UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA

MOLINA





CURSO:
Enzimologa.
TEMA:
Prctica N 10 Purificacin parcial de fosfatasa cida-

PROFESOR:
Aliaga Rota, Pilar.
GRUPO:
B*
10 de diciembre, 2012

I. FUNDAMENTO
La purificacin parcial de fosfatasa cida de hgado realizada en la prctica se fundamenta
en la precipitacin fraccionada con sulfato de amonio. La concentracin salina suele
expresarse como fuerza inica, entonces esta tcnica logra la precipitacin de protenas
mediante el aumento de la fuerza inica del medio, y es que, en general, las protenas
aumentan su solubilidad a concentraciones salinas bajas (salting in) y precipitan a
concentraciones salinas altas (salting out) (Primo, 1995).
Esto se produce porque las grandes
cantidades de sal en la solucin
disminuyen las interacciones
protena-agua ya que quitan la
capa de solvatacin, generando que
predominen las interacciones
protena-protena lo que provoca la
precipitacin de las mismas
(Universidad Nacional de Quilmes,
2010). Como la concentracin de
sales a la que precipita cada protena
es distinta, entonces una mezcla de
protenas puede purificarse
fraccionadamente por la adicin
creciente de sulfato de amonio,
separando despus de cada adicin el precipitado con las protenas restantes, aislando en
cada fraccin una fraccin ms pura de la enzima de inters.

II. REVISIN LITERARIA.
Las enzimas son protenas. Las protenas se purifican por procedimientos de
fraccionamiento, en una serie de pasos independientes en el que se aprovechan las
propiedades fisicoqumicas de la protena de inters para separarla de manera progresiva
de otras sustancias (Voet & Voet, 2006). Para ello es necesaria la liberacin de entre las
estructuras en las que se encuentra la enzima de inters y mantenerla en solucin. Esto se
conoce como solubilizacin y extraccin de protenas. Muchas necesitan de una ruptura
mecnica para que la clula libere su contenido, para el presente ensayo se utiliza la tcnica
de homogenizacin para tal fin. Una vez liberada, la enzima queda expuesta a agentes que
la pueden daar de forma irreversible por lo cual es importante mantenerla estable, por
ello suele disolverse en soluciones amortiguadoras (buffers) eficaces en el rango de pH en
el que el material es estable (Voet & Voet, 2006).
De acuerdo a Saeed (2009) la fosfatasa cida de alto peso molecular de hgado de pollo
tiene un pH ptimo entre 4.5-5.5 y una temperatura ptima a 50C.
Ilustracin 1. Dependencia de la solubilidad con la
concentracin salina. Imagen disponible en:
http://elcuadernodecalpurniatate.blogspot.com/2012/09
/sales-proteinas-y-solubilidad-efectos.html
Para la separacin fraccionada de la enzima de inters pueden utilizarse tcnicas que
aprovechen las propiedades de solubilidad, termoestabilidad, polaridad, tamao,
especificidad de la unin, etc. (Voet et al, 2007). En la prctica se utiliza el criterio de
solubilidad.
La solubilidad de una protena en una
concentracin baja de iones aumenta a
medida que se le agrega sal, este fenmeno
es conocido como salting in (Voet et al,
2007) permitiendo que precipiten otras
protenas; pero al agregar ms sales, la
solubilidad de la enzima disminuye
nuevamente. Este fenmeno es conocido
como salting on y resulta en la
precipitacin de la protena (Voet et al,
2007).
En el trabajo realizado por Saeed (2009) se
realiza la purificacin de la enzima fosfatasa
cida de alto peso molecular de hgado de
pollo, en la tabla 1 se muestran los valores obtenidos a partir del fraccionamiento con sales
de sulfato de amonio al 30% y al 60% de saturacin.
Tabla 1. Purificacin de fosfatasa cida de alto peso molecular proveniente de hgado de pollo.
Fuente Isolation, purification and characterization of Zn++-dependent acid phosphatase from chickens heart
and its comparison with the enzyme of chickens liver (Saeed, 2009).




Ilustracin 2. (a) Se agrega la sal por debajo del punto de
precipitacin de la protena de inters. (b) Luego de la
centrifugacin precipitan protenas no deseadas, se
descartan y se agregan sales en concentracin suficiente
para precipitar la protena de inters. (c) Despus de la
segunda centrifugacin se recupera la protena en el
precipitado. Fuente: Fundamentos de Bioqumica: La
vida a nivel molecular (Voet et al, 2007).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Volmenes registrados
Tubos Sob I Sob II Sob III PP I PP II
Volumen (ml) 19.7 19.2 17.9 1.8 4.95

Determinacin de Actividad enzimtica.
Tubos Sob I Sob II Sob III PP I PP II
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
s

Blanco
Muestra
0.292 0.253 0.191 0.177 0.392
Muestra 1.078 0.752 0.037 0.023 1.670
Repeticin 1.065 0.739 0.191 0.544 1.680
Promedio 0.7995 0.4925 0* 0.367* 1.283
C.V (%) 0,8579 1,2331 95,5214 129,9480 0,4222
Actividad
Enzimtica
16,264 9,764 0,000 0,682 6,558

Clculos: Se utiliza la ecuacin:
A=a.b.c
Donde:
a = Coeficiente de extincin molar del nitrofenolato: 18400 L mol
-1
cm
-1

b = Longitud de la cubeta: 1cm
c = Concentracin

Para Sob I

(Tubo)


( )


(Volumen Sob I) 19.7







Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de Sob I 16.264 UE

Para Sob II

(Tubo)


( )


(Volumen Sob II) 19.2







Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de Sob II 9,764 UE

Para Sob III

Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de Sob III 0 UE

Para PP I

(Tubo)


( )


(Volumen Sob I) 1.8







Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de PP I 0.682 UE



Para PP II

(Tubo)


( )


(Volumen Sob I) 19.7







Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de PP II 6,558 UE

Determinacin de concentracin de protenas
Tubos Sob I Sob II Sob III PP I PP II
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
s

Muestra 0,099 0,089 0,030 0,043 0,206
Repeticin 0,100 0,089 0,031 0,043 0,198
Promedio 0,0995 0,089 0,0305 0,043 0,202
C.V (%) 0,711 0,000 2,318 0,000 2,800
Concentracin de
protena (mg/ml)
0,435 0,389 0,133 0,188 0,884
Concentracin de
protena en Vol.
obtenido
514,70 448,70 143,36 20,32 262,56

Clculos: Utilizando la ecuacin de la curva de calibracin de la prctica pasada se
determin la concentracin de protenas en los tubos muestra:
Ecuacin: Absorbancia = 0,2285 x Concentracin (mg/ml)
Para Sob I
Absorbancia promedio: 0,0995
0,0995 = 0,2285x
X = 0,435 mg/ml
0,435 mg protena 1ml
2,613 mg protena 6ml (tubo)
2,613 mg protena 0,1ml (extracto crudo)
514,700 mg protena 19.7 ml (sobrenadante)
Concentracin de protena en el Sob I: 514,7 mg

Para Sob II
Absorbancia promedio: 0,0995
0,089 = 0,2285x
X = 0,389 mg/ml
0,389 mg protena 1ml
2,337 mg protena 6ml (tubo)
2,337 mg protena 0,1ml (extracto crudo)
448.700 mg protena 19.2 ml (sobrenadante)
Concentracin de protena en el Sob II: 448.7 mg

Para Sob III
Absorbancia promedio: 0,0305
0,0305 = 0,2285x
X = 0,133 mg/ml
0,133 mg protena 1ml
0.801 mg protena 6ml (tubo)
0.801 mg protena 0,1ml (extracto crudo)
143.357 mg protena 17.9 ml (sobrenadante)
Concentracin de protena en el Sob III: 143.357 mg
Para PP I
Absorbancia promedio: 0,043
0,043 = 0,2285x
X = 0.188 mg/ml
0,188 mg protena 1ml
1.129 mg protena 6ml (tubo)
1.129 mg protena 0,1ml (extracto crudo)
20.324 mg protena 1.8 ml (sobrenadante)
Concentracin de protena en el PP I: 20.324 mg

Para PP II
Absorbancia promedio: 0,202
0,202 = 0,2285x
X = 0,884 mg/ml
0,884 mg protena 1ml
5.304 mg protena 6ml (tubo)
5.304 mg protena 0,1ml (extracto crudo)
262.556 mg protena 19.7 ml (sobrenadante)
Concentracin de protena en el PP II: 262.556 mg
Tabla de purificacin
Fraccin Volumen (ml)
Actividad
(UE)
Protena (mg)
Rendimiento
(%)
Act. Especfica
(UE/mg)
Sob I 19.7 16.264 514.70 100,000 0,0316
Sob II 19.2 9.764 448.70 60,038 0,0218
Sob III 17.9 0.000 143.36 0,000 0,0000
PP I 1.8 0.682 20.32 4,194 0,0336
PP II 4.95 6.558 262.56 40,322 0,0250

Despus del homogenizado, el precipitado de este es descartado, ya que la enzima en estudio
se encuentra en solucin para evitar que su centro activo sufra daos y darle estabilidad en el
pH.
Tomamos como punto de partida al sobrenadante 1, que al saturarse a un 25% con sulfato de
amonio nos permite separar protenas diferentes a fosfatasa cida en el precipitado 1 y
obtener una purificacin parcial de la enzima en la solucin sobrenadante 2. Siendo este
ltimo la muestra a saturar al 55% con sulfato de amonio para aislar la enzima en el
precipitado 2 y quedando as poca o nada de enzima en el sobrenadante 3. Es importante
recordar que para el anlisis espectrofotomtrico es necesario que la muestra se encuentre en
solucin y sea traslcido, por ello, el precipitado 2 debe disolverse en buffer inmediatamente
para evitar que el centro activo sufra cambios conformacionales y mantener el pH estable.
Fuente: Qumica de protenas - UNMSM

Como se muestra en la Tabla 2, mediante la purificacin de esta enzima, se intenta mantener
altos los niveles de actividad enzimtica y disminuir las protenas totales, asimismo, la
actividad especfica final debe ser ms alto que el inicial, ya que la actividad se mantiene y las
protenas totales disminuyen.
En la purificacin parcial llevada a cabo, observamos que en un inicio, el sobrenadante 3 y el
precipitado 1 tienen un error en una de sus repeticiones, ya que al parecer se olvid aadir el
extracto crudo, es por ello que el coeficiente de variacin es ms alto al esperado puesto que
los otros factores se mantuvieron constantes.
Para fosfatasa cida de alto peso molecular, la saturacin que se practica en la tabla 1 est
entre el 30% y 60% de sulfato de amonio (Saeed, 2009); sin embargo, en la purificacin llevada
a cabo en el laboratorio se us una saturacin del 25% y 55% de sulfato de amonio, lo cual nos
debera proporcionar mayor cantidad de protena recuperada en una primera saturacin, esto
se verifica mediante la comparacin entre las actividades especficas de ambos.
Tabla 3: Comparacin de actividades ezpecficas
AE experimental AE ensayo- Saeed
Sobrenadante 1 0,0316 0,037
Sobrenadante 2 0,0218 0,030
Precipitado 2 0,0250 0,034

2
En ambas pruebas se verifica que la actividad enzimtica es alta, muy a pesar que el volumen
de extracto crudo es distinto, podemos relacionar tambin las actividades especficas ya que su
medida es UE/mg. En nuestro caso, la actividad especfica fue menor al del ensayo de Saeed, a
pesar de que la saturacin usada es un poco menor al de Saeed, esto es debido a errores
humanos en medicin y/o adicin de algn reactivo en la actividad enzimtica y cantidad de
protenas.
Es por ello, que la recuperacin de enzima en el ensayo de Saeed mediante la metodologa de
saturacin con sales es aproximadamente la mitad, mientras que en el nuestro es de 40,3%. Lo
cual, nos indica que para futuras purificaciones, deberamos cambiar la saturacin de la enzima
al 30% y luego al 60%, en el cual se muestra mayor efectividad que el estudiado en el
laboratorio. Sin embargo, a pesar del bajo rendimiento y errores vistos a lo largo del proceso,
se pudo aislar satisfactoriamente a la fosfatasa cida por medio de saturaciones con sulfato de
amonio.

BIBLIOGRAFA
Primo Yfera, Eduardo. Qumica orgnica bsica y aplicada: de la molcula a la
industria. Reverte, 1995 - 484 pginas. Pg.: 990. Universidad Nacional de Quilmes.
2010. TP2: Extraccin y cuantificacin de protenas. Introduccin a la Biologa Celular y
Molecular.
Fecha de revisin: 08/12/2012.
Disponible en: http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf
Voet, Donald; Voet, Judith G. Bioqumica: 3a edicin. Ed. Mdica Panamericana,
28/08/2006 - 1700 pginas. Pg.: 138
Voet, Donald; Voet, Judith G. Pratt, Charlotte W. Fundamentos de Bioqumica: La vida
a nivel molecular. Ed. Mdica Panamericana, 20/06/2007 - 1260 pginas. Pg.: 101
Saeed, Asma. Tesis: Isolation, purification and characterization of Zn++-dependent acid
phosphatase from chickens heart and its comparison with the enzyme of chickens
liver. High molecular weight acid phosphatase from chickens liver: Separation and
characterization. Department of Biological Sciences Gomal University Dera Ismail
Khan. 2009.
Revisado: 08/12/2012.
Disponible en: http://prr.hec.gov.pk/Thesis/315S.pdf
Autor: Mercedes Sobern Lozano, H. Haak, M. Calixto.
Ttulo: Purificacin de fosfatasa cida de alto peso molecular de hgado de cerdo.
Disponible en:
https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/b
ibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid
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