Resistencia del VIH

a la terapia antiviral

GRUPO RESISTENCIA DEL VIH A LA TERAPIA ANTIVIRAL. EXPOSICIN 29
OCTUBRE
104823- Miguel Jos Corts
108106- Samuel Corts
107672- Beln Crdoba
104367- Mara Ludovica del Prete
109-195 Pierfrancesco di Maro
109404- Achraf Diab
109668- Andrea Pelizziari

Como primera aproximacin al tema de la resistencia del virus del HIV a los
antirretrovirales, debe tenerse en cuenta la definicin de virus.

Un virus es un ente biolgico capaz de autoreplicarse utilizando la maquinaria celular
de la clula en la cual se hospeda. Los virus difieren entre s por el tamao, la forma y la
composicin qumica de su genoma. Es un agente potencialmente patgeno compuesto
por una cpside (o cpsida) de protenas que envuelve externamente al virus, formada
por unas subunidades idnticas denominadas capsmeros. Los capsmeros son
protenas globulares que en ocasiones tienen una parte glicdica unida, se ensamblan
entre s dando a la cubierta una forma geomtrica. El virus, adems, presenta una
nucleocpside compuesta por protenas que recubre al cido nucleico, que puede ser
ADN(llamndose Adenovirus) o ARN(Retrovirus), pero nunca ambos. Algunos virus
necesitan de enzimas, por lo que las cargan dentro de su envoltorio como parte de su
equipaje: por ejemplo, la transcriptasa inversa, para los Retrovirus.
El ciclo vital de un virus depende de la clula invadida, para poder producir luego,
muchas copias del virus original. En dicho proceso reside la capacidad destructora de
los virus, ya que pueden perjudicar a la clula hasta destruirla. Pueden infectar clulas
eucariotas o procariotas (en cuyo caso se les llama bacterifagos) y pueden hacerlo de
dos formas distintas: reproducindose en el interior de la clula infectada, utilizando
todo el material y la maquinaria de la clula hospedante; o unindose al material
gentico de la clula en la que se aloja, produciendo cambios genticos en ella.
-VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana. Como cualquier virus, es un agente
infeccioso incapaz de sobrevivir por s solo. Para vivir y multiplicarse el virus necesita
invadir clula de algn organismo vivo; en nuestro caso, acta sobre las clulas de
nuestro sistema inmune (glbulos blancos o, especficamente Linfocitos CD4),
destruyndolas o haciendo que dejen de cumplir su funcin.
Una de las principales causas de fracaso al tratamiento artirretroviral observadas en
cuando a dicho virus es la aparicin de resistencias.

2.-Drogas antirretrovirales.
Para comprender en profundidad los mecanismos de resistencia del VIH a los
antirretrovirales, es imprescindible definir cada tipo y accin de dichos medicamentos.

NRTI (Anlogos Nuclesidos para la Transcriptasa Inversa): interfieren en el proceso
de la Transcriptasa inversa insertando dentro de la copia viral del ADN materiales de
construccin falsos, haciendo que el proceso fracase y evitando as que el virus se
apropie del ncleo de la clula para poder replicarse.
PI (Inhibidores de la Proteasa): La fragmentacin de las cadenas ms largas de
protenas est producida por la enzima Proteasa. El PI, impide que dicha fragmentacin
tenga lugar. Consecuentemente, las protenas que resultan son copias defectuosas que
sibien pueden destruir la clula que infect, ya no pueden infectar ms clulas. Al
producir nuevos virus defectuosos se logra que la infeccin no se propague dentro del
organismo con la misma rapidez y tericamente se podra llegar a una "cronificacin"
de la infeccin, ya que al haber menos virus, menos clulas CD4 se infectaran y la
persona que vive con el VIH podra combatir mejor las infecciones y vivir ms tiempo.
NNRTI (Anlogos No Nuclesidos para la Trancriptasa Inversa): Interfieren en la
misma etapa de los NRTI, pero utilizando un proceso qumico diferente. Tienen una
estructura qumica heterognea. Actan de un modo no competitivo, a diferencia de los
anlogos de los Nuclesidos, sobre la Transcriptasa inversa. Causan una ruptura en el
sitio catalizador de la enzima. In Vitro, actan sinrgicamente con los NRTI y son
activos frente a las cepas de VIH resistentes al AZT.
Los mejores resultados se han obtenido cuando se han utilizado en una triple asociacin,
generalmente junto a AZT y ddi. En estudios clnicos se ha podido observar que estas
asociaciones disminuyen la CV por lo tanto, aumentan el nmero de clulas CD4, sin
embargo, no existen datos que permitan afirmar que mejoran la supervivencia o retrasan
la aparicin de SIDA.
Los NNRTI son una alternativa a los PI en las asociaciones con 2 NRTI para las
personas que no toleran los PI o que no desean tomarlos. Se desconoce si esta
alternativa es equivalente a la aconsejada: 2 NRTI y 1 PI, ya que mientras stos actan
sobre dos blancos diferentes, los NNRTI y los NRTI actan sobre el mismo).

3.-Resistencia del HIV a drogas antirretrovirales.
La resistencia en sentido amplio se define como cualquier cambio que mejore la
replicacin del VIH en presencia de un inhibidor. Es importante tener en cuenta que el
concepto de resistencia es relativo, porque si se parte de un inculo lo suficientemente
pequeo y se usa un frmaco en concentracin suficiente, un virus resistente podra
presentarse como sensible. En trminos especficos, la resistencia del VIH al
tratamiento antirretroviral consiste en un fenotipo alterado como resultado de un cambio
en el genotipo viral que se puede detectar tanto in vitro como in vivo.
Epidemiolgicamente, se puede hablar de resistencias primarias y secundarias. Son
resistencias primarias cuando se encuentran en virus de pacientes que no han sido
tratados previamente, lo que implica que la infeccin se ha adquirido a partir de cepas
de VIH resistentes. Por el contrario, se trata de resistencias secundarias, cuando
aparecen en la poblacin viral de un paciente como consecuencia de la presin selectiva
ejercida por la exposicin a frmacos antirretrovirales.

Mecanismos de resistencia:
El mecanismo por el cual el HIV de torna resistente a las drogas antirretrovirales vara
con el tipo de droga, dado que cada frmaco acta mediante un mecanismo de accin
diferente. En general, los cambios asociados a resistencia se localizan en las regiones
codificantes para las enzimas blanco de la accin de la droga. Sin embargo, se han
evidenciado tambin cambios co-evolutivos en los sustratos virales de las enzimas del
HIV afectadas.

A NRTIs:
Hasta el momento han sido caracterizados tres mecanismos de resistencia a las drogas
de la familia de los NRTIs. El primer mecanismo es mediado por mutaciones en la RT
que permiten discriminar entre el sustrato natural (desoxinucletido trifosfato) y el
NRTI, impidiendo la adicin del inhibidor a la cadena de ADN en elongacin. El
segundo mecanismo es el reposicionamiento del complejo templador-cebador. El tercer
mecanismo es mediado por mutaciones que aumentan la tasa de remocin del NRTI
terminador de cadena por pirofosforlisis (mediado por pirofosfato o ATP); esta
reaccin es llevada a cabo por la RT y permite la continuacin de la sntesis de ADN.
A NNRTIs:
La resistencia a los NNRTIs puede desarrollarse rpidamente cuando se suministran en
forma de monoterapia, fundamentalmente por la seleccin de mutaciones alrededor del
sitio de unin del sustrato en la enzima. Estos cambios estn asociados con una menor
afinidad de la droga por la RT.
A PIs:
La resistencia a PIs est mediada por cambios estructurales en el sitio de unin al
sustrato que resultan en una reduccin de la afinidad por el sustrato. Tambin pueden
ocurrir cambios fuera del sitio de unin al sustrato, e involucraran distintos
mecanismos, como la alteracin de la catlisis enzimtica, efectos en la estabilidad del
dmero, alteraciones en la cintica de unin del inhibidor o cambio de la estructura del
sitio activo a travs de perturbaciones estructurales a larga distancia.

4.- Fenmenos asociados a la resistencia.
El fenmeno de la resistencia en el contexto de la infeccin por HIV es muy complejo,
y se complica an ms por la existencia de factores tales como ser la resistencia
cruzada, la reversin de la resistencia y la resistencia a mltiples drogas.

Resistencia cruzada: ocurre cuando la resistencia a una droga causa resistencia a otro u
otros frmacos dentro de la misma clase de drogas. En el marco de las opciones
teraputicas actuales, es de sumo inters considerar que cualquier tratamiento elegido
debe proveer un beneficio clnico mximo en el presente y flexibilidad en el futuro, en
caso de que el esquema inicial fallara. Este tipo de resistencia se puede encontrar en las
tres principales familias de drogas.
Reversin de la resistencia: tiene lugar cuando las mutaciones asociadas a resistencia a
una droga, revierten el efecto de las mutaciones asociadas a resistencia a otra droga. Son
numerosos los intentos de utilizar este fenmeno para la identificacin de
combinaciones de antirretrovirales ms efectivos en el uso clnico.
Resistencia a mltiples agentes: es el fenmeno asociado a drogas que actan mediante
mecanismos distintos. Este es un problema que surge en el tratamiento del HIV dado el
uso creciente de los esquemas teraputicos combinados, as como el extensivo uso
secuencial de los agentes. Se postula que la recombinacin es uno de los factores ms
importantes relacionado al rpido desarrollo de variantes del VIH con alto grado de
resistencia a mltiples drogas.

5.- Mutaciones asociadas a la resistencia a antirretrovirales.
Se clasifican las mutaciones asociadas a resistencia en dos grandes categoras:
Mutaciones primarias: estn asociadas directamente a un grado mensurable de
resistencia fenotpica a los agentes antirretrovirales.
Mutaciones secundarias: por s solas, confieren un muy bajo o nulo nivel de resistencia,
pero al interaccionar con las mutaciones primarias, aumentan o restituyen la capacidad
replicativa viral y/o aumentan el nivel de la resistencia a los agentes.

6.- Pruebas para la determinacin de resistencias.
Existen dos grandes grupos de tcnicas para la determinacin de resistencias del VIH al
tratamiento antirretroviral: las genotpicas y las fenotpicas.

Pruebas genotpicas
Las pruebas genotpicas tienen como base el anlisis del genoma y por tanto encuentran
la presencia de mutaciones. En funcin del principio en que se basen, el nmero de
mutaciones detectables es distinto. Las tcnicas que utilizan la secuenciacin, detectan
todas las mutaciones presentes en las regiones del genoma del VIH que codifican para la
retrotranscriptasa y para la proteasa. Cuando el fundamento de la tcnica es la
hibridacin, slo se encuentra determinado nmero de mutaciones de significacin
conocida.

Pruebas genotpicas comerciales:
Existen tres pruebas genotpicas comerciales, la secuenciacin directa de ARN
retroviral y dos tcnicas basadas en la hibridacin (LiPATM y GeneChipTM), cuyo
fundamento se describe brevemente a continuacin.
Secuenciacin: el principio general de esta tcnica consiste en la obtencin de
molculas de ADN, un nucletido ms largo que la precedente y su posterior separacin
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolucin.
En la actualidad, aunque el principio bsico no ha cambiado, las tcnicas modernas de
secuenciacin se derivan del mtodo de Sanger, segn el cual en lugar de fraccionar el
ADN en cuestin, se procede a la sntesis de pequeos fragmentos a partir de la cadena
molde. Esta sntesis tiene una peculiaridad, que es la incorporacin de nucletidos
terminadores de cadena. Estos nucletidos en realidad son didesoxinucletidos-5-
trifosfato (ddNTP), es decir, carecen de grupo hidroxilo (OH) en posicin 3', que es
fundamental para la elongacin de la cadena, porque es precisamente en esta posicin
donde la polimerasa inserta el siguiente nucletido durante la sntesis de ADN. La
adicin de la proporcin adecuada de nucletidos naturales con respecto a estos
didesoxinucletidos dar lugar a la sntesis de fragmentos de diversos tamaos.
Para secuenciar el VIH se pueden adoptar dos estrategias: la secuenciacin del genoma
proviral integrado en los linfocitos, que ya est como ADN, o la realizacin de una
retrotranscripcin previa de ARN viral plasmtico, para obtener una coleccin de ADN
retrovirales. Para poder obtener secuencias confiables, un requisito fundamental es la
idoneidad del material de partida, tanto en pureza como en cantidad. Para garantizar este
aspecto se realiza, en primera instancia, una PCR anidada, que son dos PCR seguidas,
de forma que el amplificado conseguido es mucho ms abundante que si se realizase
una PCR ordinaria. Tras la obtencin del material gentico suficiente se procede a la
purificacin del amplificado para eliminar restos de iniciadores, sales, enzimas,
nucletidos, etc.
Una vez obtenidos todos los fragmentos se procede a su separacin electrofortica, que
se realiza de forma automatizada en un secuenciador; sta puede ser segn la clsica
PAGE de alta resolucin o mediante electroforesis capilar. Independientemente de la
tcnica de electroforesis acoplada al secuenciador, los fragmentos se separarn en
funcin de su tamao molecular. Las seales se recogen en un procesador electrnico
acoplado al secuenciador y ste deduce la secuencia por comparacin de los fragmentos
solapantes, de manera que esta secuencia en realidad es una secuencia consenso que
representa las secuencias de las subpoblaciones virales mayoritarias.
Para determinar la presencia de mutaciones que confieren resistencia a los
antirretrovirales se extrae el genoma de una muestra del paciente y se procede a su
secuenciacin. Una vez obtenida la secuencia del VIH de la muestra problema, la
secuencia obtenida del gen RT o de la proteasa se compara con las correspondientes
secuencias de una cepa salvaje del VIH prototipo no resistente utilizando un programa
informtico acoplado al secuenciador.
LiPATM: el fundamento de esta tcnica es una hibridacin reversa post-PCR. El soporte
de la hibridacin consiste en tiras de nitrocelulosa con sondas de oligonucletidos
especficos inmovilizadas en lneas paralelas. Estas sondas son complementarias a la
secuencia de mutaciones conocidas que confieren resistencia a los frmacos
antirretrovirales. La amplificacin de la muestra se realiza con oligonucletidos
cebadores biotinilados que permitirn el revelado de la reaccin. Despus de la
hibridacin se aade un conjugado compuesto por estreptavidina-fosfatasa alcalina, que
se unir a cualquier hbrido formado sobre la tira. Al aadir el sustrato de la enzima se
producir un precipitado marrn-prpura en las posiciones correspondientes.
VIH GeneChipTM (Affimetrix): a pesar de que el fundamento de esta tcnica es una
hibridacin, el resultado final es la secuenciacin del material amplificado a partir de la
muestra. El soporte de hibridacin son microarreglos de ADN o chips de silicio que
contienen una biblioteca combinatoria de sondas, que consiste en una gran cantidad
de oligonucletidos solapantes. La hibridacin de estos microarreglos con ADN
retroviral va a permitir identificar el nucletido presente en cada posicin de la
secuencia a analizar. Como los productos de RT-PCR estn marcados, permitir deducir
la secuencia la deteccin de fluorescencia tras la hibridacin mediante barrido de lser e
integracin de las seales obtenidas con un programa informtico. Una ventaja de esta
tcnica es que permite el anlisis simultneo de un elevado nmero de muestras.
Pruebas fenotpicas
Las pruebas fenotpicas consisten en sistemas de replicacin in vitro que enfrentan al
virus con diferentes concentraciones de drogas antirretrovirales. El grado de inhibicin
del crecimiento se establece por comparacin con una cepa de referencia.

Pruebas fenotpicas comerciales:
Como las pruebas genotpicas, son una medida indirecta, pues la presencia de
mutaciones no siempre implica su expresin, las pruebas fenotpicas deberan ser el
primer escaln natural en la deteccin de resistencias. Bsicamente estas tcnicas
consistan en el co-cultivo de linfocitos del paciente con lneas celulares linfoides, como
MT2 y MT4, en presencia de frmacos antirretrovirales. Transcurridas unas semanas se
meda la replicacin viral por la produccin de antgeno p24 o la actividad
retrotranscriptasa. Estas tcnicas tienen varias limitaciones e inconvenientes como son
la laboriosidad, altos costos, la infraestructura necesaria, el largo tiempo requerido y la
falta de estandarizacin. Todo esto ha sido resuelto en parte por las tcnicas de virus
recombinantes (RVA).

Tcnicas de virus recombinantes:
Las tcnicas de virus recombinantes determinan la concentracin que inhibe 50% de la
infectividad (IC50) y la comparan con la IC50 de una cepa de referencia o de un
aislamiento anterior de un mismo paciente. Actualmente, existen dos tcnicas
comerciales que se diferencian sobre todo en:el sistema de produccin del virus
recombinante, el mecanismo de deteccin de la replicacin viral, el valor umbral de
carga viral requerido, el tiempo de realizacin, la cepa de referencia y el punto de corte.
Entre las principales ventajas que presentan las pruebas fenotpicas de resistencia a los
frmacos antirretrovirales estn su capacidad para medir directamente la sensibilidad al
frmaco en cuestin, de forma importante aportan informacin sobre resistencias
cruzadas, que se pueden aplicar a cualquier molcula y que son relativamente fciles de
interpretar.
BIBLIOGRAFA.
http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-98872005000300004
http://www.aidsmeds.com/articles/Resistencia_6971.shtml