..........................................
Alelo Mutado
1145 Exon 10
.................................................ATCGCCCGGGG
R P G
CTTGCCTGTGTTGAGAGAATAGAAAAGTACCAAGATAGTTTCCTGCTGGCCTTTGAACAC
L A C V E R I E K Y Q D S F L L A F E H
TATATCAATTACCGAAAACACCACGTGACACACTTTTGGCCAAAACTCCTGATGAAGGTG
Y I N Y R K H H V T H F W P K L L M K V
1297-1304delGCCTGCCA
ACAGATCTGCGGATGATAGGA TGCCAGCCGCTTCCTGCACATGAAGGTGGAA
T D L R M I G C Q P L P A H E G G M
TGCCCCACAGAACTCTTCCCCCCTTTGTTCCTGGAAGTGTTCGAGGATTAGACTGACTGA
P H R T L P P F V P G S V R G L N
*
1413
ATTCATTCTCATAATTCC..........................................
Anlisis de microsatlites
TGrI29 TGrI30
Familia 4
1 461 aa
Hinge
AF-2
Wild Type
NH
2
-

-COOH

DBD LBD
1297-1304delGCCTGCCA
1 460 aa
Hinge
AF-2
NH
2
-

-COOH

DBD LBD
TCAG TCAG
M.F. Control
Nueva mutacin en el exn 9
p.L341P
Alelo Normal Alelo mutado
CTG CCG
Leu (341) Pro (341)

3
T
A
A
A
A
A
G
T/C
C
G
A
C
C
G
G
5

1307 :
Familia 5
Exn Pacientes Mutaciones Nuevas Instituciones
9 PC c.991A>G
(AAT>GAT)
p.N331D H. Gutirrez
ARGENTINA
9 MF c.1022T>C
(CTG>CCG)
p.L341P H. Gutirrez
ARGENTINA
9 AS c.1036C>T
(CTT>TTT)
p.L346F H. Gutirrez
ARGENTINA
10 MA c.1293A>G
(ATA>ATG)
p.I431M H. Garrahan
ARGENTINA
10 CB c.1297-
1304delGCCT
GCCA
p.A433fs
X461
H. Militar
Central
ARGENTINA
10 ED c.1358C>T
(CCT>CTT)
p.P453L H. Gutirrez
ARGENTINA
10 MF c.1339C>A
(CCC>ACC)
p.P447T H. R. Meja
ARGENTINA
Exn Pacientes Mutaciones conocidas Instituciones
9 MA c.1012C>T
(CGG>TGG)
p.R338W H. Garrahan
ARGENTINA
10 GC c.1357C>A
(CCT>ACT)
p.P453T H. Durn
ARGENTINA
10 VB c.1357C>A
(CCT>ACT)
p.P453T H. Eva Pern
ARGENTINA
10 NL c.1357C>A
(CCT>ACT)
p.P453T H. M.Central
ARGENTINA

9 EM c.1003G>C p.A335P IDIMI
10 (GCA>CCA) CHILE
10 AE c.1376T>G p.F459C H. Clnicas
(TTC>TGC) Uruguay
8 GF c.803C>G p.A268G H. Clnicas
(GCC>GGC) ARGENTINA

312pb
262pb

50pb
312pb
Exn 10
Amplificacin por PCR
262pb 50pb
ccannnnn nnnntgg
cccnnnnn nnnntgg
XcmI
XcmI
Agarosa 3%
MK Ndig GC BGL s/enz
Validacin de la mutacin p.P453T por digestin con XcmI
THR-WT
ESP

THR-N331D
ESP
THR-R338W
ESP
QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSDAIFDLGMSL
HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HHHHH--------EEEE--EHHH----
HHEE-----HHHHHHHH------------H---HHHHH--------EEEE--EHHH----

QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTWGQLKNGGLGVVSDAIFDLGMSL
HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HHHHH--------EEEE--EHHH----
THR-L341P
QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQPKNGGLGVVSDAIFDLGMSL

ESP
HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HEH----------EEEE--EHHH----

THR-L346F
ESP
QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGPGVVSDAIFDLGMSL

HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HHHHH---------EEEE-EHHH----

QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLDGEMAVTRGQLKNGGLGVVSDAIFDLGMSL

Exn 9
Anlisis predictivo de la estructura secundaria del receptor
E: lmina H: hlice -: aa conectores
Exn 10
Anlisis predictivo de la estructura secundaria del receptor
E: lmina H: hlice -: aa conectores
THR

- WT LLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED
ESP HHH - H --- HEHE --- HHHHHH ------------- HHHH ---

THR

- p.I431M LLMKVTDLRMMGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED
ESP HHH - HH -- HHHHH -- HHHHHH ------------- HHHH ---

THR

- p.P447T LLMKVTDLR MIGACHASRFLHMKVECTTELFPPLFLEVFED
ESP HHH - H --- HEHE --- HHHHHHH ------------ HHHH ---

THR

- p.P453T LLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPTLFLEVFED
ESP HHH - H --- HEHE --- HHHHHH ----------- HHHHHH ---

THR

- p.P453L LLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPLL FLEVFED
ESP HHH - H --- HEHE --- HHHHHH ---------- HHHHHHH ---
Homo sapiens
Macaca mulatta
Macaca fascicularis
Mus musculus
Rattus norvegicus
Equus caballus
Canis familiaris
Conger myriaster
Danio rerio
Gallus gallus
Xenopus laevis
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPDSETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPDSETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESDTLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD
LPCEDQIILLKVCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD
p.N331D p.L346F p.R338W
p.L341P
296
296
296
296
296
296
302
232
230
204
208

351
351
351
351
351
351
357
287
285
259
263

Homo sapiens
Macaca mulatta
Macaca fascicularis
Mus musculus
Rattus norvegicus
Equus caballus
Canis familiaris
Conger myriaster
Danio rerio
Gallus gallus
Xenopus laevis
INYRKHHVTHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED
INYRKHHVTHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVGCPTELFPPLFLEVFED
INYRKHKVSYFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED
INYRKHKVAHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED
INYRKHHVAHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED
INYRKHNIAHFWPKLLMKVTDLRMIGACHASRFLHMKVECPTELFPPLFLEVFED
p.P447T p.P453L
p.P453T
p.I431M
407
407
407
407
407
407
413
343
341
315
319
461
461
461
461
461
461
467
397
395
369
373
Anlisis evolutivo del receptor
P453
L456
E457
L453
L456
E457
T453
L456
E457
Exn Pacientes Mutaciones Nuevas Instituciones
9 PC c.991A>G
(AAT>GAT)
p.N331D H. Gutirrez
9 MF c.1022T>C
(CTG>CCG)
p.L341P H. Gutirrez
9 AS c.1036C>T
(CTT>TTT)
p.L346F H. Gutirrez
10 MA c.1293A>G
(ATA>ATG)
p.I431M H. Garrahan
10 CB c.1297-
1304delGCCT
GCCA
p.A433fs
X461
H. Militar
Central
10 ED c.1358C>T
(CCT>CTT)
p.P453L H. Gutirrez
10 MF c.1339C>A
(CCC>ACC)
p.P447T H. Ramos
Meja
Exn Pacientes Mutaciones conocidas Instituciones
9 MA c.1012C>T
(CGG>TGG)
p.R338W H. Garrahan
10 GC c.1357C>A
(CCT>ACT)
p.P453T H. Durn
10 VB c.1357C>A
(CCT>ACT)
p.P453T H. Eva Pern
10 NL c.1357C>A
(CCT>ACT)
p.P453T H. Militar
Central
En el 90 % de casos de RTH no existen sntomas ni
signos patognomnicos por lo cual la identificacin de
nuevas mutaciones en el gen TR aumentar la
precisin en el diagnstico y tratamiento de RTH.

Conclusiones
El anlisis de la estructura secundaria de las
protenas mutadas y los estudios evolutivos proteicos
permiten inferir que las mutaciones identificadas son
de tipo inactivante.

El anlisis poblacional indica que la mutaciones
identificadas no se tratan de polimorfismos
frecuentes.
Perspectivas
2) Expresin in vitro de los alelos TR
conteniendo las mutaciones identificadas.
Determinacin de la afinidad de las hormonas
tiroideas por los receptores mutados.
1) Bsqueda de mutaciones en los exones 7 y
8 del gen TR en aquellos pacientes en los
cuales no se han identificado alteraciones.
Binding a co-represores
Binding a co-activadores
Mutaciones del Receptor de TSH en Patologa Tiroidea
H
2
O
2
ARNm
Traduccin
I
-
Gen de la TPO
TSH
receptor de TSH
protena G
GDP
GS
TG
TPO
NIS
Pendrina
RXR
Zn
TR
Zn
Co-activador
TRE
O HO CH2 OH
NH2
COOH
I
I
I
TATA
Gen Blanco
TF IIB
TBP
Membrana apical
Transcripcin
T
3
I
-
RNA pol
TTF-1, TTF-2, PAX8
ThOX
Molecular cloning of the thyrotropin receptor. Parmentier
M, Libert F, Gerard C, Perret J, Van Sande J, Dumont J,
Vassart G. Science 246: 1620 1622, 1989.

Cloning, sequencing and expression of the human
thyrotropin (TSH) receptor. Libert F, Lefort A, Parmentier
M, Ludgate M, Dumont J, Vassart G. Biochemical and
Biophysical Research Communications 165: 1250 1255,
1989.

Estudio del Hipertiroidismo
sin componente inmunitario.
Identificacin de mutaciones en el gen del Receptor de TSH
responsables de la patogenia de formas localizadas
o generalizadas de la hiperfuncin
de las clulas tiroideas.
Antecedentes
I
+
I
-
H
2
O
2
Mit
Dit
Mit
Dit
T
3
T
4
TG
TG
Lumen folicular
Pendrina
DUOX TPO
NIS
I
-
Na
+
Circulacin sangunea
Esquema simplificado de la sntesis de hormonas tiroideas
Membrana
basolateral
NH2
COOH
Y Y
Y
Representacin esquemtica del Receptor de TSH
motivos de 25 residuos ricos en leucina
Dominio extracelular: 398 AA
6 sitios de glicosilacin
especificidad de binding
Dominios transmembrana: 270 AA
Homologa con R de LH/CG y R de FSH
Dominio intracelular: 76 AA
Activacin de Gs
TSH
Cascada regulatoria controlada por el receptor de TSH
Receptor de TSH
Protena Gs
inactiva
GDP

GTP
Receptor de TSH
GTP

GDP
TSH
OFF
Receptor de TSH
GTP

Protena Gs
activa
Adenil ciclasa activa
ATP
AMPc
TSH
ON
Receptor de TSH
GDP

Adenil ciclasa
GTP
RXR
Zn
TR
Zn
Co-activador
OH
NH2
I
I
I
Gen Blanco
TRE
O HO CH2
COOH
TATA
TF IIB
TBP
Transcripcin
T
3
RNA pol
H
2
O
2
Gen de la TG

Transcripcin
ARNm
T raduccin
I
-
Gen de la TPO
TSH
receptor de TSH
protena G
GDP
GS
TG
TPO
NIS
Pendrina
Membrana apical
I
-
TITF-1, TITF-2, PAX8
DUOX
Fisiologa molecular
Adenil ciclasa

Gen: 60 Kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5
203 71 74 74 74 77 68 77 188 1000 pb
3
Protena: 764 aa COOH NH
2

ARNm: 2.295 b
5 3
Cromosoma 14
14q31
Representacin esquemtica del gen del Receptor de TSH
Mutaciones en el gen del Receptor de TSH
Las caractersticas y severidad de los fenotipos que resultan de la
expresin de receptores anmalos varan, dependiendo de:
1) Naturaleza de la mutacin
Somtica

Por lnea germinal
Familiar
Espordica (de novo)
2) Localizacin de la mutacin en la secuencia codificante
Dominios
Extracelular
Transmembrana
Intracelular
3) Base gentica del paciente
4) Factores ambientales
Afecta a una clula tiroidea y a las clulas hijas que derivan de su
multiplicacin.
Afecta a toda la tiroides
Mutaciones en el Receptor de TSH
Prdida de Funcin Ganancia de Funcin
Resistencia a la tirotrofina Hipertiroidismo no Autoinmune
Hipertiroidismo
Autoinmune: Autoanticuerpos activan la
cascada adenilciclasa-AMPc.
No autoinmune: Mutaciones en el receptor
de TSH y en la protena G activan en forma
autnoma la cascada adenilciclasa-AMPc.
Mutaciones del Receptor de TSH
Autonoma Tiroidea

Tiroides Normal
Adenoma Tiroideo
Txico
Bocio Multinodular
Txico
Hiperplasia Tiroidea
Txica
Formas clnicas de hipertiroidismo no autoinmune
Mutaciones en el receptor que producen
fenotipos con ganancia de funcin.
Causas:
GTP

Protena Gs
activa
Adenil ciclasa
Receptor de TSH
ATP
AMPc
PKA
Activacin de la Funcin Tiroidea
Proliferacin celular
Mutacin
Autonoma de la cascada regulatoria como
consecuencia de mutaciones activantes
Ganancia de funcin: activacin del receptor en ausencia de ligando.
Estrategia experimental
Purificacin de ADN de leucocitos, tejido tiroideo (nodular y
perinodular)
Amplificacin del exn 10 y secuenciacin
Estudios funcionales
Produccin de AMPc
Acumulacin de inositol fosfato
Binding con
125
I-TSH
COS 7
Vector pSVL Receptores Mutados

Identificacin de mutaciones
Mutacin Exn Localizacin en la protena
Serina 281 Asparagina 9 Dominio aminoterminal Extracelular
Serina 281 Treonina 9 Dominio aminoterminal Extracelular
Serina 281 Isoleucina 9 Dominio aminoterminal Extracelular
Metionina 453 Treonina 10 Segundo segmento de transmembrana
Isoleucina 486 Metionina 10 Primer loopextracelular
Isoleucina 568 Treonina 10 Segundo loopextracelular
Asprtico 619 Glicina 10 Tercer loop intracelular
Alanina 623 Valina 10 Tercer loop intracelular
Alanina 623 Isoleucina 10 Tercer loop intracelular
Alanina 623 Serina 10 Tercer loo p intracelular
Leucina 629 Fenilalanina 10 Sexto segmento de transmembrana
Isoleucina 630 Leucina 10 Sexto segmento de transmembrana
Fenilalanina 631 Leucina 10 Sexto segmento de transmembrana
Fenilalan ina 631 Cistena 10 Sexto segmento de transmembrana
Treonina 632 Isoleucina 10 Sexto segmento de transmembrana
Asprtico 633 Glutmico 10 Sexto segmento de transmembrana
Asprtico 633 Treoni na 10 Sexto segmento de transmembrana
Asprtico 633 Histidina 10 Sexto segmento de transmembrana
Asprtico 633 Alanina 10 Sexto segmento de transmembrana
Prolina 639 Serina 10 Sexto segmento de tran smembrana
Valina 656 Fenilalanina 10 Tercer loop extracelular
Del 613 - 621 10 Tercer loop extracelular
Del Tirosina 655 10 Tercer loop extracelular

Mutaciones en el gen del receptor de TSH en el adenoma
tiroideo txico y en el bocio multinodular txico.
Tipo de Mutacin: Somtica
Presencia Allica: Heterocigota
Adenoma tiroideo txico
Mutaciones en Gs
(Arg 201, Glu 227)
Mutaciones en el gen del R de TSH en la Hiperplasia Tiroidea Txica
Congenital hyperthyroidism caused by a mutation in the thyrotropin-receptor gene. Peter
Kopp, Gilbert Vassart. The New England J ournal of Medicine, 1995.
Alelo Normal Alelo mutado
CTC TTC
Leu (631) Phe (631)
Mutacin por lnea
germinal espordica
(6 segmento de TM)
Mutacin Exn Localizacin en la protena Tipo de herencia
Serina 281 Asparagina 9 Dominio aminoterminal EC Espordico
Metionina 453 Treonina 10 Segundo segmento de TM Espordico
Serina 505 Asparagina 10 Tercer segmento de TM Espordico
Serina 505 Arginina 10 Tercer segmento de TM Familiar
Valina 509 Alanina 10 Tercer segmento de TM Familiar
Alanina 623 Valina 10 Tercer loop intracelu lar Familiar
Leucina 629 Fenilalanina 10 Sexto segmento de TM Familiar
Fenilalanina 631 Leucina 10 Sexto segmento de TM Espordico
Tronina 632 Isoleucina 10 Sexto segmento de TM Espordico
Asparagina 650 Tirosina 10 Sexto segmento de TM Familiar
Asparagina 670 Serina 10 Sptimo segmento de TM Familiar
Cistena 672 Tirosina 10 Sptimo segmento de TM Familiar
Del 613 - 621 10 Tercer loop extracelular Familiar / E spordico
Del 655 10 Tercer loop extracelular Familiar / Espordico
Del 658 - 661 10 Tercer loop extracelular Familiar / Espordico

Mutaciones en el gen del receptor de TSH
Hiperplasia Tiroidea Txica.
Tipo de Mutacin: Germinal
Tipo de herencia: Autosmica Dominante
Hipertiroidismo familiar gestacional
Por mutagnesis dirigida se determin que la ganancia de
funcin era debida a la prdida de la lisina en la posicin 183.
Mutacin identificada: Lys 183 Arg, Met, Gln
Localizacin en la protena: Dominio extracelular aminoterminal
Tipo de Mutacin: Germinal
Tipo de herencia: Autosmica Dominante
Efecto: Sensibilidad aumentada a la estimulacin por hCG
respecto del receptor WT
Mutaciones en el gen del receptor de TSH
Carcinomas de tiroides
Mutacin Exn Localizacin en la protena
Alanina 623 Serina 10 Tercer loop intracelular
Treonina 632 Alanina, Isoleucina 10 Sexto segmento de TM
Asprtico 633 Histidina 10 Sexto segmento de TM
Del 655 10 Tercer loop extracelular

Carcinomas tiroideos
Mutaciones en Gs
(Arg 201, Glu 227)
Tipo de Mutacin: Somtica
Mutaciones activantes en el receptor de TSH
Gs
Gs
S281L
Gs
-
+
+
Modelo de la activacin de Gs por el Receptor de TSH
Ms de 37 mutaciones activantes han sido descriptas
siendo una valiosa herramienta para el anlisis de la
estructura / funcin del R de TSH.
No existe una relacin simple entre la posicin de las
mutaciones o la naturaleza de la sustitucin aminoacdica y
sus caractersticas funcionales.
Adenoma tiroideo txico
Hiperplasia tiroidea txica
Mutaciones activantes en el Receptor de TSH son la
principal causa de:
Conclusiones: Autonoma
Es necesario para estudios funcionales usar un contexto celular
correcto en donde las caractersticas bioqumicas de ganancia
de funcin de los receptores mutados sean representativas del
escenario fisiolgico o patofisiolgico de la tiroides.
Mutaciones del Receptor de TSH
Resistencia a la Tirotrofina
Hipotiroidismo sin bocio o disembriognesis (80 %)
Causas: agenesia, hipoplasia, ectpica

Genes alterados: TTF1, TTF2, PAX 8, TSHR, NKX2-5
Hipotiroidismo con bocio o dishormonognesis (20 %)
Causa: defectos en la sntesis de hormonas tiroideas
Genes alterados: TG, TPO, Pendrina, NIS, Duox 2, Duox A2,
DEHAL1
TSH TSH TSH TSH TSH
T
4
T
3

T
4
T
3

T
4
T
3

T
4
T
3

T
4
T
3

TG TG
TG TG TG
TG TPO
DUOX2
DUOXA2
TTF1
TTF2
PAX8
NKX2.5
TSHR
DEHAL1
TSH srica y

TT
4
y TT
3
srica

TG srica

Tamao de la Tiroides
Test de descarga de
Perclorato
Gene(s) involucrados
Disgenesias
Tiroideas y
Resistencia a
TSH

Defecto de la
Organificacin
del Ioduro
Defecto de la
Sntesis de la
Tiroglobulina

Defecto del
reciclado del
Ioduro
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
hours
%

u
p
t
a
k
e

o
f

1
3
1
I

KClO4
Descarga de Perclorato
Mutaciones inactivantes en el receptor de TSH
Exon
1
4
6
6
10
10
10
10
10
10
10

ttcattctctctctctctttctctctctccctctagTTACCTAAACAAGAATAAATACC

ttcattctctctctctctctctttctctctctccctctagTTACCTAAACAAGAATAAATACC

ttcattctctctctctctctctctttctctctctccctctagTTACCTAAACAAGAATAAATACC
pSPL3-[CT]
6
pSPL3-[CT]
8
pSPL3-[CT]
9
Estudios de splicing
c.553T>C (p.N187N) g.IVS6+13A>G g.IVS5-69C>T
C A
T
Exon 6 Exon 7
Haplotype CAT
T G
C
Exon 6 Exon 7
Haplotype TGC
C/T A/G
T/C
Exon 6 Exon 7
Haplotype CAT/TGC
c.553T>C (p.N187N) g.IVS6+13A>G g.IVS5-69C>T
C A
T
Exon 6 Exon 7
Haplotype CAT
C A
T
Exon 6 Exon 7
Haplotype CAT
T G
C
Exon 6 Exon 7
Haplotype TGC
T G
C
Exon 6 Exon 7
Haplotype TGC
C/T A/G
T/C
Exon 6 Exon 7
Haplotype CAT/TGC
C/T A/G
T/C
Exon 6 Exon 7
Haplotype CAT/TGC
Pattern A
Pattern B
Pattern C
TGTACAACAATGGCTTTACTTCA TGTACAACAATGGCTTTACTTCA AGTGCATATGCGCAGCAAGA AGTGCATATGCGCAGCAAGA AGTATTACCAGTTCTACTCC AGTATTACCAGTTCTACTCC
C/C A/A
T/T
GAGTATTACCGGTTCTACTCC GAGTATTACCGGTTCTACTCC AGTGCATATGTGCAGCAAGA AGTGCATATGTGCAGCAAGA TGTACAACAACGGCTTTACTTCA TGTACAACAACGGCTTTACTTCA
T/T G/G C/C
AGTGCATATGNGCAGCAAGA AGTGCATATGNGCAGCAAGA AGTATTACCNGTTCTACTCC AGTATTACCNGTTCTACTCC TGTACAACAANGGCTTTACTTCA TGTACAACAANGGCTTTACTTCA
C/T A/G T/C
Exon 6 Exon 7
TGTACAACAATGGCTTTACTTCA TGTACAACAATGGCTTTACTTCA AGTGCATATGCGCAGCAAGA AGTGCATATGCGCAGCAAGA AGTATTACCAGTTCTACTCC AGTATTACCAGTTCTACTCC
C/C A/A
T/T
AGTGCATATGCGCAGCAAGA AGTGCATATGCGCAGCAAGA AGTATTACCAGTTCTACTCC AGTATTACCAGTTCTACTCC
C/C A/A
T/T
T/T G/G C/C
T/T G/G C/C
C/T A/G T/C
C/T A/G T/C
Exon 6 Exon 7 Exon 6 Exon 7

Tiroides, Maestria 2013

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